Les éléments Alu sont les retrotransposons les plus prolifiques chez l’humain avec plus d’1 million de copies occupant plus de 10% du génome. Afin de contrecarrer l’expansion des rétro-éléments, les organismes ont développés différents mécanismes pour préserver l’intégrité de leurs génomes. Le plus proéminent, également utilisé pour lutter contre la réinsertion d’ADN viral dans le génome hôte, est l’édition de l’ARN. Chez les mammifères, la plus courante est la déamination de l’adénine en inosine catalysée par la famille de protéine ADAR dont Les principales cibles sont les éléments Alu chez l’humain. L’édition des éléments Alu conduit à leur séquestration dans le noyau des cellules, mute leurs promoteurs internes, cible de l’ARN polymérase III (POLIII), et leurs queues poly-A, prévenant ainsi leur future rétrotransposition. Dans la première partie de cette étude, l’analyse de données de séquençage haut-débit révèle que ~40% des éléments Alu sont reconnus par POLIII, qu’ils sont présents en tant que petits ARN dans le cytoplasme et le noyau des cellules, que certain d’entre eux sont associés à la chromatine, et que la transcription des éléments Alu est un phénomène courant dans les tissus somatiques qui concorde avec l’expression d’éléments LINE1 fonctionnels. Ceci suggère que la rétrotransposition peut être un mécanisme normal dans la plupart des tissus humains. Enfin, l’analyse de l’expression des éléments Alu et LINE1 chez la souris montre que la transcription de rétrotransposons n’est pas spécifique de l’humain. Dans la seconde partie de cette étude, une nouvelle méthode a été développée pour explorer l’impact de l’édition de l’ARN sur le transcriptome en identifiant les ARN édités par séquençage haut-débit. Dans un premier temps, un anticorps ciblant ADAR a été utilisé pour extraire les ARN associés aux protéines de l’édition. Cette méthode n’étant pas suffisamment efficace, une autre stratégie, qui extrait directement les ARN contenant de l’inosine, a été développée : dans un premier temps, l’ARN est fixé à des billes magnétiques par leurs extrémités 3’, ensuite, les billes sont traitées au glyoxal/acide borique et à la RNAse T1 pour libérer la région 5’ des ARN contenant une ou plusieurs inosines, et enfin, les ARN libérés sont séquencés par séquençage haut débit. En utilisant cette méthode, 1822 sites d’éditions ont été identifiés dans l’ARN de cerveau de souris, incluant 28 nouveaux sites présents dans des séquences codantes qui conduisent à des mutations non-synonymes des futures protéines. Des sites d’éditions ont aussi été observés pour la première fois dans les ARN ribosomaux, les snoRNA et les snRNA. / The Alu repeats comprise more than 10% of the human genome. They spread in the genome by retrotransposition. As a response to this invasion, organisms developed mechanisms to preserve the integrity of their genome, such as RNA editing. The most abundant type of editing in mammals is A-to-I editing where the ADAR proteins transform adenosine into inosine and targets mainly Alu elements in human. Editing of the Alu elements leads to their sequestration in the nucleus and mutates their internal POLIII promoter and their poly-A tail, thus preventing their subsequent transposition. In the first part of this study, we challenged the view that Alu elements are dormant occupant of the genome by characterizing their activity. Deep-sequencing data analyses revealed that ~40% of Alu elements can bind POLIII, they present a definite localization in the cell and associate with chromatin and polysomes, and that Alu elements transcription is a widespread phenomenon in normal tissues which correlates with functional LINE1 elements expression. This suggested that Alu element retrotransposition may be a natural mechanism in most normal human tissues. Further analyses showed that SINE and LINE expression in somatic tissues was not exclusive to human but also occurs in mouse. Finally, attempts were made to identify tissue specific insertions in the human genome resulting from retrotransposition events. In the second part of this study, a new method was developed to understand the full impact of RNA editing on transcriptomes by characterizing the edited RNA in a high-throughput fashion. First, immunoprecipitation was attempted to pull-down RNA associated with the editing enzymes ADARs. Since this method was inefficient, another approach purifying directly the edited RNA was developed. First, the RNA was sequestered on magnetic beads. Then an inosine specific cleavage based on RNAseT1 treatment of RNA protected with glyoxal and borate allowed the separation of the edited RNA from the total RNA. Finally, deep sequencing was used to identify edited RNA. 1,822 editing sites were found in mouse brain RNA by this method, including 28 new editing sites modifying the coding sequences of genes and editing in rRNA, snoRNA and snRNA which were never observed before.

Les rétrotransposons sont des éléments génétiques mobiles qui constituent presque la moitié de notre génome. Seule la sous-famille L1HS appartenant à la classe des Long Interspersed Element-1(LINE-1 ou L1) a gardé une capacité de mobilité autonome chez l’Homme. Leur mobilisation dans la lignée germinale, mais Aussi dans certains tissus somatiques, contribue à la diversité du génome humain ainsi qu’à certaines maladies comme le cancer. Ainsi, de nouvelles copies de L1 peuvent directement s'intégrer dans des séquences codantes ou régulatrices, et altérer leur fonction. De plus, les séquences L1 contiennent elles-mêmes plusieurs éléments cis-régulateurs et leur insertion à proximité ou dans un gène peut produire des altérations génétiques plus subtiles. Afin d'explorer l'ensemble de ces altérations à l'échelle du génome, nous avons développé un logiciel dédié à l’analyse des données de séquençage d'ARN qui permet d'identifier des transcrits chimériques ou antisens impliquant les L1 et d'annoter ces isoformes en fonction des différents événements d’épissage alternatif subits. Au cours de ce travail, il est apparu que la compréhension du lien entre polymorphisme des insertions et phénotype nécessite une vue complète des différentes copies L1HS présentes chez un individu donné. Afin de disposer d'un catalogue aussi complet que possible de ces polymorphismes identifiés dans des échantillons humains sains ou pathologiques et publiés dans des journaux scientifiques, nous avons développé euL1db, la base de données des insertions de rétrotransposon L1HS chez l’Homme. En conclusion, ce travail aidera à comprendre l’impact des L1 sur l’expression des gènes, à l'échelle du génome. / Retrotransposons are mobile genetics elements, which form almost half of our genome. Only the L1HS subfamily of the Long Interspersed Element-1 class (LINE-1 or L1) has retained the ability to jump autonomously in humans. Their mobilization in the germline – but also in some somatic tissues – contributes to human genetic diversity and to diseases, such as cancer. L1 reactivation can be directly mutagenic by disrupting genes or regulatory sequences. In addition, L1 sequences themselves contain many regulatory cis-elements. Thus, L1 insertions near a gene or within intronic sequences can also produce more subtle genic alterations. To explore L1-mediated genic alterations in a genome-wide manner, we have developed a dedicated RNA-seq analysis software able to identify L1 chimeric or antisense transcripts and to annotate these novel isoforms with their associated alternative splicing events. During the course of this work, it appeared that understanding the link between L1HS insertion polymorphisms and phenotype or disease requires a comprehensive view of the different L1HS copies present in a given individual or sample. To provide a comprehensive summary of L1HS insertion polymorphisms identified in healthy or pathological human samples and published in peer-reviewed journals, we developed euL1db, the European database of L1HS retrotransposon insertions in humans. This work will help understanding the overall impact of L1 insertions on gene expression, at a genome-wide scale.

De l’organisme unicellulaire aux organismes multicellulaires complexes, la spécification cellulaires est un aspect fondamental de la biologie de l'adaptation et du développement. Les cellules souches pluripotentes (CSP) telles que les embryonnaires (CSE) fournissent un modèle approprié pour étudier les mécanismes de régulation et la spécification du sort des cellules chez les mammifères. Les ESC de souris sont connus pour être de nature hétérogènes et sont rapportées comme étant composées de multiples états de cellules souches ressemblant à des stades distincts du développement embryonnaire précoce, tels que totipotentes, pluripotentes, préparées et endoderme primitif. Malgré des études approfondies sur les CSE, les mécanismes moléculaires régulant leur hétérogénéité et l'état totipotent, en particulier, ne sont pas bien compris. Le travail présenté dans cette thèse utilise les CSE de souris comme modèle intéressant pour déterminer les mécanismes de signalisation et de régulation génique qui conduisent à l'hétérogénéité cellulaire et l'état cellulaire totipotent des CSE. Dans une première étude, nous avons utilisé la cytométrie en flux de masse pour analyser simultanément de multiples protéines régulatrices des cellules souches, en mettant l'accent sur les facteurs de transcription clés, les protéines de signalisation et les modificateurs de la chromatine qui régissent les CSE de souris. Les données de cytométrie en flux de masse ont révélé des variations dans les niveaux protéiques cellulaires individuels des régulateurs des cellules souches et ont souligné la vaste coactivation des voies de signalisation cellulaire dans des conditions de culture définies des CSE. De plus, l'application de la cytométrie en flux de masse a facilité l'identification d'états cellulaires distincts et de leurs caractéristiques moléculaires au sein des CSE, offrant des aperçus de leurs variations selon différentes conditions de culture, validant ainsi la présence d'hétérogénéité cellulaire dans les CSE de souris. Dans une deuxième étude, nous avons identifié la signalisation du facteur de croissance des os (BMP) comme inducteur de l'état totipotent. Nous avons également constaté que le rôle du BMP dans la totipotence est réprimé par la coactivation des voies FGF, NODAL et WNT. En inhibant ces voies coactivées, nous démontrons l'amélioration de l'induction de cellules totipotentes et la suppression des états préparés et d'endoderme primitif. Nous avons validé les changements d'état cellulaire au niveau cellulaire unique grâce à un séquençage d'ARNm à cellule unique. De plus, nous avons également démontré que les cellules totipotentes reprogrammées in vitro imitent les cellules totipotentes de l'embryon préimplantatoire avec la capacité de générer des blastocystes in vitro (Blastoïdes) et de s'intégrer dans les lignées embryonnaires et extra-embryonnaires chez la souris. Ensemble, ces résultats ont révélé les mécanismes de signalisation du BMP pour réguler à la fois l'état totipotent et l'hétérogénéité des CSE. Pour la troisième étude, nous avons utilisé les observations clés de nos données de cytométrie en flux de masse (première étude) pour évaluer le rôle des protéines régulatrices clés pour promouvoir l'état cellulaire totipotent. Ici, nous démontrons que NACC1, un régulateur transcriptionnel des CSE, agit également comme un régulateur important des cellules totipotentes. Après avoir identifié NACC1 comme un régulateur potentiel à partir de données de protéines cellulaires à cellule unique et de transcriptome en vrac, nous avons validé sa fonction en utilisant une suppression médiée par CRISPR en combinaison avec des conditions de reprogrammation cellulaire pluripotente à totipotente. Ensuite, nous avons intégré une combinaison d'approches génomiques pour étudier les changements au niveau du système dépendants de NACC1 dans le transcriptome, l'accessibilité à la chromatine et la liaison à l'ADN génomique. Ensemble, ces données ont révélé que NACC1 induit à la fois les programmes d'expression génique codant et de gènes de rétrotransposons pour promouvoir l'état cellulaire totipotent. Enfin, nous avons montré que NACC1 régule les éléments rétrotransposables MERVL-int et MT2_Mm pour moduler l'expression des gènes codants de l'état totipotent. En conclusion, cette thèse révèle la nature hétérogène des CSE de souris au niveau protéique à cellule unique, élucide le rôle significatif et les mécanismes de la voie de signalisation BMP pour réguler l'état totipotent et l'hétérogénéité des CSE, et dévoile les mécanismes de régulation génique dépendants de NACC1 pour promouvoir l'état totipotent. Ces résultats ouvrent la voie à des études ultérieures visant à comprendre la spécification de l'état des cellules souches et leur transition via la modulation des voies de signalisation / facteurs de transcription. De plus, ces mécanismes peuvent réguler l'état cellulaire totipotent chez l'homme, éclairant l'hétérogénéité cellulaire dans les CSE humaines et dans des contextes pathologiques, tels que le cancer. / From unicellular entities to intricate multicellular organisms, the omnipresent process of cell fate specification is a fundamental aspect of adaptation and developmental biology. Pluripotent stem cells (PSCs) such as embryonic stem cells (ESCs) provide a suitable model to study the regulatory mechanisms and cell fate specification in mammals. Intriguingly, mouse ESCs are known to be heterogenous in nature and are reported to consist of multiple stem cell states resembling distinct stages of early embryogenesis, such as totipotent, pluripotent, primed, and primitive endoderm. Despite extensive study of ESCs, the molecular mechanisms regulating their heterogeneity and the totipotent state in particular are not well understood. The work presented in this thesis utilizes mouse ESCs as an attractive model to delineate the signaling and gene regulatory mechanisms driving the cellular heterogeneity and the totipotent cell state of ESCs. In the first study, we utilized mass cytometry (cytometry by time of flight) to concurrently analyse multiple stem cell regulatory proteins, focusing on key transcription factors, signaling proteins, and chromatin modifiers that govern mouse ESCs. Mass cytometry data revealed variations in the single-cell protein levels of stem cell regulators and highlighted the extensive cross-activation of cell signaling pathways across defined culture conditions of ESCs. Furthermore, the application of mass cytometry facilitated the identification of distinct cell states and their molecular features within ESCs, offering insights into their variations across different culture conditions, thereby validating the presence of cellular heterogeneity in mouse ESCs. In the second study, we identified bone morphogenetic protein (BMP) signaling as an inducer of the totipotent state. We also found that, BMP’s role for totipotency is repressed by the cross-activation of FGF, NODAL, and WNT pathways. Through rational inhibition of these cross-activated pathways, we demonstrate the enhancement in the induction of totipotent cells and suppression of primed and primitive endoderm states. We validated the cell state changes at the single-cell level through single-cell mRNA sequencing. Furthermore, we also demonstrate that the in-vitro reprogrammed totipotent cells mimic the totipotent cells of preimplantation embryo with the potency to generate in-vitro blastocyst (Blastoids) and to integrate into both embryonic and extra-embryonic lineages in the mice. Together these results revealed BMP signaling mechanisms to regulate both the totipotent state and the heterogeneity of ESCs. For our third study, we utilized the key observations from our mass cytometry data (first study) to evaluate the role of key regulatory proteins to promote the totipotent cell state. Here, we demonstrate that NACC1, a transcriptional regulator of ESCs, also acts as an important regulator of totipotent cells. Following identification of NACC1 as a potential regulator from both single-cell protein and bulk transcriptome data, we validated its function using CRISPR-mediated knock-out in combination with pluripotent-to-totipotent cell reprogramming conditions. Next, we integrated a combination of genomic approaches to study the NACC1 dependent system’s level changes in the transcriptome, chromatin accessibility and genomic DNA binding. Together, these data revealed that NACC1 induces both the coding gene and retrotransposon gene expression programs to promote the totipotent cell state. Finally, we showed that NACC1 regulates MERVL-int and MT2_Mm retrotransposable elements to modulate the expression of coding genes of the totipotent state. In conclusion, this thesis reveals the heterogeneous nature of mouse ESCs at the single-cell protein level, elucidates the significant role and mechanisms of BMP signaling pathway to regulate the totipotent state and ESC heterogeneity, and unveils NACC1 dependent gene regulatory mechanisms to promote the totipotent state. These findings open the door for subsequent studies aimed at understanding stem cell state specification and their transition occurring via modulation of signaling pathways / transcription factors. Moreover, these mechanisms may regulate the totipotent cell state in humans, shedding light on the cellular heterogeneity in human ESCs and in disease contexts, such as cancer.