Infektionen mit H. pylori führen zu Veränderungen im Aufbau und der zellulären Zusammensetzung des Magenepithels. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass Stromazellen, die sich in unmittelbarer Nähe der epithelialen Stammzelle befinden, die funktionelle Nische für dieses Kompartiment bilden und wichtige Faktoren für die Regulierung des Stammzellumsatzes und Differenzierung darstellen. Daher konzentriere ich mich bei dieser Arbeit auf die Rolle der Myh11+ Myofibroblasten, die sich sowohl unter als auch zwischen den Epitheldrüsenzellen befinden. Ich fand heraus, dass die Myofibroblasten in der Homöostase einen BMP-Gradienten entlang der Drüsenachse mit erhöhter Expression von Bmp2 im oberen Teil erzeugen, während die Drüsenbasis von Zellen umgeben ist, die Bmp-Inhibitoren produzieren. Basierend auf der Funktionsanalyse mit 3D-Organoidmodellen ist der Bmp-Signalweg ein zentraler Faktor für die rasche Differenzierung von Stammzellen in faveoläre mukusproduzierende Zellen. Darüber hinaus wurde ein auto-parakriner Signalweg gefunden, der zur Bildung von Bmp2 in Epithelzellen führt. Meine Untersuchungen Daten zeigten eine Verringerung des BMP-Signalwegs in H. pylori-infizierten Myofibroblasten. Darüber hinaus führte eine Infektion mit H. pylori nicht nur zum Verlust der stromalen, sondern auch der epithelialen Bmp2-Expression. Diese Beobachtung ging mit einer Zunahme von IFNγ einher, was auf eine Verbindung zwischen beiden Signalwegen hinwies. Tatsächlich zeigten anschließende Experimente mit Organoiden, dass IFNγ den Bmp-Signalweg hemmt und dadurch die terminale Differenzierung blockiert. Zusammenfassend zeigen meine Untersuchungen, dass das Schicksal einer Zelle, die zur Oberfläche der Magendrüse wandert, eine Induktion des BMP-Signalwegs erfährt. Die Reduktion dieses Signals durch IFNγ deutet auf einen Mechanismus hin, der Veränderungen in der zellulären Differenzierung und die Entwicklung von prämalignen epithelialen Läsionen im Verlauf einer H. pylori-Infektion bewirkt. / Infection with Helicobacter pylori (H. pylori) leads to alterations of the topology and cellular composition of the gastric epithelium. Recent studies have shown that stromal cells located in close proximity to the epithelial stem cell are creating the niche for this compartment and provide crucial factors that regulate stem cell turnover and fate decisions. Therefore, this thesis focuses on of Myh11+ myofibroblasts that are located beneath and between the epithelial gland cells. I found that during homeostasis, the myofibroblasts generate a BMP gradient along the gland axis with strong expression of Bmp2 in the upper part, whereas the base is surrounded by cells producing BMP inhibitors. Based on functional analysis with 3D organoid models, the BMP gradient occurs to be a main factor responsible for rapid differentiation of stem cells into pit surface mucous cells. Moreover, experiments led me to identify an auto-paracrine feed-forward BMP2 loop in epithelial cells, which further stabilizes BMP signaling once it is activated and induces terminal differentiation. Data presented in this study demonstrated a reduction of BMP signaling in H. pylori-infected myofibroblasts. Furthermore, infection with H. pylori resulted in loss of not only stromal, but also epithelial Bmp2 expression. This observation was accompanied with increase of Interferon γ (IFNγ), which indicated a link between both pathways. Consistently, stimulation of organoids with IFNγ impairs BMP signaling and the BMP2 feed-forward loop, and thereby blocks terminal differentiation. Together, this study shows that the fate of a cell migrating into the surface of the gastric gland is determined by an induction of BMP signaling and stabilized by an auto-paracrine BMP signaling enhancement. Reduction of this signaling by IFNγ revealed a mechanism which contributes to altered cellular differentiation and development of premalignant epithelial alterations in the context of H. pylori infection.

