La recherche de maïs plus tolérants au déficit hydrique est un enjeu fondamental pour la production agricole dans les prochaines décennies. Le but ce travail a été d’identifier et de caractériser des gènes impliqués dans la variation de caractères complexes affectés par le déficit hydrique chez le maïs.Nous avons tout d’abord identifié des transcrits et des protéines, dont la teneur variait entre deux mélanges de lignées recombinantes différant pour une région chromosomique influençant la croissance foliaire et la protandrie en condition de déficit hydrique. Parmi les huit gènes candidats cartographiés au niveau de la région d’intérêt, se trouvait le facteur de transcription ZmMYB31 impliqué dans la biosynthèse de la lignine. Nous avons montré que son expression était corrélée à celle de deux de ses cibles, à la teneur en lignine et à l’expression du gène ZmFatA impliqué dans la biosynthèse des acides gras, suggérant un rôle régulateur de la protéine ZmMYB31 via la synthèse de lignine et de dérivés lipidiques.Dans un second volet, nous avons montré que la sur-expression du gène candidat ZmASR1 (ZmASR1-OE) chez le maïs maintenait le rendement en condition de déficit hydrique. Des analyses transcriptomiques et protéomiques nous ont permis d’identifier 25 cibles de la protéine ZmASR1, dont sept gènes impliqués dans la biosynthèse des acides aminés branchés. Nous avons également montré qu’il existait une étroite corrélation entre 13 métabolites diminués par ZmASR1-OE, six étant connus pour être négativement corrélés à la biomasse. Enfin, des résidus phosphorylés ont été identifiés chez les protéines ZmASR1, ZmASR2 et ZmASR3, suggérant leur régulation par phosphorylation. / Maize is particularly sensitive to water deficit at reproductive stages. As such, identification of factors that confer tolerance to water deficit would pave the way for increasing agricultural productivity. The aim of this work was to identify and make up the functional characterization of candidate genes for water deficit tolerance in maize.Firstly, transcriptomic and proteomic analyses of bulked recombinant inbred lines revealed eight differentially expressed genes colocating with a chromosomal region exhibiting two QTLs for leaf growth and anthesis-silking interval sensitivities to water deficit. Among them, we identified the transcription factor ZmMYB31 gene involved in the control of lignin biosynthesis. The expression of ZmMYB31 was correlated with that of its targets genes ZmCOMT and ZmFAD9, as well as ZmFatA involved in fatty acid biosynthesis. Changes in lignin and fatty acid content allowed us to hypothesis a regulatory role of ZmMYB31 via lignin and fatty acid-derived metabolites.Secondly, we showed that transgenic maize plants overexpressing the candidate gene ZmASR1 (ZmASR1-OE) maintained kernel yield under water deficit condition in the field. Transcriptomic and proteomic analyses of ZmASR1-OE leaves allowed us to identify 25 direct or indirect target genes of ZmASR1, in particular seven genes involved in branched-chain amino acid (BCAA) biosynthesis. We also showed a tight correlation between the level of 13 decreased metabolites in ZmASR1-OE leaves, 6 of which being previously shown to be negatively correlated to biomass. Phosphoresidues were also found in ZmASR1, ZmASR2 and ZmASR3, suggesting that these proteins are regulated by phosphorylation.

