Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:15:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Consonni_SilvioRoberto_D.pdf: 7954683 bytes, checksum: 766ce32e5bbb5a5c0b8cc78fd2735dc0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Há um crescente avanço no desenvolvimento das tecnologias que permitam a localização de proteínas em células por microscopias de luz e eletrônica combinadas, com o uso das sondas moleculares miniSOG e Apex2, por exemplo. Adicionalmente busca-se compreender como proteínas são responsáveis pelas funções celulares e teciduais. A Quinase de Adesão Focal (FAK), proteína da cascata de sinalização das integrinas é considerada uma mediadora em potencial do estresse mecânico nos cardiomiócitos. Sabe-se que em cardiomiócitos submetidos a estímulos hipertróficos, ocorre rápida ativação da FAK e sua redistribuição subcelular, contudo são pouco conhecidos os mecanismos envolvidos nesses processos. Outra proteína de grande importância no coração é a Calsarcina-1 (CS1), regulador negativo da via de Calcineurina, crucial no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca. Entretanto os mecanismos envolvidos nessa regulação negativa, assim como a distribuição subcelular de CS1 são pouco conhecidos. Visando à interação entre essas áreas para estudo da distribuição espaço-temporal dos componentes celulares e de proteínas, bem como a importância da FAK e CS1 no sarcômero e seu papel na sinalização hipertrófica sob estímulo mecânico, o objetivo geral desse trabalho foi explorar a capacidade das proteínas FAK e CS1 para incorporar geneticamente sondas moleculares que permitissem monitorar por meio de imagens o comportamento dessas moléculas-chave na biologia do disco Z em MVRNs submetida ao estiramento mecânico. Para isso, foram realizados ensaios de localização subcelular com uso de sondas moleculares aplicadas à microscopia correlativa, bem como ensaios bioquímicos, moleculares e de atividade enzimática. Os dados confirmaram a FAK associada às fibras de actina e adesões focais em células H9c2 e foi demonstrado à microscopia de luz que FAK wild-type (wt) translocou-se parcialmente para o compartimento nuclear após estimulação do agonista fenilefrina, enquanto que FAK Y397F (forma mutante inativa) não apresentou mesmo fenótipo. Por outro lado, apesar da padronização e expressão das construções com FAK e miniSOG ou Apex2 em células HEK 293T e H9c2, não foi conclusiva a localização subcelular da FAK, por meio do uso de microscopia eletrônica em MVRN. Provavelmente devido à distribuição difusa da maior parte das moléculas de FAK, não foi identificada uma região elétron-densa conclusiva à microscopia eletrônica de transmissão. No tocante à importância da CS1, observou-se que o estiramento cíclico não induziu o aumento na expressão proteica ou gênica relativa de CS1 e CnA, assim como não houve alteração na atividade fosfatase de CnA. No entanto houve redução da interação de CS1 e CnA, bem como alteração na localização de CS1 em MVRN sob estímulo mecânico. Dados de superexpressão e silenciamento de CS1 corroboram a regulação negativa de CS1 à CnA em MVRN sob estímulo mecânico. Baseando-se em dados estruturais, especulou-se que como o sítio de ligação de NFAT e CS1 à CnA são muito próximos e ao mesmo tempo distante do sítio ativo da fosfatase, é possível que o papel de CS1 na regulação negativa de CnA ocorra por impedimento espacial ao fator de transcrição NFAT. Portanto, esses resultados podem contribuir para uma possível inferência farmacológica, visto que a via de Calcineurina-NFAT é uma das principais mediadoras de hipertrofia em cardiomiócitos, mediante estímulos patológicos / Abstract: There is an increasing move towards the development of technologies that allow the localization of proteins in cells by combined electron and light microscopy, with the use of molecular probes such as miniSOG and APEX2. Additionally we seek to understand how proteins are responsible for the cellular and tissue functions. The Focal Adhesion Kinase (FAK) is protein of integrin signaling cascade considered as a potential mediator of mechanical stress in cardiomyocytes. It is known that in cardiomyocytes subjected to hypertrophic stimuli by rapid activation of FAK and its subcellular redistribution, however the mechanisms involved in these processes are poorly understood. Another very important protein in the heart is Calsarcin-1 (CS1), a negative regulator of the Calcineurin pathway which is crucial in the development of cardiac hypertrophy. However the mechanisms involved in the negative regulation as well as the subcellular distribution CS1 are poorly understood. Aiming at the interaction between these areas to study the spatial-temporal distribution of cellular and protein components, and the importance of FAK and CS1 in the sarcomere and its role in hypertrophic signaling under mechanical stimulation, the aim of this study was to explore the ability of FAK and CS1 to incorporate genetically molecular probes that allow monitoring through images the behavior of these key molecules in the Z disc biology in MVRNs subjected to mechanical stretch. To this end, we performed subcellular localization assays using molecular probes applied to the correlative microscopy, biochemical and molecular assays and enzymatic activity. These data confirm the FAK associated with actin and focal adhesions fibers in H9c2 cells and has been shown by light microscopy that FAK wild-type (wt) is partially translocated to the nuclear compartment after stimulation of the agonist phenylephrine, while FAK Y397F (inactive mutant form) did not show the same phenotype. Moreover, despite standardization and expression of FAK and miniSOG or APEX2 in HEK 293T cells and H9c2, it was inconclusive subcellular localization of FAK, through the use of electron microscopy, in MVRN. Probably due to the diffuse distribution of most FAK molecules, it has no conclusive electron-dense region in transmission electron microscopy. Regarding the importance of CS1, it was observed that the cyclic stretch did not induce an increase in protein expression or gene relative CS1 and CnA, as there was no change in the phosphatase activity of CnA. However there was less interaction CS1 and CnA and change in CS1 location in MVRN under mechanical stimulation. CS1 overexpression and silencing corroborate the negative regulation of the CS1 over CnA in MVRN under mechanical stimulation. Based on structural data, it has been speculated that as the NFAT and CS1 binding sites are very close in CnA and at the same time distant from the active site of the phosphatase, it is possible that the role of CS1 in the negative regulation of CnA occur by steric hindrance to the NFAT transcription factor. Therefore, these results may contribute to a possible pharmacological inference, whereas Calcineurin-NFAT pathway is a major mediator of hypertrophy in cardiac myocytes by pathologic stimuli / Doutorado / Biologia Tecidual / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

O câncer de pele é um dos mais frequentes entre humanos, sendo o melanoma o tipo menos comum, mas com grande importância devido à agressividade que ele apresenta. Um dos principais agentes etiológicos deste tipo de tumor é a radiação ultravioleta proveniente da luz solar. A fração de radiação ultravioleta B (UVB) gera dano no DNA e induz alterações nas células da pele após a exposição prolongada e sem proteção. A resposta à luz UVB em melanócitos e melanomas é diferente, mostrando a importância do perfil celular. O efeito genotóxico da luz UVB pode alterar a expressão de moléculas como galectina-3 e MAPKs, desencadeando respostas UVB-dependentes. Galectina-3 é uma lectina que reconhece beta-galactosídeos e está envolvida na regulação de diversos processos celulares que modificam a viabilidade celular e a proliferação. Esta molécula é ubiquamente expressa apresentando um comportamento específico dependendo da sua localização subcelular. No presente trabalho mostramos que a distribuição de galectina-3 em melanoma e melanócitos é ampla, encontrando-se tanto no núcleo como no citoplasma, podendo ser modificada após irradiação UVB ou ainda secretada para o meio extracelular. Além disso, observamos que a luz UVB ativa a via de MAPKs, proteínas quinases ativadas por mitógenos envolvidas no crescimento, sobrevivência, diferenciação e resposta a estresse, em melanócitos e em melanomas poucos minutos após a exposição à UVB. Uma maior atividade de p38 e de ERK é evidenciada em melanomas, enquanto que em melanócitos a via de p38 é a mais ativa, corroborando a noção de que a resposta celular à luz UVB difere entre melanócitos e melanoma. As moléculas p38 e JNK são proteínas quinases ativada pelo estresse (SAPK). A via de JNK não é tão responsiva em alguns melanomas, mas ativação desta molécula parece estar envolvida com a sobrevivência celular e a translocação mitocondrial após UVB. Em adição, a inibição de JNK leva ao aumento de morte celular em linhagens melanocíticas irradiadas e não irradiadas, e em melanoma induz morte e aumenta autofagia após irradiação. Esta molécula parece interagir com galectina-3 em modelos murinos, mas não em melanomas humanos, enquanto que ERK interage fisicamente com galectina-3 em melanócitos e melanomas humanos, independente de UVB. Através do silenciamento de galectina-3 pela técnica de RNA de interferência, mostramos o aumento da ativação da via de ERK após irradiação e de proteínas downstream de ERK, promovendo a proliferação celular em melanomas nessas condições. Em melanócitos parece existir uma regulação negativa da via de ERK por galectina-3 acompanhada de uma diminuição da viabilidade celular após o silenciamento dessa lectina, independente de UVB. Estes resultados mostram que galectina-3 é uma importante reguladora de eventos associados com sobrevivência e morte celular em melanoma. Por outro lado, em melanomas a ausência de galectina-3 induz aumento da proliferação associada à ativação de ERK, evidenciando a importância do tipo celular na ação de galectina-3 / Skin cancer is the most common cancer among humans, melanoma being the least common type but very important due to its aggressive behavior. A major etiologic agent of this type of tumor is ultraviolet radiation from the sunlight. The ultraviolet B rays (UVB) cause DNA damage and induce alterations over the skin cells after prolonged exposition without protection. The UVB response in melanocytes and melanoma cells is different. This shows the importance of the cellular profile. The genotoxic effect of UVB light can alter the expression of molecules such as galectine-3 and MAPKs and also triggers multiple responses UVB-dependent. Galectin-3 is a lectin that recognizes beta-galactosides. It is involved in the regulation of many cellular processes that modify cellular viability and proliferation and presents specific behavior depending on its subcellular localization. In the present study we showed that galectine-3 distribution in melanoma cells and melanocytes is large, lying both in the nucleus and in the cytoplasm. After UVB irradiation this distribution could be modified or even galactine-3 secreted itself into the extracellular space. Moreover, we observed that UVB light activates the mitogen-activated protein kinase pathway (MAPK) involved in growth, survival, differentiation and stress-response in melanocytes and in melanoma cells just a few minutes after exposure. An increased activity of p38 and ERK was observed in melanomas, while in melanocytes just p38 pathway was highly active, supporting the notion that the cellular response to UVB light differs between melanocytes and melanoma cells. The molecules p38 and JNK are stress-activated protein kinases (SAPK). The JNK pathway is not responsive in some melanoma cells, but the activation of this molecule appears to be involved in cell survival and mitochondrial translocation after being exposed to UVB. Inhibition of JNK leads to increased cell death in irradiated and non-irradiated melanocytic lineage, but in melanoma cells induces cell death and increased autophagy only after irradiation. This molecule seems to interact with galectin-3 in mouse models but not in human melanomas, whereas ERK physically interacts with galectin-3 in human melanocytes and melanoma cells, regardless of UVB exposure. Through the knockdown of galectin-3 by siRNA, we showed increased activation of the ERK and its downstream pathway after irradiation, thus inducing cell proliferation. In melanocytes seems to be a negative regulation of the ERK pathway by galectin-3 accompanied by a decrease in cell viability after its knockdown regardless of UVB exposure. These results show that galectin-3 is an important regulatory molecule of events associated with cell death and survival in melanoma, which has different behavior depending on the cell type

INTRODUÇÃO: Embora os corticosteróides sejam considerados tratamento padrão-ouro na asma, pacientes com asma grave não são totalmente controlados com este tratamento. Estudos prévios com inibidores da Rho quinase sugeriram uma influência benéfica destas drogas na asma, atuando como uma possível alternativa anti-inflamatória. No entanto, não há estudos anteriores avaliando os efeitos destes inibidores, associados ou não com corticosteróides, na modulação da mecânica do sistema respiratório e oscilatória do tecido pulmonar distal, assim como nas alterações histopatológicas, em modelo animal de inflamação pulmonar crônica. OBJETIVOS: Avaliar se o tratamento com o inibidor específico da Rho (Y- 27632), associado ou não com a dexametasona modula a resposta de mecânica pulmonar, inflamatória, de remodelamento da matriz extracelular e ativação do estresse oxidativo em cobaias com inflamação alérgica crônica. MÉTODOS: As cobaias receberam sete inalações de ovoalbumina (1-5mg/ml; grupo OVA) durante 4 semanas. A partir da quinta inalação, os animais do grupo da Rho quinase receberam inalação de Y-27632 (1mM) (grupo OVA-RHO) e ou dexametasona (2 mg.kg-1) associada ou não a Y-27632 (grupos OVA-C ou grupos ORC), 10 minutos antes de cada inalação com OVA. Setenta e duas horas depois da sétima inalação, os animais foram anestesiados, exsanguinados, o óxido nítrico exalado foi coletado e a mecânica do sistema respiratório (Ers e Rrs) e oscilatória do tecido pulmonar distal (Et e Rt) foram realizadas em condições basais e após desafio com OVA (0,1%). Após, as fatias de pulmão foram removidas e submetidas à avaliação histopatológica. RESULTADOS: Houve um aumento no óxido nítrico exalado, nas respostas máximas de Ers, Rrs, Rt e Et após desafio antigênico, nos eosinófilos, nas células positivas para IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-?, iNOS, MMP-9, TIMP-1,TGF- ß, NF?B e no conteúdo do 8-iso-PGF2?, no conteúdo de fibras elásticas, colágenas e de actina em vias aéreas e no parênquima pulmonar distal do grupo OVA comparado ao controle (P<0,05). Nos grupos OVA-RHO, OVA-C e ORC houve uma diminuição em todos os parâmetros comparados ao grupo OVA (P<0,05). A associação do Y-27632 com o tratamento com corticosteróide (grupo ORC) potencializou a atenuação do conteúdo de colágeno e IFN-? na parede das vias aéreas e IL-2, IFN-?, 8-iso-PGF2? e NF-?B no parênquima distal comparado aos grupos OVA-RHO e OVA-C (P<0,05). No grupo ORC houve uma redução nas células positivas para TIMP-1 e eosinófilos no septo alveolar comparado ao grupo OVA-C (P<0,05). CONCLUSÕES: A inibição da Rho quinase ou o tratamento com corticosteróides contribuíram para o controle da resposta de mecânica pulmonar, da resposta eosinofílica e linfocitária Th1 e Th2, do remodelamento da matriz extracelular e da ativação do estresse oxidativo nas vias aéreas e parênquima distal neste modelo animal. A associação do inibidor da Rho quinase com o corticosteróide potencializou o controle de parte da resposta de remodelamento e de inflamação nas vias aéreas e parênquima. A inibição da Rho quinase associada ou não a corticosteróides pode ser considerada uma ferramenta farmacológica futura para o tratamento de doenças pulmonares crônicas / INTRODUCTION: Although corticosteroids are considered gold standard of asthma treatment, patients with serious asthma are not totally controlled with this treatment. Previous studies with Rho-kinase inhibitors suggested a beneficial influence of these drugs on asthma, being a possible anti-inflammatory alternative. However, there are no previous studies evaluating in an animal model of chronic pulmonary inflammation the effects of such inhibitors, combined or not with corticosteroids, on the mechanics modulation of the respiratory system and oscillation of distal pulmonary tissue, as well as on histopathological alterations. OBJECTIVES: To evaluate whether treatment with the specific Rho inhibitor (Y-27632), combined or not with dexamethasone, modulates the responses of pulmonary mechanics, inflammation, extracellular matrix remodeling, and oxidative stress activation in guinea pigs with chronic allergic inflammation. METHODS: Guinea pigs received seven ovalbumin inhalations (1-5mg/ml; OVA group) during 4 weeks. After the fifth inhalation, the animals of the Rho-kinase group received inhalation of Y-27632 (1mM) (OVA-RHO group) and/or dexamethasone (2 mg.kg-1), combined or not with Y-27632 (OVA-C groups or ORC groups), 10 minutes before each inhalation with OVA. Seventy-two hours following the seventh inhalation, the animals were anesthetized, exsanguinated, the exhaled nitric oxide was collected, and mechanics of the respiratory system (Ers and Rrs) and oscillation of the distal lung tissue (Et e Rt) were performed in basal conditions and after challenge with OVA (0.1%). Afterwards, lung slices were removed and submitted to histopathological evaluation. RESULTS: There was an increase of exhaled nitric oxide, maximum responses of Ers, Rrs, Et and Rt after antigen challenge, eosinophil counts, cells positive for IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-?, iNOS, MMP-9, TIMP-1,TGF-ß, NF?B, and in the content of 8-iso-PGF2?, elastic fibers, collagen fibers and actin in the airways in distal lung parenchyma of the OVA group, compared to the control (P<0.05). In the OVA-RHO, OVA-C and ORC groups there was a decrease in all parameters, when compared to the OVA group (P<0.05). The treatment combining Y-27632 with corticosteroid (ORC group) maximized the attenuation of the content of collagen and IFN-y in the airways walls, and of IL-2, IFN-?, 8-iso-PGF2? and NF-?B in distal parenchyma, when compared to the OVA-RHO and OVA-C groups (P<0.05). In the ORC group, there was a reduction of cells positive for TIMP-1 and eosinophils in the alveolar septum, compared to the OVA-C group (P<0.05). CONCLUSIONS: Rho kinase or treatment with corticosteroids contributed to the control of the pulmonary mechanics response, Th1 and Th2 lymphocyte and eosinophil responses, extracellular matrix remodeling, and activation of the oxidative stress in the airways and distal parenchyma of this animal model. The combined treatment with Rho kinase and corticosteroid maximized the control of part of the remodeling response and inflammation of the airways and parenchyma. Rho-kinase inhibition combined or not with corticosteroids can be considered a future pharmacological tool for treatment of chronic pulmonary diseases

Introdução: Pearlman e colaboradores relacionou a presença de mutações ativadoras no gene MAP3K1 com o desenvolvimento testicular anormal em pacientes com disgenesia gonadal 46,XY familial, embora os estudos em camundongos tenham demonstrado que o gene Map3k1 não é essencial para a determinação testicular. No desenvolvimento gonadal masculino, a ligação do MAP3K1 à proteína RHOA promove uma fosforilação normal de p38 e ERK1/2, o que determina um bloqueio da via da beta-catenina pela MAP3K4. Já no desenvolvimento feminino, ocorre uma hiper fosforilação de p38 e ERK1/2, o que determina a ativação da via da beta-catenina e o bloqueio da via de retroalimentação positiva do SOX9 e o desenvolvimento testicular. Objetivos: Pesquisar a presença de variantes alélicas do gene MAP3K1 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento sexual (1) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal e avaliar a repercussão funcional das variantes identificadas. Casuística e Métodos: Quarenta e sete pacientes com disgenesia gonadal 46,XY (17 com a forma completa e 29 com a forma parcial) e uma paciente com DDS 46,XY de causa etiológica não conhecida foram estudados. As regiões codificadoras do gene MAP3K1 foram amplificadas e sequenciadas pelo método de Sanger ou painel customizado de genes-alvo associados ao DDS. Estudo in vitro utilizando o método de detecção colorimétrica In-Cell ELISA com anticorpos específicos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foi realizado em fibroblastos obtidos por biópsia de pele e mantidos em cultura celular de 3 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1. A quantificação da fosforilação de p38 e ERK por ensaio de citometria em células linfoblastóides mutadas foram realizados em amostras de 4 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1 em estudo realizado em colaboração. Imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 foram realizadas em tecidos gonadais parafinados das pacientes portadoras de variantes alélicas nos genes MAP3K1 e FGFR2. Resultados: Vinte e uma variantes alélicas, sete das quais ainda não descritas na literatura, foram identificadas no gene MAP3K1. Quatro novas variantes alélicas exônicas e não sinônimas (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg e p.Cys691Arg) foram identificadas em heterozigose; todas foram classificadas como deletérias para a proteína nos estudos de predição \"in silico\", não foram identificadas em indivíduos controles brasileiros estudados e não estão descritas nos bancos de dados populacionais. A variante p.Leu639Pro foi identificada em duas irmãs com disgenesia gonadal 46,XY portadoras da variante p.Ser453Leu no gene FGFR2 identificada previamente. A variante intrônica c.834+1G >T identificada em heterozigose foi classificada como deletéria à proteína na análise no site de predição para alteração de \"splicing\". Os ensaios colorimétricos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foram inconclusivos. Os estudos in vitro de avaliação dos níveis de fosforilação de p38 e ERK evidenciaram uma maior fosforilação nas culturas celulares mutantes para o MAP3K1 quando comparado com a linhagem celular selvagem, resultado estatisticamente significativo ( p < 0,001) e que corrobora com os dados publicados previamente. A imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 mostrou uma maior marcação em células germinativas nos tecidos gonadais das pacientes portadoras das variantes no MAP3K1 e FGFR2 do que no tecido testicular normal, porém marcações foram identificadas também em células germinativas de tecidos testiculares de indivíduos com DDS 46,XY de outras etiologias. Conclusões: Os achados sugerem fortemente a participação das mutações identificadas no MAP3K1 na etiologia dos distúrbios do desenvolvimento sexual dos pacientes estudados. Porém, uma melhor compreensão dos mecanismos de participação da via MAPK nas redes gênicas de regulação do processo de determinação testicular humano ainda é necessário / Introduction: Pearlman et al. associated the presence of activating mutations in MAP3K1 gene with abnormal testicular development in patients with familial 46,XY gonadal dysgenesis, although studies in mice have shown that the Map3k1 gene is not essential for testicular determination. In male gonadal development, the binding of MAP3K1 to the RHOA protein promotes a normal phosphorylation of p38 and ERK1/2, and a blockade of the beta- catenin pathway is determined by MAP3K4. In the female development, hyperphosphorylation of p38 and ERK1/2 occurs. p38 and ERK1/2 hyperphosphorylated determine the activation of the beta-catenin pathway, the blockade of the positive feedback pathway of SOX9 and the testicular development. Objectives: To investigate the presence of allelic variants of the MAP3K1 gene in patients with 46,XY disorders of sex development (DSD) due to abnormalities of gonadal development and to evaluate the functional repercussion of the identified variants. Patients and Methods: Forty-seven patients with 46,XY gonadal dysgenesis (17 patients with complete form and 29 with partial form) and one patient with 46,XY DSD of unknown cause were studied. The MAP3K1 coding regions were amplified and sequenced by Sanger method or by custom panel of target genes associated with DSD. In-Cell ELISA assay with specific antibodies for the detection of phosphorylated and non-phosphorylated ERK1/2 and AKT was performed on fibroblasts obtained by skin biopsy and kept in cell culture of 3 individuals with MAP3K1 variants. Quantification of p38 and ERK phosphorylation by cytometric assay on mutated lymphoblastoid cells were performed on samples from 4 subjects with MAP3K1 variants in a collaborative study. Immunohistochemistry with anti-Caspase-3 antibodies were performed on paraffinembedded gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 allelic variants. Results: Twenty-one allelic variants, seven of them have not yet been described in the literature, were identified in the MAP3K1. Four novel exonic and non-synonymous allelic variants (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg and p.Cys691Arg) were identified in heterozygous state; all of them were classified as deleterious in silico prediction sites; they were not identified in Brazilian control subjects and they were not described in the human genetic variation databases. The p.Leu639Pro variant was identified in two sisters with 46,XY gonadal dysgenesis carrying the previously identified FGFR2 variant (p Ser453Leu). The intronic c.834+1G > T variant identified in heterozygous state was classified as deleterious in the prediction sites. Colorimetric assays for the detection of phosphorylated and nonphosphorylated ERK1/2 and AKT were not significant. In vitro studies to evaluate p38 and ERK phosphorylation levels evidenced increased phosphorylation in the MAP3K1 mutant cells when compared to the wild type cells line; a statistically significant result (p < 0.001) that confirmed previously published data. The immunohistochemistry study with anti-Caspase-3 antibodies showed that the gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 variants exhibited more apoptotic germ ceIls than normal testicular tissue, but stained germ cells were also identified in the testicular tissues of the 46,XY DSD controls.Conclusions: These findings strongly suggest the participation of MAP3K1 mutations in the etiology of the testicular abnormalities of the 46,XY DSD patients of this study. However, a better understanding of the mechanisms of MAPK pathway in the gene regulatory networks of the human testicular determination process is still necessary

INTRODUÇÃO: Embora os corticosteróides sejam considerados tratamento padrão-ouro na asma, pacientes com asma grave não são totalmente controlados com este tratamento. Estudos prévios com inibidores da Rho quinase sugeriram uma influência benéfica destas drogas na asma, atuando como uma possível alternativa anti-inflamatória. No entanto, não há estudos anteriores avaliando os efeitos destes inibidores, associados ou não com corticosteróides, na modulação da mecânica do sistema respiratório e oscilatória do tecido pulmonar distal, assim como nas alterações histopatológicas, em modelo animal de inflamação pulmonar crônica. OBJETIVOS: Avaliar se o tratamento com o inibidor específico da Rho (Y- 27632), associado ou não com a dexametasona modula a resposta de mecânica pulmonar, inflamatória, de remodelamento da matriz extracelular e ativação do estresse oxidativo em cobaias com inflamação alérgica crônica. MÉTODOS: As cobaias receberam sete inalações de ovoalbumina (1-5mg/ml; grupo OVA) durante 4 semanas. A partir da quinta inalação, os animais do grupo da Rho quinase receberam inalação de Y-27632 (1mM) (grupo OVA-RHO) e ou dexametasona (2 mg.kg-1) associada ou não a Y-27632 (grupos OVA-C ou grupos ORC), 10 minutos antes de cada inalação com OVA. Setenta e duas horas depois da sétima inalação, os animais foram anestesiados, exsanguinados, o óxido nítrico exalado foi coletado e a mecânica do sistema respiratório (Ers e Rrs) e oscilatória do tecido pulmonar distal (Et e Rt) foram realizadas em condições basais e após desafio com OVA (0,1%). Após, as fatias de pulmão foram removidas e submetidas à avaliação histopatológica. RESULTADOS: Houve um aumento no óxido nítrico exalado, nas respostas máximas de Ers, Rrs, Rt e Et após desafio antigênico, nos eosinófilos, nas células positivas para IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-?, iNOS, MMP-9, TIMP-1,TGF- ß, NF?B e no conteúdo do 8-iso-PGF2?, no conteúdo de fibras elásticas, colágenas e de actina em vias aéreas e no parênquima pulmonar distal do grupo OVA comparado ao controle (P<0,05). Nos grupos OVA-RHO, OVA-C e ORC houve uma diminuição em todos os parâmetros comparados ao grupo OVA (P<0,05). A associação do Y-27632 com o tratamento com corticosteróide (grupo ORC) potencializou a atenuação do conteúdo de colágeno e IFN-? na parede das vias aéreas e IL-2, IFN-?, 8-iso-PGF2? e NF-?B no parênquima distal comparado aos grupos OVA-RHO e OVA-C (P<0,05). No grupo ORC houve uma redução nas células positivas para TIMP-1 e eosinófilos no septo alveolar comparado ao grupo OVA-C (P<0,05). CONCLUSÕES: A inibição da Rho quinase ou o tratamento com corticosteróides contribuíram para o controle da resposta de mecânica pulmonar, da resposta eosinofílica e linfocitária Th1 e Th2, do remodelamento da matriz extracelular e da ativação do estresse oxidativo nas vias aéreas e parênquima distal neste modelo animal. A associação do inibidor da Rho quinase com o corticosteróide potencializou o controle de parte da resposta de remodelamento e de inflamação nas vias aéreas e parênquima. A inibição da Rho quinase associada ou não a corticosteróides pode ser considerada uma ferramenta farmacológica futura para o tratamento de doenças pulmonares crônicas / INTRODUCTION: Although corticosteroids are considered gold standard of asthma treatment, patients with serious asthma are not totally controlled with this treatment. Previous studies with Rho-kinase inhibitors suggested a beneficial influence of these drugs on asthma, being a possible anti-inflammatory alternative. However, there are no previous studies evaluating in an animal model of chronic pulmonary inflammation the effects of such inhibitors, combined or not with corticosteroids, on the mechanics modulation of the respiratory system and oscillation of distal pulmonary tissue, as well as on histopathological alterations. OBJECTIVES: To evaluate whether treatment with the specific Rho inhibitor (Y-27632), combined or not with dexamethasone, modulates the responses of pulmonary mechanics, inflammation, extracellular matrix remodeling, and oxidative stress activation in guinea pigs with chronic allergic inflammation. METHODS: Guinea pigs received seven ovalbumin inhalations (1-5mg/ml; OVA group) during 4 weeks. After the fifth inhalation, the animals of the Rho-kinase group received inhalation of Y-27632 (1mM) (OVA-RHO group) and/or dexamethasone (2 mg.kg-1), combined or not with Y-27632 (OVA-C groups or ORC groups), 10 minutes before each inhalation with OVA. Seventy-two hours following the seventh inhalation, the animals were anesthetized, exsanguinated, the exhaled nitric oxide was collected, and mechanics of the respiratory system (Ers and Rrs) and oscillation of the distal lung tissue (Et e Rt) were performed in basal conditions and after challenge with OVA (0.1%). Afterwards, lung slices were removed and submitted to histopathological evaluation. RESULTS: There was an increase of exhaled nitric oxide, maximum responses of Ers, Rrs, Et and Rt after antigen challenge, eosinophil counts, cells positive for IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-?, iNOS, MMP-9, TIMP-1,TGF-ß, NF?B, and in the content of 8-iso-PGF2?, elastic fibers, collagen fibers and actin in the airways in distal lung parenchyma of the OVA group, compared to the control (P<0.05). In the OVA-RHO, OVA-C and ORC groups there was a decrease in all parameters, when compared to the OVA group (P<0.05). The treatment combining Y-27632 with corticosteroid (ORC group) maximized the attenuation of the content of collagen and IFN-y in the airways walls, and of IL-2, IFN-?, 8-iso-PGF2? and NF-?B in distal parenchyma, when compared to the OVA-RHO and OVA-C groups (P<0.05). In the ORC group, there was a reduction of cells positive for TIMP-1 and eosinophils in the alveolar septum, compared to the OVA-C group (P<0.05). CONCLUSIONS: Rho kinase or treatment with corticosteroids contributed to the control of the pulmonary mechanics response, Th1 and Th2 lymphocyte and eosinophil responses, extracellular matrix remodeling, and activation of the oxidative stress in the airways and distal parenchyma of this animal model. The combined treatment with Rho kinase and corticosteroid maximized the control of part of the remodeling response and inflammation of the airways and parenchyma. Rho-kinase inhibition combined or not with corticosteroids can be considered a future pharmacological tool for treatment of chronic pulmonary diseases

Introdução: Pearlman e colaboradores relacionou a presença de mutações ativadoras no gene MAP3K1 com o desenvolvimento testicular anormal em pacientes com disgenesia gonadal 46,XY familial, embora os estudos em camundongos tenham demonstrado que o gene Map3k1 não é essencial para a determinação testicular. No desenvolvimento gonadal masculino, a ligação do MAP3K1 à proteína RHOA promove uma fosforilação normal de p38 e ERK1/2, o que determina um bloqueio da via da beta-catenina pela MAP3K4. Já no desenvolvimento feminino, ocorre uma hiper fosforilação de p38 e ERK1/2, o que determina a ativação da via da beta-catenina e o bloqueio da via de retroalimentação positiva do SOX9 e o desenvolvimento testicular. Objetivos: Pesquisar a presença de variantes alélicas do gene MAP3K1 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento sexual (1) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal e avaliar a repercussão funcional das variantes identificadas. Casuística e Métodos: Quarenta e sete pacientes com disgenesia gonadal 46,XY (17 com a forma completa e 29 com a forma parcial) e uma paciente com DDS 46,XY de causa etiológica não conhecida foram estudados. As regiões codificadoras do gene MAP3K1 foram amplificadas e sequenciadas pelo método de Sanger ou painel customizado de genes-alvo associados ao DDS. Estudo in vitro utilizando o método de detecção colorimétrica In-Cell ELISA com anticorpos específicos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foi realizado em fibroblastos obtidos por biópsia de pele e mantidos em cultura celular de 3 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1. A quantificação da fosforilação de p38 e ERK por ensaio de citometria em células linfoblastóides mutadas foram realizados em amostras de 4 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1 em estudo realizado em colaboração. Imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 foram realizadas em tecidos gonadais parafinados das pacientes portadoras de variantes alélicas nos genes MAP3K1 e FGFR2. Resultados: Vinte e uma variantes alélicas, sete das quais ainda não descritas na literatura, foram identificadas no gene MAP3K1. Quatro novas variantes alélicas exônicas e não sinônimas (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg e p.Cys691Arg) foram identificadas em heterozigose; todas foram classificadas como deletérias para a proteína nos estudos de predição \"in silico\", não foram identificadas em indivíduos controles brasileiros estudados e não estão descritas nos bancos de dados populacionais. A variante p.Leu639Pro foi identificada em duas irmãs com disgenesia gonadal 46,XY portadoras da variante p.Ser453Leu no gene FGFR2 identificada previamente. A variante intrônica c.834+1G >T identificada em heterozigose foi classificada como deletéria à proteína na análise no site de predição para alteração de \"splicing\". Os ensaios colorimétricos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foram inconclusivos. Os estudos in vitro de avaliação dos níveis de fosforilação de p38 e ERK evidenciaram uma maior fosforilação nas culturas celulares mutantes para o MAP3K1 quando comparado com a linhagem celular selvagem, resultado estatisticamente significativo ( p < 0,001) e que corrobora com os dados publicados previamente. A imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 mostrou uma maior marcação em células germinativas nos tecidos gonadais das pacientes portadoras das variantes no MAP3K1 e FGFR2 do que no tecido testicular normal, porém marcações foram identificadas também em células germinativas de tecidos testiculares de indivíduos com DDS 46,XY de outras etiologias. Conclusões: Os achados sugerem fortemente a participação das mutações identificadas no MAP3K1 na etiologia dos distúrbios do desenvolvimento sexual dos pacientes estudados. Porém, uma melhor compreensão dos mecanismos de participação da via MAPK nas redes gênicas de regulação do processo de determinação testicular humano ainda é necessário / Introduction: Pearlman et al. associated the presence of activating mutations in MAP3K1 gene with abnormal testicular development in patients with familial 46,XY gonadal dysgenesis, although studies in mice have shown that the Map3k1 gene is not essential for testicular determination. In male gonadal development, the binding of MAP3K1 to the RHOA protein promotes a normal phosphorylation of p38 and ERK1/2, and a blockade of the beta- catenin pathway is determined by MAP3K4. In the female development, hyperphosphorylation of p38 and ERK1/2 occurs. p38 and ERK1/2 hyperphosphorylated determine the activation of the beta-catenin pathway, the blockade of the positive feedback pathway of SOX9 and the testicular development. Objectives: To investigate the presence of allelic variants of the MAP3K1 gene in patients with 46,XY disorders of sex development (DSD) due to abnormalities of gonadal development and to evaluate the functional repercussion of the identified variants. Patients and Methods: Forty-seven patients with 46,XY gonadal dysgenesis (17 patients with complete form and 29 with partial form) and one patient with 46,XY DSD of unknown cause were studied. The MAP3K1 coding regions were amplified and sequenced by Sanger method or by custom panel of target genes associated with DSD. In-Cell ELISA assay with specific antibodies for the detection of phosphorylated and non-phosphorylated ERK1/2 and AKT was performed on fibroblasts obtained by skin biopsy and kept in cell culture of 3 individuals with MAP3K1 variants. Quantification of p38 and ERK phosphorylation by cytometric assay on mutated lymphoblastoid cells were performed on samples from 4 subjects with MAP3K1 variants in a collaborative study. Immunohistochemistry with anti-Caspase-3 antibodies were performed on paraffinembedded gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 allelic variants. Results: Twenty-one allelic variants, seven of them have not yet been described in the literature, were identified in the MAP3K1. Four novel exonic and non-synonymous allelic variants (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg and p.Cys691Arg) were identified in heterozygous state; all of them were classified as deleterious in silico prediction sites; they were not identified in Brazilian control subjects and they were not described in the human genetic variation databases. The p.Leu639Pro variant was identified in two sisters with 46,XY gonadal dysgenesis carrying the previously identified FGFR2 variant (p Ser453Leu). The intronic c.834+1G > T variant identified in heterozygous state was classified as deleterious in the prediction sites. Colorimetric assays for the detection of phosphorylated and nonphosphorylated ERK1/2 and AKT were not significant. In vitro studies to evaluate p38 and ERK phosphorylation levels evidenced increased phosphorylation in the MAP3K1 mutant cells when compared to the wild type cells line; a statistically significant result (p < 0.001) that confirmed previously published data. The immunohistochemistry study with anti-Caspase-3 antibodies showed that the gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 variants exhibited more apoptotic germ ceIls than normal testicular tissue, but stained germ cells were also identified in the testicular tissues of the 46,XY DSD controls.Conclusions: These findings strongly suggest the participation of MAP3K1 mutations in the etiology of the testicular abnormalities of the 46,XY DSD patients of this study. However, a better understanding of the mechanisms of MAPK pathway in the gene regulatory networks of the human testicular determination process is still necessary

O câncer de pele é um dos mais frequentes entre humanos, sendo o melanoma o tipo menos comum, mas com grande importância devido à agressividade que ele apresenta. Um dos principais agentes etiológicos deste tipo de tumor é a radiação ultravioleta proveniente da luz solar. A fração de radiação ultravioleta B (UVB) gera dano no DNA e induz alterações nas células da pele após a exposição prolongada e sem proteção. A resposta à luz UVB em melanócitos e melanomas é diferente, mostrando a importância do perfil celular. O efeito genotóxico da luz UVB pode alterar a expressão de moléculas como galectina-3 e MAPKs, desencadeando respostas UVB-dependentes. Galectina-3 é uma lectina que reconhece beta-galactosídeos e está envolvida na regulação de diversos processos celulares que modificam a viabilidade celular e a proliferação. Esta molécula é ubiquamente expressa apresentando um comportamento específico dependendo da sua localização subcelular. No presente trabalho mostramos que a distribuição de galectina-3 em melanoma e melanócitos é ampla, encontrando-se tanto no núcleo como no citoplasma, podendo ser modificada após irradiação UVB ou ainda secretada para o meio extracelular. Além disso, observamos que a luz UVB ativa a via de MAPKs, proteínas quinases ativadas por mitógenos envolvidas no crescimento, sobrevivência, diferenciação e resposta a estresse, em melanócitos e em melanomas poucos minutos após a exposição à UVB. Uma maior atividade de p38 e de ERK é evidenciada em melanomas, enquanto que em melanócitos a via de p38 é a mais ativa, corroborando a noção de que a resposta celular à luz UVB difere entre melanócitos e melanoma. As moléculas p38 e JNK são proteínas quinases ativada pelo estresse (SAPK). A via de JNK não é tão responsiva em alguns melanomas, mas ativação desta molécula parece estar envolvida com a sobrevivência celular e a translocação mitocondrial após UVB. Em adição, a inibição de JNK leva ao aumento de morte celular em linhagens melanocíticas irradiadas e não irradiadas, e em melanoma induz morte e aumenta autofagia após irradiação. Esta molécula parece interagir com galectina-3 em modelos murinos, mas não em melanomas humanos, enquanto que ERK interage fisicamente com galectina-3 em melanócitos e melanomas humanos, independente de UVB. Através do silenciamento de galectina-3 pela técnica de RNA de interferência, mostramos o aumento da ativação da via de ERK após irradiação e de proteínas downstream de ERK, promovendo a proliferação celular em melanomas nessas condições. Em melanócitos parece existir uma regulação negativa da via de ERK por galectina-3 acompanhada de uma diminuição da viabilidade celular após o silenciamento dessa lectina, independente de UVB. Estes resultados mostram que galectina-3 é uma importante reguladora de eventos associados com sobrevivência e morte celular em melanoma. Por outro lado, em melanomas a ausência de galectina-3 induz aumento da proliferação associada à ativação de ERK, evidenciando a importância do tipo celular na ação de galectina-3 / Skin cancer is the most common cancer among humans, melanoma being the least common type but very important due to its aggressive behavior. A major etiologic agent of this type of tumor is ultraviolet radiation from the sunlight. The ultraviolet B rays (UVB) cause DNA damage and induce alterations over the skin cells after prolonged exposition without protection. The UVB response in melanocytes and melanoma cells is different. This shows the importance of the cellular profile. The genotoxic effect of UVB light can alter the expression of molecules such as galectine-3 and MAPKs and also triggers multiple responses UVB-dependent. Galectin-3 is a lectin that recognizes beta-galactosides. It is involved in the regulation of many cellular processes that modify cellular viability and proliferation and presents specific behavior depending on its subcellular localization. In the present study we showed that galectine-3 distribution in melanoma cells and melanocytes is large, lying both in the nucleus and in the cytoplasm. After UVB irradiation this distribution could be modified or even galactine-3 secreted itself into the extracellular space. Moreover, we observed that UVB light activates the mitogen-activated protein kinase pathway (MAPK) involved in growth, survival, differentiation and stress-response in melanocytes and in melanoma cells just a few minutes after exposure. An increased activity of p38 and ERK was observed in melanomas, while in melanocytes just p38 pathway was highly active, supporting the notion that the cellular response to UVB light differs between melanocytes and melanoma cells. The molecules p38 and JNK are stress-activated protein kinases (SAPK). The JNK pathway is not responsive in some melanoma cells, but the activation of this molecule appears to be involved in cell survival and mitochondrial translocation after being exposed to UVB. Inhibition of JNK leads to increased cell death in irradiated and non-irradiated melanocytic lineage, but in melanoma cells induces cell death and increased autophagy only after irradiation. This molecule seems to interact with galectin-3 in mouse models but not in human melanomas, whereas ERK physically interacts with galectin-3 in human melanocytes and melanoma cells, regardless of UVB exposure. Through the knockdown of galectin-3 by siRNA, we showed increased activation of the ERK and its downstream pathway after irradiation, thus inducing cell proliferation. In melanocytes seems to be a negative regulation of the ERK pathway by galectin-3 accompanied by a decrease in cell viability after its knockdown regardless of UVB exposure. These results show that galectin-3 is an important regulatory molecule of events associated with cell death and survival in melanoma, which has different behavior depending on the cell type

Embora a grande maioria dos pacientes com asma tenha controle com o padrão de tratamento com corticosteroides, 5 a 10% destes asmáticos ainda desenvolvem algumas formas graves da doença e são considerados pacientes difíceis de controlar. A ativação do NFkB contribui para a manutenção e desenvolvimento de inflamação pulmonar crônica na fisiopatologia da asma. O éster fenetilico do ácido cafeico (CAPE), um componente ativo de própolis das colmeias de abelhas, é conhecido por ter propriedades antiinflamatórias e imunomoduladoras. É conhecido como um potente e um inibidor específico da ativação de NFk B. Nós anteriormente mostramos que Y27632, um inibidor de Rho quinase, atenuou a resposta pulmonar das vias aéreas, inflamação e remodelamento. Para o nosso conhecimento, tratamentos com os inibidores de NFk B ou Rho-quinase em comparação com o uso de corticosteroides não foram previamente investigados em um modelo animal de inflamação pulmonar crônica alérgica. MÉTODOS: Trinta camundongos BALB/C machos (20 a 25g) foram divididos em cinco grupos (n=6 em cada grupo): SAL (instilado com solução salina), OVA (expostos à ovalbumina), OVA-CAPE (expostos à ovalbumina e tratados com CAPE), OVA-RHO (expostos à ovalbumina e tratados com inibidor de Rho), OVA-CORT (expostos à ovalbumina e tratados com corticosteróide). Os animais foram sensibilizados para ovalbumina durante 28 dias e os controles receberam solução salina. A administração de corticosteróide (1mg/Kg/dia) e CAPE (10mg/Kg/dia) foi feita por via intraperitoneal e Y-27632 (10 mg/kg) administrado por via intranasal, todos nos dias 22, 24, 26 e 28 do protocolo experimental. Vinte e quatro horas após a conclusão do protocolo experimental, os animais foram submetidos a uma avaliação da curva de resposta à dose à metacolina, consideramos as respostas máximas da Resistência ao Sistema Respiratório (Rrs) e Elastância (Ers) às 24 horas após o último desafio com ovalbumina (respostas basais e máximas após a metacolina desafio 3, 30 e 300mg/mL). Posteriormente, os pulmões foram removidos e a análise histológica foi realizada usando morfometria. RESULTADOS: não houve diferenças nos valores basais de todos os grupos. expostos à ovalbumina Houve um aumento em Rrs e Ers após o desafio da metacolina em comparação com o grupo SAL (p < 0,05). No grupo exposto ao OVA, os tratamentos com CAPE, CORT e RHO reduziram a resposta máxima de Ers em relação ao OVA (p < 0,05). Em relação ao tratamento com somente CAPE atenuou a resposta máxima de Rrs em relação ao OVA (p < 0,05). Houve diminuição nos eosinófilos, conteúdo de fibras de colágeno, células positivas para iNOS, MMP-9, TIMP-1 em grupos OVA-CAPE, OVA-CORT e OVA-RHO em comparação com os animais sensibilizados (grupo OVA) (p < 0,05). CONCLUSÃO: a inibição de NFkB e Rho-quinase contribuiu para o controle da hiperresponsividade, inflamação, processo de remodelamento da matriz extracelular e ativação do estresse oxidativo. Embora os inibidores de NFkB e Rho-quinase sejam uma alternativa ao tratamento da asma, são necessários mais estudos / Although the great majority of asthma patients obtain control with the gold standard treatment using corticosteroids, 5 to 10% of these asthmatics still develop some severe forms of the disease, called difficult to control patients. Activation of NFk B contributes to the maintenance and development of chronic lung inflammation in pathophysiology of asthma. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE), an active component of propolis from honeybee hives, is known to have anti-inflammatory and immunomodulatory properties. It is known as a potent and a specific inhibitor of NFk B activation. We previously have shown that Y27632, a Rho-quinase inhibitor, attenuated airway lung responsiveness, inflammation and remodeling. To our knowledge, treatments with the NFk B or Rho-kinase inhibitors compared to the use of corticosteroids have not been previously investigated in an animal model of chronic allergic lung inflammation. METHODS: Thirty male BALB/c mice (20 to 25g) were divided into five groups (n=6 in each group): SAL (saline-instilled), OVA (exposed-ovalbumin), OVA-CAPE (exposedovalbumin and treated with CAPE), OVA-RHO (exposed-ovalbumin and treated with Rho inhibitor), OVA-CORT (exposed-ovalbumin and treated with corticosteroid). The BALB/c mice were sensitized to ovalbumin for 28 days and controls received saline. The administration of corticosteroid (1mg/Kg/day) and CAPE (10mg/Kg/day) was made intraperitoneally and Y-27632 (10mg/kg) was intranasally, all on days 22, 24, 26 and 28 of the experimental protocol. Twentyfour hours after completion of the experimental protocol, animals were subject to an evaluation of dose response curve to methacholine. We considered the maximal responses of respiratory system resistance (Rrs) and elastance (Ers) 24 hours after the last challenge with ovalbumin (baseline and maximal responses after metacholine challenge 3, 30 and 300mg/mL). Afterwards, lungs were removed and histological analysis was performed using morphometry. RESULTS: There were no differences on baseline values of all groups. Ovalbumin-exposed mice had an increase in Rrs and Ers after methacholine challenge compared to SAL group (p < 0.05). In OVA-exposed groups, the treatments with CAPE, CORT and RHO reduced maximal response of %Ers compared to OVA (p < 0.05). In relation to %Rrs only CAPE treatment attenuated the maximal response compared to OVA (p < 0.05). There was a decrease in eosinophils, collagen fibers content, iNOS, MMP-9, TIMP-1 positive cells in OVACAPE, OVA-CORT and OVA-RHO groups compared to only sensitized animals (OVA group) (p < 0.05). CONCLUSION: NFkB and Rho-quinase inhibition contributes to the control of hyperresponsiveness, inflammation, extracellular matrix remodeling process and oxidative stress activation. Although NFkB and Rho-quinase inhibitors were an alternative to asthma treatment, more studies are needed

A isoforma 3 do trocador Na+ /H+ (NHE3), presente em membrana apical, é a proteína de transporte que medeia a maior parte da reabsorção de NaCl e NaHCO3- em túbulo proximal renal. A fosforilação direta do NHE3 por PKA na serina 552 é um dos mecanismos pelos quais a sua atividade pode ser inibida. A ligação da angiotensina II (Ang II) ao receptor AT1 (AT1R) em túbulo proximal estimula a atividade do NHE3 por diferentes vias de sinalização. Entretanto, não foram ainda bem estabelecidos os efeitos da ativação da via AT1R/Gi, com consequente diminuição nos níveis de cAMP, na regulação do NHE3. A Ang II pode ainda estimular a atividade do NHE3 por promover a sua translocação da base para o corpo das microvilosidades, entretanto, o papel da proteína motora miosina IIA nesta translocação em resposta à Ang II ainda não foi estabelecido. Sendo assim esta tese teve como objetivos: (1) testar a hipótese de que a Ang II diminui os níveis de fosforilação do NHE3 mediados pelo cAMP/PKA na serina 552 aumentando a sua atividade por reduzir os níveis de cAMP e (2) testar a hipótese de que a miosina IIA participa da redistribuição do NHE3 da base para o corpo das microvilosidades em túbulo proximal renal em condições de estímulo da reabsorção de sódio, como ocorre em resposta à Ang II. Visando avaliar os efeitos da ativação da via AT1R/Gi na regulação do NHE3, verificamos, por meio da técnica de recuperação do pH dependente de Na+, que, em condições basais, a Ang II estimulou a atividade do NHE3, mas não alterou a atividade da PKA e nem afetou os níveis de fosforilação do NHE3 na serina 552 em uma linhagem de células de túbulo proximal (OKP). Entretanto, na presença da forskolin (FSK), agente que eleva os níveis intracelulares de cAMP, a Ang II foi capaz de contrapor-se ao efeito inibitório da FSK sobre o NHE3 por promover redução na concentração de cAMP, diminuição da atividade da PKA e, consequentemente, diminuição nos níveis de fosforilação da serina 552. Todos os efeitos da Ang II foram bloqueados quando um pré-tratamento com Losartan, antagonista do receptor AT1, foi feito nas células OKP, destacando a contribuição da via AT1R/proteína Gi no aumento da atividade do NHE3 pela Ang II. Observamos que a inibição da proteína Gi com PTX (toxina pertussis) diminuiu a atividade do NHE3 em células OKP e que a PTX diminuiu a atividade do NHE3 assim como preveniu o efeito estimulatório da Ang II sobre a atividade do NHE3 em túbulo proximal de ratos Wistar. Adicionalmente, com a intenção de avaliar os efeitos da miosina IIA na redistribuição do NHE3, constatamos que a blebistatina, inibidor da miosina IIA, preveniu completamente o aumento de atividade do NHE3 mediado pela Ang II em ratos Wistar e que o uso da blebistatina foi capaz de prevenir o aumento do NHE3 na superfície de células OKP tratadas com Ang II. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a Ang II contrapõe-se aos efeitos do cAMP/PKA sobre a fosforilação e a atividade do NHE3 pela ativação da via AT1R/Gi e que a miosina IIA desempenha um papel na mediação da regulação da atividade do NHE3 em túbulo proximal renal de ratos em resposta à Ang II. Sugerem ainda que a desfosforilação do NHE3 na serina 552 pode representar um evento chave na regulação do manuseio de sal tubular proximal pela Ang II na presença de hormônios natriuréticos que promovem o aumento dos níveis de cAMP e da fosforilação do transportador e que a miosina IIA está envolvida na regulação do tráfego do NHE3 em túbulo proximal renal / The Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3), expressed on the apical membrane, is responsible for most NaCl and NaHCO3 - reabsorption in the renal proximal tubule. Direct phosphorylation of NHE3 by PKA at serine 552 is one of the mechanisms by which its activity is inhibited. Binding of angiotensin II (Ang II) to the AT1 receptor (AT1R) in the proximal tubule stimulates NHE3 activity through multiple signaling pathways. However, the effects of AT1R/Gi activation and subsequent decrease in cAMP accumulation on NHE3 regulation are not well established. Ang II can also stimulate NHE3 activity by promoting its translocations from the base to the body of the microvilli, however, the role of the myosin IIA motor protein in this translocation in response to Ang II is not yet established. Therefore, the aims of this thesis are: (1) to test the hypothesis that Ang II decreases the cAMP/PKA-mediated NHE3 phosphorylation levels at serine 552 increasing its activity by reducing cAMP levels and (2) to test the hypothesis that myosin IIA participates in the NHE3 redistribution from the base to the body of the microvilli in the renal proximal tubule under conditions in which sodium reabsorption is stimulated, such as in response to Ang II. In order to evaluate the effects of AT1R/Gi pathway activation on NHE3 regulation, by means the intracellular pH recovery technique, we verified that under basal conditions, Ang II stimulated NHE3 activity but did not affect PKA-mediated NHE3 phosphorylation at serine 552 in opossum kidney (OKP) cells. However, in the presence of the cAMP-elevating agent forskolin (FSK), Ang II counteracted FSK-induced NHE3 inhibition, reduced intracellular cAMP concentrations, lowered PKA activity, and prevented the FSK-mediated increase in NHE3 serine 552 phosphorylation. All effects of Ang II were blocked by pretreating OKP cells with the AT1R antagonist Losartan, highlighting the contribution of the AT1R/Gi pathway in Ang II-mediated NHE3 upregulation under cAMP-elevating conditions. We also verified that Gi protein inhibition by pertussis toxin treatment decreased NHE3 activity both in vitro and in vivo and, more importantly, prevented the stimulatory effect of Ang II on NHE3 activity in Wistar rat proximal tubules. Additionally, we assessed the effects of myosin IIA on NHE3 redistribution, and found that blebbistatin, a myosin IIA inhibitor, completely prevented the increase of Ang II-mediated NHE3 activity in Wistar rats and that blebbistatin was able to prevent the increase of NHE3 on the Ang II-treated OKP cells surface. Collectively, our results suggest that Ang II counteracts the effects of cAMP/PKA on NHE3 phosphorylation and inhibition by activating the AT1R/Gi pathway and that myosin IIA plays a role in mediating the NHE3 activity regulation in the rat renal proximal tubule in response to Ang II. Furthermore, these findings support the notion that NHE3 dephosphorylation at serine 552 may represent a key event in the regulation of renal proximal tubule sodium handling by Ang II in the presence of natriuretic hormones that promote cAMP accumulation and transporter phosphorylation, and that myosin IIA is involved in NHE3 trafficking regulation in the renal proximal tubule

Partículas da exaustão de motores a diesel (DEP) têm propriedades toxicológicas, devido às características físico-químicas. O DEP é capaz de ativar as vias de sinalização intracelular e induzir alterações metabólicas em células e tecidos do sistema respiratório. O objetivo desta tese foi: 1) avaliar o perfil das mucinas e alterações epiteliais em explantes de traqueia de camundongo BALB/c expostos ao DEP e DEP tratado com ácido nítrico e solventes orgânicos; e 2) em cultura de células de epitélio brônquico humano (BEAS-2B) expostas ao DEP e DEP tratado com hexano (DEP/HEX) para avaliar ativação de MAPK (ERK e JNK), citotoxidade, integridade de citoesqueleto, viscoelasticidade celular e expressão gênica de enzimas envolvidas no estresse oxidativo e apoptose. Os resultados mostraram que, em explantes de traqueia, o DEP causa aumento significativo em relação ao grupo controle na quantidade de muco ácido (p= 0,001), diminuição no muco neutro (p=0,001), diminuição de muco misto (p= 0,001), aumento de vacuolização (p= 0,001), aumento de apoptose (p=0,001), ora com aumento de pERK e diminuição de pJNK, e vice-versa. Os explantes submetidos à exposição ao DEP e DEP/MET aumentaram significativamente o muco ácido (p=0,01) e DEP/HEX provocou aumento da extrusão do muco (p=0,007), provavelmente devido à ação do enriquecimento inorgânico. Para as células BEAS-2B, nos resultados obtidos com células epiteliais expostas ao DEP e DEP/HEX, foram observadas alterações na membrana citoplasmática, mitocôndrias e citoesqueleto. As células expostas apenas ao DEP em baixas concentrações (15ug/mL) apresentaram alterações na expressão de genes envolvidos no apoptose (BCL-2 e Caspase-3 (p=0,05 e p=0,01) e estresse oxidativo [(SOD1 e SOD2 e GPx. p=0,01 )], e CYP1A1 ((p=0,01) / Diesel exhaust particles (DEPs) from diesel engines have toxic properties that result from their physical and chemical characteristics. DEPs are able to activate intracellular signaling pathways and induce metabolic changes to cells and tissues of the human respiratory system. This dissertation sought to evaluate: 1) the profile of mucins and the epithelial changes to the tracheal explants of BALB/c mice exposed to both DEP and DEP treated with nitric acid and organic solvents (50 and 100 ug/mL; and 2) human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) in culture after their exposure to both DEP and DEP treated with hexane (DEP/HEX) at 100 ug/mL in order to determine MAPK (ERK/JNK) activation, cytotoxicity, cytoskeletal integrity, cell viscoelasticity and gene expression of the enzymes involved in oxidative stress and apoptosis. The results show that, in tracheal explants, DEP causes a significant increase (compared to the control) in the quantity of acidic mucus (p=0.001), a decrease in alkaline mucus (p=0.001), a decrease in mixed mucus (p=0.001), an increase in vacuolization (p=0.001), an increase in apoptosis (p=0.001), along with an increase in pERK and a decrease in pJNK, and vice versa. The explants that were exposed to DEP and DEP/MET were found to have significantly higher quantities of acidic mucus (p=0.01), and DEP/HEX caused an increase in mucus extrusion (p=0.007), which was likely due to inorganic enrichment. In the case of BEAS-2B cells, the results obtained from epithelial cells exposted to DEP and DEP/HEX revealed alterations in the cytoplasmic membrane, the mitochondria, and the cytoskeleton. The cells exposed to DEP alone at low concentrations (15 ug/mL) experienced alterations in the genes involved in apoptosis (BCL-2 and Caspase-3; p=0.05 and p=0.01, respectively), as well as oxidative stress [(SOD1, SOD2, and GPx; p=0.01 )], and changes to CYP1A1 (p=0.01)