Diese Dissertation befasst sich mit den möglichen Folgen einer Kolonisation mit Helicobacter pylori (H. pylori) im Kindesalter. Von besonderem Interesse ist dabei die Entwicklung des Body-Mass-Index (BMI). Dazu werden die Daten einer populationsbezogenen Querschnittsstudie, welche 1998 und 2006 unter Leipziger Schulanfängern bzw. Achtklässlern durchgeführt wurde, analysiert. Insgesamt konnten 1349 bzw. 1161 Kinder, deren H. pylori-Status mittels 13C‑Harnstoff-Atemtest untersucht wurde, in die Untersuchung inkludiert werden. Dabei bestätigte sich, dass die Besiedlung mit H. pylori u.a. signifikant mit einem geringeren sozialen Status und einer geringeren Körpergröße der Kinder assoziiert ist. Der BMI der untersuchten Kinder unterscheidet sich jedoch nicht signifikant in Abhängigkeit von einer Kolonisation mit H. pylori. Auf diesen Ergebnissen basierend werden zwei Hypothesen diskutiert. Zum einen wird analysiert, inwieweit ein Einfluss einer Infektion mit dem Erreger auf den BMI der Kinder nicht sicher auszuschließen ist und dieser eventuell aufgrund der Komplexität der Gewichtsentwicklung in den Ergebnissen dieser Untersuchung nicht erkennbar ist. Zum anderen wird die geringere Körpergröße H. pylori‑besiedelter Kinder nicht auf mit der Infektion in Verbindung stehende Ernährungsstörungen in Zusammenhang gebracht, da sonst vor einer entscheidenden Größenminderung das Gewicht bzw. der BMI der Studienteilnehmer zurück bleiben müsste.

[ES] De entre los patógenos emergentes presentes en agua, las bacterias del género Helicobacter son de las más alarmantes, ya que se encuentran directamente relacionadas con el cáncer gástrico y hepatobiliar y su epidemiología aún no está clara. Se ha planteado que H. pylori puede ser adquirida por diferentes vías de transmisión, entre las que se destaca el agua. Se ha demostrado su capacidad de supervivencia frente a los tratamientos comunes de desinfección de aguas. Por todo ello, en esta tesis se ha investigado la presencia de células viables, y por tanto infectivas, de H. pylori en aguas potables y de riego, mediante la mejora y la optimización de técnicas de cultivo y moleculares. Este trabajo se inició con la búsqueda de un medio de cultivo óptimo. Se obtuvieron resultados muy positivos con el medio de cultivo Agar Dent con sulfato de polimixina B, independientemente del origen de la muestra. Seguidamente, se desarrolló un método de pre-tratamiento con Propidium Monoazide y PEMAXTM para la detección y cuantificación de células de H. pylori viables, por PCR. Se confirmó que el PMA a una concentración de 50 µM y un periodo de incubación de 5 minutos sería la metodología óptima de tratamiento antes del análisis mediante qPCR. A continuación, se analizaron 20 muestras de agua residual. Mediante la técnica de cultivo, fue posible la detección de 4 colonias sospechosas de Helicobacter spp. y H. pylori, cuya identificación fue confirmada mediante amplificación y posterior secuenciación. La técnica DVC-FISH indico la presencia de células viables de Helicobacter spp. en 15 (75%) de las muestras. Respecto a la detección de células de H. pylori, mediante DVC-FISH y FISH, estos microorganismos se observaron en 10 (50%) y 11 (55%) de las 20 muestras analizadas, respectivamente. La técnica qPCR determino la presencia de H. pylori en las muestras, con un porcentaje de detección del 60%. Finalmente, mediante metagenómica de secuenciación dirigida, se analizó el microbioma de 16 muestras de aguas residuales. Los filos dominantes de las muestras analizadas fueron Proteobacteria, seguido de Bacteroidetes y Firmicutes. H. pylori se detectó en 6 muestras de aguas residuales. Además, se detectaron otras especies de Helicobacter spp., como H. hepaticus, H. pullorum y H. suis. Igualmente, mediante PCR se identificó el gen cagA en 5 muestras de agua