La quantification du protéome à très haute sensibilitée n’est actuellement pas réalisable, et est un problème pour l’analyse de cellule isolée, d’échantillon rare ou pour la détection de protéine de faible abondance. Afin d’améliorer la sensibilité, une idée est d’utiliser un microscope capable de détecter des protéines individuellement. Il faut pour cela dans un premier temps mesurer la proportion du protéome actuellement marquée par une sonde fluorescente afin de pouvoir faire des mesures quantitatives. Avec des conditions dénaturantes et la détection des amines, on arrive à marquer jusqu’à 75% du protéome d’un lysat cellulaire, avec un marquage plus efficace quand la protéine est de grande taille. Dans un deuxième temps, il faut séparer par la taille le protéome afin de réaliser un profil protéique. Si la puce microfluidique ne permet pas la réalisation d’un profil avec une résolution, le micro SDS-PAGE en est capable en permettant également l’observation du profil par microscopie, autorisant la détection jusqu’à 10 ng de protéines par bande et ainsi permettant d'obtenir un profil à partir de seulement 100 cellules. Cette sensibilité a permis l’identification de quatre lignées cellulaires de cancer du sein, avec un fort potentiel pour une application pour le diagnostic de cellule cancéreuse provenant de petite biopsie, plus facile pour le patient. / Proteomic quantification at very high sensitivity is not achieved yet, even if they are a need to realize this quantification for the analysis of uncommon samples at a single cell level, or for the detection of low abundance protein. To improve this sensitivity, one way is to use a microscope able to detect single-molecule. In this optic, the first step to enable precise quantification is to measure the proportion of the proteome that is labeled by a fluorescent probe. When using strong denaturant conditions combined with a probe able to detect the amine of the protein, we are able to label up to 75% of the proteome from a cell lysate, with an increase in the labeling efficiency when the protein is bigger. The second step necessitates the protein separation by size in order to realize a proteome profile. Two technics were used for that, the microfluidic chip and the micro SDS-PAGE. The second one enables the possibility to scan the profile by microscopy, allowing the detection of up 10 ng of protein and then permits the analysis of only 100 cells. This sensitivity enables the differentiation of 4 different proteome profiles from cell lines originated from breast cancer, with a potential in the diagnostic of cancer cell from a smaller biopsy, allowing a less painful experience for the patient.

Au cours des prochaines décennies, les besoins en bois vont entraîner une pression considérable sur la production forestière. Pour le Douglas (Pseudotsuga menziesii), deuxième essence utilisée pour le reboisement des forêts françaises, le développement et la diffusion de variétés améliorées par sélection classique est lente. Chez les conifères l’embryogenèse somatique, méthode de multiplication végétative la plus performante, a été développée avec succès. Cependant elle n’est obtenue à ce jour qu’à partir de matériel juvénile (graines) malgré les nombreux travaux engagés. Les objectifs de ce travail de thèse ont été de 1) caractériser à différentes échelles l’aptitude à l’embryogenèse somatique en comparant des masses embryogènes (ME) et des cals non-embryogènes (NE) isogéniques, 2) caractériser les marqueurs responsables de la variation du potentiel embryogène en comparant aux niveaux cellulaire et moléculaire, les ME primaires à des ME secondaires et tertiaires obtenues lors de la ré initiation de l’embryogenèse somatique à partir d’ES cotylédonaires. 1) Pour le premier objectif, nous avons rapproché des données de protéomique et de transcriptomique, que nous avons complétées par des observations biologiques (potentiel embryogène), histologiques, et biochimiques (teneur en eau, glucides, régulateurs de croissance). Nous avons observé chez les ME une surexpression des marqueurs impliqués dans la différenciation (hormones, facteurs de transcription) et la division cellulaire (évènements de mitose, teneur en glucides, information génétique). Nous avons retrouvé certains facteurs de transcription marqueurs de l’embryogenèse somatique : WOX, LEC1, SERK1, BBM. En comparaison, les NE sont caractérisés par la réponse aux stimuli (ABA, phénols, protection contre les ROS), mais aussi par le stockage de réserves carbonées (amidon). 2) Le potentiel embryogène des ME secondaires et tertiaires augmente significativement. Au niveau cellulaire, cela se traduit par une amélioration de la structuration des ES (diminution de centres polyembryogènes au profit d’ES isolés). Le rapprochement des données de protéomique et de transcriptomique ont mis en évidence que lors de cette reprogrammation cellulaire il y a surexpression du métabolisme des protéines, oxydatif, et hormonal. La présence de facteurs de transcription associés à la maturation de l’ES (WRKY, NAC, ARF, ERF et MYB) surexprimés précocement pourrait aussi être une caractéristique ciblant un plus fort potentiel embryogène chez le Douglas. Nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de l’aptitude à l’embryogenèse somatique du Douglas. Ils pourraient permettre in fine d’initier l’embryogenèse somatique à partir de matériel âgé. / Résumé anglais non communiqué

Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire, responsable d'une infection cosmopolite très répandue, la toxoplasmose. Les différents schémas de traitement de la toxoplasmose reposent sur l'association de la pyriméthamine et d'un sulfamide qui agissent en synergie pour bloquer la voie de synthèse des folates. Cependant des échecs thérapeutiques ont été rapportés dans la littérature, et trois souches naturellement résistantes à la sulfadiazine, TgA 103001 (Type I), TgH 32006 (Type II) et TgH 32045 (Type II variant), ont été décrites. Notre travail a porté sur l'étude des mécanismes de résistance à la sulfadiazine chez T. gondii. Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l'implication des gènes cibles, dhps et dhfr, ainsi que les ABC transporteurs TgABC.B1, TgABC.B2, TgABC.C1 et TgABC.C2 dans la résistance à la sulfadiazine chez T. gondii. Cependant aucun polymorphisme ni surexpression de ces gènes n'a pu être relié aux mécanismes de résistance. Nous avons ensuite comparé les protéomes des souches naturellement résistantes aux protéomes des souches sensibles RH (Type I) et ME-49 (Type II) par DIGE. Parmi les 31 protéines différentiellement exprimées entre souches sensibles et résistantes, quatre protéines, ROP2, MIC2, ENO2 et IMC1, nous ont semblé intéressantes. Afin de s'affranchir des variations liées aux différences de fond génétique des souches, les souches sensibles RH et ME-49 ont été rendues résistantes in vitro à la sulfadiazine par pression médicamenteuse croissante, résistance validée in vitro grâce à la mise au point d'un nouveau test de chimiosensibilité. Nous avons ensuite, par 2-DE, comparé les protéomes des souches de type II sensible (ME-49), et résistantes (ME-49-RSDZ et TgH 32006) sans identifier le ou les candidat(s) impliqué(s) dans la résistance médicamenteuse. Cependant, l'analyse des souches ME-49 sensible et ME-49-RSDZ résistante, par microarrays, nous a permis d'identifier une cible appartenant à la voie de synthèse des folates : la folylpolyglutamate synthase. / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite responsible of a widespread infection, toxoplasmosis. Treatment options for toxoplasmosis are generally limited to combinations of sulfonamide and pyrimethamine which have a synergistic action on T. gondii folate synthesis by inhibiting two major enzymes: dihydropteroate synthase (DHPS) and dihydrofolate reductase (DHFR). However treatment failures have been reported, and three naturally sulfadiazine resistant strains, TgA 103001 (Type I), TgH 32006 (Type II) and TgH 32045 (Type II variant), have been described. In this work, we studied resistance mechanisms to sulfadiazine on T. gondii. We are interested, in a first time, on the involvement of target genes, dhps and dhfr, and ABC transporters, TgABC.B1, TgABC.B2, TgABC.C1 and TgABC.C2, in the sulfadiazine resistance on T. gondii. However, neither polymorphisms nor overexpression of these genes has been linked to resistance mechanisms. Then, we compared proteomes of naturally resistant strains to sensitive strains RH (Type I) and ME-49 (Type II) by DIGE. Among the 31 proteins differentially expressed between sensitive and resistant strains, four proteins, ROP2, MIC2, ENO2 and IMC1, seemed to be interesting. In order to avoid variations due to differences from genetic background, sensitive strains RH and ME-49 have been made resistant in vitro by gradual increase in sulfadiazine concentration. This resistance was checked in vitro by the development of a new chemosensitivity assay. We compared then, by 2-DE, proteomes of the type II strains, sensitive (ME-49) and resistant (ME-49-RSDZ and TgH 32006), without identifying candidates implicated in sulfadiazine resistance mechanisms. However, analysis of the sensitive strain ME-49 and the resistant strain ME-49-RSDZ, by microarrays, allowed us to identify a candidate belonging to folate synthesis pathways: folylpolyglutamate synthase.

