La protéine p76 (« hypothetical protein LOC196463 ») a été identifiée au laboratoire lors d'une analyse protéomique ciblant les protéines mannose-6-phosphate de lignées cellulaires humaines U937 et MCF7. Ce rapport de thèse présente l'étude de cette protéine concernant certaines de ses caractéristiques biochimiques, sa localisation intracellulaire et l'approche de sa fonction. Ainsi, nous avons mis en évidence la présence de 6 N-glycosylations, ainsi que la présence effective de sucres mannose-6-phosphate. Une maturation protéolytique des précurseurs de la forme humaine et murine de p76 a été observée ; les chaînes issues de ces clivages ont été en partie caractérisées à l'aide des anticorps développés au laboratoire. L'étude de sa localisation intracellulaire par immunofluorescence et par fractionnements subcellulaires réalisés sur du foie de souris indique clairement que p76 est localisée dans les lysosomes. Enfin, p76 ayant une homologie de séquence avec une phospholipase B nouvellement caractérisée de Dictyostelium discoideum, des tests fonctionnels ont été mis en œuvre pour détecter une telle activité pour la protéine recombinante hp76-myc, mais sans succès. En revanche, une expérience de fat blot a montré que hp76-myc se lie à la cardiolipine, un phospholipide particulier des membranes mitochondriales et bactériennes.

En France la prise en charge des grandes douleurs fait toute sa place à la morphine. Cependant la prise prolongée de morphine entraîne la tolérance et la dépendance. Une stratégie de protéomique différentielle a été entreprise afin d'identifier les adaptations cellulaires à un traitement par la drogue dans des cellules SH-SY5Y. Nous avons montré, notamment, qu'un traitement chronique entraîne la dégradation par le protéasome des protéines Gbeta et Ggamma2. Aussi, le niveau de dégradation de Gbeta est corrélé avec le niveau de sensibilisation de l'adénylyl cyclase (AC), phénomène impliqué dans la dépendance à la morphine. Globalement, l'analyse protéomique a permis de détecter environ 50 protéines et une centaine de phosphoprotéines modulées par la drogue. Mes travaux ont permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire responsable de la sensibilisation de l'AC et surtout suggèrent pour la première fois que le protéasome est impliqué dans les effets chroniques de la morphine.

