La douleur neuropathique est due à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel. La prégabaline, un anticonvulsivant, et la duloxétine, un antidépresseur, sont des traitements de référence, efficaces chez un tiers des patients. Mieux comprendre leurs mécanismes d’action est crucial pour améliorer leur tolérance et leur efficacité. En utilisant un modèle murin de douleur neuropathique périphérique, nous montrons que : 1) la prégabaline, dont l’action est indépendante du système opioïdergique, agit sur la composante neuroimmunitaire périphérique de la douleur ; 2) la duloxétine agit via deux mécanismes indépendants, l’un central (contrôles descendants) pour un traitement aigu et l’autre périphérique (ganglion rachidien) pour un traitement chronique. Dans ce cas, l’analyse transcriptomique met en évidence une inhibition de l’inflammation neurogène. La comparaison des taux plasmatiques de duloxétine chez l’homme et chez la souris suggère une action périphérique chez l’homme. / Neuropathic pain is caused by a lesion or a disease of the somatosensory nervous system. Pregabalin, an anticonvulsant, and duloxetine, an antidepressant, are the standard treatments, effective in one-third of patients. A better understanding of their mechanisms of action is a crucial point to improve their tolerance and efficiency. By using a murine model of peripheral neuropathy, we have shown that : 1) pregabalin, whose effect is independent from the opioid system, acts on the peripheral neuroimmune component of pain ; 2) duloxetine acts via two independent mechanisms, one central (descending controls) for an acute treatment and the other peripheral (dorsal root ganglia) for a chronic treatment. In this case, transcriptomic analysis hightlights an inhibition of the neurogenic inflammation. Comparison of duloxetine plasmatic levels in humans and mice suggests a peripheral action in humans.

Suite au projet de séquençage du génome d’Arabidopsis thaliana, plus de 400 récepteurs de types serine/thréonine kinases (Protein Receptor Kinase ou PRK) ont été prédits. Par contre, seulement sept paires de récepteurs/ligands ont été caractérisées jusqu’à présent par des techniques de biochimie et d’analyse, de mutants. Parmi ceux-ci figurent les PRK : BRI1, CLV1, SRK, SR160, Haesa-IDA et PEPR1 qui jouent un rôle important dans le développement, l’auto-incompatibilité sporophytique et les mécanismes de défense. Le but de mon projet de maîtrise était de développer un bioessai à haut débit qui permettra la découverte de ligands peptidiques. Le bioessai utilisera des PRK chimériques composés du domaine extracellulaire (l’ectodomaine) de la PRK à l’étude fusionnée au domaine intracellulaire d’une PRK qui agira comme rapporteur. Deux stratégies sont présentement développées dans notre laboratoire : la première consiste à fusionner la PRK à l’étude avec le domaine intracellulaire (l’endodomaine) du récepteur tyrosine kinase animal EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Suite à l’interaction avec une fraction protéique contenant un ligand correspondant à la PRK étudiée, une transphosphorylation de l’endodomaine (le domaine kinase) serait détectable. La seconde stratégie utilise l’endodomaine du récepteur BRI1, un récepteur répondant aux brassinostéroïdes. Suite à l’interaction avec une fraction protéique contenant un ligand correspondant à la PRK étudiée, cette fois-ci nous devrions être en mesure de mesurer l’activation d’un gène rapporteur répondant normalement à une activation par les brassinostéroïdes. / The complete sequence of the genome of Arabidopsis thaliana was achieved in year 2000 and has resulted in the prediction of more than 400 receptor serine/threonine kinase or Plant Receptor Kinase (PRK). Despite this tremendous work, only seven pairs of ligand/receptor have been characterized through conventional techniques such as mutant analysis and biochemical characterization. These receptors have been found to play an important role in plant defense (SP160), development (BRI1, CLV1) and sporophytic autoincompatibility (SRK). The aim of the project was to develop a high throughput bioassay in order to find new ligands for known receptors. In order to do so, the bioassay will use chimeric protein technology, by fusing the ectodomain of a receptor to a known endodomaine. The latter will play the role of a reporter. Two strategies were developed in our laboratory and are being tested. The first strategy is to fuse the ectodomain of an unknown PRK to the phylogeneticaly unrelated kinase domain of the animal Epidermal Grown Factor Receptor (EGFR). When tested with a crude protein extract containing the specific ligand of the unknown PRK, a transphosphorylation should occur and be detected. The second strategy will use the endodomain of BRI1 as a reporter, a receptor responding to the brassinosteroid phytohormone, which will relay the message to a second construct used as a reporter gene once the ligand has bound the PRK ectodomain fused to the BRI1 endodomain.

Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires chez l’Homme, et leur implication dans un grand nombre de processus physiologiques justifie pleinement l’intérêt de leur étude. Les anticorps spécifiques de ces récepteurs sont des outils polyvalents à haute valeur ajoutée, qui restent toutefois encore trop rarement disponibles, notamment en raison des difficultés techniques posées par leur génération. Ce manuscrit présente la mise au point d’une méthode d’immunisation alternative et innovante, mettant en jeu des particules virales recombinantes dérivées du Virus de la Forêt de Semliki (SFV) codant pour le récepteur d’intérêt. Appliquée au récepteur de l’adénosine A2A humain, l’immunisation permet d’engendrer la surexpression de celui-ci à la surface des cellules de l’animal infecté, et de provoquer l’apparition d’une réponse immunitaire. Cette approche permet d’une part de générer un sérum polyclonal de souris spécifique au récepteur, et ouvre donc une nouvelle voie pour l’obtention d’anticorps monoclonaux murins. Elle semble d’autre part prometteuse pour la génération de nanobodies. / G Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest membrane protein family represented in the human genome. Their involvement in a wide number of biological processes fully supports their study. GPCR-targeting antibodies are versatile and valuable tools, which remain scarcely available, chiefly because their generation is a challenging process. This thesis presents an alternative and innovative strategy in which recombinant Semliki Forest Virus (SFV) particles coding for the receptor of interest are used as immunogens. When applied to the human version of the Adenosine A2A receptor, this method enables to cause the receptor’s overexpression at the surface of the infected animal cells, which generates an immune response. This strategy enables to raise receptor-specific mouse polyclonal serum. It opens a new path towards the generation of monoclonal mouse antibodies. Additionally, it seems to also be a promising approach to develop nanobodies.

La triadine est une famille de protéines du muscle squelettique. Quatre isoformes de la triadine ont été clonées: Trisk 95, Trisk 51, Trisk 49 et Trisk 32. Ce sont des protéines transmembranaires du reticulum sarcoplasmique (RS). Trisk 95 et Trisk 51 sont localisées dans la triade où elles sont associées au récepteur de la ryanodine (RyR), un canal calcique. Trisk 49 et Trisk 32 sont localisées dans le RS longitudinal. Il a été montré que Trisk 95 régule les relâchements de Ca2+ du RyR. L'objectif de ce travail de thèse a été d'étudier les fonctions des triadines dans le muscle squelettique grâce à différentes approches et techniques complémentaires. Dans un premier temps, Trisk 95 et de Trisk 51 ont été étudiées par surexpression in vivo dans les muscles de souris. La caractérisation de ces muscles a permis de mettre en évidence l'association du RyR avec la cavéoline, une protéine de la membrane plasmique. Dans un second temps, la fonction de Trisk 32 a été étudiée dans le muscle squelettique. L'étude précise de sa localisation a permis de montrer qu'elle est localisée dans la triade, dans le RS longitudinal, et à proximité des mitochondries. Des expériences de co-immunoprécipitation ont révélé qu'elle est associée avec le RyR et avec le récepteur de l'IP3. De par ses partenaires, Trisk 32 semble jouer un rôle dans la régulation de nombreux mécanismes impliquant le Ca2+. Enfin, le gène de la triadine a été invalidé chez la souris. Cette souris KO triadine présente une faiblesse musculaire et des défauts dans l'ultrastructure de la triade. Ces résultats indiquent qu'en plus de sa fonction de régulation des relâchements de Ca2+ la triadine pourrait avoir un rôle structural.

Les glandes salivaires sont des glandes mixtes : la salive (produit exocrine) estimpliquée dans le maintien de l'homéostasie buccale alors que les secrétions endocrines (ex :facteurs de croissance) ont un rôle physiologique (gamétogénèse, ostéogenèse,hypertension...) Chez les mammifères, elles affichent un dimorphisme sexuel qui laisseentrevoir une sensibilité éventuelle à des xeno-hormones.Ce mémoire présente l'action de la génistéine (phyto-oestrogène) et/ou de la vinclozoline(anti-androgène) sur la glande submandibulaire (SM) de rat lors d'une exposition précoce viala mère (gestation-lactation) et lors d'une exposition pendant la période de croissance (dusevrage à l'âge adulte). Les glandes SM, prélevées au stade immature et jeune adulte, ont faitl'objet d'une analyse histologique et d'une étude de marqueurs moléculaire des fonctionsendocrines et exocrines associées aux processus gustatifs. L'exposition précoce ralenti ledéveloppement de la glande SM et augmente sélectivement la préférence au sucré des malesimmatures mais pas des adultes ; l'analyse moléculaire révèle une action sélective sur lesfonctions exocrines corrélée à celle sur les préférences, ainsi qu'une action sur les fonctionsendocrines (facteurs de croissances) qui s'inverse avec l'âge. L'exposition à partir du sevrageperturbe seulement les mâles qui présentent des altérations des structures sécrétrices coupléesà des modifications d'expression des récepteurs hormonaux et facteurs de croissance, maisaussi au taux sérique de l'EGF.Cette étude identifie la glande submandibulaire comme cible de perturbateurs endocriniens etpose la question des conséquences physiologiques à terme

Suite au projet de séquençage du génome d’Arabidopsis thaliana, plus de 400 récepteurs de types serine/thréonine kinases (Protein Receptor Kinase ou PRK) ont été prédits. Par contre, seulement sept paires de récepteurs/ligands ont été caractérisées jusqu’à présent par des techniques de biochimie et d’analyse, de mutants. Parmi ceux-ci figurent les PRK : BRI1, CLV1, SRK, SR160, Haesa-IDA et PEPR1 qui jouent un rôle important dans le développement, l’auto-incompatibilité sporophytique et les mécanismes de défense. Le but de mon projet de maîtrise était de développer un bioessai à haut débit qui permettra la découverte de ligands peptidiques. Le bioessai utilisera des PRK chimériques composés du domaine extracellulaire (l’ectodomaine) de la PRK à l’étude fusionnée au domaine intracellulaire d’une PRK qui agira comme rapporteur. Deux stratégies sont présentement développées dans notre laboratoire : la première consiste à fusionner la PRK à l’étude avec le domaine intracellulaire (l’endodomaine) du récepteur tyrosine kinase animal EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Suite à l’interaction avec une fraction protéique contenant un ligand correspondant à la PRK étudiée, une transphosphorylation de l’endodomaine (le domaine kinase) serait détectable. La seconde stratégie utilise l’endodomaine du récepteur BRI1, un récepteur répondant aux brassinostéroïdes. Suite à l’interaction avec une fraction protéique contenant un ligand correspondant à la PRK étudiée, cette fois-ci nous devrions être en mesure de mesurer l’activation d’un gène rapporteur répondant normalement à une activation par les brassinostéroïdes. / The complete sequence of the genome of Arabidopsis thaliana was achieved in year 2000 and has resulted in the prediction of more than 400 receptor serine/threonine kinase or Plant Receptor Kinase (PRK). Despite this tremendous work, only seven pairs of ligand/receptor have been characterized through conventional techniques such as mutant analysis and biochemical characterization. These receptors have been found to play an important role in plant defense (SP160), development (BRI1, CLV1) and sporophytic autoincompatibility (SRK). The aim of the project was to develop a high throughput bioassay in order to find new ligands for known receptors. In order to do so, the bioassay will use chimeric protein technology, by fusing the ectodomain of a receptor to a known endodomaine. The latter will play the role of a reporter. Two strategies were developed in our laboratory and are being tested. The first strategy is to fuse the ectodomain of an unknown PRK to the phylogeneticaly unrelated kinase domain of the animal Epidermal Grown Factor Receptor (EGFR). When tested with a crude protein extract containing the specific ligand of the unknown PRK, a transphosphorylation should occur and be detected. The second strategy will use the endodomain of BRI1 as a reporter, a receptor responding to the brassinosteroid phytohormone, which will relay the message to a second construct used as a reporter gene once the ligand has bound the PRK ectodomain fused to the BRI1 endodomain.