Les nanomatériaux posent de nouvelles questions en termes de toxicologie humaine et environnementale et représentent une nouvelle interface avec le milieu biologique aux propriétés spécifiques. De nombreuses inconnues demeurent, en particulier à l’échelle moléculaire, pour permettre d’expliquer certains mécanismes de toxicité. Lorsqu’elles entrent en contact avec le milieu biologique, les nanoparticules se couvrent d’une couche de protéines adsorbées. Celle-ci leur confère une nouvelle « identité biologique » qui contrôle la réponse cellulaire et leur devenir au sein de l’organisme. Nous avons étudié l’adsorption de protéines modèles sur la silice nanostructurée. Après avoir caractérisé la silice nanoporeuse et les nanoparticules de silice utilisées, l’adsorption de la myoglobine, de l’hémoglobine et des protéines d’un extrait cellulaire de levure a été étudiée afin de déterminer les paramètres physico-chimiques et thermodynamiques de l’adsorption des protéines sur la silice. Un enrichissement en résidus basiques, regroupés en clusters de charge, favorise l’adsorption des protéines grâce à la formation d’interactions électrostatiques avec la surface chargée de la silice, indépendamment de la charge globale de la protéine. A l’inverse, un enrichissement en résidus aromatiques est défavorable à l’adsorption car ces résidus forment des interactions π-π qui rigidifient la structure de la protéine. L’identification des protéines adsorbées et non adsorbées à partir d’un milieu complexe pourrait également être utilisée pour les études de toxicité cellulaire. A partir de l’étude de la structure, de la dynamique et de l’activité de la myoglobine et de l’hémoglobine adsorbées sur les nanoparticules de silice, nous avons cherché à définir l’état d’une protéine adsorbée. L’étude de la structure, réalisée par dichroïsme circulaire, spectroscopie UV-visible, d’absorption X, infrarouge, fluorescence et microcalorimétrie, montre une perte partielle de structure importante des protéines adsorbées associée à une grande hétérogénéité de conformations, sans modification majeure de la structure de l’hème. Deux sites potentiels d’interaction entre myoglobine et nanoparticules de silice ont été identifiés à l’aide d’une technique de cartographie de surface par irradiation. L’étude de la dynamique de la myoglobine adsorbée par diffusion élastique et inélastique de neutrons a permis de montrer que l’adsorption s’accompagnait d’une diminution importante de la flexibilité de la protéine. Malgré la perte de structure, la metmyoglobine adsorbée conserve une activité de fixation de ligands très proche de celle de la protéine libre. L’hémoglobine adsorbée présente de façon inattendue une augmentation de son affinité pour l’oxygène et une diminution de sa coopérativité, sans dissociation du tétramère. Cet effet est reproductible lors de l’adsorption de l’hémoglobine humaine, de l’hémoglobine pontée DCL et de l’hémoglobine mutée S. Deux effecteurs permettent par ailleurs de moduler l’affinité de l’hémoglobine adsorbée. Aussi importantes soient-elles, les modifications de structure et d’activité observées sont entièrement réversibles après désorption dans des conditions douces. L’adsorption des hémoprotéines sur les nanoparticules de silice représente véritablement un nouveau type de stress avec résilience pour les protéines en termes de relations entre structure, dynamique et activité. / Nanomaterials raise new questions in environmental and human toxicology and represent a novel interface with specific properties with the biological medium. Several unknown remain to explain all the mechanisms of toxicity, especially at the molecular lever. When they enter the biological medium, nanoparticles get covered by a protein corona. This corona yields to a new “biological identity” that controls the cellular response to nanoparticles and their fate in the organism. We studied the adsorption of model proteins on nanostructured silica. The first part is dedicated to the characterization of nanoporous silica and silica nanoparticles that we used. Then the adsorption of myoglobin, hemoglobin and protein mixture from yeast cells was studied to determine the thermodynamic and physical-chemical parameters of protein adsorption on silica. The enrichment of basic residues, gathered in charge clusters, favors the adsorption of proteins by the formation of electrostatic interactions with the charged surface of silica, independently of the global charge of the protein. On the contrary, the enrichment in aromatic residues is unfavorable to protein adsorption because they form π-π interactions that rigidify the protein structure. The identification of adsorbed and non-adsorbed proteins from a complex medium could also be used for cellular toxicity studies. From the study of the structure, the dynamics and the activity of myoglobin and hemoglobin adsorbed on silica nanoparticles, we tried to define the state of an adsorbed protein. The structural study, based on circular dichroism, fluorescence, infrared, X-ray and UV-visible spectroscopy and microcalorimetry, shows a substantial partial structure loss of adsorbed proteins together with a high conformational heterogeneity, without major modifications of the heme structure. Two potential interaction sites of