Une analyse protéomique de la fraction membranaire d'un échantillon foie de rat fortement enrichi en lysosomes a mené à la découverte de l'Onzin parmi les protéines les plus abondantes. Nous avons montré que cette petite protéine riche en cystéines et fortement conservée entre différentes espèces est majoritairement présente dans les organes lymphoïdes et dans le tube digestif. La distribution intracellulaire de l'Onzin dans le foie de souris a été étudiée par des techniques de centrifugation, notamment en induisant in vivo par différentes substances (invertase de levure, Triton WR-1339 et billes de latex) le changement de la densité des lysosomes et des phagosomes. Nous déduisons de ces expériences que l'Onzin est associée à un compartiment de la voie endocytaire en relation dynamique avec le lysosome des cellules de Kupffer. Ces résultats ont également été confirmés et précisés par des approches biochimiques et morphologiques en utilisant des macrophages péritonéaux de souris.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les Systèmes d'Information Scientifique (SIS) sont des Systèmes d'Information (SI) dont le but est de produire de la connaissance et non pas de gérer ou contrôler une activité de production de biens ou de services comme les SI d'entreprise. Les SIS se caractérisent par des domaines de recherche fortement collaboratifs impliquant des équipes pluridisciplinaires et le plus souvent géographiquement éloignées, ils manipulent des données aux structures très variables dans le temps qui vont au-delà de la simple hétérogénéité : nuages de points issus de scanner 3D, modèles numériques de terrain, cartographie, publications, données issues de spectromètre de masse ou de technique de thermoluminescence, données attributaires en très grand volume, etc. Ainsi, contrairement aux bases de données d'entreprise qui sont modélisées avec des structures établies par l'activité qu'elles supportent, les données scientifiques ne peuvent pas se contenter de schémas de données pré-definis puisque la structure des données évolue rapidement de concert avec l'évolution de la connaissance. La gestion de données scientifiques nécessite une architecture de SIS ayant un niveau d'extensibilité plus élevé que dans un SI d'entreprise. Afin de supporter l'extensibilité tout en contrôlant la qualité des données mais aussi l'interopérabilité, nous proposons une architecture de SIS reposant sur : - des données référentielles fortement structurées, identifiables lors de la phase d'analyse et amenées à évoluer rarement ; - des données complémentaires multi-modèles (matricielles, cartographiques, nuages de points 3D, documentaires, etc.). Pour établir les liens entre les données complémentaires et les données référentielles, nous avons utilisé un unique paradigme, l'annotation sémantique. Nous avons proposé un modèle formel d'annotation à base ontologique pour construire des annotations sémantiques dont la cohérence et la consistance peuvent être contrôlées par une ontologie et des règles. Dans ce cadre, les annotations offrent ainsi une contextualisation des données qui permet de vérifier leur cohérence, par rapport à la connaissance du domaine. Nous avons dressé les grandes lignes d'une sémantique du processus d'annotation par analogie avec la sémantique des langages de programmation. Nous avons validé notre proposition, à travers deux collaborations pluridisciplinaires : - le projet ANR CARE (Corpus Architecturae Religiosae Europeae - IV-X saec. ANR-07- CORP-011) dans le domaine de l'archéologie. Son objectif était de développer un corpus numérique de documents multimédia sur l'évolution des monuments religieux du IVe au XIe siècle (http://care.tge-adonis.fr). Un assistant d'annotation a été développé pour assurer la qualité des annotations par rapport à la connaissance représentée dans l'ontologie. Ce projet a donné lieu au développement d'une extension sémantique pour MediaWiki ; - le projet eClims dans le domaine de la protéomique clinique. eClims est un composant clinique d'un LIMS (Laboratory Information Management System) développé pour la plate-forme de protéomique CLIPP. eClims met en oeuvre un outil d'intégration basé sur le couplage entre des modèles représentant les sources et le système protéomique, et des ontologies utilisées comme médiatrices entre ces derniers. Les différents contrôles que nous mettons en place garantissent la validité des domaines de valeurs, la complétude, la consistance des données et leur cohérence. Le stockage des annotations est assuré par une Base de Données orientées colonnes associée à une Base de Données relationnelles.

Afin de mieux comprendre les mécanismes du trafic cellulaire, les processus de transport des substrats vacuolaires à travers le tonoplaste, le stockage des métabolites et leur dégradation, une analyse globale et exhaustive du protéome vacuolaire d'Arabidopsis thaliana a été réalisée. La connaissance de la localisation subcellulaire des protéines permet de mieux comprendre la fonction des organelles et la compartimentation du métabolisme des plantes. Mais la description précise du protéome d'un organite nécessite d'identifier clairement les véritables protéines résidantes du compartiment étudié. Une tâche si précise est complexe puisqu'elle nécessite la mise en place d'une préparation d'organites purs et homogènes. Pour y parvenir, un protocole de purification de vacuoles à partir de protoplastes isolés de cellules en culture sur un gradient de densité de Ficoll a été amélioré. La combinaison de plusieurs approches de protéomique a permis d'identifier les protéines présentes dans les fractions vacuolaires soluble et membranaire de façon quantitative et fonctionnelle. Les différentes approches ont ainsi mis en évidence des associations et mécanismes moléculaires complexes qui régissent les différentes activités vacuolaires. Cette protéothèque de référence constitue une base pour étudier la dynamique du protéome vacuolaire en réponse à plusieurs stress incluant les métaux lourds. Plusieurs méthodes sans a priori et ciblée ont été proposé afin d'étudier l'impact du cadmium sur la vacuole, ce compartiment cellulaire clé de la détoxication.

La variabilité non maîtrisée de la tendreté de la viande bovine est un problème majeur pour la filière industrielle, cette qualité étant très recherchée par les consommateurs. Depuis de nombreuses années, différents programmes de recherche ont identifié des marqueurs ADN, ARN et protéines de la tendreté de la viande bovine, dans des contextes différents. Aux Etats-Unis et en Australie, des recherches ont abouti à la conception de tests efficaces de prédiction de la qualité de la viande. Ces tests ne fonctionnent cependant pas sur les élevages français. La filière française est donc demandeuse de tests de prédiction simples permettant de mesurer la tendreté sur l'animal vivant et la carcasse. De tels tests sont inexistants à l'heure actuelle. L'objectif de la thèse est de valider ou non une liste de potentiels marqueurs protéiques de la tendreté, et de développer des équations de prédiction de cette qualité, afin d'envisager la conception de tests immunologiques de prédiction à destination de la filière sur l'animal vivant et la carcasse, dans un avenir proche. Une nouvelle technique pour quantifier les protéines d'un échantillon de muscle bovin a été développée, le Dot-Blot, et permet de disposer de prototype pour de futurs tests de phénotypage de la tendreté. L'utilisation de cette technique a permis de quantifier 24 protéines sur 111 échantillons de deux muscles de boeufs et de taurillons de race Charolaise. Ces travaux ont identifié en premier lieux des effets biologiques liés au type de muscle et d'animal sur l'abondance des protéines. Puis, trois analyses différentes, dont les résultats sont concordants, ont validé des marqueurs de tendreté et mis en lumière les principaux mécanismes cellulaires impliqués dans la tendreté, générant des équations de prédiction de la tendreté. Des outils de bioinformatique ont été construits à partir de données expérimentales de la thèse sur les protéines de la tendreté et de bases de données humaines, afin de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la mise en place de la tendreté. En conclusion, ce travail de thèse a développé un nouvel outil d'analyse et les premières équations de prédiction de la tendreté de la viande bovine fiables sur un système centré sur les mâles, supports indispensables au développement de tests de prédiction de la tendreté sur l'animal vivant et la carcasse. De plus, ce travail a permis de mieux comprendre et caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place de la tendreté.

La détection et l'identification des protéines sur gel d'électrophorèse dépend aussi bien du marqueur des protéines utilisés (généralement un marqueur fluorescent) que de ses propriétés physicochimiques propres (rendement quantique, Stokes' shift et recouvrement des bandes d'absorption et d'émission, photoblanchiment), de sa stabilité (chimique et photochimique), et de son accessibilité. Créer une gamme de nouveaux fluorophores dont les propriétés physicochimiques peuvent être modulées en partant d'une structure bien connue et très avantageux dans l'optique d'anticiper les caractéristiques supposées des composées envisagés. Cependant, même si de nombreux fluorophores sont disponibles commercialement, ils souffrent généralement de différentes contraintes telles que leurs prix prohibitifs, leur manque de sensibilité, leur stockes' shift trop faible ou bien encore leur stabilité. L'accès à une famille de fluorophores résolvant l'ensemble de ces contraintes pour la détection de protéines sur gel d'électrophorèse représenterait donc un réel défi. L'épicocconone, isolée du champignon Epicoccocum Nigrum, se lie de façon covalente aux amines (et donc également aux protéines) en conduisant à un adduit énaminique qui est très fluorescent. Cet adduit émet dans le rouge (610 nm) lorsqu'irradié dans l'UV (395 nm) ou le visible (520 nm). Ces propriétés ont donc conduit à l'utilisation de ce produit naturel comme marqueur fluorescent de protéines sur gel d'électrophorèse menant à une sensibilité de détection rarement atteinte et à une gamme de linéarité très importante (104). La première synthèse de l'épicocconone a alors été engagée au sein de notre laboratoire. Elle a finalement conduit à une chimiothèque d'analogues encore plus efficace ayant permis d'établir une véritable relation structure-fluorescence.

