INTRODUÇÃO: Indivíduos com asma possuem infiltração aumentada de células inflamatórias, produção de quimiocinas e hiperresponsividade de vias aéreas. Estes apresentam níveis aumentados de interleucina (IL)-17, importante na regulação da expressão de mediadores inflamatórios e recrutamento de células inflamatórias, outra característica é aumento da atividade da proteína Rho-quinase em suas vias aéreas. A modulação da IL-17 e da proteína Rho-quinase pode ser promissora para o tratamento desta doença. OBJETIVO: Estudar os efeitos dos tratamentos realizados com anticorpo neutralizador anti-IL17 e do inibidor da Rho-quinase, associados ou não, em camundongos com inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Foram utilizados 64 camundongos BALB/c, divididos em 8 grupos (8 animais por grupo): SAL (solução salina); OVA (ovoalbumina), SAL-RHOi (salina e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi (ovoalbumina e inibidor de Rho-quinase), SAL - anti-IL17 (salina e anti-IL17), OVA - anti-IL17 (ovoalbumina e anti-IL17), SAL - RHOi - anti-IL17 (salina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi - anti-IL17 (ovoalbumina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase). O protocolo de sensibilização e indução da inflamação pulmonar por ovoalbumina teve duração de 28 dias. O Anti-IL17A (clone 50104 - 7,5 ug por dose) foi administrado via intraperitoneal e inibidor de Rho-quinase (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h antes de cada desafio com ovoalbumina (22, 24, 26 e 28 dias). RESULTADOS: Houve um aumento na resistência do sistema respiratório e na elastância, nos marcadores inflamatórios CD4+, CD8+, ROCK1 e ROCK2, IL-1-beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalfa, em vias sinalizadoras NF-kappaB, FOXP-3 e células dendríticas, em marcadores de remodelamento MMP9, MMP12, TIMP1, iNOS, TGF-beta, no conteúdo de isoprostano, decorina, biglicano, fibronectina e fibras colágenas e na expressão gênica de VAChT, IL-17 e arginase, no grupo OVA em comparação com o grupo controle. O tratamento dos animais sensibilizados, de forma individualizada ou a associação dos dois, atenuou estas respostas quando comparados ao grupo sensibilizado com ovoalbumina e não tratado (p < 0,05). O tratamento do inibidor de Rho-quinase associado ao anti-IL17 gerou potencialização do controle da resposta de hiperresponsividade à metacolina, assim como nas vias aéreas a redução do número de células positivas TNF-alfa, IL-4, IL-5 e nos septos alveolares o número de células positivas IL-4, IL-5, TGF-beta, FOXP3, ROCK1 e ROCK2 (p < 0,05). CONCLUSÃO: O tratamento com anti-IL17 associado ao inibidor da Rho-quinase modula a hiperresponsividade das vias aéreas, inflamação, e remodelamento e estresse oxidativo em animais com inflamação pulmonar alérgica crónica / RATIONALE: Individuals with asthma have increased infiltration of inflammatory cells, chemokines production, and airway hyperresponsiveness. Asthmatics have elevated levels of interleukin (IL)-17, which plays an important role in regulating the expression of inflammatory mediators and recruitment of inflammatory cells, these individuals also have increased Rho-kinase protein activity in their airways. The modulation of IL-17 and Rho-kinase protein may be promising for the treatment of this disease. OBJECTIVE: To study the effects of anti-IL17 neutralizing antibody and Rho-kinase inhibitor treatments, associated or not, on mice with chronic allergic lung inflammation. METHODS: Were used 64 BALB/c mice, divided into eight groups (n=8 in each group): SAL (saline-instilled); OVA (exposed-ovalbumin); SAL-RHOi (saline and Rho-kinase inhibitor), OVA-RHOi (exposed-ovalbumin and Rho-kinase inhibitor); SAL - anti-IL17 (saline and anti-IL17), OVA - anti-IL17 (exposed-ovalbumin and anti-IL17); SAL - RHOi -anti-IL17(saline, Rho-kinase inhibitor and anti-IL17), OVA - RHOi - anti-IL17 (exposed-ovalbumin, anti-IL17 and Rho kinase inhibitor). The protocol for sensitization and induction of pulmonary inflammation by ovalbumin has the duration of 28 days. The Anti-IL17A neutralizing antibody (clone 50104-7.5 ug per dose) was administered via the intraperitoneal, and Rho-kinase inhibitor (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h before each ovalbumin challenge (22, 24, 26 and 28 day). RESULTS: There was an increase in respiratory system resistence and elastance, in the positive cells evaluated CD4+, CD8+, ROCK1 and ROCK2, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalpha, TGF-beta, MMP9, MMP12, TIMP1 and isoprostane, decorin, biglican, fibronectin, collagen fibers content, signaling pathways NF-kappaB, FOX-P3, dendrict cells and gene expression of VAChT, IL-17 and arginase in the OVA group compared to the control group. Treatment of the sensitized animals with the Rho-kinase inhibitor or with the anti-IL17 or with the combination of the two, attenuated these responses when compared to the ovalbumin-sensitized and untreated group (p < 0,05). The treatment of the anti-IL17 associated Rho-kinase inhibitor generated potentiation of the hyper responsiveness response to methacholine, as well as in the airways the reduction of the number of TNF-alpha, IL-4, IL-5 positive cells and in the alveolar septa the number of IL-4, IL-5, FOXP3, TGF-beta, ROCK1 and ROCK2 (p < 0.05). CONCLUSION: Anti-IL17 treatment associated with the Rho-kinase inhibitor modulates airway hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress in animals with chronic allergic pulmonary inflammation