myoglobin with silica nanoparticles have been identified by a footprinting technique. The study of adsorbed myoglobin dynamics by elastic and inelastic neutron scattering highlighted the important decrease of protein dynamics that occurs upon adsorption. However, despite the structure loss, adsorbed metmyoglobin retains almost all of its activity of ligand binding. Unexpectedly, adsorbed hemoglobin shows an increase of its oxygen affinity and a decrease of its cooperativity, without any dissociation of the tetramer. This effect can be reproduced on human hemoglobin, cross-linked DCL hemoglobin and variant S hemoglobin. Besides, two effectors allow modulating the affinity of adsorbed hemoglobin. Despite the extent of structural and activity changes, all these modifications are entirely reversible upon desorption in soft conditions. The adsorption of hemoproteins on silica nanoparticles depicts a new sort of stress with resilience for proteins in terms of structure, dynamics and activity relationship.

L’objectif de ce projet était de comprendre comment l’expression du génome influence les caractères de qualité du foie gras, tels que le poids de foie, le taux de fonte et les teneurs, en lipides et protéines, et d’identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents. Afin de répondre à ces objectifs, nous avons dans un premier temps étudié l’expression différentielle de protéines selon les phénotypes des foies des canards mulards puis dans un second temps, nous avons entrepris d’identifier des QTL phénotypiques et protéiques (pQTL) à l’aide d’une nouvelle carte génétique composée de marqueurs SNP et microsatellites. Tout d’abord, une optimisation du dispositif expérimental a été entreprise : 3 famille F1, composées de 98 canes backcross et de leurs 294 fils mulards ont été sélectionnés pour leur contribution à des QTL existants liés à la qualité du foie gras. La première approche nous a permis de montrer que les foies ont des profils protéiques et métaboliques différents selon leur phénotype. Ainsi, les foies légers qui fondent peu, avec une faible teneur en lipides mais une forte teneur en protéines présentent un processus anabolique par la surexpression de protéines impliquées dans les métabolismes lipidiques, glucidiques, de synthèse. Au contraire, les foies lourds, fondant beaucoup, avec une forte teneur en lipides mais une faible teneur en protéines présentent des mécanismes de cytoprotection et de réponse au stress. La seconde approche nous a permis de mettre en évidence 30 QTL relatifs à des phénotypes de qualité du foie gras et 50 pQTL relatifs à différentes protéines. Sept chromosomes se démarquent par la ségrégation de plusieurs QTL et pQTL permettant d’émettre des hypothèses quant aux fonctions des gènes sous-jacents à ces QTL. Entre autres, le locus d’APL15 semble lié à la glycolyse et celui d’APL18 à des processus de survie cellulaire. L’ensemble de ces résultats permet ainsi non seulement d’identifier les voies métaboliques impliquées dans la qualité du foie, mais également d’établir un lien entre les caractères, les protéines et les loci des QTL suggérant un déterminisme génétique de ces voies métaboliques impliquées. Ces relations nécessitent d’être approfondies afin de préciser les processus et les gènes impliqués dans la qualité du foie gras. / The aim of this project was to understand how the genome expression influences liver quality traits such as liver weight, melting rate, lipid and protein rates, and to identify the molecular mechanisms underlying it. First, we studied the differential expression of proteins according to liver quality traits of mule ducks. Then we carried out detections of uni-trait and multi-traits phenotypic QTL and protein QTL using a new genetic map containing SNP and microsatellite markers. In preamble to the study, the optimization of the experimental disposal was necessary: 98 backcross dams and their 294 mule sons, composing 3 F1 families were selected because of their contribution to the likelihood of existing QTL related to foie gras quality. The first study showed that livers presented different protein and metabolic profiles according to their phenotypes. Indeed, light livers, with low melting rate, low lipid rate and high protein rate show an over-expression of proteins involved in lipid, glucid or in synthesis metabolism, suggesting an anabolism process. On the contrary, heavy livers, with high melting rate, high lipid rate and low protein rate show cytoprotection and response to stress mechanisms. The second study highlighted 30 QTL related to liver quality traits and 50 pQTL related to different proteins. In particular, 7 chromosomes segregated several QTL and pQTL, permitting to assess hypothesis on the functions of the genes underlying these QTL regions. As an example, the APL15 locus seems linked to glycolysis and the APL18 one seems linked to cell survival ones. All these results helped in identifying metabolic pathways implicated in liver quality as well as establishing a link between traits, proteins and the QTL loci, suggesting a genetic determinism of these pathways. These relationships need to be further studied in order to bring precision to the process and to determine more precisely the genes implicated in the foie gras quality traits.