La détection et l’identification de micro-organismes pathogènes est un réel enjeu de santé public tant au niveau alimentaire, que clinique ou d’intérêt national tel qu’illustré en biodéfense. Dans tous ces domaines, il est important d‘avoir des méthodes d’identification et de détection qui soient à la fois rapide, sensible et robuste. Cette thèse a pour objectif de contribuer au développement d’une approche rapide d’identification de micro-organismes sans a priori par spectrométrie de masse en tandem. Cette approche innovante, appelée phylopeptidomique, repose sur l’alliance de la peptidomique, i.e. analyse à large échelle des peptides provenant de la digestion enzymatique d’un échantillon biologique, et de la phylogénie des organismes cellulaires. Après extraction des protéines présentes dans l’échantillon à ausculter, des peptides sont générés et analysés par spectrométrie de masse en tandem. La déconvolution des signaux MS/MS à l’aide du logiciel « µOrg.ID » développé en propre au laboratoire permet d’identifier et quantifier les organismes présents dans l’échantillon en fonction des organismes indexés dans les bases de données. L’étude du protéome de Bacillus atrophaeus, agent simulant de l’anthrax, sous forme sporulée et végétative a permis d’illustrer une méthode d’identification de biomarqueurs protéiques permettant de déterminer le ratio entre les deux formes dans un échantillon. La limite de détection de la phylopeptidomique dans des échantillons purs et des échantillons en mélange équimolaire a été établie sur des bactéries modèles d’intérêts médical et environnemental. La limite de détection de spores de Bacillus atrophaeus en présence de 14 matrices interférentes (alimentaires, environnementales et autres) a permis de mettre en évidence les avantages et limitations de l’approche. Enfin, un mélange artificiel standardisé de 24 organismes a été développé afin d’évaluer les outils de bio-informatique en métaprotéomique. / The detection and identification of pathogenic microorganisms is a real public health issue for the food industry and the clinics or national interest as illustrated in the biodefense field. Thus, it is important to have identification and detection methods that are fast, sensitive and robust. This PhD thesis aims at contributing to the development of a rapid approach to identify microorganisms without any a priori by tandem mass spectrometry. This innovative approach, called phylopeptidomics, is based on the combination of peptidomics, i.e. large scale analysis of peptides derived from the enzymatic digestion of a biological sample, and the phylogeny of cellular organisms. After extraction of the proteins from the sample of interest, peptides are generated and analyzed by tandem mass spectrometry. The deconvolution of MS/MS signals using the "μOrg.ID" software developed in the laboratory enables the identification and quantification of organisms present in the sample according to the organisms indexed in generalist databases. The study of the proteome of Bacillus atrophaeus, a simulant agent of anthrax, in sporulated and vegetative form, has provided an illustration of a new method of identification of protein biomarkers, which allows determining the ratio between both forms. The limit of detection of phylopeptidomics in pure samples and equimolar mixtures was established with model bacteria of medical and environmental interests. The limit of detection of B. atrophaeus spores in the presence of 14 interfering matrices (food, environmental and others) has highlighted the advantages and limitations of the approach. Finally, a standardized artificial mixture of 24 organisms was developed in order to evaluate bioinformatics tools in metaproteomics.

En raison du vieillissement de la population, la maladie d’Alzheimer (MA) est devenue un problème majeur en santé public. Le dosage des biomarqueurs présents dans le liquide céphalorachidien (Ab 1-42, tau et hepcidine) étant de bons indicateurs précoces de l’apparition et de l’évolution de la MA, il paraît essentiel de disposer de mesures fiables. Etablir la traçabilité métrologique des résultats aux unités du système international par le biais de méthodes de référence primaires ou de matériaux de référence certifiés d’ordre supérieur est un moyen privilégié pour évaluer et améliorer la fiabilité et la comparabilité des résultats dans le temps et entre les laboratoires. Des méthodes de dosages par LC-MS/MS pour ces trois biomarqueurs ont été développées et validées. Pour le dosage de l’hepcidine, la pureté de l’étalon peptidique a fait l’objet d’une caractérisation approfondie par spectrométrie de masse haute résolution qui permettra de standardiser les dosages de routine à l’échelle internationale.Mots clés : Peptides b amyloïdes, Protéine tau, Hepcidine, Biomarqueurs, Protéomique Clinique, Traçabilité métrologique, Spectrométrie de masse / Due to the aging of population, Alzheimer’s disease (AD), is becoming a major public health concern. Measurement of biomarkers (Amyloid Beta, tau and hepcidin) in cerebrospinal fluid being early diagnostic indicators of AD, reliable measurements are needed to detect and quantify them accurately. Establishing metrological traceability of results to the International System of Units through primary reference methods or higher-order certified reference materials is a privileged mean to assess and improve results accuracy and comparability across laboratories. Assays for these three biomarkers were set up and validated by LC-MS/MS. The hepcidin standard was further characterized by high resolution mass spectrometry, paving the road toward standardization at the international scale of results.Key words : b amyloids peptides, Tau protein, Hepcidin, Biomarkers, Clinical proteomic, Metrological traceability, Mass spectrometry