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:25Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00212.pdf: 1245886 bytes, checksum: 4848d0e58992c5a9ff4b387a14c2534a (MD5) / Objetivos: Analisar a expressão das proteínas CD10 e NM23 por estudo imunohistoquímico do tecido do carcinoma colorretal e da mucosa adjacente. Avaliar a relação da expressão dessas proteínas com os aspectos anatomopatológicos da neoplasia, estadiamento clínico, ocorrência de metástases hepáticas e prognóstico dos doentes. Método: Cento e trinta doentes operados por carcinoma colorretal foram analisados. Bloco de tissue microarray foi confeccionado com tecido neoplásico e com a mucosa não neoplásica adjacente. Estudo imuno-histoquímico foi realizado com anticorpos monoclonais NM23 e CD10 no tecido neoplásico e no tecido não neoplásico da mucosa adjacente. A leitura foi realizada por aparelho de escaneamento de lâminas. A imunoexpressão foi avaliada pelo percentual de células coradas e foram obtidos escores de intensidade. Foram considerados como positivos para CD 10 os tumores que expressavam o marcador em mais de 10% das células neoplásicas. Para NM 23 considerou-se dois grupos divididos em fortes expressores (mais de 50%) e expressores fracos (menos de 50%) das células coradas. Os resultados foram relacionados com as características morfológicas e histopatológicas do carcinoma colorretal, estadiamento clínico, presença de metástases hepáticas e com o prognóstico. No estudo estatístico foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal- Wallis e exato de Fisher. A sobrevivência foi avaliada utilizando a curva de Kaplan- Meier, e o desfecho de comparação entre as curvas foi calculado pelo teste de Long rank. Resultados: Ambos os marcadores CD10 e NM23 apresentaram expressão maior no tecido do carcinoma do que na mucosa não neoplásica adjacente (p<0,0001 para ambos). A imunoexpressão tecidual das proteínas NM23 e CD10 não apresentou relação com o grau de diferenciação celular (p=0,57 e p=0,48, respectivamente), invasão vascular (p=0,85 e p=0,67, respectivamente), invasão linfática (p=0,41 e 0,73, respectivamente), infiltração perineural (p=0,46 e p=0,24, respectivamente) e com o estadiamento pela classificação TNM (p=0,19 para ambos). A imunoexpressão de CD10 no tecido do carcinoma colorretal foi maior (p=0,05) nas neoplasias exofíticas do que nos tumores não exofíticos. A expressão das proteínas NM23 e CD10 não apresentou relação com a incidência de metástases linfonodais (p=0,08 e 0,30, respectivamente). A expressão tecidual dos marcadores NM23 e CD10 não se relacionou com a ocorrência de metástases hepáticas (p=0,59 e p=0,31, respectivamente). A sobrevivência livre de doença mostrou relação significante (p=0,01) com a maior intensidade de imunoexpressão da proteína NM23 no tecido do carcinoma colorretal, o mesmo não ocorrendo com a imunoexpressão da proteína CD10 (p=0,18). A sobrevivência global não mostrou relação com as expressões das proteínas NM23 e CD10 (p=0,13 e p=0,24, respectivamente). Conclusões: O tecido neoplásico do carcinoma colorretal expressou mais intensamente as proteínas NM23 e CD10 do que a mucosa não neoplásica adjacente. A imunoexpressão de CD10 no tecido do carcinoma colorretal foi maior (p=0,05) nas neoplasias exofíticas do que nos tumores não exofíticos. A expressão das proteínas NM23 e CD10 não se relacionou com os demais aspectos anatomopatológicos da neoplasia, com a presença de metástase hepática e com o estadiamento do carcinoma colorretal. Os doentes com imunoexpressão aumentada da proteína NM23 apresentaram sobrevivência livre de doença significativamente maior. A intensidade da imunoexpressão tecidual da proteína CD10 não influenciou a sobrevivência livre de doença e a sobrevivência global não se relacionou com a imunoexpressão das proteínas NM23 e CD10. / Aims: To analyze the tissue expression of the proteins CD 10 and NM 23 through the immunohistochemichal study of the colorectal carcinoma and evaluate the expression relation of these proteins with the anatomopathological aspects of the neoplasia, clinical staging, occurrence of hepatic metastasis