Les stratégies de protéomique quantitative sans marquage sont très attractives dans le domaine de la recherche de biomarqueurs de pathologies. Cependant, elles requièrent une pleine maîtrise du schéma analytique et de sa répétabilité. Plus particulièrement, la préparation d’échantillons nécessite d’être suffisamment répétable pour ne pas impacter la qualité et la fiabilité des résultats. Les objectifs de cette thèse étaient de développer et d’optimiser des méthodes analytiques pour la protéomique quantitative, en particulier pour l’étape de préparation d’échantillons. Ainsi, un protocole innovant, simple, rapide et permettant l’analyse quantitative sans marquage d’un grand nombre d’échantillons avec une haute répétabilité a été développé et optimisé : le « Tube-Gel ». Par ailleurs, des préparations d’échantillons adaptées à différentes matrices biologiques pour la recherche de biomarqueurs ont été élaborées. Les méthodes mises au point et leur application ont permis de proposer des candidats biomarqueurs pour plusieurs pathologies : le glioblastome, les lymphomes B diffus à grandes cellules, et les complications survenant sur les greffons rénaux. / Label-free quantitative proteomics strategies are very attractive for diseases biomarkers researches. These approaches require the full control and the repeatability of the analytical workflow. In particular, the sample preparation has to be repeatable enough to ensure the quality and reliability of the results. Objectives of this work were to optimize and develop analytical methods for quantitative proteomics, with a special focus on the sample preparation step. Thus, an innovative, easy and fast protocol allowing the analysis of high sample numbers with high repeatability was developed and further optimized: the “Tube-Gel” protocol. Besides,sample preparations adapted to a variety of biological matrices were developed for the search of biomarkers. The developed methods and their application allowed the identification of potential biomarkers for a variety of diseases: glioblastoma, diffuse large B-cell lymphomas and renal transplants failures.

La maladie de Wilson est une atteinte génétique rare associée à des mutations du gène codant pour l’ATP7B, protéine de transport et d’excrétion du cuivre dans l’organisme, entrainant une accumulation toxique de cuivre dans l’organisme au niveau du foie et du cerveau. La difficulté d’établir une corrélation génotype-phénotype et la grande hétérogénéité du tableau clinique conduisent à des difficultés de prise en charge, notamment concernant le diagnostic et le suivi biologique et thérapeutique des patients. Dans cette étude, nous avons orienté nos recherches vers la découverte et l’évaluation de candidats biomarqueurs de diagnostics et de pronostics précoce de l’évolution vers des formes neurologiques de la maladie. L’accessibilité au modèle préclinique murin Atp7b-/- nous a permis d’engager une étude préclinique permettant dans un premier temps d’optimiser la partie expérimentale pour l’identification la plus fiable de nouveaux candidats biomarqueurs plasmatiques. Cette étude a permis l’identification d’un panel de 7 candidats biomarqueurs. Ces résultats nous ont permis de susciter l’intérêt des équipes médicales du Centre National de Référence Wilson (CNR) à Lyon et à Paris et d’engager une étroite collaboration pour débuter l’étude clinique. L’obtention d’une première cohorte d’échantillons plasmatiques provenant de patients atteints de la maladie de Wilson a permis d’évaluer la valeur translationnelle et clinique des candidats biomarqueurs identifiés et de débuter l’étude clinique d’exploration du protéome plasmatique de patients atteints de la maladie de Wilson. En outre, la compréhension des mécanismes moléculaires associés au développement de la physiopathologie hépatique a été étudiée et a permis de mettre en évidence de nouvelles cibles pour, à terme, améliorer la prise en charge clinique des patients atteints de la maladie de Wilson. / Wilson’s disease is a rare genetic disorder triggered by mutations in the ATP7B gene, which encodes a transport protein involved in copper transport and excretion, triggering toxic copper overloads in the liver and the brain. The lack of genotype-phenotype correlation and phenotype variability lead to clinical care difficulties, especially for the diagnosis and biological follow up of patients. In this study, we initiated the discovery and evaluation of biomarker candidates for the diagnosis of Wilson’s disease and for early prognosis towards neurological manifestation. With the availability of the Atp7b-/- mice model, we engaged a preclinical study leading to the qualification of a panel of 7 biomarker candidates. These results allowed us to raise the interest of the National Reference Center for Wilson’s disease (CNR) medical teams in Lyon and Paris and to engage a close collaboration to initiate clinical study. Using a first plasma cohort from Wilson’s disease patients, we assessed the translational and clinical value of the 7 biomarker candidates and engage discovery study on patients’ plasma samples. Furthermore, we also studied the molecular mechanisms involved in liver pathophysiology using the Atp7b-/- mice model using discovery proteomics. These investigations led to the identification of a new potential therapeutic target.

La microsporidie Encephalitozoon cuniculi, parasite intracellulaire obligatoire, pathogène de l'homme, est responsable d'infections opportunistes chez des sujets immunodéprimés. Sa spore est protégée par une épaisse paroi protéo-chitineuse pour laquelle peu de données sur les constituants protéiques sont disponibles. Dans ces travaux, nous avons décrit le protéome exprimé dans les stades tardifs de développement d'E. cuniculi. Grâce à des extractions protéiques séquentielles et une double stratégie d'analyse protéomique, après électrophorèse et "Shotgun", 177 protéines différentes ont pû être identifiées, permettant d'obtenir une vision globale de la physiologie de la spore. L'exploitation de ces données et le développement d'un crible bioinformatique a permis l'identification de 4 protéines de paroi. Le premier modèle dynamique de morphogenèse de la paroi microsporidienne a été proposé grâce au suivi de la localisation de ces protéines durant le cycle de développement

La spectrométrie de masse est une technique utilisée en protéomique pour identifier des protéines inconnues dans un échantillon. Le spectromètre mesure la masse de fragments de la protéine et fournit ainsi des spectres expérimentaux qui sont des représentations, sous forme de séries de pics, de la présence de ces différents fragments. En étudiant ces spectres, nous espérons pouvoir identifier la protéine d'origine en la retrouvant dans une banque. L'objectif de cette thèse est de proposer de nouvelles méthodes permettant d'étudier ces spectres. Cependant, ces méthodes doivent fonctionner sur des organismes non séquencés. Dans ce cas particulier, nous ne retrouverons pas exactement ces protéines dans la banque, mais uniquement des protéines qui y ressemblent. Nous proposons tout d'abord un nouvel algorithme dit de comparaison de spectres : PacketSpectralAlignment. Cet algorithme permet de comparer des spectres expérimentaux à des spectres créés à partir des données contenues dans la banque, et ce, même en présence de modifications. Cette comparaison permet l'association de chacun des spectres à un peptide de cette banque. Ensuite, nous détaillerons différents prétraitements et filtrages permettant d'améliorer l'exploitation de notre nouvel algorithme. Tous ces éléments sont intégrés dans une plate-forme intitulé SIFpackets. Enfin, nous validons les résultats de PacketSpectralAlignment ainsi que de SIFpackets sur différents jeux de données réelles.