residual y una de agua potable. Respecto el genotipo vacAs1, se observó en 4 muestras de agua residual; el genotipo vacAm1, se identificó en una muestra de agua potable y 2 de agua de riego. En las biopelículas analizadas, 2 fueron positivas para el tipo vacAm1, y otros dos para el gen de resistencia pbp1A. Del mismo modo se analizaron 45 muestras de heces. No se observaron colonias sospechosas en Agar Dent selectivo. Mediante qPCR se evidenció H. pylori en 41 muestras (45,56%). Fue posible cuantificar 10 muestras directas y 18 enriquecidas, con concentraciones entre 3,39*103 y 2,61*103 UG/mL, las restantes presentaban niveles superiores al umbral de fiabilidad (>35 ciclos). Por DVC-FISH se observaron células viables de H. pylori en 26 (57,78%) de las 45 muestras directas. La identificación de mutaciones en el 23S rDNA, de la resistencia a la claritromicina, mostro que el 37,79% de las muestras de heces presentaban células de H. pylori potencialmente resistentes. Mediante secuenciación dirigida y posterior análisis bioinformático se identificó H. pylori en 13 muestras directas y 13 muestras enriquecidas, y otras especies como H. hepaticus y H. pullorum. Por último, se evaluó la capacidad de H. pylori para formar biopelículas y su resistencia frente a los tratamientos comunes de desinfección. Se analizaron 27 biopelículas procedentes del sistema de distribución de agua potable para detectar la presencia de H. pylori mediante qPCR. El porcentaje de detección fue del 23%, siendo posible la cuantificación en 5 muestras, con concentraciones entre 7,32*101 y 1,16*101 unidades genómicas/mL. Los resultados obtenidos en esta Tesis confirman la existencia de células viables de H. pylori y otros Helicobacter spp. en aguas residuales tras su tratamiento, lo que significa un riesgo potencial para la Salud Pública. De igual forma se demuesta su presencia en muestras de heces, proporcionando un punto de partida para el estudio del riesgo que puede suponer para el ser humano la trasmisión fecal-oral de estas especies. Este trabajo también demuestra la capacidad de H. pylori de formar biopelículas y su resistencia frente a tratamientos comunes de desinfección y confirma su existencia en sistemas de distribución de agua potable. / [CAT] D'entre tots els patògens emergents presents en aigua, els bacteris del gènere Helicobacter són dels més alarmants, ja que es troben directament relacionats amb el càncer gàstric i hepatobiliar i la seua epidemiologia encara no és clara. S'ha plantejat que H. pylori es pot transmetre per diferents vies de transmissió, entre les quals destaca l¿aigua. S'ha demostrat la seua capacitat de supervivència enfront dels tractaments comuns de desinfecció d'aigües. Per tant, en aquesta tesi s'ha investigat la presència de cèl·lules viables, i per tant infectives, d' H. pylori en aigües potables i de reg, mitjançant la millora i l'optimització de tècniques de cultiu i moleculars. Aquest treball es va iniciar amb la cerca d'un cultiu òptim. Es van obtenir resultats molt positius amb el mitjà de cultiu Agar Dent amb sulfat de polimixina B, independentment de l'origen de la mostra. Seguidament, es va desenvolupar un mètode de pretractament amb Propidium Monoazide i PEMAXTM per a la detecció i quantificació exclusiva de cèl·lules d' H. pylori viables per PCR. Es va confirmar que el PMA a una concentració de 50 µM i un període d'incubació de 5 minuts seria la metodologia òptima de tractament abans de l'anàlisi mitjançant qPCR. A continuació, es van analitzar 20 mostres d'aigua residual. Mitjançant la tècnica de cultiu, va ser possible la detecció de 4 colònies sospitoses d' Helicobacter spp. i H. pylori, la identificació de la qual va ser confirmada mitjançant amplificació i posterior seqüenciació. La tècnica DVC-FISH va demostrar la presència de cèl·lules viables d' Helicobacter spp. en 15 (75%) de les mostres, sense necessitat d'un pas previ d'enriquiment. Respecte a la detecció de cèl·lules d' H. pylori, mitjançant DVC-FISH i FISH, aquests microorganismes es van observar en 10 (50%) i 11 (55%) de les 20 mostres analitzades, respectivament. La tècnica qPCR determinà la presència d' H. pylori a les mostres amb un percentatge de detecció del 60%. Finalment, mitjançant metagenòmica de seqüenciació dirigida, es va analitzar el microbioma de 16 mostres d'aigües residuals. Els talls dominants de les mostres analitzades van ser Proteobacteria, seguit de Bacteroidetes i Firmicutes. H. pylori es va detectar mitjançant aquesta tècnica en 6 mostres d'aigües residuals. A més, es van detectar altres espècies d' Helicobacter spp., com H. hepaticus, H. pullorum i H. suis. Igualment mediant PCR es va identificar el gen cagA en 5 mostres d'aigua residual i una d'aigua potable. Respecte al genotip vacAs1, es va observar en 4 mostres d'aigua residual; el genotip vacAm1, es va identificar en una mostra d'aigua potable i 2 d'aigua de reg. En les biopel·lícules analitzades, 2 van ser positives per al tipus vacAm1, i altres dos per al gen de resistència pbp1A. De la mateixa manera es van analitzar 45 mostres de femta. No es van observar colònies sospitoses en Agar Dent selectiu. Mitjançant la tècnica qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori en 41 mostres (45,56%). Va ser possible quantificar 10 mostres directes i 18 enriquides, amb concentracions d'entre 3,39*103 i 2,61*103 UG/ml, les restants presentaven nivells per damunt del llindar de fiabilitat (>35 cicles). Mitjançant DVC-FISH es van observar cèl·lules viables d' H. pylori en 26 (57,78%) de les 45 mostres directes. La detecció de mutacions en el 23S rDNA, específiques de la resistència a la claritromicina, va indicar que el 37,79% de les mostres de femta presentaven cèl·lules d' H. pylori potencialment resistents. Mitjançant seqüenciació dirigida i posterior anàlisi bioinformàtica es va identificar H. pylori en 13 mostres directes i 13 mostres enriquides, i altres espècies com H. hepaticus i H. pullorum. Finalment, es va avaluar la capacitat d' H. pylori per a formar biopel·lícules i la seua resistència enfront dels tractaments comuns de desinfecció. Es van analitzar 27 biopel·lícules procedents del sistema de distribució d'aigua potable per a detectar la presència d' H. pylori mitjançant qPCR. El percentatge de detecció va ser del 23%, sent possible la quantificació en 5 mostres corresponents a concentracions d’entre 7,32*101 i 1,16*101 unitats genòmiques/ml. Els resultats obtinguts en aquesta Tesi confirmen la presència de cèl·lules viables d' H. pylori i altres Helicobacter spp. en aigües residuals després del seu tractament, la qual cosa suposa un risc potencial per a la Salut Pública. D'igual forma, s'evidencia la seua presència en mostres de femta, proporcionant un punt de partida per a l'estudi del risc que la transmissió fecal-oral d'aquestes espècies pugui suposar per als humans. Aquest treball també demostra la capacitat d' H. pylori de formar biopel·lícules i la seua resistència enfront als tractaments comuns de desinfecció, i confirma la seua presència en sistemes de distribució d'aigua potable. / [EN] Among all the emergent pathogens in water, bacteria of the Helicobacter genus are among the most disturbing, as they are directly related to gastric and hepatobiliary cancer and their epidemiology is still unclear. It has been suggested that H. pylori can be acquired through different transmission routes, among which water stands out. Its ability to survive against common water disinfection treatments has been demonstrated. In addition, H. pylori can form insoluble biofilms, which favors its resistance to the different disinfection and potabilization treatments. Therefore, in this thesis has investigated the presence of viable cells, and therefore potentially infective, of H. pylori in drinking and irrigation waters, through the improvement and optimization of culture and molecular techniques. This work began with the development of an optimal culture medium. Positive results were obtained with the culture medium Agar Dent with polymyxin B sulfate. Subsequently, a pretreatment method with Propidium Monoazide and PEMAXTM was developed for the exclusive detection and quantification of viable H. pylori cells by PCR. It was confirmed that PMA at a concentration of 50 µM and an incubation period of 5 minutes, would be the optimal treatment methodology before analysis by qPCR. A total of 20 wastewater samples, aseptically collected at the outlet of the biological reactor and after disinfection treatment, were then analyzed. Using the culture technique, it was possible to detect 4 suspicious colonies of Helicobacter spp. and H. pylori, whose identification was confirmed by amplification and subsequent sequencing. DVC-FISH technique demonstrated the presence of viable Helicobacter spp. cells in 15 (75%) of the samples. Regarding the detection of H. pylori cells, by DVC-FISH and FISH, these microorganisms were observed in 10 (50%) and 11 (55%) of the 20 samples analyzed, respectively. The qPCR technique determined the presence of H. pylori in the samples with a detection rate of 60%. Finally, using deep-amplicon sequencing, the microbiome of 16 wastewater samples was analyzed. The dominant phylum in the samples analyzed were Proteobacteria, followed by Bacteroidetes and Firmicutes. H. pylori was detected by this technique in 6 wastewater samples. In addition, others Helicobacter spp., such as H. hepaticus, H. pullorum and H. suis were detected. PCR technique was used to identify the cagA gene in 5 wastewater samples and one drinking water sample. Regarding the vacAs1 genotype, it was observed in 4 samples of wastewater; the vacAm1 genotype, was identified in one drinking water sample and 2 irrigation water samples. In the biofilms analyzed, 2 were positive for the vacAm1 type, and two for the resistance gene pbp1A. Likewise, 45 stool samples were analyzed. No suspicious colonies were observed on selective Dent Agar. The qPCR technique demonstrated the presence of H. pylori in 41 samples (45.56%). It was possible to quantify 10 direct samples and 18 enriched samples, with concentrations between 3.39*103 and 2.61*103 GU/mL, the remaining samples had levels above the reliability threshold (>35 cycles). DVC-FISH showed viable H. pylori cells in 26 (57.78%) of the 45 direct samples. Detection of 23S rDNA mutations specific for clarithromycin resistance indicated that 37.79% of stool samples had potentially resistant H. pylori cells. Through Deep-amplicon sequencing and subsequent bioinformatics analysis, H. pylori was identified in 13 direct samples and 13 enriched samples, as well as other species such as H. hepaticus and H. pullorum. Finally, the ability of H. pylori to form biofilms and their resistance to common disinfection treatments was evaluated. Twenty-seven biofilms from the drinking water distribution system were also tested for the presence of H. pylori by qPCR. The detection rate was 23%, being possible the quantification in 5 samples corresponding to concentrations between 7.32*101 and 1.16*101 GU/mL. / Esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a las ayudas de carácter predoctoral: “Ayuda de conselleria para la contratación de personal investigador en formación -Irene Hortelano Martin (determinación del riesgo para el consumidor de la presencia de H. pylori y otros helicobacters patógenos en aguas de consumo mediante técnicas moleculares y metagenómica) (ACIF/2016/150) Generalitat Valenciana (2016-2019). Y a la financiación de los proyectos: “Helicobacter pylori y otros helicobacters patógenos en aguas y alimento: Desarrollo y aplicación de herramientas moleculares dirigidas a la evaluación del riesgo para el consumidor (REF. AGL2014-53875-R)”. Ministerio de Economía y Competitividad, España. “Determinación del riesgo para la salud pública debido a la presencia de H. pylori en agua y alimentos: Detección (AICO/2018/273)”. Generalitat Valenciana (2018-2020). / Hortelano Martín, I. (2021). Determinación del riesgo para el consumidor de la presencia de H. pylori y otros Helicobacter spp. patógenos en aguas de consumo mediante técnicas moleculares y metagenómica [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/178942 / TESIS

Objetivo: Determinar la frecuencia de Helicobacter pylori en muestras histopatológicas gástricas malignas y premalignas del servicio de anatomía patológica del Hospital Regional Lambayeque durante los años 2016 al 2019. Material y métodos. Estudio censal, observacional descriptivo, retrospectivo y transversal. La población de estudio estuvo conformada por los pacientes cuyas muestras histológicas gástricas fueron recibidas y estudiadas en el servicio de anatomía patológica del Hospital Regional Lambayeque. Resultados. Cumplieron con los criterios de selección 566 pacientes. La edad media fue 57,3; rango de 8 a 97 años. Hubo un predominio de pacientes entre la quinta (23.9%), sexta (24%) y séptima (17%) década de la vida. La frecuencia global de Helicobacter Pylori en las muestras seleccionadas fueron de 70.5%, con un predominio en el sexo masculino (71.2%). Los hallazgos anatomopatológicos se distribuyeron de la siguiente manera: 147 pacientes (26%) con gastritis crónica atrófica (GCA), 333 (58.8%) con metaplasia intestinal (MI), 60 (10.6%) con displasia y 26 (4.6%) con cáncer gástrico. Metaplasia intestinal fue el hallazgo más común; el mismo que se encontró en 166 personas (49.85%) con MI completa, 73 (21.92%) con MI incompleta y 94 (28.22%) con MI mixta. Conclusiones La frecuencia de Helicobacter Pylori (HP) fue alta en las lesiones premalignas, mientras que no hubo diferencias en la presencia o ausencia en muestras gástricas malignas. Conforme avanzaba la edad disminuía la frecuencia del HP pero aumentaban la gravedad de las lesiones. / Objective: Determine the frequency of Helicobacter pylori in malignant and premalignant gastric histopathological samples from the pathological anatomy service of the Hospital Regional Lambayeque during the years 2016 to 2019. Material and methods. Census, observational, descriptive, retrospective and cross-sectional study. The study population was made up of patients whose gastric histological samples were received and studied in the pathological anatomy service of the Hospital Regional Lambayeque. Results. 566 patients fulfilled the selection criteria. The mean age was 57.3; range from 8 to 97 years. There was a predominance of patients between the fifth (23.9%), sixth (24%) and seventh (17%) decades of life. The overall frequency of Helicobacter Pylori in the selected samples was 70.5%, with a predominance in the male sex (71.2%). The anatomopathological findings were distributed as follows: 147 patients (26%) with chronic atrophic gastritis (CAG), 333 (58.8%) with intestinal metaplasia (IM), 60 (10.6%) with dysplasia and 26 (4.6%) with gastric cancer. Intestinal metaplasia was the most common finding; the same that was found in 166 people (49.85%) with complete MI, 73 (21.92%) with incomplete MI and 94 (28.22%) with mixed MI. Conclusions The frequency of Helicobacter Pylori (HP) was high in premalignant lesions, while there were no differences in the presence or absence in malignant gastric samples. As age advanced, the frequency of PH decreased but the severity of the lesions increased.

published_or_final_version / Pathology / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / abstract / Medicine / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / abstract / Medicine / Master / Doctor of Medicine

published_or_final_version / abstract / Chemistry / Doctoral / Doctor of Philosophy

More than half of all people worldwide are infected with H. pylori. The infection always cause a gastric inflammation that may develop into peptic ulcer disease or gastric cancer. Attachment proteins, adhesins, mediate specific adherence of H. pylori to receptor structures on the human gastric mucosa. The best-characterized H. pylori adhesin-receptor interactions are the BabA adhesin and the binding to the fucosylated blood group antigens ABO/Lewis b (Leb) and the SabA adhesin and its binding to the inflammation associated sialyl-Lewis x antigen. During H. pylori infection the availability of receptor structures on the human gastric mucosa changes as a consequence of the host inflammatory and immune responses. Consequently the bacterial population need to adjust its adherence properties to stay colonized. This thesis describes mechanisms that generate H. pylori populations with variable adherence properties and mechanisms for adjustment of adhesin expression levels.In H. pylori strains devoid of Leb-binding, we found bacterial cells with Leb-binding. Isolation of such H. pylori clones demonstrated that the change in receptor binding phenotype was obtained via the mechanisms of homologous recombination and slipped strand mispairing (SSM). Disease presentation in relation to BabA expression was studied in H. pylori infected Mongolian gerbils. We showed that BabA was not essential for colonization but caused severe injury to the gastric mucosa and was turned off during long-term infection by nucleotide changes within the babA gene. Gerbils infected with BabA-weak-expressing strains maintained BabA expressing clones for a longer period than gerbils that were infected with BabA-high-expressing strains. Studies of the gerbil gastric mucosal glycosylation showed that gerbils respond in a similar way as humans and Rhesus monkeys which support gerbils to be a model suitable for studying H. pylori infection and disease outcome in relation to adherence.We studied the SSM mechanism of SabA phase variation and the cognate shift in sLex-binding phenotype and we show sLex-binding activity to be growth phase dependent. H. pylori vesicles were characterized for the major phosholipid and protein components. Virulence factors e.g., VacA, and CagA were identified and both the BabA and the SabA adhesins was shown to be located on the vesicle surface and to mediate specific binding to their cognate receptors present on the human gastric mucosa. H. pylori generate bacterial cells with different receptor binding phenotypes via the mechanisms of homologous recombination, SSM and nucleotide changes. These mechanisms will probably contribute to bacterial fitness by the generation of quasi species populations where some of the clones will be better adapted to the environmental chances during persistent infection.

The development of improved sequencing technologies hasenabled the field of genomics to evolve. Handling andsequencing of large numbers of samples require an increasedlevel of automation in order to obtain high throughput andconsistent quality. Improved performance has lead to thesequencing of numerous microbial genomes and a few genomes fromhigher eukaryotes and the benefits of comparing sequences bothwithin and between species are now becoming apparent. Thisthesis describes both the development of automated purificationmethods for DNA, mainly sequencing products, and a comparativesequencing project. The initially developed purification technique is dedicatedto single stranded DNA containing vector specific sequences,exemplified by sequencing products. Specific capture probescoupled to paramagnetic beads together with stabilizing modularprobes hybridize to the single stranded target. After washing,the purified DNA can be released using water. When sequencingproducts are purified they can be directly loaded onto acapillary sequencer after elution. Since this approach isspecific it can be applied to multiplex sequencing products.Different probe sets are used for each sequencing product andthe purifications are performed iteratively. The second purification approach, which can be applied to anumber of different targets, involves biotinylated PCR productsor sequencing products that are captured using streptavidinbeads. This has been described previously, buthere theinteraction between streptavidin and biotin can be disruptedwithout denaturing the streptavidin, enabling the re-use of thebeads. The relatively mild elution conditions also enable therelease of sensitive biotinylated molecules. Another project described in this thesis is the comparativesequencing of the 40 kbcagpathogenicity island (PAI) in fourHelicobacter pyloristrains. The results included thediscovery of a novel gene, present in approximately half of theSwedish strains tested. In addition, one of the strainscontained a major rearrangement dividing thecagPAI into two parts. Further, information about thevariability of different genes could be obtained. Keywords:DNA sequencing, DNA purification, automation,solid-phase, streptavidin, biotin, modular probes,Helicobacter pylori,cagPAI. / <p>NR 20140805</p>