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Investigations of the bacterial sink for plant emissions of chloromethane / Etude du puits bactérien pour les émissions végétales de chlorométhaneFarhan Ul Haque, Muhammad 30 May 2013 (has links)
Le chlorométhane est le plus abondant des composés organo-halogénés dans l’atmosphère et il est impliqué dans la destruction de l’ozone dans la stratosphère. Les sources et les puits de chlorométhane restent mal évalués. Bien que synthétisé et utilisé de manière industrielle, il est principalement produit naturellement, avec comme sources majeures les émissions provenant des végétaux et plus particulièrement de la phyllosphère, qui correspond aux parties aériennes des plantes. Certaines bactéries épiphytes de la phyllosphère sont des méthylotrophes capables d’utiliser des composés organiques sans liaison carbone-carbone comme le méthanol et le chlorométhane comme unique source de carbone et d’énergie pour leur croissance. La plupart des bactéries chlorométhane-dégradantes isolées jusqu’à présent utilisent une voie métabolique pour leur croissance sur chlorométhane appelée voie cmu (pour chloromethane utilisation), caractérisée par l’équipe. L’objectif principal de cette thèse a été de déterminer si des bactéries de la phyllosphère peuvent jouer le rôle de filtre pour l’émission de chlorométhane par les plantes. Dans ce but, un modèle de laboratoire a été mis en place, constitué de la plante Arabidopsis thaliana connue pour produire du chlorométhane par une réaction impliquant le gène HOL1, et la bactérie Methylobacterium extorquens CM4, souche de référence pour l’étude du métabolisme de dégradation du chlorométhane, qui possède la voie cmu et dont le génome complet a été séquencé et analysé. Des variants d’A. thaliana avec différents niveaux d’expression du gène HOL1 (le type sauvage, le mutant homozygote « knock-out » hol1 et un variant HOL1-OX avec surexpression) ont été sélectionnés par PCR et qPCR. Des souches bactériennes chlorométhane-dégradantes ont été isolées à partir de la phyllosphère d’A. thaliana, dont il a été montré qu’elles possèdent la voie cmu. Un bio-rapporteur bactérien pour le chlorométhane a été construit à l’aide d’un plasmide exploitant la région promotrice du gène conservé de la déshalogénase (cmuA) de la souche M. extorquens CM4. Il présente une réponse fluorescente rapide, sensible, et spécifique aux méthyl-halogénés de manière concentration-dépendante. L’application du bio-rapporteur aux trois variants d’A. thaliana étudiés suggère des niveaux d’émissions de chlorométhane différents. L’analyse, par qPCR et qRT-PCR, de l’ADN métagénomique extrait de la surface des feuilles a montré une corrélation entre la proportion relative de bactéries portant le gène cmuA et l’exprimant dans cet environnement, et l’expression du gène HOL1. Ces résultats indiquent qu’une production de chlorométhane, même très modeste par rapport aux fortes émissions de méthanol par A. thaliana, confère un avantage sélectif pour les bactéries épiphytes chlorométhane-dégradantes. Ces dernières pourraient ainsi bien jouer un rôle de filtre pour les émissions de chlorométhane de la phyllosphère vers l’atmosphère. En perspective, de nouvelles expériences complémentaires, basées sur l’analyse par génomique comparative des souches chlorométhane-dégradantes également effectuée dans le cadre du projet et sur une analyse par séquençage à haut-débit initiée dans ce travail, sont proposées pour améliorer la compréhension des mécanismes d’adaptation des bactéries chlorométhane-dégradantes dans la phyllosphère. / Chloromethane is the most abundant halocarbon in the environment, and responsible for substantial ozone destruction in the stratosphere. Sources and sinks of chloromethane are still poorly constrained. Although synthesized and used industrially, chloromethane is mainly produced naturally, with major emissions from vegetation and especially the phyllosphere, i.e. the aerial parts of plants. Some phyllosphere epiphytes are methylotrophic bacteria which can use single carbon compounds such as methanol and chloromethane as the sole source of carbon and energy for growth. Most chloromethane-degrading strains isolated so far utilize the cmu pathway for growth with chloromethane which was characterized by the team. The main objective of this work was to investigate whether epiphytes may act as filters for plant emissions of chloromethane, by using a laboratory bipartite system consisting of the model plant Arabidopsis thaliana, known to produce chloromethane mainly by way of the HOL1 gene, and the reference chloromethane-degrading bacterial strain Methylobacterium extorquens CM4, possessing the cmu pathway and of known genome sequence. Three A. thaliana Col-0 variants with different levels of expression of HOL1, i.e. the wild-type strain, its homozygous HOL1 knockout mutant hol1 and an HOL1-OX HOL1 overexpressor, were selected using PCR and qRT-PCR. Chloromethane-degrading strains were isolated from the A. thaliana phyllosphere, and shown to contain the cmu pathway. A plasmid-based bacterial bioreporter for chloromethane was constructed which exploits the promoter region of the conserved chloromethane dehalogenase gene cmuA of strain CM4. It yields rapid, highly sensitive, specific and methyl halide concentration-dependent fluorescence. Application of the bioreporter to the three A. thaliana variants differing in expression of HOL1 investigated in this work suggested that they indeed synthesize different levels of chloromethane. Analysis by qPCR and qRT-PCR of metagenomic DNA from the leaf surface of these variants showed that the relative proportion and expression of cmuA in this environment paralleled HOL1 gene expression. Taken together, the results obtained indicate that even minor amounts of chloromethane produced by A. thaliana in the face of large emissions of methanol may provide a selective advantage for chloromethane-degrading methylotrophic bacteria in the phyllosphere environment. This suggests that chloromethane-degrading epiphytes may indeed act as filters for emissions of chloromethane from plants. Further experiments are envisaged to further assess the adaptation mechanisms of chloromethane-degrading bacteria in the phyllosphere, building upon the comparative genomic analysis of chloromethane-degrading strains which was also performed in this work, and on the preliminary investigations using high-throughput sequencing that were initiated.
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Etude de la complexité des éléments Cis-régulateurs chez les mammifères en utilisant des approches à haut débit / Study of cis-regulatory elements complexity in mammals using high-throughput approachesGriffon, Aurelien 02 June 2015 (has links)
La régulation des gènes est à l’origine de la diversité cellulaire en permettant aux cellules de se différencier et de se spécialiser. La régulation génique repose largement sur l’existence de séquences d’ADN non codantes dans le génome, appelées "éléments cis-régulateurs", qui vont permettre de recruter de nombreux facteurs de transcription afin de former d’importants complexes (nucléo)protéiques qui vont agir sur le niveau de transcription des gènes. Ce recrutement est notamment contrôlé par des modifications épigénétiques. Le développement des techniques de séquençage et des méthodes d’analyse bioinformatiques permettent d’intégrer de grandes quantités de données pour étudier le fonctionnement des éléments régulateurs. Dans un premier temps, l’intégration de l’ensemble des données ChIP-seq disponibles dans les bases de données nous a permis de créer un catalogue d’éléments régulateurs putatifs chez l’Homme. L’analyse de ce catalogue nous a alors mené à caractériser ces éléments et à mettre en évidence la complexité combinatoire des facteurs de transcription. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une étude basée sur l’analyse des éléments régulateurs impliqués dans la différenciation précoce des lymphocytes T chez la souris. Cette étude a permis de mettre en évidence deux niveaux de complexité impliqués dans la régulation des gènes : le premier est basé sur la combinatoire des facteurs de transcription au sein des éléments régulateurs et le second repose sur la combinatoire des éléments eux-mêmes. Finalement, nous avons développé une nouvelle technique d’analyse quantitative et à haut débit de l’activité régulatrice de régions génomiques chez les mammifères. / Gene regulation is responsible for cell diversity by allowing cell differentiation and specialisation. Gene expression regulation relies mainly on the existence of non-coding DNA sequences in the genome, called "cis-regulatory elements", which recruit numerous transcription factors to form (nucleo)protein complexes which act on the gene transcription level. This recruitment is controlled in particular by epigenetic modifications. The rapid development of sequencing technologies and bioinformatics methods makes possible the integration of large amounts of data to study regulatory elements. First, the integration of ChIP-seq data for all transcription factors available in public databases has allowed us to create an extensive catalogue of putative regulatory elements in the human genome. The overall analysis of this catalogue led us to further characterize these elements and to highlight the high level of combinatorial complexity of transcription factors in the genome. Secondly, we conducted a more specific study based on the analysis of the regulatory elements involved in the early differentiation of T-cells in mice. This study provided an opportunity to highlight two levels of complexity based on regulatory elements and involved in gene regulation: the first rests on the transcription factor combinatorial in regulatory elements and the second is based on the combinatorial of elements themselves within loci. Finally, to validate experimentally the regulatory elements, we have developed a new quantitative and high-throughput technique to assess the regulatory activity of genomic regions in mammals.
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Reinvigorating women's rights in Africa : the case for the Special Rapporteur and Additional ProtocolLuswata Kawuma, Eva January 2003 (has links)
"The objectives of the study are as follows: 1. To critically examine the efficacy of the mandate of the Special Rapporteur on the Rights of Women in Africa (SRRWA) with particular emphasis on the new legal framework created by the Protocol. 2. To investigate the operation of some universal and regional organs with comparable mandate, and their possible relevance to the improvement of the SRRWA. 3. To put forward recommendations for the improvement of the mandate of the SRRWA that will enhance its impact on the promotion and protection of women's rights in Africa. ... Following this introduction, the study is divided into three chapters. The first chapter traces the envolvement of the SRRWA in the Commission, provides its current operations and briefly expounds on the other mechanisms in the Commission targeting women. The second chapter evaluates both the terms of the mandate (within the context of the Protocol), and its successes and shortcomings. The third chapter explores comparative international and regional protection mechanisms and their possible relevance to the SRRWA. The fourth chapter contains recommendations on improving the mandate and concluding remarks." -- Introduction. / Thesis (LLM (Human Rights and Democratisation in Africa)) -- University of Pretoria, 2003. / http://www.chr.up.ac.za/academic_pro/llm1/dissertations.html / Centre for Human Rights / LLM
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Comprendre la régulation de p21 indépendante de p53 durant la sénescence dans le cancer de l'ovaireAda Ndong, Marie Orléane 04 1900 (has links)
Le carcinome ovarien est l'une des tumeurs gynécologiques les plus meurtrières dans le monde et particulièrement au Canada. En effet, il s’agit du troisième cancer de l’appareil reproducteur féminin le plus fréquent au Canada, selon la Société Canadienne du Cancer qui estima que sur 3 000 canadiennes ayant été diagnostiquées avec un cancer de l’ovaire en 2022, environ 1 950 ne survivront pas à la maladie. Les traitements de première ligne pour ce cancer comprennent la chirurgie cytoréductive associée à une chimiothérapie à base de platine et de taxane comme l’association des anticancéreux que sont le Carboplatine et Paclitaxel. Nous retrouvons également comme traitement la radiothérapie, et, plus récemment, les inhibiteurs de la poly (ADP-ribose) polymérase (PARPi) comme l'Olaparib qui sont désormais utilisés en première ligne dans ce type de cancer. Ces traitements peuvent entraîner différentes décisions concernant le devenir des cellules, impliquant non seulement la mortalité ou la survie des cellules cancéreuses, mais aussi un arrêt de la prolifération induit par le traitement appelé TIS pour sénescence induite par la thérapie.
Alors que les décisions relatives au devenir des cellules sont déterminantes pour l'issue du traitement du cancer, notre capacité à mesurer le devenir des cellules dans le cancer en temps réel est extrêmement limitée. Pour cette raison, il n'existe pas de modèles de cancer de l'ovaire qui puissent fournir un suivi non invasif du devenir des cellules à des moments spécifiques avec des biomarqueurs adaptés, pour décrypter le rôle des différents devenirs cellulaires, ou pour servir de contrôles expérimentaux précis dans les tests précliniques des stratégies d'intervention basées sur le devenir des cellules. Néanmoins, nous avons démontré qu’un fragment du promoteur du gène de la protéine p21, que nous avons nommé p21SEN, n'est exprimé que pendant la sénescence induite par les radiations, la chimiothérapie et les PARPi dans des lignées d’adénocarcinome ovarien à cellules claires (TOV21G). En effet, nous avons généré des lignées exprimant une protéine fluorescente verte dirigée par le promoteur p21SEN et ainsi, nous avons pu observer et suivre son activation à travers un signal vert durant la sénescence induite par les différents traitements utilisés. De plus, de façon intéressante, nos résultats ont également permis de montrer que cette expression de p21SEN durant la TIS semble être partiellement indépendante du facteur de transcription p53. Ainsi, nous suggérons que le promoteur p21SEN pourrait servir de rapporteur, en partie indépendant de p53, de l'induction de la sénescence dans un modèle utilisant un système de surveillance non invasif des décisions relatives au devenir des cellules dans le cancer de l'ovaire. / Ovarian carcinoma is one of the deadliest gynecological tumors worldwide, and particularly in Canada. In fact, it is the third most common cancer of the female reproductive system in Canada, according to the Canadian Cancer Society, which estimates that out of 3,000 Canadian women diagnosed with ovarian cancer in 2022, around 1,950 will not survive the disease. First-line treatments for this cancer include cytoreductive surgery combined with platinum and taxane chemotherapy such as the combination of the anticancer drugs Carboplatin and Paclitaxel. Other treatments include radiation therapy and, more recently, poly (ADP-ribose) polymerase inhibitors (PARPi) such as Olaparib, which are now used as first-line therapy for this type of cancer. These treatments can lead to different cell fate decisions, involving not only cancer cell death or survival, but also a treatment-induced proliferation arrest called TIS for therapy-induced senescence.
While cell fate decisions are critical to the outcome of cancer treatment, our ability to measure cell fate in real time in cancer is extremely limited. For this reason, there are no ovarian cancer models that can provide non-invasive monitoring of cell fate at specific time points with tailored biomarkers, to decipher the role of different cell fates, or to serve as accurate experimental controls in preclinical testing of fate-based intervention strategies. Nevertheless, we have demonstrated that a fragment of the p21 promoter, which we have termed p21SEN, is expressed only during radiation-, chemotherapy-, and PARPi-induced senescence in clear cell ovarian adenocarcinoma cell lines (TOV21G). Indeed, we generated cell lines expressing a green fluorescent protein directed by the p21SEN promoter and thus, we were able to observe and follow its activation through a green signal during the senescence induced by the different treatments used. Moreover, interestingly, our results also showed that this expression of p21SEN during TIS seems to be partially independent of the transcription factor p53. Thus, we suggest that the p21SEN promoter could serve as a partially p53-independent reporter of senescence induction in a model using a non-invasive monitoring system of cell fate decisions in ovarian cancer.
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A repercussão geral no Supremo Tribunal FederalCoelho, Damares Medina 04 August 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014-08-04 / This paper analyses Brazilian Supreme Federal Court s ( Supremo Tribunal Federal , STF) decision behavior, under the specific perspective of the general repercussion of the constitutional question. The starting point was the academic debate and several empiric studies regarding the judicial decision making process in the supreme courts. The Brazilian experience was analyzed using a comprehensive empiric research that comprised the examination of the whole universe of general repercussion s topics judged by STF until December 31st 2013. We have investigated how STF has been applying the institute of
general repercussion in order to understand general repercussion effects on the access to constitutional jurisdiction. The outcome evidenced the rapporteur power over the definition of general repercussion s result, as well as his selectivity of the case, of the process to be judged and of the judging house. We have identified that the institutional context influences the
trial s output, once the virtual plenary is the main competent house for judging general repercussion on STF. The analysis showed that, despite virtual plenary success and its
adjustment to general repercussion trial, there are limitations to be faced for its improvement and a possible amplification of its competences. Finally, we concluded that the incorporation
of the general repercussion of the constitutional question to STF s decision process increased access to constitutional jurisdiction. / O presente trabalho analisa o comportamento decisório do Supremo Tribunal Federal, sob o específico crivo da repercussão geral da questão constitucional. O ponto de partida foi o debate acadêmico e inúmeros estudos empíricos acerca do processo de tomada de decisão judicial nas supremas cortes. A experiência brasileira foi analisada a partir de exaustiva pesquisa empírica que compreendeu o exame de todo o universo de temas de
repercussão geral julgados pelo STF, até 31 de dezembro de 2013. Investigamos de que forma o tribunal vem aplicando o instituto da repercussão geral, para compreender os seus efeitos na jurisdição constitucional: restritivos ou ampliativos do acesso à jurisdição constitucional. Os resultados encontrados evidenciaram o poder do relator na definição do resultado da
repercussão geral, bem como a sua seletividade da matéria, do processo a ser julgado e do órgão julgador. Identificamos que o contexto institucional influencia no resultado do julgamento, sendo que o plenário virtual é o principal órgão competente para o julgamento da repercussão geral no STF. A análise demonstrou que, apesar do êxito do plenário virtual e de sua adequação para o julgamento da preliminar de repercussão geral, há limitações a serem enfrentadas para o seu aperfeiçoamento e possível ampliação de suas competências. Por fim, concluímos que a incorporação da repercussão geral da questão constitucional ao processo decisório do STF ampliou o acesso à jurisdição constitucional.
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Stratégies d'analyse spatio-temporelle de l‟épissage alternatif chez Caenorhabditis elegans / Strategies for spatio-temporal analysis of alternative splicing in Caenorhabditiqs elegans nervous systemMillet, Jonathan 18 December 2015 (has links)
L‟épissage alternatif est un mécanisme de régulation de l‟expression des gènes ayant pris une importance croissante dans l‟étude du vivant. Si des méthodes existent pour déterminer les gènes qui y sont soumis, peu d‟outils sont disponibles pour suivre ces événements d‟épissage in vivo au cours du développement. Pourtant, la caractérisation des régulations sous-jacentes à ces évènements et la détermination des facteurs impliqués sont dépendantes de stratégies fiables pour les visualiser dans des conditions physiologiques.Nous avons développé un système adapté à l‟étude d‟événements d‟épissage basé sur un rapporteur fluorescent bicolore. Nous l‟avons appliqué à cinq gènes de l‟organisme modèle Caenorhabditis elegans et avons suivi leur épissage in vivo.Parmi les différents gènes suivis, deux d‟entre eux suivaient un modèle d‟épissage potentiellement stochastique, un autre une absence d‟épissage alternatif détectable. Les deux derniers gènes présentent un profil d‟épissage spécifique à certain types cellulaires mais ont un effet toxique sur l‟organisme lorsque nous les avons exprimés à partir de concatémères extrachromosomiques. Pour remédier à cela, nous avons choisi de mettre en place une méthode simplifiée d‟insertion en simple copie des rapporteurs utilisant le CRISPR-Cas.Nos résultats indiquent que le système rapporteur fonctionne avec succès. Cependant, il peut encore être amélioré pour se rapprocher des taux physiologiques de transcription grâce à une insertion en simple copie dans le génome de l‟organisme. Nous avons également révélé un événement sous le contrôle de régulations spatiales, temporelles et conditionnelles. De plus, nous avons créé une série de constructions capables de déterminer les éléments en cis impliqués dans la régulation du gène top-1. / Alternative splicing is a regulatory mechanism of gene expression which is increasingly studied in Life Science. Methods exist to study this mechanism but specific tools to follow each alternative splicing event in a spatio-temporal manner are lacking. Yet, the characterization of the regulation and the elements that determines them depends on valide strategies for visualising them in physiological conditions.We have developped a dual-fluorescent reporter-based system in order to follow alternative splicing event regulation in vivo. It has been applied to five different genes in the model organism Caenorhabditis elegans. Among the genes followed, two follow a potentially stochastic scheme, one show no visible sign of alternative splicing. The last display tissue specific splicing patterns but developed a toxic effect in the animal when expressed from a multicopy extrachromosomal array. To remediate this problem, we decided to develop a method that allows for simpler single copy insertion of fluorescent reporter using CRISPR-Cas.Our results indicates that the dual-fluorescent reporter works well. However, this system can be upgraded by getting close to physiological rates of transcription allowed by single-copy insertion in the genome of C.elegans. We also discovered an alternatiove splicing event which follows a spatial, temporal and conditionnal regulation. Moreover, we constructed a set of different reporter to unravel the regulation observed in the gene top-1.
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Rôle du ribosome dans la sénescenceDel Toro Del Toro, Neylen 12 1900 (has links)
La sénescence est considérée comme un mécanisme de suppression tumorale puisque les cellules potentiellement dangereuses, activent leurs protéines de sauvegarde pour arrêter leur prolifération. Les protéines de sauvegarde telles que RB et p53 sont activées suite à différents stress comme des dommages à l’ADN, le raccourcissement des télomères ou l’induction oncogénique. Les cellules sénescentes restent métaboliquement actives, subissent des modifications dans leur expression génique, et sécrètent des cytokines et des chimiokines qui ont des effets paracrines pro-oncogéniques, mais peuvent également contribuer à la stabilité de l’arrêt du cycle cellulaire dans la sénescence de façon autocrine. Une des particularités du phénotype sénescent est la dégradation sélective des protéines dépendante de l’ubiquitination et du protéasome. Parmi les cibles de dégradation se trouvent des protéines impliquées dans la biogenèse du ribosome, ainsi que celles d’autres voies cellulaires requises pour la croissance de cellules cancéreuses. Ceci est lié à un stress nucléolaire qui affecte la biogenèse du ribosome, menant à l’accumulation, dans le nucléoplasme ou le nucléole, de protéines ribosomiques. Ce comportement suggère que les ribosomes des cellules sénescentes seraient structurellement différents. Par conséquent, ceci pourrait entrainer des effets sur leurs capacités à réguler l’initiation, l’élongation et/ou la terminaison de la traduction des ARN messagers (ARNm). Par ailleurs, la déplétion de certaines protéines impliquées dans la ribogenèse, ainsi que la surexpression de protéines ribosomiques telles que RPS14/uS11 amènent à la sénescence.
Malgré le stress nucléolaire et les défauts de ribogenèse associés à la sénescence, les cellules sénescentes présentent des niveaux de translecture du codon d’arrêt très diminué, suggérant l’existence de défauts de production de protéines allongées en C-terminal.
Nous émettons l’hypothèse que les défauts de la ribogenèse affecteraient la fonction des protéines ribosomiques et des ribosomes. Cette perturbation aurait un impact sur le rôle de suppresseur tumoral de la sénescence.
Le premier objectif de cette thèse consiste à démontrer le rôle de RPL22/eL22 en tant que régulateur du cycle cellulaire et inducteur de la sénescence. Le deuxième but est de démontrer que, malgré la perturbation nucléolaire, les ribosomes des fibroblastes sénescents reconnaissent les codons d’arrêt de façon plus efficace que les ribosomes des cellules transformées, ou des cellules normales en prolifération.
Nous avons démontré que le phénotype de sénescence peut être induit quand l’expression de RPL22/eL22 est augmentée. RPL22/eL22 s’accumule principalement dans le nucléole, de manière différente de RPS14/uS11, dont l’accumulation est nucléoplasmique. En effectuant des essais kinases in vitro, nous avons montré que RPL22/eL22, tout comme RPS14/uS11, peuvent interagir et inhiber le complexe CDK4-Cycline D1 afin d’activer la voie de RB et établir l’arrêt du cycle cellulaire et la sénescence.
Afin de démontrer la fidélité de la terminaison de la traduction dans les cellules sénescentes, nous avons utilisé un système de rapporteurs de luciférases, pour détecter les erreurs de translecture ainsi que pour avoir un contrôle interne du système. L’inactivation de la voie du suppresseur tumoral RB par surexpression de CDK4 ou de l’oncoprotéine virale E7, nous a permis d’observer l’augmentation de la translecture dans les cellules sénescentes. Tandis que l’activation de la voie de suppression tumorale RB, à l’aide du suppresseur de tumeur PML, de la surexpression de RPL22/eL22 et de RPS14/uS11, ainsi que de l’utilisation de Palbociclib (PD-0332991), un inhibiteur des kinases CDK4/6, a montré une réduction des erreurs de translecture.
Ces résultats indiquent une nouvelle fonction des protéines du ribosome en tant que suppresseurs de tumeur, permettant d’inhiber les erreurs de translecture du codon d’arrêt de façon dépendante de la voie de RB. Ces travaux suggèrent que de petites molécules ou peptides pourraient simuler les fonctions inhibitrices de ces protéines ribosomiques afin de traiter certains cancers où la voie de RB est activable. / Senescence is considered a mechanism for tumor suppression since potentially dangerous cells activate their protective proteins to stop their proliferation. Safeguard proteins such as RB and p53 are activated as a result of stress such as DNA damage, telomere shortening or oncogenic induction. Senescent cells are metabolically active, they undergo changes in their gene expression and secrete cytokines and chemokines with pro-oncogenic paracrine effects, but which can also contribute to the stability of the senescent cell cycle arrest in an autocrine way. One of the peculiarities of the senescent phenotype is the selective ubiquitination and proteasome dependent-degradation of proteins involved in ribosome biogenesis and other cellular pathways required for cancer cell growth, leading to the accumulation, in the nucleoplasm or nucleolus, of ribosomal proteins. This behavior suggests that the ribosomes of senescent cells are structurally different. Therefore, this could have effects on their ability to regulate the initiation, elongation and/or translation termination of messenger RNAs (mRNAs). Moreover, the depletion of some proteins involved in ribogenesis, as well as the overexpression of ribosomal proteins such as RPS14/uS11 lead to senescence.
Despite nucleolar stress and ribogenesis defects associated to senescence, global translation does not seem to be affected in senescence. Strikingly, senescent cells have reduced translational readthrough suggesting that they have defects in the production of C-terminal extended proteins.
We hypothesize that defects in ribogenesis would affect the function of ribosomal proteins and ribosomes influencing the tumor suppressor role of senescence. The first aim of this thesis is to demonstrate the role of RPL22/eL22 as a regulator of the cell cycle and senescence inducer. The second aim of this thesis is to demonstrate that, despite the nucleolar disruption, the ribosomes of senescent fibroblasts recognize stop codons more efficiently than ribosomes from transformed cells, but also than ribosomes from proliferating normal cells.
We found that the senescent phenotype can be induced by enhancing the expression of RPL22/eL22. RPL22/eL22 accumulates mainly in the nucleolus, unlike RPS14/uS11, whose accumulation is nucleoplasmic. By performing an in vitro kinase assay, we showed that RPL22/eL22, just like RPS14/uS11, can interact and inhibit the CDK4-Cyclin D1 complex in order to activate the RB pathway and establish cellular arrest and senescence.
To assess translation termination accuracy in senescent cells, we used a system of luciferase reporters to measure the fidelity of translation termination. Inactivation of the RB tumor suppressor pathway using CDK4 or the viral oncoprotein E7 also increased readthrough in senescent cells while overexpression of PML, a tumor suppressor that activates the RB pathway, overexpression of RPL22/eL22 and RPS14/uS11, as well as the use of Palbociclib (PD-0332991), a CDK4/6 inhibitor, reduce readthrough errors.
These results indicate a novel function of ribosomal proteins as tumor suppressors, making it possible to inhibit translational readthrough errors, in a RB-dependent pathway. This work suggests that small molecules or peptides could mimic the inhibitory functions of these ribosomal proteins in order to treat cancers where the RB pathway is activatable.
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