The aims of this study were to assess the hematological response, erythrocyte membrane lipoperoxidation, antioxidant status and the mineral interaction in lambs supplemented with iron. In the first study, the oxidative profile, erythrogram, and the mineral interaction were assessed in lambs with anemia due to worm infection. For doing it, 27 lambs with anemia due to worm infection were used and they were divided in three groups: Control Group (GC) n=9, Ferrous Sulphate Group (G2) n=9 and Ferric Sulphate Group (G3) n=9. The animals of G2 received 200 mg of iron in the ferrous form (Fe+2) orally daily, the animals of G3 received 200 mg of iron in the ferric form (Fe+3) orally daily, whereas the GC received no treatment. There was no statistic difference in the serum iron values and erythrogram7. Serum copper and zinc values were lower in the G2 and G3 on days 21 and 28 of the experiments, whereas faecal copper, iron and zinc excretion were higher in the same groups. The SOD levels were lower in the G2 and G3 on day 28 whereas the NPTH measurement showed a decrease on days 21 and 28. In relation to TBARS, there was an increase. It was concluded that oral supplementation with 200 mg of iron, irrespective of its form does not increase the erythrocyte response in lambs. As well as, it has antagonist action on copper and zinc, reducing its serum concentrations and increasing the faecal excretion of these minerals. Moreover, the decrease of the serum copper and zinc concentrations causes a decrease in activity of superoxide dismutase, causing an oxidative stress situation. In turn, the second experiment assessed the hematological parameters, weight gain and hepatic function in anemic lambs. It was used 27 lambs with anemia due to worm infection divided in three experimental groups: Control Group (GC) n=9, Ferrous Sulphate Group (G2) n=9 and Iron Dextran Group (G3) n=9. The animals of G2 received 200 mg of iron in the ferrous form (Fe+2) orally daily, the animals of G3 received two intramuscular injections of 25 mg/kg/body weight of iron dextran at 7-day interval, the first one on day zero of the experiment, whereas the GC received no treatment. The serum iron levels in the G3 were higher than GC and G2 on days 7 and 14 (P>0,05). In relation to erythrogram, the G3 showed a significant improvement (P>0,05) compared to GC and G2 on days 7, 14 and 21. The hepatic iron levels in the G3 were higher than GC and G2, without changing the measurement of hepatic function. OPG and leucocytes levels showed no statistic difference among the groups. It was concluded that the administration of two doses of iron dextran increases serum and hepatic concentration of this mineral, however without damage to this organ and increases erythropoiesis whereas daily oral administration of 200 mg has no influence over red blood cell serie, neither serum and hepatic levels of this mineral. Both of them do not influence leucocytes. / O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta hematológica, lipoperoxidação da membrana do eritrócito, status antioxidante e a interação mineral em cordeiros suplementados com ferro. No primeiro estudo avaliaram-se o perfil oxidativo, eritrograma e interação mineral em cordeiros com anemia verminótica. Para isto, utilizou-se 27 cordeiros com anemia verminótica divididos em três grupos; Grupo controle (GC) n= 9, Grupo Sulfato ferroso (G2) n= 9 e Grupo Sulfato férrico (G3) n= 9. Os animais do G2 receberam via oral diariamente 200mg de ferro na forma ferrosa (Fe+2), os animais do G3 receberam via oral diariamente 200mg de ferro na forma férrica (Fe+3), enquanto que o GC não recebeu tratamento. Não houve diferença estatística nos valores de ferro sérico e eritrograma. Valores de cobre e zinco sérico foram inferiores nos G2 e G3 nos dias 21 e 28 do experimento, enquanto que a excreção fecal de cobre, ferro e zinco foram superiores nesses mesmos grupos. Os níveis de SOD foram inferiores nos G2 e G3 no dia 28 enquanto que a mensuração dos NPTH demonstrou diminuição nos dias 21 e 28. Em relação ao TBARS, houve um aumento no dia 28 nos G2 e G3. Conclui-se que a suplementação oral de 200mg de ferro, independente da sua forma, não aumenta a resposta eritrocitária em cordeiros. Bem como, tem ação antagonista sobre cobre e zinco, diminuindo suas concentrações séricas e aumentando a excreção fecal destes minerais. Além disso, pela diminuição das concentrações séricas de cobre e zinco causa uma diminuição da atividade da superóxido dismutase, ocasionando uma situação de estresse oxidativo. Por sua vez, o segundo trabalho avaliou os parâmetros hematológicos, ganho de peso e função hepática em cordeiros anêmicos. Foram utilizados 27 cordeiros com anemia verminótica alocados em três grupos experimentais; Grupo controle (GC) n= 9, Grupo Sulfato ferroso (G2) n= 9 e Grupo Ferro Dextrano (G3) n= 9. Os animais do G2 receberam via oral diariamente 200mg de ferro na forma ferrosa (Fe+2), os animais do G3 receberam duas aplicações de 25mg/kg/p.v. de ferro dextrano IM com intervalo de sete dias, a primeira no dia zero do experimento, enquanto que o GC não recebeu tratamento. Os níveis de ferro sérico no G3 foram superiores quando comparado aos GC e G2 nos dias 7 e 14 (P<0,05). Em relação ao eritrograma, o G3 apresentou uma melhora significativa (P<0,05) em comparação aos GC e G2 nos dias 7, 14 e 21. Os níveis de ferro hepático no G3 foram superiores em relação aos GC e G2, sem alterar a mensuração de parâmetros de função hepática. Os níveis de OPG e leucócitos não apresentaram diferença estatística entre os grupos. Conclui-se que a administração de duas doses de ferro dextrano eleva as concentrações séricas e hepáticas deste mineral, entretanto sem causar danos a este órgão e, aumenta a eritropoiese, enquanto que a administração oral diária de 200mg não tem influência sobre a série vermelha do sangue bem como sobre níveis séricos e hepáticos deste mineral. Ambos não exercem influência sobre leucócitos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The oxidation of low density lipoprotein is now an established hypothesis of atherogenesis and suggests that accumulation of oxidized low density lipoprotein (oxLDL) in the vessel wall is an early event in disease progression. OxLDL represents a variety of modification of both lipid and apolipoprotein B (apoB) components by peroxidation. This promotes atherosclerosis through inflammatory and immunologic mechanisms that lead to the formation of macrophage foam cells. There are studies showing that different antioxidants inhibit both ex vivo LDL oxidation and atherosclerosis in experimental animals. In view of this, we have evaluated the antioxidant properties of the new oximes butane-2,3-dionethiosemicarbazone and 3-(phenylhydrazono)butan-2-one against Cu2+-induced LDL and serum oxidation. Conjugated dienes formation, loss of tryptophan fluorescence, and TBARS formation were assassed as oxidation parameters. The results obtained in this study showed that both oximes are able to prevent Cu2+-induced LDL and serum oxidation in a concentration-dependent manner. Moreover, both oximes caused a significant increase in lag phase of conjugated dienes formation and a significant decrease in TBARS production. Indeed, oximes protected the early stage of LDL oxidation as destruction of tryptophan residues of ApoB and the subsequent propagation phase. Oxime butane-2,3-dionethiosemicarbazone showed to be more effective than 3-(phenylhydrazono) butan-2-one in all parameters analyzed. In conclusion, both oximes exhibited a protective role in LDL and serum oxidation. This protection may contribute to prevent LDL oxidation in vivo and thus the atherogenesis. However, further stydies are needed to clarify the oximes antioxidant properties angainst other models of free radical generators and the molecular mechanism in which oximes prevent LDL oxidation. / A oxidação da LDL é uma hipótese da aterogênese e sugere que o acúmulo de lipoproteína de baixa densidade oxidada (oxLDL) na parede do vaso é um evento precoce na progressão da doença. A oxLDL é uma molécula oriunda das modificações oxidativas que ocorrem nos componentes lipídicos e na apolipoproteína B (apoB) da LDL. A oxLDL ajuda a promover a aterosclerose através de mecanismos imunológicos e inflamatórios que levam à formação de células espumosas (foam cells). Existem estudos mostrando que diferentes antioxidantes inibem tanto a oxidação da LDL ex vivo quanto o desenvolvimento de aterosclerose em modelos de animais experimentais. Em vista disto, neste trabalho foi avaliado o efeito das propriedades antioxidantes das oximas butano-2,3-dionethiosemicarbazone e 3- (phenylhidrazono)butano-2-ona contra a oxidação da LDL isolada e do soro induzida por Cu2+. A formação de dienos conjugados, a perda da fluorescência do triptofano e a formação de TBARS foram avaliadas como parâmetros de oxidação. Os resultados obtidos neste estudo mostraram que ambas as oximas foram capazes de prevenir a oxidação da LDL e do soro induzidas por Cu2+ de maneira dependente da concentração. Ambas as oximas causaram um aumento significativo na fase lag da formação de dienos conjugados e uma diminuição significativa na produção de TBARS. Além disso, as oximas se mostraram efetivas em proteger a fase inicial da oxidação da LDL, indicada pela destruição de resíduos de triptofano da apoB e a subsequente fase de propagação. A oxima butano-2,3-dionethiosemicarbazone mostrou-se mais eficaz do que a 3-(phenylhydrazono) butano-2-one em todos os parâmetros analisados. Em conclusão, ambas as oximas foram efetivas em proteger a LDL da oxidação. Esta proteção pode contribuir para evitar a oxidação de LDL in vivo e possivelmente a aterogênese. No entanto, estudos adicionais são necessários para esclarecer as propriedades antioxidantes das oximas contra outros geradores de radicais livres e o mecanismo molecular pelo qual as mesmas reduzem a oxidação da LDL.

O transtorno do humor bipolar (THB) é uma doença de curso recorrente, crônica e altamente incapacitante e está associado com o aumento da morbidade e da mortalidade por condições médicas gerais, como câncer e diabetes, as quais podem estar associadas com o aumento do dano ao DNA. Marcadores periféricos vêm sendo utilizados para verificarmos alterações bioquímicas que possam estar associadas com o THB e/ou possivelmente associadas à patofisiologia do THB. Diversos grupos têm proposto o envolvimento da S100B nos transtornos psiquiátricos. Outros marcadores bioquímicos, particularmente os associados como o dano oxidativo, também estão sendo estudados nesses trastornos. No presente estudo, nós avaliamos marcadores de dano neuronal, estresse oxidativo e dano ao DNA em pacientes com THB. As aterações astrocíticas foram verificadas através dos níves séricos de S100B; espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividade das enzimas antioxidantes foram medidas para verificar os níveis séricos de estresse oxidativo nos paciente com THB nas diferentes fases da doença. O dano ao DNA foi avaliado utilizando-se o ensaio Cometa em trinta e dois pacientes bipolares tipo-I. Nós encontramos um aumento significativo dos níveis de S100B, atividade da Superóxido dismutase (Sod) e da razão entre Sod/(glutationa peroxidase + catalase) nos pacientes maníacos e deprimidos. Os pacientes bipolares tipo-I apresentaram elevação da freqüencia de dano ao DNA em comparação ao grupo controle. Estes resultados sugerem um potencial dano oxidativo nos pacientes bipolares. A variação oxidativa periférica pode estar indicando que estas ocorram durante as fases ativas da doença (depressão e mania) e estejam realcionadas ao aumento do dano ao DNA dos pacientes. Além disso, alterações astrocíticas também foram relatadas pelas alterações dos níveis de S100B. / Bipolar disorder (BD) is a chronic, severe, and highly disabling psychiatric disorder that is associated with increased morbidity and mortality due to general medical conditions. There is an emerging body of evidence correlating chronic medical conditions to DNA damage. Peripheral markers have been used to assess biochemical alterations associated with BD and/or possibly involved in its pathophysiology. Many groups have proposed the involvement of S100B in psychiatric disorders. Other biochemical markers, particularly associated with oxidative stress have been studied in this disorder. In the present study we evaluated markers of brain injury, oxidative stress and DNA damage in patients with BD. Brain injury was assessed using serum S100B content; oxidative stress was assessed using serum thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and activities of antioxidant enzymes in BD patients in different episodes of disease. The DNA damage was assessed using Comet assay in thirty-two bipolar-I outpatients. We found a significant increment of serum S100B during episodes of mania and depression but not in euthymic patients. Superoxide dismutase (Sod) activity, as well the Sod/glutathione peroxidase plus catalase ratio, was also increased in manic and depressed patients. On the other hand, TBARS levels were increased in BD patients regardless of the phase of the disorder. Bipolar-I outpatientes present an increase frequency of DNA damage as compared to controls. These findings suggest a potential oxidative damage in BD patients. This peripheral oxidative imbalance indicates that systemic changes are taking place during the active phases (depressive and mania) of the illness, and this may be increases DNA damage in BD patients. Such changes seem to relate to astrocyte function, as assessed using serum S100B.

A 5-oxoprolina (ácido L-piroglutâmico) se acumula na deficiência de glutationa sintetase, uma doença genética autossômica recessiva clinicamente caracterizada por anemia hemolítica, acidose metabólica e sintomas neurológicos severos. Considerando que os mecanismos de dano cerebral nessa doença são pouco conhecidos, e que recentemente demonstramos que a 5-oxoprolina é capaz de promover estresse oxidativo in vitro, resolvemos investigar os efeitos in vivo da 5-oxoprolina sobre parâmetros de estresse oxidativo, afim de melhor esclarecer seu papel na neurotoxicidade da 5-oxoprolina e sua participação nos mecanismos neuropatológicos da deficiência de glutationa sintetase. Para isso, os efeitos da administração subcutânea aguda de 5-oxoprolina foram estudados sobre o potencial antioxidante total (TRAP); a quimiluminescência espontânea; as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS); o conteúdo de carbonilas, ácido ascórbico, glutationa reduzida (GSH), peróxido de hidrogênio, tióis e dissulfetos (e a razão SH/SS), assim como sobre as atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx), e a atividade da glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD) em córtex cerebral e cerebelo de ratos de 14 dias de vida Os resultados obtidos indicaram que in vivo a 5-oxoprolina causa lipoperoxidação e oxidação protéica, compromete as defesas antioxidantes cerebrais e aumenta o conteúdo de peróxido de hidrogênio, indicando que a 5-oxoprolina promove estresse oxidativo in vivo em córtex cerebral e cerebelo de ratos jovens, mecanismo possivelmente envolvido na neuropatologia da deficiência de glutationa sintetase, na qual a 5-oxoprolina está acumulada. O ácido N-acetilaspártico, por outro lado, se acumula na Doença de Canavan, uma leucodistrofia severa causada pela deficiência da enzima aspartoacilase e clinicamente caracterizada por retardo mental severo, hipotonia e macrocefalia, e também por convulsões tônico-clônicas generalizadas em aproximadamente metade dos pacientes. O ácido N-acetilaspártico é um precursor imediato para a biossíntese enzimática do ácido Nacetilaspartilglutâmico, cuja concentração também está elevada nos pacientes afetados pela Doença de Canavan. Considerando que os mecanismos de dano cerebral nessa doença permanecem pouco esclarecidos, investigamos o papel do estresse oxidativo na neurotoxicidade dos ácidos N-acetilaspártico e N-acetilaspartilglutâmico, a fim de avaliar o possível envolvimento dos mesmos na neuropatologia da Doença de Canavan. Os efeitos in vitro dos ácidos N-acetilaspártico e N-acetilaspartilglutâmico, assim como os efeitos das administrações subcutânea e intracerebroventricular (i.c.v.) de ácido N-acetilaspártico e da administração i.c.v. do ácido N-acetilaspartilglutâmico, foram estudados sobre os seguintes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos: TRAP; TAR; quimiluminescência espontânea; TBA-RS; conteúdos de GSH, peróxido de hidrogênio, tióis totais e carbonilas; atividades das enzimas antioxidantes CAT, SOD e GPx; e atividade da G6PD. Os resultados indicaram que apenas o ácido N-acetilaspártico é capaz de aumentar o conteúdo de peróxido de hidrogênio, estimular a lipoperoxidação e a oxidação protéica e de comprometer as defesas antioxidantes em cérebro de ratos, promovendo estresse oxidativo, que pode estar envolvido nos mecanismos patofisiológicos responsáveis pelo dano cerebral observado nos pacientes afetados pela Doença de Canavan, cujo marcador bioquímico clássico é o acúmulo de ácido N-acetilaspártico. / 5-Oxoproline (L-pyroglutamic acid) accumulates in glutathione synthetase deficiency, an autossomic recessive inherited disorder clinically characterized by hemolytic anemia, metabolic acidosis and severe neurological symptoms. Considering that the mechanisms of brain damage in this disease are poorly known, and that oxidative stress is elicited by 5-oxoproline in vitro, we decided to study the in vivo effects of this metabolite on oxidative stress parameters, in order to further clarify its role in 5-oxoproline neurotoxicity and its participation on the neuropathological mechanisms of patients affected by glutathione sintetase deficiency. The effects of acute subcutaneous administration of 5- oxoproline were studied on a wide spectrum of oxidative stress parameters, such as total radical-trapping antioxidant potential (TRAP); spontaneous chemiluminescence; thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS); and carbonyl, ascorbic acid, reduced glutathione (GSH), hydrogen peroxide, thiol and disulfide contents (and SH/SS ratio), as well as on the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx), and on the activity of glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD) in cerebral cortex and cerebellum of 14-day-old rats. The results indicated that in vivo 5-oxoproline causes lipid peroxidation and protein oxidation, impairs brain antioxidant defenses and increases hydrogen peroxide content, indicating that 5- oxoproline elicits oxidative stress in vivo in cerebral cortex and cerebellum of young rats, a mechanism that may be involved in the neuropathology of gluthatione synthetase deficiency, in which this metabolite accumulates. N-acetylaspartic acid, on the other hand, accumulates in Canavan Disease, a severe leukodystrophy characterized by swelling and spongy degeneration of the white matter of the brain. This inherited metabolic disease, caused by deficiency of the enzyme aspartoacylase, is clinically characterized by severe mental retardation, hypotonia and macrocephaly, and also generalized tonic and clonic type seizures in about half of the patients. N-acetylaspartic acid is an immediate precursor for the enzyme-mediated biosynthesis of N-acetylaspartylglutamic acid, whose concentration is also increased in urine and cerebrospinal fluid of patients affected by Canavan Disease. Considering that the mechanisms of brain damage in this disease remain poorly understood, in the present study we investigated whether oxidative stress is elicited by N-acetylaspartic acid or its metabolite, N-acetylaspartylglutamic acid. The in vitro effects of N-acetylaspartic acid and N-acetylaspartylglutamic acid, as well as the effect of the acute subcutaneous administration of N-acetylaspartic acid, and the intracerebroventricular administration of Nacetylaspartic acid or N-acetylaspartylglutamic acid, were studied on oxidative stress parameters: TRAP, TAR, spontaneous chemiluminescence, TBA-RS, reduced glutathione content, sufhydryl content, carbonyl content, and on enzyme activities of CAT, SOD and GPx as well as on GSH and hydrogen peroxide contents and on G6PD activity, in the cerebral cortex of rats. Our results indicated that only N-acetylaspartic acid promotes oxidative stress by stimulating lipid peroxidation, protein oxidation and by impairing antioxidant defenses and enhancing hydrogen peroxide content in rat brain. This could be involved in the pathophysiological mechanisms responsible for the brain damage observed in patients affected by Canavan Disease, in which N-acetylaspartic acid accumulation is the biochemical hallmark.

O câncer de pulmão é a neoplasia maligna mais letal em todo o mundo. As terapias disponíveis são pouco eficazes e a alta mortalidade não têm se alterado ao longo dos anos. O câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC do inglês non small cell lung cancer) representa 80% dos casos e pode ser dividido em três subtipos histológicos: adenocarcinoma (AdC), carcinoma de células grandes (LCC do inglês large cell carcinoma) e carcinoma escamoso. Células tumorais possuem maior capacidade de proliferação, migração e invasão. São também incapazes de responder a sinais que inibam proliferação ou ativem morte celular programada e ainda estimulam a formação de novos vasos sanguíneos. Todos estes aspectos são afetados pelo metabolismo redox, cuja homeostase intracelular é mantida pelo equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes. A homeostase redox das células pulmonares é afetado pela exposição à grande pressão de O2 e oxidantes ambientais, devido à fisiologia deste órgão. Além disso, todo tumor sólido se desenvolve num microambiente de inflamação crônica com alta produção de espécies reativas (ER). Portanto, a tumorigênese selecionará células adaptadas para sobrepujar este ambiente oxidativo em seu favor. Discute-se que a elevação de defesas antioxidantes contribua para esta adaptação. Porém, apesar de níveis elevados de ER poderem causar morte celular por estresse oxidativo, hoje se sabe que um aumento moderado nestes níveis modula processos fisiológicos relevantes à agressividade tumoral, como os citados a cima. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar a relação entre o metabolismo redox intracelular e a agressividade tumoral em NSCLC. Foram utilizadas 4 linhagens humanas de NSCLC de dois tipos histológicos: AdC (A549 e EKVX) e LCC (H-460 e HOP-92). Foram avaliados dois parâmetros de agressividade tumoral (invasividade e quimioresistência), obtendo-se uma linhagem claramente mais agressiva em cada subtipo histológico. Após, foi analisado o perfil redox intracelular em função da agressividade. Concluiu-se que as linhagens mais agressivas possuem um desbalanço enzimático sugerindo uma elevação no steadystate da produção de ER, confirmada posteriormente pelo ensaio de DCF. Estas linhagens apresentaram ainda potencial antioxidante total e o nível de tióis reduzidos (-SH) diminuídos e índice de lipoperoxidação aumentado. Esses dados corroboram os resultados anteriores e juntos caracterizam o ambiente redox intracelular das linhagens mais agressivas como mais pró-oxidante. Caso houvesse aumento nas defesas antioxidantes durante a progressão tumoral, esperaríamos um estado redox mais redutor, porém, o presente trabalho demonstra o contrário. Posteriormente, foi avaliada a influência da espécie reativa peróxido de hidrogênio (H2O2) em dois parâmetros de malignidade tumoral. Na proliferação celular, o H2O2 se mostrou um mediador necessário, uma vez que sua remoção inibe este processo. Ainda, sua adição estimulou maior proliferação nas linhagens mais agressivas. O H2O2 também foi capaz de aumentar a taxa de migração celular, enquanto sua remoção a inibiu parcialmente. Desta forma, pode-se concluir que o desbalanço redox favorecendo ambiente intracelular pro-oxidante acompanha a progressão tumoral em NSCLC. Além disso, ela é fundamental à malignidade das células tumorais de NSCLC. Assim, o uso de antioxidantes como terapia adjuvante possivelmente é uma alternativa viável para melhorar o prognóstico de câncer de pulmão de não pequenas células. / Lung cancer is the most lethal malignant neoplasy worldwide. The available therapies have little efficacy and the high death rate has not been changed in the last decade. Non small cell lung cancer (NSCLC) accounts for 80% of the cases and can be sub-classified in three histological subtypes: adenocarcinoma (AdC), large cell carcinoma (LCC) and squamous cell carcinoma. Cancer cells have elevated capacity to proliferate, migrate and invade. Also, they stimulate the growth of new blood vessels and are insensitive to signals that inhibit proliferation or activate programmed cell death. All of there aspects are influenced by redox metabolism, which homeostasis is maintained by the equilibrium between oxidants and antioxidants. The redox homeostasis of pulmonary cells is affected by the exposure to elevated O2 pressure and environmental oxidants, due to the physiology of the lungs. Besides, every solid tumor develops in a chronic inflammatory microenvironment with elevated production of reactive species (RS). Thus, the occurrence of a tumor must select those cells necessarily capable of dealing with this oxidative environment. It is believed that this success could be achieved with an increased antioxidant capacity. Although elevated levels of RS can cause oxidative stress-mediated cell death, nowadays it is known that mild increase in RS levels can influence the physiology of the cell, including the aspects mentioned earlier. This way, the present study aimed to investigate the association between intracellular redox metabolism and tumor aggressiveness in NSCLC. Four human NSCLC cell lines were used divided in two histological subtypes: AdC (A549 and EKVX) and LCC (H-460 and HOP-92). In first place, it was evaluated two aggressiveness parameters (invasiveness and chemoresistance), obtaining one cell line clearly most aggressive within each histological subtype. Then, the intracellular redox profile was evaluated and analyzed in light of aggressiveness. We found that the most aggressive cell lines have an enzymatic imbalance suggesting an elevation of steady-state RS production, further confirmed by DCF assay. These cell lines also showed lower reduced thiol (-SH) levels and total antioxidant potential, and higher lipoperoxidation index. This data corroborates previous conclusion and collectively characterize the intracellular redox environment of the most aggressive cell lines as more pro-oxidant. If tumor progression were followed by elevation in antioxidant defenses, one would expect a reducer intracellular environment, however this work demonstrates the opposite. Hence, the influence of the RS hydrogen peroxide (H2O2) in malignant parameters was evaluated. In proliferation, H2O2 could be defined as a necessary mediator, once its removal inhibited this process. Moreover, addition of H2O2 stimulated higher proliferation in the most aggressive cell lines. Hydrogen peroxide was also capable of enhance the migratory rate, while its removal partially inhibited it. Concluding, the redox imbalance favoring pro-oxidative intracellular environment might follows NSCLC tumor progression. Furthermore, it is essential to tumor malignancy in NSCLC. This way, the use of antioxidants as adjuvant therapy could be a viable alternative to improve the prognostic of non small cell lung cancer.

Foram realizados estudos in vitro para verificar a presença de componentes fenólicos, capacidade antioxidante total (TRAP) e a reatividade antioxidante total do suco de uva e vinho tinto. Também foi verificada a propriedade destas bebidas de inibir a produção de ânion superóxido (O2 •-) pela xantina oxidase in vitro. Estes estudos comprovaram que o vinho tinto apresenta maior quantidade (TRAP) e qualidade (TAR) de antioxidantes em relação ao suco, assim como maior porcentagem de inibição de produção de O2 •-. Em conseqüência, foi realizado um estudo in vivo, utilizando um modelo de insuficiência cardíaca direita (ICD) através da administração de monocrotalina (MCT) na dose de 60mg/kg. Foram utilizados ratos machos Wistar, onde foram investigados os efeitos da administração do suco de uva preta e vinho tinto Cabernet Franc durante 45 dias. Foram avaliados parâmetros morfométricos através da hipertrofia cardíaca direita, esquerda e nível de congestão hepática e pulmonar, parâmetros hemodinâmicos do VD medindo a pressão intraventricular sistólica direita (PSVD), diastólica final ventricular direita (PDFVD) e as respectivas derivadas (+dP/dt e –dP/dt). Seis grupos experimentais foram estabelecidos: Controle (GC), Insuficiente (GI), Vinho (GV), Vinho insuficiente (GVI), Suco (GS) e Suco insuficiente (GSI). As bebidas foram administradas por sonda intragástrica, na quantidade de 20 mL.kg–1.dia–1 de suco e água, e o vinho na concentração de 15 mL.kg–1 .dia–1. Os animais aos quais foi administrado vinho, iniciaram o tratamento com suco desde o desmame até 49 dias de idade, devido à bebida ser isenta de álcool, e somente em idade mais avançada (aos 50 dias de vida) se introduziu o vinho. Os grupos GC e GI receberam água nas mesmas condições durante o protocolo experimental.

Estresse oxidativo é um desequilíbrio entre a geração de radicais livres e a capacidade de defesa do sistema antioxidante endógeno. Sabe-se também que o acúmulo extracelular de aminoácidos excitatórios leva a uma exacerbada estimulação de seus receptores, provocando insultos oxidativos no cérebro e pode levar a uma série de eventos que podem ser os causadores de diversas patologias como isquemia e doenças neurodegenerativas. A adenosina, ao ligar-se aos seus receptores, age como neuromoduladora da liberação desses neurotransmissores, protegendo as células contra o estresse oxidativo. Alem disso, sabe-se que a ativação de receptores de adenosina promove um aumento da atividade de enzimas antioxidantes. A Cafeína tem sua principal ação farmacológica através do antagonismo não seletivo dos receptores de adenosina, causando o bloqueio dos mesmos, e neste caso leva ao acúmulo de neurotransmissores no meio extracelular. Entretanto em altas concentrações, ela pode, por si só, ter ação antioxidante, “seqüestrando” radicais livres e, desta maneira, protegendo a célula do dano oxidativo. Por outro lado, alguns estudos demonstram que ela também pode ter ação pró-oxidante, quando em presença de altas concentrações de íons cobre e pode ter ação pró-apoptótica, via ativação da caspase 3. O objetivo deste trabalho foi a caracterização do efeito da ingestão crônica de cafeína (1g/L) por 7dias, sobre a atividade de enzimas de defesa antioxidantes (CAT, GSH-Px, SOD) em homogenato de hipocampo, cerebelo e estriado de ratos Wistar adultos. Nós também medimos a produção de radicais livres e a peroxidação de lipídeos Os resultados obtidos demonstraram que cafeína, administrada cronicamente, causa um aumento na peroxidação dos lipídeos de membranas e uma diminuição nas atividades das enzimas antioxidantes SOD e GSH-Px, nas três estruturas analisadas quando comparadas ao controle, porém não foi observada alteração na atividade da catalase. Além disso, não encontramos alteração nos níveis de produção de radicais livres. Portanto, embora alguns trabalhos demonstrem que a ingestão crônica de cafeína pode ter uma ação neuroprotetora, em nosso trabalho nós demonstramos que cafeína pode potencialmente provocar dano celular em estruturas cerebrais através da diminuição das enzimas antioxidantes. Provavelmente, esse efeito seja devido a uma diminuição da expressão e/ou número de receptores de adenosina (A1 ou A2) ou a cafeína está agindo somente como antagonista competitivo, bloqueando a ação da adenosina endógena. Outros experimentos são necessários para comprovar esta hipótese.

Os compostos carbonílicos no estado triplete (CCT) são considerados espécies reativas de oxigênio uma vez que possuem comportamento químico semelhante ao de radicais alcoxil. Quando formadas em sistemas biológicos, estas espécies podem estar envolvidas tanto em processos benéficos quanto deletérios ao organismo, como é o caso da lipoperoxidação, onde CCT não só são gerados como também iniciam ou amplificam o processo. Visando estudar a capacidade de dienos conjugados de suprimir a energia triplete de tais compostos, de forma a diminuir seus efeitos deletérios, determinou-se as constantes de supressão, para quatro diferentes dienos, de acetona triplete gerada pela da termólise do tetrametil-1 ,2- dioxetano e pelo sistema enzimático isobutanal/ \"horseradish peroxidase\"/O2 Todos os dienos apresentaram constantes de supressão de ordem difusional. Foi analisada também a forma pela qual os dienos suprimem a acetona triplete e concluiu-se que tanto dienos com hidrogênios alílicos (2,4-hexadienoato e seu éster etílico), potencialmente abstraíveis, quanto dienos sem estes hidrogênios (2 ,4-pentadienoato e seu éster metílico), suprimem a acetona por um processo físico de transferência de energia, que leva à sua fotoisomerização cis,trans. A reatividade destes dienos frente a espécies reativas de oxigênio comumente formadas em sistemas de lipoperoxidação, como o oxigênio singlete, radicais hidroxil, peroxil e superóxido, foi também testada, mostrando que nenhum dos dienos apresenta atividade sequestradora destas espécies. Experimentos preliminares de lipoperoxidação em sistemas biomiméticos (mitocôndrias e microssomos isolados de fígado de rato), mostraram que o trans, trans-2,4-hexadienoato de etila é capaz de inibir o inchamento mitocondrial induzido por benzofenona triplete e de suprimir a quimiluminescência de microssomos induzida por Fe2+/ ascorbato. Concluiu-se assim que dienos conjugados, contendo ou não hidrogênios alílicos, podem ser usados como supressores específicos de compostos carbonílicos triplete em sistemas biológicos e contribuir para o esclarecimento dos mecanismos de reação destes processos. / Triplet carbonyls can be named reactive oxygen species once they behave chemically as alkyloxyl radicals and therefore can potentially drive beneficial and deleterious processes in biological systems. In the case of lipid peroxidation, these species have been found not only to be reaction products but also to amplify the radical chain by hydrogen abstraction of polyunsatured lipid molecules. With the aim of finding efficient and reliable chemical probes for triplet carbonyls, we studied here the quenching properties of conjugated dienes, namely 2,4-hexadienoate and 2,4- pentadienoate anions and corresponding alkyl esters, upon triplet acetone generated either chemically (thermolysis of tetramethyl-1 ,2-dioxetane) or enzymically (aerobic oxidation of isobutanal/horseradish peroxidase). As expected, the quenching rate constants were found to be diffusion controlled, although those for the pentadienoate derivatives were 3-fold lower than those measured for the hexadienoates. Therefore, independently of the presence of allylic hydrogens in the diene probe, the triplet acetone quenching occurred by a physical process followed by cis,trans-isomerization, without hydrogen abstraction from the quencher. The reactivity of the studied dienes towards oxygen reactive species known to be formed during lipid peroxidation, such as singlet oxygen, and peroxyl, hydroxyl and superoxide radicals, was also investigated to assure they would not interfere with the radical lipoperoxidation chain. Indeed, none of the dienes showed antioxidant activity on classical model systems. Preliminary experiments with model systems widely used to study lipid peroxidation showed that the trans, trans-ethyl sorbate can inhibit the mitochondrial swelling induced by enzymically formed triplet benzophenone and to quench the chemiluminescence of microsome preparations challenged with iron/ascorbate. This is in agreement with reported work showing that the lipid peroxidation chain associated with mitochondria permeabilization and polyunsaturated fatty acid peroxidation is amplified by intermediate triplet carbonyl products. Altogether our data indicate that conjugated dienes can be used as specific quenchers of triplet carbonyls formed in biological systems without reacting with other reactive intermediates.

O colesterol é um importante componente das membranas celulares em eucariotos superiores, desempenhando papéis estruturais e funcionais. O colesterol possui uma insaturação em sua estrutura sendo, portanto, alvo de oxidação mediada por espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio. A oxidação não enzimática do colesterol gera, como produtos primários, os hidroperóxidos de colesterol. Tais moléculas, por sua vez, são altamente reativas e podem reagir com metais livres e/ou metaloproteínas, trazendo consequências à celula. Neste sentido, o primeiro capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação dos hidroperóxidos de colesterol (ChOOH) com o citocromo c (citc), uma heme proteína envolvida no transporte de elétrons na mitocôndria. Análises de espectroscopia no UV-Vis mostraram que o ChOOH promove o bleaching da banda Soret do citc de uma maneira dose-dependente. Mais ainda, esta reação leva à formação de radicais centrados em carbono tanto na proteína como no lipídeo, sugerindo uma redução homolítica do ChOOH. Como consequências, pode-se observar a oligomerização do citc, um processo que pode influenciar no transporte de elétrons bem como na sinalização para a apoptose. A partir da reação do citc com ChOOH podem surgir, direta ou indiretamente, outras espécies reativas, como aldeídos, cetonas e epóxidos. Dentre estas, destacam-se os aldeídos de colesterol, em particular o colesterol secoaldeído (CSec) e o carboxialdeído (ChAld), uma vez que foram encontrados elevados em placas ateroscleróticas e em tecidos cerebrais de pacientes com doenças neurodegenerativas. Tais espécies podem reagir com resíduos de aminoácidos provocando alterações estruturais e funcionais em proteínas. Neste sentido, o segundo capítulo deste trabalho tem como objetivo estudar a reação do ChAld com citc. Usando modelos mimétivos de membrana e espectrometria de massas, foi mostrado que o ChAld modifica covalentemente o citc por um mecanismo consistente com a formação de bases de Schiff. Tal modificação ocorre preferencialmente em resíduos de lisina que interagem com a membrana. Estas modificações influenciam na afinidade do citc pela membrana, aumentando sua aderência, o que pode ter influência no transporte de elétrons e sinalização para a apoptose. No terceiro e último capítulo deste trabalho nós buscamos uma ferramente analítica que permitisse analisar modificação de proteínas promovidas por produtos de oxidação de colesterol e outros esteróis. Em um estudo realizado em colaboração com o grupo do professor Porter na Universidade de Vanderbilt, utilizamos ensaios baseados em click chemistry para buscar proteínas modificadas. Para isso, foram sintetizados derivados de colesterol e 7-deidrocolesterol (7-DHC, precursor imediato do colesterol) contendo um grupo alquinil na sua cadeia lateral. Este grupo pode ser ligado a um grupo azida por meio de uma reação de cicloadição, em um processo conhecido como click chemistry. Após a síntese e caracterização dos derivados lipídicos contendo o grupo alquinil na cadeia lateral, células Neuro2a foram tratadas com o alquinil-7-DHC e o alquinil-colesterol para averiguar seu metabolismo. Análises por HPLC-MS/MS mostraram que ambos derivados contendo o grupo alquinil foram metabolisados e convertdos nos respectivos ésteres. Usando um modelo celular para a doença conhecida como Sindrome de Smith-Lemli-Opitz (SLOS), doença caracterizada pela deficiência na enzima 7-deidrocolesterol redutase, foi mostrado que o acúmulo característico de 7-DHC nos pacientes pode levar a uma maior modificação de proteínas promovidas por seus derivados, o que pode contribuir para o desenvolvimento da doença. / Cholesterol is an important component of eukaryotic cellular membranes, where it has an influence in the fluidity and stability. Due to the presence of a double bond in its structure, cholesterol can be oxidized by reactive oxygen and nitrogen species. This non-enzymatic oxidation generates, as primary products, cholesterol hydroperoxides. Such molecules, in turn, are highly reactive and can react with free metal ions and/or metalloproteins, affecting cell metabolism. Therefore, the first chapter of the present study aims to investigate the reaction of cholesterol hydroperoxides (ChOOH) with cytochrome c (cytc), a heme protein involved in the mitochondrial electron transport. Spectroscopic analyses in the UV-Vis region showed that ChOOH induces a dose-dependent bleaching of cytc\'s Soret band. In addition, this reaction leads to the formation of carbon-centered radicals on both protein and lipid, suggesting a homolytic reduction of ChOOH. As consequences, cytc undergoes oligomerization, a process that can influence electron transport and apoptosis signaling. The reaction of cytc and ChOOH can produce, directly or indirectly, reactive species such as epoxides, aldehydes and ketones. Among them, cholesterol aldehydes, such as cholesterol secoaldehyde (CSec) and cholesterol carboxyaldehyde (ChAld), are of particular interest, since they were previously found elevated in atherosclerotic plaques and brain tissue of patients bearing neurodegenerative diseases. These species can also react with amino acid residues leading to protein denaturation and malfunction. With that in mind, the second chapter of this study aims to investigate the reaction of ChAld and cytc. Using mimetic membrane models and mass spectrometry analyses, we showed that ChAld covalently modifies cytc through a mechanism consistent with the formation of Schiff base adducts. Such modification occurs mostly at lysine residues that are known to interact with the membrane. The modifications have an influence in the affinity of cytc to the membrane, where they increase its binding to the membrane, a process that could affect the electron transport and apoptosis signaling. In the last and third chapter of this study we wanted an analytical tool that allowed the investigation of protein adduction promoted by cholesterol and other sterols-derived oxidation products. In a study performed in collaboration with the Porter group from Vanderbilt University, we used analyses based on click chemistry to search for protein adduction. To address that, we first synthesized derivatives of cholesterol and 7-dehydrocholesterol (7-DHC, the immediate precursor of cholesterol) containing an alkynyl group in the side chain. The alkynyl group can be ligated to an azide group through a cycloaddition reaction, in a process known as click chemistry. After the synthesis and characterization of alkynyl derivatives, Neuro2a cells were treated with alkynyl-7-DHC and alkynyl-cholesterol to check their metabolism. HPLC-MS/MS analyses showed that both alkynyl derivatives are metabolized and converted into their respective esters. In addition, using a cell model for Smith-Lemli-Optiz Syndrome (SLOS), a disease characterized by the deficiency in the dehydrocholesterol reductase 7, we showed that the characteristic accumulation of 7-DHC in SLOS patients might be associated with protein adduction promoted by its oxidation products, which might contribute to the development of the disease.

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