Lors de cette étude, nous avons d’abord localisé les récepteurs CB1 et CB2 sur les structures neuronales. Nous avons montré que les récepteurs CB1 et CB2 sont présents sur les dendrites et les axones et les filopodes. Dans le même ordre d’idée, nous avons localisé le récepteur DCC sur les structures neuronales. Celui-ci est aussi présent sur les dendrites, les axones et les filopodes. Ces résultats suggèrent que le récepteur DCC serait impliqué non seulement dans le processus de synaptogenèse médié par le récepteur CB1, comme cela a été montré dans le laboratoire du professeur Bouchard, mais aussi dans celui, éventuellement, médié par le récepteur CB2. Nous avons ensuite évalué l’effet des ligands du récepteur CB2. Nous n’avons détecté aucun effet clair des agonistes inverses (AM630 et JTE907) et des agonistes (JWH015 et JWH133) quant à la médiation du processus de synaptogenèse en terme de variation de la densité des filopodes et des points de contacts synaptiques. Nous avons obtenu des résultats variables. Ceux-ci furent non reproductibles. Nous avons obtenu des résultats différents des résultats originaux lorsque nous avons requantifié visuellement les mêmes photos à deux reprises Nous avons développé une méthode informatisée de quantification qui nous a permis d’obtenir des résultats reproductibles. Cependant, nous n’avons toujours pas détecté d’effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Ces résultats préliminaires ne nous permettent ni d’infirmer, ni de confirmer d’éventuels effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Une étude exhaustive serait nécessaire pour le déterminer. / During this study we first localised the receptors CB1 and CB2 on neuronal structures. We have shown that those receptors expressed on dendrites and filopodia. Likewise and based on Bouchard’s previous laboratory results showing an implication of the netrin-1 receptor, Deleted in Colorectal Cancer (DCC), on the synaptogenesis process mediated by the receptor CB1 we localized the receptor DCC on neuronal structures. We have shown that the receptor DCC is expressed on dendrites, axons and filopodia. These results suggest an implication of the receptor DDC in a synaptogenesis process that would be mediated by the receptor CB2. We then evaluated the effects triggered by the receptor CB2’s ligands on the synaptogenesis process. We found no evidences of any effects on synaptogenesis mediated by the receptor CB2 inverse agonists (AM630 and JTE907) and agonists (JWH015 and JWH133) in term of filopodia density and synaptic contacts density variations. We witnessed highly variable results that were irreproducible. Visual quantifications of filopodia and synaptic contacts density were variable as we quantified two times the same set of photos. We have therefore developed a computer based quantification method by which we were able to obtained reproducible results. Nevertheless we found no evidence of any implication of the receptor CB2 on the synaptogenesis process. These preliminary results do not allow us neither to rule out nor to confirm eventual CB2 receptor effects on synaptogenesis. An exhaustive study is required to access possible CB2 receptors effect on synaptogenesis.

Le récepteur humain de la mélatonine MT1 appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). En raison du rôle majeur qu'il joue dans la régulation du rythme circadien, ce récepteur est impliqué dans les troubles du sommeil et la dépression et présente donc un intérêt thérapeutique important. Afin de progresser vers une meilleure caractérisation structurale et fonctionnelle de ce récepteur, nous avons élaboré une stratégie globale visant à générer les échantillons et méthodes nécessaires pour de telles études. Nous avons ainsi mis au point un ensemble original de conditions de production et de purification permettant d'isoler les récepteurs MT1 sous forme relativement pure, homogène et fonctionnelle. Parallèlement, à partir d'un RCPG de référence, le récepteur de l’adénosine A2A, nous avons mis au point un panel de techniques d’analyses biochimiques et biophysiques qui contribuent à une caractérisation fine des récepteurs purifiés et leur interaction avec des ligands. / The human MT1 melatonin receptor belongs to the family of G protein-coupled receptors (GPCRs). It plays a major role in the regulation of circadian rhythm and is involved in sleep disorders and depression. This receptor is thus of significant therapeutic interest. However, very few in vitro studies have been conducted on this receptor and in particular no structural characterization and interactio studies by biophysical methods. In order to progress on these aspects, we developed conditions of production and purification of MT1 receptors for obtaining samples compatible with this type of study. Furthermore, we initiated stabilization tests of the purified receptors. Meanwhile, we have developed biochemical and biophysical analysis techniques to characterize the purified receptors and study their interactions with ligands, on a reference GPCR, the A2A adenosine receptor.

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Les ganglions de la base forment un réseau neuronal mettant en jeu une circuiterie complexe et jouant un rôle essentiel dans la régulation des fonctions motrices, dans différentes formes d'apprentissage sensorimoteur, ainsi que dans les processus motivationnels. Cette régulation met en jeu une boucle cortico-striato-thalamo-corticale dans laquelle le striatum tient une position centrale en étant la principale structure d’entrée de ce réseau. Il joue le rôle de filtre en intégrant et traitant l’ensemble des informations qui y parviennent. Ce réseau neuronal complexe peut être altéré par différentes pathologies humaines (maladie de Parkinson, schizophrénie, chorée de Huntington, addiction aux drogues, …) qui résultent d’une perturbation ou d’une lésion au niveau d’une ou plusieurs structures composant le système des ganglions de la base.<p>Le striatum, premier relais du système des ganglions de la base, reçoit deux afférences principales :les voies dopaminergique nigro-striatale et glutamatergique cortico-striatale. En plus de ces deux afférences majeures, l’adénosine, par son action sur ses récepteurs, joue de nombreux rôles de régulation dans ce système. Ainsi, l’activité neuronale des neurones épineux moyens du striatum est modulée par les récepteurs de la dopamine qui sont en étroites interactions avec les récepteurs de l’adénosine. Bien que la signalisation de la dopamine et de l’adénosine ait été l’objet de nombreuses attentions, les mécanismes impliqués dans la régulation, par les récepteurs D2 de la dopamine et A2A de l’adénosine, dans le contrôle du potentiel membranaire et de l’excitabilité intrinsèque des neurones épineux moyens du striatum et leurs conséquences sur cette excitabilité en cas de déplétion en dopamine (mimant la maladie de Parkinson) restent encore très méconnues.<p>Dans ce travail de thèse, nous avons donc tenté d’élucider les mécanismes de régulation des récepteurs D2 et A2A et leurs interactions dans la modulation de la transition du potentiel membranaire et de l’excitabilité intrinsèque des neurones striataux, ainsi que les conséquences d’une déplétion en dopamine sur cette excitabilité neuronale. <p><p>Dans le premier travail de thèse, sur un modèle in vitro de transition du potentiel membranaire et par l’utilisation de peptides compétitifs, nous avons montré que les récepteurs D2 et A2A régulent le plateau de dépolarisation du potentiel membranaire induit par le NMDA via un mécanisme d’interaction protéine-protéine intramembranaire. En effet, l’activation du récepteur D2 supprime la transition entre un potentiel membranaire hyperpolarisé, le « down-state » et un plateau de dépolarisation du potentiel membranaire, le « up-state » par la régulation de l’activité du canal calcique Cav1.3a interagissant avec la protéine d’ancrage Shank. L’activation du récepteur A2A per se n’a pas d’effet, mais il réverse totalement la modulation de la transition du potentiel membranaire par le récepteur D2 selon un mécanisme dans lequel l’hétéromérisation des récepteurs A2A-D2 est strictement nécessaire, démontrant ainsi un intérêt physiologique direct de ces hétéromères. Nos travaux démontrent que la transition du potentiel membranaire et la fréquence de décharge des potentiels d’action des neurones striataux sont étroitement contrôlées par les récepteurs D2 et A2A via des interactions spécifiques protéine-protéine impliquant une hétéromérisation des récepteurs A2A-D2.<p><p>Dans la seconde étude présentée dans cette thèse, nous avons mis en évidence une régulation antagoniste de l’excitabilité intrinsèque des neurones épineux moyens du striatum par les récepteurs D2 et A2A via des mécanismes impliquant la modulation d’une conductance potassique de type A (IA). Par ailleurs, nous avons montré qu’une déplétion en dopamine conduit à une augmentation de l’excitabilité intrinsèque de ces neurones via une diminution d’une conductance IA. Malgré une forte diminution des afférences synaptiques excitatrices déterminées par une diminution de la densité des épines dendritiques et une augmentation du courant minimal nécessaire pour induire un premier EPSP, l’augmentation de l’excitabilité intrinsèque induite par la déplétion en dopamine résulte en un renforcement de la réponse des synapses restantes, permettant aux neurones striataux de répondre à une stimulation en provenance des afférences excitatrices de manière similaire voire même, plus efficace que dans les conditions contrôles. De plus, cette augmentation de l’excitabilité intrinsèque via la régulation d’une conductance IA représente une forme de plasticité homéostatique permettant au neurone de compenser une perturbation de l’activité neuronale ou de la transmission synaptique et donc d’assurer une stabilité de son patron de décharge des potentiels d’action. Ces données montrent la capacité de cette homéostasie à maintenir la fréquence de décharge des neurones striataux dans une gamme fonctionnelle, et ce dans des conditions pathologiques, permettant de stabiliser l’activité neuronale dans un réseau altéré.<p><p><p>En conclusion, l’ensemble de ce travail de thèse a permis de mettre en évidence une interaction fonctionnelle des récepteurs D2 de la dopamine et A2A de l’adénosine dans la régulation du contrôle de l’excitabilité des neurones épineux moyens du striatum. Il a également permis d’établir l’existence d’un mécanisme de plasticité homéostasique intervenant dans ce système neuronal altéré, afin de maintenir une activité électrique fonctionnelle des neurones striataux.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished