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Evaluating DNA damage response (DDR) activation in human prostate cancerDelouya, Guila 30 April 2014 (has links)
Introduction: Au Canada, le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes et le plus mortel après les cancers du poumon et du côlon. Il y a place à optimiser le traitement du cancer de la prostate de manière à mettre en œuvre une médecine personnalisée qui s’adapte aux caractéristiques de la maladie de chaque patient de façon individuelle.
Dans ce mémoire, nous avons évalué la réponse aux dommages de l’ADN (RDA) comme biomarqueur potentiel du cancer de la prostate. Les lésions potentiellement oncogènes de l'ADN déclenche une cascade de signalisation favorisant la réparation de l'ADN et l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire pour préserver l’intégrité du génome. La RDA est un mécanisme central de suppression tumorale chez l’homme. La RDA joue un rôle important dans l’arrêt de la prolifération des cellules dont les génomes sont compromis, et donc, prévient la progression du cancer en agissant comme une barrière. Cette réponse cellulaire détermine également comment les cellules normales et cancéreuses réagissent aux agents utilisés pour endommager l'ADN lors du traitement du cancer comme la radiothérapie ou la chimiothérapie, en plus la présence d,un certain niveau de RDA dans les cellules du cancer de la prostate peuvent également influer sur l'issue de ces traitements. L’activation des signaux de la RDA peut agir comme un frein au cancer dans plusieurs lésions pré-néoplasiques de l'homme, y compris le cancer de la prostate. Il a été démontré que la RDA est augmentée dans les cellules de néoplasie intra- épithéliale (PIN) comparativement aux cellules prostatiques normales. Toutefois, le devient de la RDA entre le PIN et l’adénocarcinome est encore mal documenté et aucune corrélation n'a été réalisée avec les données cliniques des patients. Notre hypothèse est que les niveaux d’activation de la RDA seront variables selon les différents grades et agressivité du cancer de la prostate. Ces niveaux pourront être corrélés et possiblement prédire les réponses cliniques aux traitements des patients et aider à définir une stratégie plus efficace et de nouveaux biomarqueurs pour prédire les résultats du traitement et personnaliser les traitements en conséquence. Nos objectifs sont de caractériser l'activation de la RDA dans le carcinome de la prostate et corréler ses données avec les résultats cliniques.
Méthodes : Nous avons utilisé des micro-étalages de tissus (tissue microarrays- TMAs) de 300 patients ayant subi une prostatectomie radicale pour un cancer de la prostate et déterminé le niveau d’expression de protéines de RDA dans le compartiment stromal et épithélial des tissus normaux et cancéreux. Les niveaux d’expression de 53BP1, p-H2AX, p65 et p-CHK2 ont été quantifiés par immunofluorescence (IF) et par un logiciel automatisé. Ces marqueurs de RDA ont d’abord été validés sur des TMAs-cellule constitués de cellules de fibroblastes normales ou irradiées (pour induire une activation du RDA). Les données ont été quantifiées à l'aide de couches binaires couramment utilisées pour classer les pixels d'une image pour que l’analyse se fasse de manière indépendante permettant la détection de plusieurs régions morphologiques tels que le noyau, l'épithélium et le stroma. Des opérations arithmétiques ont ensuite été réalisées pour obtenir des valeurs correspondant à l'activation de la RDA qui ont ensuite été corrélées à la récidive biochimique et l'apparition de métastases osseuses.
Résultats : De faibles niveaux d'expression de la protéine p65 dans le compartiment nucléaire épithélial du tissu normal de la prostate sont associés à un faible risque de récidive biochimique. Par ailleurs, nous avons aussi observé que de faibles niveaux d'expression de la protéine 53BP1 dans le compartiment nucléaire épithéliale du tissu prostatique normal et cancéreux ont été associés à une plus faible incidence de métastases
osseuses.
Conclusion: Ces résultats confirment que p65 a une valeur pronostique chez les
patients présentant un adénocarcinome de la prostate. Ces résultats suggèrent également que le marqueur 53BP1 peut aussi avoir une valeur pronostique chez les patients avec le cancer de la prostate. La validation d'autres marqueurs de RDA pourront également être corrélés aux résultats cliniques. De plus, avec un suivi des patients plus long, il se peut que ces résultats se traduisent par une corrélation avec la survie. Les niveaux d'activité de la RDA pourront éventuellement être utilisés en clinique dans le cadre du profil du patient comme le sont actuellement l’antigène prostatique spécifique (APS) ou le Gleason afin de personnaliser le traitement. / Background: Prostate cancer is the most frequently diagnosed cancer in Canadian men and is the third deadliest after lung and colon cancers. Currently, prostate cancer treatments are based on results obtained of digital rectal exam, Gleason scores from biopsy specimens and serum PSA (Prostatic Specific Antigen) levels. The identification of specific biomarkers for diagnosis and prognosis, as well as new therapeutic targets, is quickly paving the way for personalized medicine. Ideally, in the future, patient care will include molecular signature of a patient's disease to guide for a more efficient treatment.
In this thesis, we evaluated the DNA damage response (DDR) as a potential biomarker in prostate cancer. DNA lesions in mammalian cells trigger the DDR signalling cascade that orchestrates DNA repair and activate cell cycle checkpoints to preserve genome integrity. Loss of genome stability is usually associated with cancer development, and activated DDR signalling in cells with genomic instability act as a cancer barrier in several pre-neoplastic human lesions, including prostate cancer. Thus, the DDR is an important cancer suppression mechanism. The DDR is also activated in response to anti- cancer agents including radiation therapy (RT) and DNA-damaging chemotherapies. Pre- existing DDR levels in prostate cancer cells may influence the outcome of these cancer treatments. DDR signalling has been detected during human prostate cancer progression from low levels in normal prostate cells to high levels in high-grade prostatic intraepithelial neoplasia (HG-PIN). However, DDR signalling variations detected from HG-PIN to adenocarcinoma remain unclear, and no correlations were performed with patient clinical outcome data. Our hypothesis is that the levels of persistent DDR signalling activity will be variable with different grades and aggressiveness of prostate cancer. The levels of this activity could be correlated with the clinical responses to treatments and could even predict this process. We believe that having new biomarkers will help personalizing cancer treatment and certainly increase treatments’ efficiency.
Our objectives are to characterize the occurrence of DDR activation in prostate carcinoma and to correlate it with patients’ survival and responsiveness to treatment.
Methods: We used tissue microarrays (TMAs) from human radical prostatectomy specimens of 300 men with prostate cancer and estimated the level of DDR protein expression in the stromal and epithelial compartments of normal and aggressive cancer tissues. The expression level of the DDR markers p53 binding protein-1 (53BP1), phosphorylated H2AX (p-H2AX), p65 (p65 subunit of Nuclear Factor (NF-κB) and phosphorylated checkpoint kinase-2 (p-CHK2) was quantified using immunofluorescence (IF) coupled to high-content automated imaging. The quantification of our DDR markers was first validated on an experimental TMA (TMA-cell) including normal and irradiated (to induce DDR signalling) cultured human fibroblasts. The data was quantified using binary layers commonly used to classify pixels in an image so areas could be analysed independently allowing the segregation of specific compartments including nuclei, epithelia and stroma. Arithmetic operations were performed to render values corresponding to DDR activation that were then correlated with clinical outcomes such as biochemical recurrence and occurrence of bone metastasis.
Results: We found that low levels of p65 protein expression in the nuclear epithelial compartments of normal prostate tissue were associated with a reduced probability of biochemical failure (which corresponds to a rise in the serum level of PSA in prostate cancer patients following treatment, surgery in this cohort of patients). Moreover, we also observed that low levels of 53BP1 protein expression in the nuclear epithelial compartments of normal and cancerous prostate tissue were associated with a lower incidence of bone metastasis.
Conclusion: These results confirm that p65 has prognostic value in patients with prostate adenocarcinoma. Based on our results, we suggest that 53BP1 marker may have a prognostic value as well. The validation of other markers and particularly DDR markers may correlate with patients’ outcome. With longer follow-up, it may translate into correlation with survival. Levels of DDR activity in cancer tissue could be used in daily clinic as part of the patient’s diagnostic profile as much as his prostatic specific antigen (PSA) or Gleason score in order to predict response and personalize the treatment in order to guide the patients towards the most appropriate treatment amongst all those available for their prostate cancer.
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Les protéines Staufen et leurs rôles dans la régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes, la réponse aux dommages à l’ADN et le cycle cellulaireTrépanier, Véronique 03 1900 (has links)
Les différents mécanismes de régulation posttranscriptionnelle de l’expression des
gènes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phénomènes
physiologiques importants, comme la prolifération cellulaire et la réponse aux dommages à
l’ADN. Deux des protéines impliquées dans ce type de régulation sont Staufen1 (Stau1) et
Staufen2 (Stau2). Elles sont des protéines de liaison à l’ARN double brin qui contribuent au
transport de l’ARN messager (ARNm), au contrôle de la traduction, à l’épissage alternatif et
sont responsables de la dégradation de certains ARNm spécifiques. Les protéines Staufen
peuvent en effet s’associer à des ARNm bien précis, d’autant plus que, majoritairement, Stau1
et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mêmes cibles. De nombreuses évidences
récentes montrent l’implication de divers mécanismes de régulation posttranscriptionnelle
dans la réponse aux dommages à l’ADN, plusieurs protéines de liaison à l’ARN y participant
d’ailleurs. De façon importante, cette réponse dicte un ou plusieurs destin(s) à la cellule qui
doit réagir à la suite de dommages à l’intégrité de son ADN: réparation de l’ADN, arrêt de la
prolifération cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait l’hypothèse que l’expression de Stau1
et/ou de Stau2 pourrait être affectée en réponse à un stress génotoxique, ce qui pourrait avoir
comme conséquence de moduler l’expression et/ou la stabilité de leurs ARNm cibles. De
même, notre laboratoire a récemment observé que l’expression de Stau1 varie pendant le cycle
cellulaire, celle-ci étant plus élevée jusqu’au début de la mitose (prométaphase), puis elle
diminue alors que les cellules complètent leur division. Par conséquent, nous avons fait
l’hypothèse que Stau1 pourrait lier des ARNm de façon différentielle dans des cellules
bloquées en prométaphase et dans des cellules asynchrones.
D’un côté, en employant la camptothécine (CPT), une drogue causant des dommages à
l’ADN, pour traiter des cellules de la lignée de cancer colorectal HCT116, nous avons observé
que seule l’expression de Stau2 est réduite de façon considérable, tant au niveau de la protéine
que de l’ARNm. L’utilisation d’autres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette
observation initiale. De plus, nous avons constaté que l’expression de Stau2 est touchée même
dans des conditions n’engendrant pas une réponse apoptotique, ce qui suggère que cette déplétion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place d’une réponse
appropriée aux dommages à l’ADN. D’ailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec
le traitement à la CPT entraîne un retard dans l’induction de l’apoptose dans les cellules
HCT116. Nous avons aussi montré que la diminution de l’expression de Stau2 est due à une
régulation de sa transcription en réponse au stress génotoxique, ce pourquoi une région
minimale du promoteur putatif de Stau2 est nécessaire. Également, nous avons identifié que le
facteur de transcription E2F1, couramment impliqué dans la réponse aux dommages à l’ADN,
peut contrôler l’expression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de l’expression de
Stau2 dans des cellules non traitées, mais cette hausse est abolie dans des cellules traitées à la
CPT, ce qui suggère que la CPT pourrait agir en inhibant l’activation transcriptionnelle de
Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observé que certains ARNm associés à Stau2, et codant
pour des protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN et l’apoptose, sont
exprimés différemment dans des cellules traitées à la CPT et des cellules non traitées.
D’un autre côté, nous avons identifié les ARNm associés à Stau1 lors de la
prométaphase, alors que l’expression de Stau1 est à son niveau le plus élevé pendant le cycle
cellulaire, grâce à une étude à grande échelle de micropuces d’ADN dans des cellules
HEK293T. Nous avons par la suite confirmé l’association entre Stau1 et certains ARNm
d’intérêts, donc codant pour des protéines impliquées dans la régulation de la prolifération
cellulaire et/ou le déroulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm à
Stau1 dans des cellules bloquées en prométaphase par rapport à des cellules asynchrones nous
a permis de constater une association préférentielle dans les cellules en prométaphase. Ceci
suggère une augmentation potentielle de la régulation de ces ARNm par Stau1 à ce moment du
cycle cellulaire.
Les données présentées dans cette thèse indiquent vraisemblablement que la régulation
posttranscriptionnelle de l’expression génique contrôlée par les protéines Staufen se fait en
partie grâce à la modulation de l’expression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions
cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de l’expression des protéines Staufen
ait des conséquences sur des sous-ensembles d’ARNm auxquels elles sont liées et que de cette façon, elles jouent un rôle pour réguler des processus physiologiques essentiels comme la
réponse aux dommages à l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire. / The various mecanisms of post-transcriptional regulation of gene expression are more
and more recognized as essential processes in diverse important physiological phenomenons,
like cell proliferation and the DNA damage response (DDR). Two of the proteins implicated
in this type of regulation are Staufen1 (Stau1) and Staufen2 (Stau2). They are double-stranded
RNA binding proteins contributing to messenger RNA (mRNA) transport, translation control,
alternative splicing and are responsible for the degradation of some specific mRNAs. The
Staufen proteins are indeed able to associate with particular mRNAs. Interestingly, Stau1 and
Stau2 predominantly form complexes with different targets. Recent evidences show the
implication of various post-transcriptional regulation mecanisms in the DDR, moreover
several RNA binding proteins are involved. Importantly, this response dictates one or several
cell fates following damage to the integrity of the cell’s DNA: DNA repair, cell proliferation
arrest, apoptosis. We hypothesized that Stau1 and/or Stau2 expression could be affected in
response to genotoxic stress, which could consequently modulate the expression and/or the
stability of their mRNA targets. Also, our laboratory has recently observed that Stau1
expression varies during the cell cycle. It is elevated up to the beginning of mitosis
(prometaphase) and it decreases as cells complete their division. We therefore hypothesized
that Stau1 could differentially bind mRNAs in cells blocked in prometaphasis and in
asynchronous cells.
On the one hand, by using camptothecin (CPT), a DNA damaging agent, to treat cells
from the colorectal cancer cell line HCT116, we observed that only the expression of Stau2 is
considerably reduced, both at the level of the protein and that of the mRNA. The use of other
cytotoxic agents allowed us to confirm this initial observation. We also noted that Stau2
expression is down-regulated even in conditions that do not induce apoptosis, suggesting that
the decrease in Stau2 expression may be required for a proper DDR. Indeed, Stau2 overexpression
together with the CPT treatment causes a delay in apoptosis induction in HCT116
cells. We also showed that Stau2 down-regulation is due to the regulation of its transcription
in response to the genotoxic stress, which necessitates a minimal region in Stau2’s putative promoter. Besides, we identified the E2F1 transcription factor, commonly implicated in the
DDR, as a regulator of Stau2 expression. E2F1 thus stimulates an increase in Stau2 expression
in non-treated cells, but this up-regulation is abolished in CPT-treated cells, which suggests
that CPT could act by inhibiting Stau2 transcriptional activation by E2F1. Finally, we
observed that some Stau2-associated mRNAs, which code for proteins implicated in the DDR
and apoptosis, are differentially expressed in CPT-treated cells compared to non-treated cells.
On the other hand, we identified Stau1-associated mRNAs during prometaphase, when
Stau1 expression is at its highest level in the cell cycle, by performing a large-scale study
using DNA microarrays in HEK293T cells. We subsequently confirmed the association
between Stau1 and some mRNAs of interest, mainly coding for proteins involved in the
regulation of cell proliferation and/or mitosis progression. A comparison of the association
between Stau1 and these mRNAs in prometaphase-blocked cells with that in asynchronous
cells allowed us to notice a preferential association in prometaphase-blocked cells. This
suggests a potential increase of the regulation of these mRNAs by Stau1 at that point of the
cell cycle.
The data presented in this thesis indicate that in all likelihood the post-transcriptional
regulation of gene expression controlled by the Staufen proteins happens in part thanks to the
modulation of Stau1 and Stau2 expression according to the cellular conditions. We then
contemplate that this fluctuation in Staufen proteins expression has consequences on mRNA
subsets with which they associate, and that this may mean they have an important role to play
in regulating essential physiological processes like DDR and cell cycle progression.
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Le rôle d’Akt dans la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN induits par les ultraviolets dans les cellules de mélanomes humainsMansouri, Soukaina 09 1900 (has links)
Le mélanome malin est l’un des cancers les plus mortels dont l’incidence continue à augmenter chaque année avec peu de traitement efficace à long terme. Il est causé et initié principalement par l’exposition excessive aux rayons ultraviolets engendrant des photoproduits hautement génotoxiques. Il est bien connu que la cascade de signalisation PI3K/Akt joue un rôle crucial dans la régulation des processus qui sont généralement dérégulés durant le développement tumoral comme la prolifération, le contrôle du cycle cellulaire et l’apoptose. Néanmoins, l’implication de cette voie moléculaire dans la réponse aux dommages à l’ADN est peu caractérisée. Chez les mammifères, trois isoformes de la protéine kinase Akt ont été identifiées: Akt1, Akt2 et Akt3. Bien qu’elles soient très homologues en termes de séquence, plusieurs études ont montré que ces isoformes ont des fonctions biologiques distinctes, et nous suggérons qu’elles puissent contribuer différemment à la régulation de la réponse génotoxique. Les objectifs de ce projet étaient de: (i) évaluer l’activation d’Akt dans les cellules de mélanomes (ii) déterminer l’impact de l’inhibition de cette activité sur la régulation de la réponse cellulaire aux UV (iii) vérifier si la perte d’expression de l’un ou de l’autre des isoformes d’Akt peut réguler la réponse aux UV. Nous avons démontré qu’Akt est transitoirement hyperactivée par phosphorylation suite aux irradiations UV dans les lignées cellulaires de mélanomes. Afin de déterminer l'importance de cette activation dans la réponse cellulaire aux UV, notre approche était de diminuer (i) la phosphorylation d’Akt par l’usage d’inhibiteurs pharmacologiques ou (ii) l’expression de chaque isoforme d’Akt par l’approche des ARN interférents. Nous avons montré que l’inhibition de la phosphorylation d’Akt amène à l’augmentation du taux de l’apoptose induit par les UV d’une manière isoforme spécifique, alors qu’elle n’a aucun effet sur la régulation de la voie de réparation par excision de nucléotides (NER), qui est la seule voie humaine pour éliminer les dommages à l’ADN induits par les UV. En somme, notre étude constitue un nouvel aspect qui permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires du développement de mélanomes malins suites aux irradiations ultraviolettes. / Malignant melanoma is one of the deadliest cancers whose incidence continues to rise each year with a few effective long-term treatments. It is caused and initiated mainly by excessive exposure to ultraviolet radiation generating highly genotoxic DNA photoproducts. It is well known that the PI3K/Akt signaling cascade plays a crucial role in the regulation of processes commonly deregulated in tumor development such as proliferation, cell cycle control and apoptosis. Nevertheless, the nuclear involvement of this molecular pathway in the genotoxic response is poorly characterized. In mammals, three Akt kinase isoforms have been identified: Akt1, Akt2 and Akt3. Although these exhibit a high degree of homology, several studies have shown that they have distinct biological functions; therefore, we suggest that these isoforms may contribute differently to the regulation of genotoxic response. The objectives of this project were to: (i) evaluate Akt activation in UV-irradiated melanoma cells, (ii) determine the effect of the Akt phosphorylation inhibition on the regulation of the cellular response to UV, (iii) evaluate whether the loss of the expression of one or more of Akt isoforms can regulate the cellular response to UV. We demonstrated that Akt undergoes transient hyperactivation after UV treatment in melanoma cell lines. To determine the importance of this activation, our approach was to reduce (i) the phosphorylation of Akt by the use of pharmacological inhibitors or (ii) the expression of each individual Akt isoform using RNA interference. We have shown that inhibition of Akt phosphorylation leads to increased rates of UV-induced apoptosis in an isoform specific manner, while exerting no effect on regulation of nucleotide excision repair (NER), the only human pathway for eliminating UV-induced DNA damage. In summary, our study provides a better understanding of the molecular mechanisms of malignant melanoma development in response to UV.
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Development of new approaches to study the role of chromatin in dna damage response / Développement de nouvelles approches pour étudier le rôle de la chromatine en réponse aux dommages de l’adnShoaib, Muhammad 06 November 2011 (has links)
Le génôme des cellules eucaryotes est condensé au sein d'une structure complexe hiérarchiquement organisée : la chromatine. La chromatine est composée d'ADN, de protéines histone et non-histone. Cette thèse a pour but d'étudier le rôle de la chromatine dans la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN (DDR) par les méthodologies de génomique fonctionnelle et de protéomique. Nous avons tout d'abord analysé les modifications post-traductionnelles (PTM) des histones dans le cadre des pontages inter-brins (ou "Interstrand Crosslinks", ICL), type particulier de lésions de l'ADN, en choisissant le modèle de l'Anémie de Fanconi (FA). Ceci a été réalisé grâce aux techniques de protéomique quantitative SILAC (Stable Isotope Labeling of Amino acid during Cell culture) et de spectrométrie de masse (MS). Nous avons ainsi réussi à identifier et à quantifier de nombreuses PTMs dans les histones H3 et H4, et à démontrer que certaines de ces PTM sont dépendantes d'une voie fonctionnelle de la signalisation de FA. Nous avons également approfondi l'étude des DDR dans les cellules de FA par une approche de génomique fonctionnelle. Pour cela, nous avons analysé le profil l'expression d'enzymes associées à l'acétylation et à la méthylation des histones. Nos résultats suggèrent l'existence de corrélations entre le profil d'expression de ces enzymes et les PTMs des histones. Des études complémentaires sont nécessaires en vue de confirmer ces corrélations. Nous avons également comparé le transcriptome de deux lignées cellulaires de FA (mutée en FANCC et corrigée en FANCC) après induction de dommages à l'ADN. Afin de différencier les changements spécifiquement associés à la voie de signalisation de FA en réponse aux ICL de l'ADN des réponses plus générales aux dommages de l'ADN, nous avons inclus des cellules traitées par rayonnement ionisant. En réalisant une analyse d'interactions factorielles, nous avons pu identifier une réponse transcriptionnelle aux dommages de l'ADN nécessitant une voie fonctionnelle de la signalisation de FA. Nous avons également tenté de pallier aux limitations rencontrées dans l'analyse des PTMs des histones. En effet, les PTMs des histones que nous avons identifiées représentent l'ensemble des modifications, c'est-à-dire les PTMs concernant les histones se trouvant immédiatement à proximité du site du dommage et en relation directe avec celui-ci, et les PTMs se trouvant à distance du dommage et pouvant ne pas être en relation directe avec celui-ci. Les approches courantes pour identifier les PTMs se trouvant à des loci particuliers sont basées sur l'immunoprécipitation classique de la chromatine où l'utilisation de formaldéhyde altère les protéines, ce qui en rend impossible l'analyse par MS. Nous avons proposé une nouvelle méthodologie basée sur la biotinylation expérimentale d'histones situées à proximité d'une protéine particulière, suivie de la purification des nucléosomes contenant ces histones biotinylées. Contrairement àl'immunoprécipiatation classique de la chromatine, cette méthode n'induit pas d'altération des protéines, permettant ainsi de purifier les histones à partir d'un locus spécifique et d'analyser à grande échelle leurs PTMs par MS. Cette approche permet aussi de suivre dans le temps les PTMs d'une fraction des histones juste après leur biotinylation. Enfin, elle présente l'avantage de pouvoir étudier le profil des PTMs de différents états fonctionnels de la chromatine grâce à l'utilisation de variants d'histones. / In eukaryotic cells, the genome is packed into chromatin, a hierarchically organized complex composed of DNA and histone and nonhistone proteins. In this thesis we have addressed the role of chromatin in cellular response to DNA damage (DDR) using various methodologies encompassing functional genomics and proteomics. First, we analyzed histone post-translational modifications (PTM) in the context of specific kind of DNA lesions (ICL-Interstrand Crosslinks) in Fanconi anemia using quantitative proteomics methodology, SILAC (Stable Isotope Labeling of Amino acids during Cell Culture). Using mass spectrometry (MS), we have successfully identified and quantified a number of histone PTM marks in histone H3 and H4, mainly acetylations and methylations,which have shown dependence upon functional FA-pathway. As a next step, we applied a functional genomics approach to study DDR in FA cells. In this analysis we first monitored the expression profile of histone modifying enzymes related to histone acetylations and methylations. Our results suggest some correlations between histone PTMs and gene expression of histone modifying enzymes, although conclusive evidence warrants further investigations. Next, we analyzed the total transcriptome after DNA damage induction in FA mutant and wild type cells. We also included in this analysis IR irradiation, in an attempt to dissociate more generic DDR from more specific changes that are associated with the role of FA pathway to the DNA ICLs. By performing a factorial interaction analysis, we were able to isolate the part of transcriptional response to DNA damage that was requiring functional FA pathway, as well as the genes that were sensitized to DNA damage by the inactivation of FA pathway. In the final part of the thesis, we attempted to solve one of the limitations that we encountered in the histone PTM analysis. The current approaches used to study histone PTMs from particular loci involves classical chromatin immunoprecipitation, which due to involvement of formaldehyde crosslinking render the protein part mostly unavailable for MS-based proteomics. We have proposed a novel methodology, which is based upon the biotin tagging of histones proximal to a protein of interest and subsequent purification of nucleosomes carrying the tagged histone. This methodology does not involve any crosslinking, enabling us to purify histones from specific loci, and subject them to large scale MS-based histone PTM analysis. A time dimension can also be added to our approach, as we can follow the modification status of particular fraction of histones once they get biotinylated. Another advantage is the use of alternate variant histones, which allows us to study the PTM profile of different functional states of chromatin. This methodology certainly has an edge on current techniques to study histone PTMs pattern associated with a particular protein of interest or with particular chromatin state.
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Le rôle de la structure de la chromatine naissante dans la réponse au stress réplicatifSimoneau, Antoine 12 1900 (has links)
No description available.
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3-D Genome organization of DNA damage repair / Rôle de l’organisation 3D du génome dans la réparation des dommages à l'ADNBanerjee, Ujjwal Kumar 18 December 2017 (has links)
Notre génome est constamment attaqué par des facteurs endogènes et exogènes qui menacent son intégrité et conduisent à différents types de dommages. Les cassures double brins (CDBs) font partie des dommages les plus nuisibles car elles peuvent entraîner la perte d'information génétique, des translocations chromosomiques et la mort cellulaire. Tous les processus de réparation se déroulent dans le cadre d'une chromatine hautement organisée et compartimentée. Cette chromatine peut être divisée en un compartiment ouvert transcriptionnellement actif (euchromatine) et un compartiment compacté transcriptionnellement inactif (hétérochromatine). Ces différents degrés de compaction jouent un rôle dans la régulation de la réponse aux dommages à l’ADN. L'objectif de mon premier projet était de comprendre l'influence de l'organisation 3D du génome sur la réparation de l'ADN. Pour cela, j’ai utilisé deux approches complémentaires dans le but d’induire et de cartographier les CDBs dans le génome de souris. Mes résultats ont mis en évidence un enrichissement de γH2AX, facteur de réparation des dommages à l’ADN, sur différentes régions du génome de cellules souches embryonnaires de souris, et ont également montré que les dommages persistent dans l’hétérochromatine, contrairement à l’euchromatine qui est protégée des dommages. Pour mon deuxième projet, j'ai cartographié l'empreinte génomique de 53BP1, facteur impliqué dans la réparation des CDBs, dans des cellules U2OS asynchrones et des cellules bloquées en G1 afin d’identifier de nouveaux sites de liaison de 53BP1. Mes résultats ont permis d’identifier de nouveaux domaines de liaison de 53BP1 couvrant de larges régions du génome, et ont montré que ces domaines de liaison apparaissent dans des régions de réplication moyenne et tardive. / Our genome is constantly under attack by endogenous and exogenous factors which challenge its integrity and lead to different types of damages. Double strand breaks (DSBs) constitute the most deleterious type of damage since they maylead to loss of genetic information, translocations and cell death. All the repair processes happen in the context of a highly organized and compartmentalized chromatin. Chromatin can be divided into an open transcriptionally active compartment (euchromatin) and a compacted transcriptionally inactive compartment (heterochromatin). These different degrees of compaction play important roles in regulating the DNA damage response. The goal of my first project was to understand the influence of 3D genome organization on DNA repair. I used two complementary approaches to induce and map DSBs in the mouse genome. My results have shown that enrichment of the DNA damage repair factor γH2AX occurs at distinct loci in the mouse embryonic stem cell genome and that the damage persists in the heterochromatin compartment while the euchromatin compartment is protected from DNA damage. For my second project, I mapped the genomic footprint of 53BP1, a factor involved in DSBs repair, in asynchronous and G1 arrested U2OS cells to identify novel 53BP1 binding sites. My results have identified novel 53BP1 binding domains which cover broad regions of the genome and occur in mid to late replicating regions of the genome.
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Etude du rôle et de la régulation de la Poly(ADP-ribose) Glycohydrolase(PARG) dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN / Role and regulation of the Poly(ADP-ribose)Glycohydrolase (PARG) in the cell response to DNA damagesHeberle, Eléa 11 December 2017 (has links)
La Poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle de protéines, impliquée dans un grand nombre de processus biologiques, dont la réparation de l’ADN. Alors que la fonction et le mode d’action de la Poly(ADP-ribose) (PAR) Polymérase 1 (PARP1), activée en réponse aux dommages de l’ADN sont bien compris, on en sait beaucoup moins sur la fonction et la régulation de l’enzyme de dégradation du PAR, la Poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). Dans le contexte de ce projet de thèse, nous décrivons de nouvelles lignées U2OS stables, déficientes pour toutes les isoformes de PARG, permettant la complémentation inductible avec chacun des isoformes de PARG. Ces modèles nous ont permis d’évaluer les contributions relatives des isoformes à la réparation de dommages à l’ADN. Nous avons identifié un nouveau partenaire cellulaire de PARG : la protéine-kinase dépendante des dommages à l’ADN (DNA-PK). Nous explorons l’interaction fonctionnelle de ces deux protéines dans le contexte de la réponse cellulaire à la camptothécine (CPT), un agent anticancéreux inhibant la topoisomérase I et provoquant l’activation simultanée de PARP1 et DNA-PK. / Poly (ADP-ribosyl) ation is a post-translational modification of proteins involved in a large number of biological processes, including DNA repair. While the function and mode of action of Poly (ADP-ribose) (PAR) Polymerase 1 (PARP1), activated in response to DNA damage, is well understood, much less is known about the function and regulation the PAR degrading enzyme, Poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). In the context of this thesis project, we describe new stable U2OS lines, deficient for all PARG isoforms, allowing the inducible complementation with each of the PARG isoforms. These models allowed us to evaluate the relative contributions of the isoforms to DNA damage repair. We have identified a new cellular partner of PARG: the DNA-dependent protein kinase-dependent kinase (DNA-PK). We explore the functional interaction between these two proteins in the context of the cellular response to camptothecin (CPT), an anticancer drug that inhibits topoisomerase I and induces the simultaneous activation of PARP1 and DNA-PK.
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Chromatin structure and DNA repair / Etude de la structure de la chromatine dans la réparation de I'ADNHoffbeck, Anne-Sophie 25 October 2013 (has links)
Notre génome est continuellement endommagé par des agents provoquant des lésions de l’ADN. Les cassures doubles brins de l’ADN (CDBs) sont les lésions les plus dangereuses. En effet, une CDB mal réparée peut mener à des aberrations de l’ADN pouvant conduire à l’apparition d’un cancer. Dans le but d’éviter les effets délétères des CDBs, nos cellules ont développé une voie de signalisation, nommée réponse aux dommages de l’ADN (RDA), permettant la détection des cassures et l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire afin d’arrêter le cycle pendant la réparation des CDBs. Une des caractéristiques principales de la RDA est l’accumulation d’un grand nombre de facteurs sur l’ADN autour de la cassure, formant un foyer visible en microscopie. Cependant, l’efficacité de réparation de l’ADN est entravée par la structure condensée de la chromatine environnante. Les mécanismes de réparation de l’ADN surmontent ce problème en recrutant de nombreuses protéines permettant le réarrangement de la chromatine afin de faciliter la réparation. Le but de mon travail de thèse est d’identifier de nouvelles protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine autour des CDBs. D’une part nous avons pour but d’identifier le protéome complet d’un foyer de réparation de l’ADN grâce à la technique PICh (Proteomics of Isolated Chromatin loci). D’autre part, nous étudions le rôle de l’oncoprotéine SET/TAF-1β, que nous avons identifié lors d’un criblage siRNA réalisé dans le but de découvrir de nouveaux facteurs chromatiniens impliqués dans la réparation des CDBs. / Various DNA damaging agents, that can cause DNA lesions, assault constantly our genome. The most deleterious DNA lesions are the breaks occurring in both strands of DNA (Double stand breaks: DSBs). Inefficient repair of DSBs can lead to aberrations that may induce cancer. To avoid these deleterious effects of DSBs, cells have developed signalling cascades which entail detection of the lesions and spreading of the signal that leads to arrest in cell cycle progression and efficient repair. A major characteristic of DNA damage response (DDR) is the accumulation of a vast amount of proteins around the DSBs that are visible in the cell as DNA damage foci. However, efficient DNA repair is hampered by the fact that genomic DNA is packaged into chromatin. The DNA repair machinery overcomes this condensed structure to access damaged DNA by recruiting many proteins that remodel chromatin to facilitate efficient repair. The aim of my PhD work is to identify novel proteinsinvolved in the DDR and/or the remodelling of chromatin surrounding DSBs. On one hand, we take advantage of the PICh (Proteomics of Isolated Chromatin loci) technique and we aim to identify the entire proteome of DNA repair foci. On the other hand, we study the role of the oncogene SET/TAFIβ, a major hit of a siRNA screen performed to identify novel chromatin related proteins that play role in repair of DSBs.
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Characterization of Pten and Trp53 deficient prostatic tumors in mice / Caractérisation des tumeurs prostatiques déficientes pour Pten et Trp53 chez la sourisEl Bizri, Rana 31 July 2018 (has links)
Le cancer de la prostate est la forme de cancer la plus fréquente et la troisième cause de décès par cancer chez l’homme dans les sociétés occidentales. Alors que la plupart des cancers de la prostate localisés sont éradiqués chirurgicalement, la plupart des tumeurs métastatiques répondant initialement aux thérapies par privation d’androgènes deviennent résistantes au traitement, causant généralement le décès du patient. Les gènes suppresseurs de tumeur PTEN et p53 étant fréquemment mutés dans les cancers de la prostate métastatiques et résistants à la castration, le laboratoire d’accueil a généré des modèles murins dans lesquels Pten et/ou Trp53 sont sélectivement invalidés à l’âge adulte dans les cellules épithéliales prostatiques dans le but de déterminer les évènements clés conduisant à la progression du cancer de la prostate. Notre étude révèle que l’invalidation de PTEN stimule la prolifération des cellules épithéliales prostatiques et conduit à des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux en quelques mois. Cette hyper-prolifération induit un stress réplicatif et une réponse aux dommages de l’ADN qui va conduire à un arrêt progressif de la croissance cellulaire et une entrée en sénescence. Les cellules sénescentes sécrètent de nombreuses cytokines et de chimiokines, et peuvent accumuler des mutations contribuant ainsi à la progression de la tumeur. Il est notable qu’en l’absence de Trp53, les épithéliums prostatiques dépourvus de Pten développent des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux entrant en sénescence. Cependant, la formation d’adénocarcinomes est accélérée et des tumeurs sarcomatoïdes pouvant générer à long terme des métastases apparaissent. En l’absence de Pten, certaines cellules épithéliales prostatiques perdent leur identité moléculaire en exprimant des marqueurs caractéristiques de cellules souches et différenciation neuroendocrinienne. Nous avons également mis en évidence des cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN et p53 résistantes à la castration exprimant à la fois des marqueurs de cellules basales et luminales. En conclusion, nos travaux ont permis une avancée dans la compréhension des mécanismes conduisant à des formes incurables de cancer de la prostate. Les traitements actuels ayant des effets secondaires importants et pouvant générer des résistances, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant l’élimination des cellules sénescentes mais aussi des cellules épithéliales prostatiques exprimant des marqueurs de cellules basales et luminales dans les lésions précancéreuses représente des perspectives intéressantes pour traiter le cancer de la prostate. / Prostate cancer (PCa) is a leading cause of male cancer death worldwide. While most locally PCa are curable, metastatic tumors initially respond to androgen deprivation therapy but ultimately relapse to castration-resistant prostate cancer (CRPC), which is a lethal disease. Since the tumor suppressor genes PTEN and p53 are frequently mutated in metastatic and CRPC, the host laboratory generated mouse models in which Pten and/or Trp53 are selectively ablated in adult prostatic epithelial cells (PECs) in order to unravel the key events leading to prostate cancer progression. Our study reveals that Pten ablation stimulates PECs proliferation forming prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) within a few months. This hyper-proliferation induces replicative stress and a DNA damage response (DDR), which in turn leads to a progressive growth arrest with characteristics of cell senescence. As senescent cells secrete a large number of cytokines and chemokines, and can accumulate other mutations, they might contribute to tumor progression. Importantly, in the absence of Trp53, most Pten-null PECs develop PINs that enter senescence. However partial loss of PECs identity is detected as we show enhanced stemness and focal neuroendocrine differentiation of luminal Pten-null PECs. In some cases, adenocarcinoma and sarcomatoid tumors are formed, and more than one-third of the latter develop metastases. Strikingly, we also show formation of a castrate-resistant cell entity of both Pten and Pten/Trp53-null PECs sharing luminal and basal markers. Taken together, as current treaments lead to side effects and resistance, the development of therapeutic strategies to eliminate senescent cells/and or PECs expressing luminal and basal/stem progenitor in pre- cancerous lesions represents promising option for prostate cancer treatment.
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Role of Histone H3 Lysine 56 Acetylation in the Response to Replicative stressNersesian, Jeanet 01 1900 (has links)
Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l’acétylation de l’histone H3 sur la Lysine 56 (H3K56ac) a lieu sur toutes les histones H3 nouvellement synthétisées qui sont déposées derrière les fourches de réplication. L’acétylation de H3K56 joue un rôle primordial dans l’assemblage de l’ADN lors la réplication et la réparation. L’acétylation de H3K56 joue également un rôle important dans la stabilité génomique et la stabilisation des fourches de réplication bloquée. En effet, les cellules dépourvues de H3K56ac sont sensibles au méthane sulfonate de méthyle (MMS) et à d’autres agents génotoxiques qui causent du stress réplicatif. Notre projet visait à investiguer les liens entre la protéine du réplisome Ctf4 et l’acétyltransférase d’histone Rtt109. Dans un premier lieu, la délétion de CTF4 a partiellement contré la sensibilité des cellules rtt109Δ au MMS. Notre analyse génétique a aussi montré que Ctf4, Rtt109, et le complexe Rtt101-Mms1-Mms22 agissent dans la même voie de réponse face à un stress réplicative. Nos résultats montrent que les cellules ctf4Δ et rtt109Δ présentent des foyers intenses du complexe de liaison à l'ADN simple-brin RPA en réponse au stress réplicatif, suggérant la formation excessive de régions d'ADN simple-brin aux fourches de réplication bloquées, ce qui conduit à une hyper activation des points de contrôle des dommages à l'ADN. Ces mutants présentent des ponts anaphase et des foyers persistants des protéines de recombinaison homologues Rad51 et Rad52 en réponse aux génotoxines, suggérant ainsi que la structure anormale des réplisomes bloqués peut compromettre leur récupération. Nos résultats indiquent également que la délétion des gènes de la RH (RAD51, RAD52, RAD54, RAD55 et MUS81) avec ctf4Δ et rtt109Δ respectivement, engendre une sensibilité synergique au MMS, suggérant que les cellules qui sont déficientes en H3K56 acétylation utilisent la RH pour réparer les dommages causés suite à un stress réplicatif. En conclusion, nos résultats suggèrent que les cellules déficientes en H3K56ac présentent des défauts de RH en réponse aux dommages à l’ADN induits par le MMS durant la phase S. / In Saccharomyces cerevisiae, histone H3 lysine 56 acetylation (H3K56ac) occurs on all newly synthesized histones H3 that are deposited behind DNA replication forks. H3K56ac plays critical role in chromatin assembly during DNA replication and repair. H3K56ac is also required for genome stability and stabilization of stalled replication fork. Cells lacking H3K56ac are sensitive to methyl methane sulfonate and other drugs that cause replicative stress.
In this thesis, we investigated the links between the replisome protein Ctf4 and the H3K56 acetyltransferase Rtt109. Deletion of CTF4 partially rescued the sensitivity of rtt109Δ cells to methyl methane sulfonate. Genetic analyses also showed that Ctf4, Rtt109, and the Rtt101-Mms1-Mms22 complex act in the same pathway to response to replicative stress. ctf4Δ and rtt109Δ cells displayed intense foci of the single-stranded DNA binding complex RPA during replicative stress, suggesting formation of excess single-stranded DNA regions at stalled replication forks, leading to hyper activation of DNA damage checkpoints. These mutants accumulated anaphase bridges and persistent foci of the homologous recombination proteins Rad51 and Rad52 in response to genotoxins, suggesting that abnormal DNA structure formed at stalled replisome may compromise their recovery. Deletion of HR genes (RAD51, RAD52, RAD54, RAD55 and MUS81) together with ctf4Δ and rtt109Δ presents synergistic sensitivity to MMS, suggesting that H3K56ac deficient cells use HR to repair the damages caused by replicative stress. Overall our results demonstrate that H3K56ac deficient cells cannot recover MMS- induced damages because HR is compromised in these mutants.
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