and patients’ prognostic. Method: One hundred and thirty operated patients of colorectal carcinoma have been analyzed. A block of tissue microarray was produced with the neoplastic mucosa and with the adjacent non-neoplastic mucosa. An immunohistochemichal study was performed with monoclonal antibodies NM23 and CD10 on the neoplastic tissue and non-neoplastic tissue of the adjacent mucosa. The interpretation of the slides was made by a scanner device. The immunoexpression was evaluated by the percentage of colored cells and the obtained intensity scores. The results were related to the morphological and histopathological characteristics of the carcinoma, clinical staging, presence of hepatic metastasis and to the prognostic of the patients. In the statistic study were used the Mann-Whitney test, the Kruskal-Wallis test and Fisher’s exact test. The analysis of survival was conducted with the use of the Kaplan-Meier curve and the comparison conclusion between the curves was calculated through the Longrank test. Results: Both markers CD10 and NM23 presented a higher expression on the carcinoma tissue rather than on the non-neoplastic adjacent mucosa (p<0,0001 for both). The expression of the proteins NM23 and CD10 did not present any relation to the degree of cellular differentiation (p=0,57 and p=0,48, respectively) , vascular invasion (p=0,85 and p=0,67, respectively), lymphatic invasion (p=0,41and 0,73, respectively), perineural infiltration (p=0,46 and p=0,24, respectively) and with the staging by the TNM classification (p=0,19). The immunoexpression of CD10 on the colorectal carcinoma tissue was higher (p=0,15) on the exophytic neoplasias than on the non-exophytic tumors. The expression of the proteins NM23 and CD10 did not present any relation with the incidence of lymphonodal metastasis (p=0,08 and 0,30, respectively). The tissue expression of the markers NM23 and CD10 did not relate to the occurrence of hepatic metastasis (p=0,59 and 0,31 respectively). The disease-free survival disclosed a significant relation (p=0,01) with a higher intensity of immunoexpression of the protein NM23 on the colorectal carcinoma’s tissue. However, the same did not occur with the immunoexpression of the protein CD10 (p=0,18). The global survival did not show any relation with the expression of the proteins NM23 and CD10 (p=0,13 and p=0,24, respectively). Conclusions: The neoplastic tissue of the colorectal carcinoma expresses more intensely the proteins NM23 and CD10 than the adjacent nonneoplastic mucosa. The expression of the proteins NM23 and CD10 does not relate to the presence of lymphonodal metastasis, hepatic metastasis, degree of cellular differentiation, colonic or rectal localization of the neoplasia, presence of vascular and/or lymphatic invasion, presence of neural infiltration and the staging of the colorectal carcinoma. The patients with increased immunoexpression of the protein NM23 presented a disease-free survival significantly higher. The intensity of the tissue immunoexpression of the protein CD10 did not influence the disease-free survival. The global survival does not relate to the immunoexpression of the proteins NM23 and CD10. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-30Bitstream added on 2014-06-13T19:26:31Z : No. of bitstreams: 1 souza_jac_me_arafo.pdf: 631355 bytes, checksum: 9371a4a7027469c6d4a66de2870a71ed (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A expressão de citocinas inflamatórias é um processo estritamente regulado por mecanismos variados, incluindo o controle da sinalização intracelular e da atividade transcricional por inibidores endógenos, os quais são pouco estudados e compreendidos. Três grupos de proteínas: SHP, PIAS e SOCS inibem de maneira distinta e específica a transdução de sinais pela via JAK/STAT, bem como a atividade dos fatores de transcrição, eventos que modulam a expressão de diversas citocinas. As doenças periodontais estão associadas à inflamação persistente, com elevados níveis de citocinas proinflamatórias, no entanto praticamente não existem informações sobre a participação destes mecanismos de regulação nas diferentes condições clínicas periodontais. Os objetivos deste projeto incluíram avaliar a cinética de expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3 e suas proteínas-alvo, STAT1 e STAT3, respectivamente, durante a evolução da doença periodontal. Foram utilizados 36 ratos Wistar divididos em 2 grupos: DP - doença periodontal induzida por 2 métodos: ligaduras ao redor dos 1os molares inferiores e injeções de 60 μg de LPS de E. coli no tecido gengival palatino dos molares superiores, 3x/semana; Grupo controle negativo - recebeu apenas injeções de PBS (veículo). Os ratos foram sacrificados 7, 15 e 30 dias após a indução da doença periodontal para avaliação histológica e análise macroscópica da perda óssea alveolar. A expressão de SOCS1 e SOCS3 e a ativação de STAT1 e STAT3 foram avaliadas nas biópsias gengivais por PCR em tempo real e Western blot. Ambos os modelos apresentaram significante e progressiva perda óssea dos 7 aos 30 dias. A inflamação foi evidente já no período de 7 dias em ambos os modelos, porém enquanto manteve-se similar nos demais períodos no modelo de indução por LPS, apresentou uma diminuição na severidade da inflamação... / Inflammatory cytokine gene expression is a process strictly regulated by various mechanisms, including the negative regulation of signaling of cytokine receptors and of the activity of transcription factors such as STATs. These mechanisms involve endogenous proteins and are largely unknown, especially in periodontal diseases. Three groups of proteins, SHP, PIAS and SOCS modulate in a fairly specific manner JAK/STAT signaling and/or STAT activity. Periodontal diseases are infectious-inflammatory conditions of the supporting tissues of the teeth associated with increased levels of proinflammatory cytokines, but there are no information regarding the role of these endogenous mediators of JAK/STAT during its course. The aims of this study included the evaluation of the expression kinetics of inducible negative regulators and their target proteins during the course of experimentally induced periodontal disease. 36 Wistar rats were divided into two groups: PD - experimental periodontal disease induced by two methods: ligature placement around the first mandibular molars and E. coli lipopolysaccharide (LPS) injections into the palatal gingival tissues of the maxillary molars, 3x/week, and Negative Control group. Rats were sacrificed 07, 15 and 30 days after disease induction for histological evaluation of periodontal inflammation and macroscopic analysis of alveolar bone loss. SOCS expression and the activation status of STAT1 and STAT3 were evaluated in gingival biopsies by real time PCR and Western Blot. Both disease models presented significant progressive bone loss from 7 to 30 days. Inflammation was evident and similar for all the periods in LPS injected sites; however, a decrease on severity at the end of the experimental period was observed in the ligature model. There was a significant (p<0.05) increase on SOCS1 and SOCS3 gene expression in PD compared to control... (Complete abstract click electronic access below)

INTRODUÇÃO: O melanoma primário da cavidade oral é uma neoplasia agressiva, rara e originada a partir da proliferação de melanócitos malignos da mucosa. Ele representa aproximadamente de 0,2 a 8% de todos os melanomas. Estudos recentes apontam algumas vias moleculares tem sido encontradas por estarem envolvidas na patogenia dos melanomas. Dentre essas vias destaca-se a via proliferativa da MAPK (mitogen activated protein kinase), esta cascata de sinalização está envolvida no controle do crescimento celular, proliferação e migração, e tem sido relacionada com um papel importante no desenvolvimento e progressão do melanoma cutâneo. OBJETIVOS: Analisar a expressão proteica e mutação pontual dos componentes da via MAPK e correlacionar com os dados clínicos-histológicos. MATERIAL E MÉTODOS: Através da imunoistoquímica avaliar a expressão proteica dos anticorpos RAS; BRAF; MEK1; MEK2; ERK1 e ERK2 em 35 casos de melanomas orais organizados em matriz (TMA: Tissue Microarray) e através de pirosequenciamento avaliar a mutação pontual dos genes BRAF; NRAS; KRAS em 14 casos de melanomas orais. RESULTADOS: Idade dos pacientes entre 9 e 91 anos, sem predileção por sexo, 75% caucasianos, 71,42% acometeram o palato, 80% com aspecto histológico grau III. A análise da expressão proteica foi: RAS (28,57%); BRAF (82,85%); MEK1 (0%); MEK2 (51,43%); ERK1 (20%)e ERK2 (74,28%). Na análise molecular observamos mutações para BRAF (9/14 casos) e NRAS (2/14 casos). CONCLUSÃO: Todos os aspectos da via MAPK necessita de outras elucidações em melanomas de áreas foto-protegidas e melanomas de mucosa e comparando diferentes populações. Entretanto, os resultados deste presente estudo apontam importante alterações na cascata RAS-RAF-MEK-ERK e estes são indicadores de prognóstico ruim em melanomas primários da mucosa oral, independente da exposição solar / BACKGROUND: Primary melanoma of the oral cavity is an aggressive and rare neoplasm and originated from the proliferation of malignant melanocytes of the mucosa. It represents approximately 0.2 to 8% of all melanomas. Recent studies indicate some molecular pathways have been found to be involved in the pathogenesis of melanomas. Among these means there is a proliferative MAPK pathway (\"mitogen activated protein kinase\"), this signaling pathway is involved in controlling cell growth, proliferation and migration, and it has been associated with a role in the development and progression of melanoma skin. OBJECTIVES: To analyze protein expression and mutation of components of the MAPK pathway and to correlate with the clinical, histological data. MATERIALS AND METHODS: Using immunohistochemistry to evaluate the protein expression of RAS, BRAF, MEK1, MEK2, ERK1 and ERK2 antibodies in 35 cases of oral melanomas organized array (TMA: Tissue Microarray) and using pyrosequencing to assess the mutation of the BRAF, NRAS, KRAS in 14 cases of oral melanomas. RESULTS: Age of patients between 9 and 91 years, regardless of gender, 75% Caucasian, 71.42% in palate, 80% with histologic grade III. Analysis of protein expression was: RAS (28.57%); BRAF (82.85%); MEK1 (0%), MEK2 (51.43%); ERK1 (20%) and ERK2 (74.28%). Molecular analysis we found BRAF mutations (9/14 cases) and NRAS (2/14 cases). CONCLUSION: All aspects of the MAPK pathway requires further elucidation in melanomas of photo-protected areas and mucosal melanomas and comparing different populations. However, the results of this study indicate important changes in the cascade RAS-RAF-MEK-ERK and these are indicators of poor prognosis in primary melanomas of the oral mucosa, regardless of sun exposure

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T05:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_D.pdf: 34867811 bytes, checksum: 839d8dbb3d76170bebebbc5e8619b847 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estudos do nosso laboratório demonstraram que a quinase de adesão focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação dos mecanismos de sinalização que determinam as alterações fenotípicas de cardiomiócitos submetidos a estímulos mecânicos. Em estudo anterior demonstramos através da inibição farmacológica da Shp2, que a mesma contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina (atividade) da FAK e regulação da expressão de genes associados ao fenótipo hipertrófico em células em cultura. O presente estudo foi realizado para examinar o impacto da depleção da Shp2,induzida por silenciamento gênico, na atividade da FAK e nas alterações fenotípicas de Miócitos Ventriculares de Ratos Neonatos (MVRNs) em condições basais e de estímulo mecânico e os efeitos da introdução de mutações no gene da Shp2, que resultem em perda, ganho ou deleção da proteína, sobre a atividade da FAK e sobre as alterações fenotípicas nos corações de camundongos. A depleção dos níveis protéicos da Shp2 por siRNA específico induziu ao aumento da fosforilação da Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, e S6 quinase Thr389, à re-expressão do gene fetal marcador molecular de hipertrofia cardíaca (?-MHC) e à um fenótipo hipertrófico dos MVRNS não estirados. A inibição da atividade do complexo FAK/Src através do tratamento dos MVRNs com PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine}aboliu o aumento na fosforilação da AKT, TSC2, e S6 quinase, bem como a hipertrofia dos MVRNs induzida pela depleção da Shp2. A inibição da mTOR (mammalian target of rapamycin) com rapamicina bloqueou o surgimentos da hipertrofia nos MNRNs tratados com siShp2. Os MVRNs tratados com PP2 ou com RNA de interferência, específico para a FAK, apresentaram-se deficientes na ativação e aumento da fosforilação da FAK, Src, ERK (extracellular signal-regulated kinase), AKT, TSC2, e S6 quiinase, e na indução de aumento da área celular em resposta ao estimulo mecânico de estiramento cíclico prolongado in vitro. A Hipertrofia em resposta ao estiramento prolongado também foi prevenida pelo tratamento dos MVRNs com rapamicina. Os resultados são consistentes em apontar que a perda ou diminuição da função da Shp2 (por depleção, mutação ou deleção gênica cardíaco-específica) induz ao aumento da ativação da FAK, AKT e via da mTOR/S6K , que são vias de sinalização sabidamente envolvidas nos processos hipertróficos do miocárdio. Interessantemente os animais portadores de mutação LS-Shp2 apresentaram redução de 50% da atividade fosfatase relacionada ao imunoprecipitado de Shp2 no miocárdio, recapitularam a desordem humana apresentando baixa estatura, dismorfia craniofacial, evidências morfológica, histopatológica, ecocardiográficas e molelculares de presença de cardiomiopatia hipertrófica. Notavelmente o tratamento desses animais com o inibidor específico da mTOR, rapamicina, foi capaz de reverter completamente o fenótipo hipertrófico dos animais LS-Shp2. Consistentemente, o ganho de função da Shp2 (no miocárdio), induzido por mutação NS (Noonan Syndrome), foi acompanhado de diminuição da atividade basal da FAK, bem como da AKT e de proteínas envolvidas na via da mTOR e de redução da área total e largura dos cardiomiócitos adultos quando comparados aos extraídos de animais selvagens. Em conjunto, os dados, aqui apresentados, indicam que a tirosino-fosfatase Shp2 contribui para regular o nível de fosforilação da FAK em cardiomiócitos e para a regulação da expressão de gêneses do programa hipertrófico e do tamanho celular através da modulação da atividade da FAK e mTOR. Sugere também, que a inibição prolongada de Shp2 pode, por si só, induzir ao aparecimento de hipertrofia cardíaca através da FAK pela modulação da via mTOR/S6K / Abstract: Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces, which drive changes in cardiac myocyte function and structure, in response to hemodynamic overload, into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether Shp2 (Src homology region 2, phosphatase 2) controls Focal Adhesion Kinase (FAK) activity and its trophic actions in cardiomyocytes. Our study was performed in neonatal rat ventricular myocytes subjected to depletion of Shp2 by RNA interference and genetically modified mice carrying mutations that induce gain and loss of function and Shp2 cardiac-specific conditional gene deletion.Depletion of Shp2 by specific small interfering RNA increased the phosphorylation of FAK Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, and S6 kinase Thr389 and induced hypertrophic gene expression pattern (?- MHC) and phenotype of nonstretched NRVMs. Inhibition of FAK/Src activity by PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7- (t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine} abolished the phosphorylation of AKT, TSC2, and S6 kinase, as well as the hypertrophy of NRVMs induced by Shp2 depletion. Inhibition of mTOR (mammalian target of rapamycin) with rapamycin blunted the hypertrophy in NRVMs depleted of Shp2. NRVMs treated with PP2 or depleted of FAK by specific small interfering RNA were defective in FAK, Src, extracellular signal-regulated kinase, AKT, TSC2, and S6 kinase phosphorylation, as well as in the hypertrophic response to prolonged stretch. The stretch-induced hypertrophy of NRVMs was also prevented by rapamycin. Subsequently we tested the hypothesis that the introduction of mutations in the Shp2 gene, causing protein deletion or loss of protein function, would contribute to increase the levels of tyrosine phosphorylation of FAK resulting in a hypertrophic phenotype in mice hearts. Likewise, we investigated the possibility that the introduction of a mutation in the Shp2 gene, which leads to gain of function, would result in decrease phosphorylation of FAK. The results were consistent in pointing out that the loss of protein or impairment of the function of Shp2 (gene deletion, depletion or mutation) induces increased activation of FAK, AKT and a the mTOR/S6K pathways, which are signaling pathways known to be involved in controlling cardiac growth and hypertrophy. Ls-Shp2 mice recapitulated the human disorder, with short stature, craniofacial dysmorphia, and morphological, histological, echocardiographic and molecular evidence of hypertrophic cardiomyopathy (HCM). Heart and/or cardiomyocyte lysates from LS-Shp2 mice showed decreased Shp2 catalytic activity, consistent with previous reports that LS mutants have dominant negative effects. Remarkably, the cardiac hypertropic phenotype in LS-Shp2 mice were completely reversed by treatment with the mTOR inhibitor, rapamycin. Consistently, the gain of function of Shp2 (induced by mutation) was accompanied by decreased basal activity of FAK and AKT and proteins involved in the mTOR signaling pathway. These findings demonstrate that basal Shp2 tyrosine phosphatase activity controls the size of cardiomyocytes by downregulating a pathway that involves FAK/Src and mTOR signaling pathways. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by Shp-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_GustavoJorge_M.pdf: 2550633 bytes, checksum: 914361a57f5efd5794bcee99ff8ce2a4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Diabetes Mellitus (DM) é uma síndrome metabólica, de etiologia múltipla, caracterizada por hiperglicemia crônica, decorrente da falta de insulina, às vezes, associado à resistência dos tecidos periféricos a esse hormônio. O DM1 é caracterizado pela infiltração de macrófagos e linfócitos do tipo T-CD4+ e T-CD8+ no pâncreas, devido a uma falha do reconhecimento no sistema autoimune, que desencadeiam processos inflamatórios com liberação de óxido nítrico (NO), de radicais livres e de citocinas tais como: interleucina-1? (IL-1 ?) e Interferon- ? (IFN- ?). Essas citocinas pró-inflamatórias ativam mecanismos que levam a morte celular por apoptose, com perda da massa funcional das células beta. Esses mecanismos podem ser reproduzidos in-vitro pela exposição de células beta a essas citocinas ou à Aloxana. O CNTF é uma citocina de sobrevivência neuronal, e em células beta age sobre o controle glicêmico inibindo secreção de insulina e promovendo sobrevivência de ilhotas. A AMPK é uma proteína quinase que em células beta atua como um sensor do estado energético celular e, quando as concentrações intracelulares de ATP diminuem, a AMPK é ativada estimulando geração de ATP e inibindo o consumo desse nucleotídeo. Em ilhotas, a AMPK desempenha função importante na regulação da secreção de insulina sendo que a inibição de AMPK protege as células beta da apoptose mediada por citosinas (IL-1? e IFN-?) ou induzidas por células T do tipo CD8+ e CD4+. Diante do exposto, conclui-se que CNTF e AMPK desempenham funções importantes e correlatas nas células beta pancreáticas e, podem ser considerados alvos terapêuticos para o tratamento do DM tipo I. Contudo, a interação entre esses dois fatores (CNTF e AMPK) em células secretoras de insulina permanece desconhecida. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a possível papel da interação entre CNTF e AMPK na morte celular induzida pelos agentes diabetogênicos IL-1? e Aloxana. Nossos resultados indicaram que: A Aloxana e a IL-1? dependem da via da AMPK para induzir apoptose em células MIN6; O CNTF modula a via da AMPK em células MIN6 e ilhotas de camundongos Swiss neonato. O CNTF foi capaz de impedir a morte celular induzida por Aloxana e por IL-1? através da downregulation da via da AMPK em células MIN6. / Abstract: Diabetes Mellitus (DM) is a metabolic syndrome of multiple etiologies, resulting from the lack of insulin sometime associated with an increase in the resistance to the hormone by insulin-target tissues. DM1 is characterized by the infiltration of macrophages and T-type CD4 + and T-CD8 + cells in the pancreas, due to a failure of the autoimmune system, causing inflammation and leading to the release of nitric oxide (NO), free radicals, and cytokines such as interleukin-1? (IL-1?) and interferon-? (IFN-?). These pro-inflammatory cytokines activate pro-apoptotic mechanisms, triggering beta cell death apoptosis, leading to a loss in functional beta cell mass. These mechanisms may be reproduced in vitro with exposure of beta cells to pro-inflammatory cytokines such as IL-1? or to Alloxan. The cytokine CNTF is a neuronal survival factor. Besides, CNTF modulates glycemia, inhibiting insulin secretion and promoting islet cells survival. AMPK is a protein kinase that acts on pancreatic beta cells as a sensor of the cellular energy state, and is activated when the cellular ATP concentrations decrease, stimulating ATP generation and inhibiting ATP consumption. In islets, AMPK plays an important role in regulating insulin secretion and inhibition of AMPK protects beta cells from apoptosis mediated by either cytokines (IL-1? and IFN-?) and/or induced T cell CD8 + and CD4 +. AIMS: Given that, both CNTF and AMPK play important role in beta cells and may be used as therapeutic targets for the treatment of DM1. However, the interaction between these two factors (CNTF and AMPK) in pancreatic beta cells remains unknown. Thus, the objective of this work was to investigate the relationship between interaction of AMPK and CNTF on pancreatic beta cell death, induced by Alloxan or IL-1?. Our results indicated that both Alloxan and IL-1? are dependent of AMPK pathway to induce apoptosis in MIN6 cells; CNTF inhibits AMPK pathway in MIN6 cells as well as in islets of newborn Swiss mice; CNTF prevents beta cell death, induced by Alloxan and IL-1?, through downregulation of AMPK pathway in MIN6 cells. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:19:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_M.pdf: 14587191 bytes, checksum: b8bac41b29ca5081a5bcb225f83e4773 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Arrazoado. A Quinase de Adesão Focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação da sinalização que determina as alterações fenotípicas de cardiomiócitos estimulados mecanicamente. A regulação da atividade da FAK é complexa e depende de mecanismos intramoleculares e da cooperação com a tirosino-quinase Src. Há evidências de que a tirosino-fosfatase SHP-2 contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina e, portanto da atividade da FAK em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Este estudo objetivou examinar se a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs. Examinamos se em MVRNs controle (i.e. não submetido a estímulo mecânico), a atividade da SHP-2 contribui para o baixo nível de fosforilação em tirosina da FAK e se em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos a inibição da atividade da SHP-2 paralela a dissociação FAK/SHP-2 exerce papel permissivo na elevação da fosforilação da FAK. Material e Métodos. Utilizou-se modelo de sobrecarga pressora por coarctação da aorta em ratos (miocárdio-VE) e estiramento in vitro em MVRNs. As abordagens experimentais incluíram técnicas de imunoprecipitação, western blot, imunohistoquímica, atividade de tirosino fosfatase in vitro, expressão de SHP-2 recombinante e avaliação da expressão do gene da cadeia pesada de beta-miosina (ß- miosina). Resultados. A coarctação da aorta (miocárdio-VE) e o estiramento (MVRNs) aumentaram a fosforilação da FAK no resíduo tirosina 397, em miocárdio-VE (200%) e em MVRNs estirados (75%). A FAK imunoprecipitada de amostras controles, encontrou-se associada a SHP-2 e o estímulo mecânico acompanhou-se de redução dessa associação, no miocárdio (60%) e em MVRNs (84%). Experimentos com imunohistoquímica e microscopia confocal demonstraram co-localização da FAK e da SHP-2 em MVRNs controle. Ocorreu redução da atividade de tirosino-fosfatase em imunoprecipitados de anticorpo anti-FAK (25%) e anticorpo anti-SHP-2 (25%) de miocárdio-VE de animais submetidos à coarctação da aorta, e anti-FAK (20%) e anti-SHP-2 (40%) de MVRNs estirados. A SHP-2 recombinante foi capaz de reduzir (70%) in vitro a fosforilação da FAK ativada por estímulo mecânico. Ocorreu aumento (125%) da quantidade de FAK fosforilada em MVRNs controles tratados com TFMS (inibidor seletivo da atividade da SHP-2); naqueles submetidos ao estiramento, o aumento em relação aos MVRNs estirados, mas não tratados com TFMS, foi menor (40%). Ocorreu paralelamente, diminuição (40%) da associação FAK/SHP-2 e aumento da expressão do gene fetal da cadeia pesada da ß - miosina (110%) em MVRNs tratados com TFMS; Os MVRNs tratados concomitantemente com TFMS e PP2 (inibidor farmacológico da FAK), apresentaram atenuação desse aumento (25%). Conclusão. Os dados sugerem que a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs, exercendo papel inibitório na ativação da FAK, contribuindo para o seu baixo nível de fosforilação em MVRNs e miocárdio na ausência de estímulo mecânico. A diminuição da associação FAK/SHP-2, da atividade específica da SHP-2 em MVRNs ou miocárdio submetidos a estímulos mecânicos e o aumento da fosforilação da FAK mediante tratamento dos MVRNs com TFMS, indicam que a redução da atividade da SHP-2 e da associação a FAK, é um importante mecanismo que colabora para o aumento de fosforilação da FAK em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos sustentados. O aumento da expressão da cadeia pesada da ß ¿ miosina conseqüente à inibição da atividade da SHP-2 e a atenuação desse aumento, perante a concomitante inibição da atividade da FAK, corrobora nossa hipótese de que a SHP-2 modula a ativação da FAK em cardiomiócitos, influenciando a reprogramação gênica característica da ativação da sinalização hipertrófica, por estímulo mecânico / Abstract: Mechanical forces drive changes in cardiac myocyte function and structure that occur in response to hemodynamic overload. Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether the protein tyrosine-phosphatase SHP-2 plays a role in baseline and stretch induced FAK activation and signaling in cultured neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs).NRVMs were subjected to cyclic stretch up to 60 min, studied by coimmunoprecipitation, immunoblotting, tyrosine-phosphatase activity assay, RT-PCR, and used in assays utilizing recombinant SHP-2 catalytic domain. Analysis was extended to NRVMs treated with Shp2 inhibitor TFMS and with FAK/Src Inhibitor PP2. FAK had a relatively low basal level of phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs. Cyclic stretch (1HZ, 10%) induced rapid and sustained (up to 60 min) increases in phosphorylation of FAK at Tyr397. The results of coimmunoprecipitation assays indicated that FAK and SHP-2 are associated in non-stretched NRVMs, but cyclic stretch markedly reduced (to 25% and 60% after 10 and 60 min, respectively) the amount of SHP-2 recovered from the anti-FAK antibody precipitates. The tyrosine phosphatase activity of the anti-SHP-2 immunocomplex taken from non-stretched cardiac myocytes was relatively high, but it was markedly reduced (to 60% after 10 and 60 min) in samples of stretched cells. The recombinant PTP domain of SHP-2 was demonstrated to be able to dephosphorylate the native FAK immunoprecipitated from NRVMs. The inhibition of SHP-2 activity by the pharmacological inhibitor TFMS markedly increased FAK phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs to levels comparable to those seen in stretched cells. Treatment with TFMS lasting for 4h was accompanied by a marked increase (to 200) the expression of beta-myosin heavy chain mRNA in non-stretched NRVMs. This effect was attenuated by 25% in NRVMs simultaneous treated with the FAK/Src inhibitor PP2.In conclusion, the present data demonstrated that the basal FAK phosphorylation at Tyr397 is modulated by SHP-2 and that inhibition of SHP-2 during cyclic stretch has a permissive role on FAK activation by mechanical stress. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by SHP-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica