Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los efectos de la exposición a bajos niveles de plomo sobre la función endocrina e inmune, no han sido objeto de suficientes estudios, siendo esta situación diferente en el caso de la intoxicación aguda, particularmente en otros sistemas corporales, tales como el nervioso, cardiovascular, reproductivo y gastrointestinal. La presente investigación estudió los efectos de la exposición subaguda a bajos niveles de plomo en el periodo prepuberal, sobre algunos parámetros conocidos que evalúan, en alguna medida, los mecanismos de adaptación inmunoendocrinos frente al stress, considerándose en este estudio, el número de linfocitos T CD4+ y CD8+, número y grado de degranulación de leucocitos eosinófilos y número de receptores para glucocorticoides presentes en timo y bazo de las ratas impúberes analizadas. Ratas Sprague Dowley hembras, mantenidas bajo condiciones de manejo con 12 h de luz y acceso libre a alimento y agua, fueron expuestas a acetato de plomo o suero fisiológico, vía inyecciones subcutáneas sucesivas, alternadas cada 72 h, a partir de los 7 días de edad hasta alcanzar los 19 días, momento en el cual cada animal tratado con plomo recibió una dosis total acumulada de 24.38 mg., distribuida en forma de dosis crecientes, proporcionales al peso de los animales. Después de 48 h de la última dosis de suero fisiológico o acetato de plomo, se aplicó una inyección endovenosa única de suero fisiológico o 18 mg de succinato de hidrocortisona por cada 100 g de peso corporal y 24 h después se anestesió a los animales con gas éter, extrayendo muestra completa de timo y bazo, seleccionando tejido para fijación en formalina al 10%, deshidratación e inclusión en parafina, para luego realizar cortes histológicos seriados, sometiéndolos a tinción con azul de anilina y eosina, para la determinación, bajo microcopía de epifluorescencia, del número y grado de degranulación de eosinófilos. Adicionalmente, se dispusieron cortes para desparafinación y posterior incubación con anticuerpos monoclonales marcados con ficoeritrina o fluoresceína, siendo destinados una primera serie de cortes a reaccionar con los anticuerpos anti-CD8, procediendo en una segunda serie, a la incubación de los cortes con anticuerpos anti-CD4. Paralelamente, se tomaron muestras de bazo y timo de ratas sometidas a inyecciones de plomo o suero fisiológico entre los días 7 y 19 de edad, aplicando intravenosamente suero fisiológico en ambos grupos el día 21, procediendo 24 hrs. después a la recolección de pequeñas muestras de tejido, incubándolas in vitro con dexametasona tritiada, congelando posteriormente los tejidos radiomarcados en propano/butano líquido enfriado en nitrógeno líquido, para luego someter las muestras a la técnica de radioautografía seca, destinada a cuantificar, bajo microscopía óptica, los receptores para glucocorticoides presentes en timo y bazo. Los resultados mostraron una disminución inducida por plomo del número de linfocitos T CD4+ y CD8+ en timo de ratas expuestas a plomo durante la vida prepuberal, encontrándose además un reducido número de linfocitos CD8+ en los grupos tratados con hidrocortisona. El número de receptores para glucocorticoides no demostró variación estadísticamente significativa atribuible al efecto del plomo en el presente estudio experimental. Los animales expuestos a plomo demostraron una disminución en el número de eosinófilos en timo, pero no en bazo. Además, presentaron una disminución inducida por hidrocortisona en el número de eosinófilos en bazo, pero no en timo. Se comprobó un efecto sinérgico entre el plomo y la hidrocortisona, demostrado por el disminuido número de eosinófilos esplénicos en los animales que recibieron plomo y luego fueron tratados con hidrocortisona. Los leucocitos eosinófilos esplénicos se degranulan con mayor intensidad en los animales expuestos a plomo, observándose una reversión de este fenómeno inducido por hidrocortisona, revelada por una menor degranulación en el grupo expuesto a plomo y tratado con hidrocortisona en relación a los animales expuestos a plomo y tratados posteriormente con suero fisiológico. El grado de degranulación de los eosinófilos tímicos, no demostró diferencias significativas producto de algún tratamiento. No obstante, los eosinófilos de timo fueron de menor volumen y de mayor luminosidad que los encontrados en todas las muestras de bazo. Luego del análisis de los resultados es posible afirmar que la exposición subaguda a plomo en ratas a edad prepuberal, modifica variablemente el número de linfocitos T en órganos linfoides, alterando paralelamente la eosinofilia tisular y el grado de degranulación de los leucocitos eosinófilos, sin cambios aparentes en el número de receptores para glucocorticoides analizados en bazo y timo. / Financiamiento FONDECYT 1.950.634

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El ácido valproico es un fármaco muy utilizado en el tratamiento de la epilepsia, sin embargo, este fármaco posee reconocidos efectos teratogénicos si se administra durante las primeras semanas del embarazo, aumentando el riesgo de defectos del tubo neural. Una de las hipótesis para explicar estos efectos es que el ácido valproico disminuye las concentraciones de antioxidantes, como la vitamina E, induciendo un estrés oxidativo afectando la embriogénesis. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el rol de la vitamina E (alfa-tocoferol), en hembras gestantes (Mus musculus) tratadas con ácido valproico para visualizar los efectos adversos de este fármaco al ser utilizado como terapia antiepiléptica. El modelo experimental utilizado consistió en 24 hembras, de 8 días de gestación, las cuales fueron separadas en 4 grupos de 6 hembras cada uno a los que se les administró los siguientes fármacos: Grupo 1: control suero fisiológico 0,3 ml; grupo 2: ácido valproico 400mg/kg/peso; grupo 3: vitamina E 200 UI y grupo 4: ácido valproico 400 mg/kg/peso, previa administración de vitamina E 200 UI 1 hora antes. Al día 17 de gestación las hembras fueron sacrificadas, los fetos fueron extraídos, examinados, cuantificados y medidos. La mitad de cada camada fue tratada mediante la técnica de Hanken y Wassersug, el resto fue destinado a técnicas histológicas (hematoxilina - eosina - azul de alcián, Von Kossa). Los animales del Grupo 2 mostraron defectos en el esqueleto axil tales como: costillas supernumerarias o lumbares, costillas fusionadas, costillas onduladas y espina bífida. Además, algunos presentaron excencefalia, fetos amorfos y cuerpos vertebrales amorfos. El número de casos de dichas malformaciones congénitas disminuyeron en forma significativa tras la coadministración de vitamina E previo al tratamiento con ácido valproico (Grupo 4). Estos hallazgos apoyan la hipótesis que las malformaciones del esqueleto axil son menos frecuentes cuando la vitamina E es administrada. Además la administración de vitamina E en el día 8 de preñez no tiene efectos tóxicos en el desarrollo de esta estructura. Estos resultados constituyen un aporte importante en los estudios de biología del desarrollo debido a que demuestra que el ácido valproico podría comportarse de manera similar al ácido retinoico alterando la expresión de genes Hox, produciendo malformaciones congénitas. Finalmente la coadministración de vitamina E contribuye a evitar estos defectos

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Diabetes Mellitus (DM) es una enfermedad metabólica crónica, de origen multifactorial, en la cual defectos en la secreción y/o en la acción de la insulina sobre los tejidos del organismo resultan en una hiperglicemia. La hiperglicemia crónica condiciona a largo plazo el desarrollo de nefropatía, retinopatía, neuropatía y complicaciones cardiovasculares, determinando una alta morbilidad y mortalidad de los pacientes diabéticos respecto a la población general. Hoy esta enfermedad se clasifica en 5 grupos de pacientes: DM tipo 1 (insulinodependientes); DM tipo 2 (insulinoresistencia y deficiencia no absoluta de insulina); Diabetes gestacional; pacientes con intolerancia a la glucosa y glicemia de ayunas alterada e individuos que tienen glicemias anormales que condicionan un alto riesgo de desarrollar diabetes. La DM tipo 1 se presenta en forma predominante en niños y adultos jóvenes, debido a una destrucción de las células beta () por causa autoinmune. El objetivo principal del tratamiento de pacientes con DM tipo 1 es la normalización de los niveles de glucosa sanguínea, evitando así complicaciones a largo plazo. El transplante de islotes de Langerhans puede ser una forma segura y relativamente sencilla de restaurar la producción endógena de insulina en pacientes crónicos, con alteraciones sistémicas que han sido inmunosuprimidos por transplante renal. En este proceso, la etapa de aislamiento de islotes de Langerhans es la más crítica: el páncreas está expuesto a condiciones no fisiológicas, como bajas temperaturas, altas concentraciones de potasio (K+), y condiciones isquémicas calientes, resultando en un efecto negativo en la viabilidad y funcionalidad celular. En este estudio se investigó el efecto de la mantención de los islotes de Langerhans a 3°C sobre la secreción de insulina, comparando condiciones fisiológicas con las condiciones usadas en los procedimientos de aislamiento de islotes de Langerhans. Para esto se aislaron islotes de Langerhans de rata y se incubaron a distintas temperaturas, se midió la secreción de insulina en condiciones basales y elevadas de glucosa; secreción de insulina en ausencia de Ca2+, y secreción de insulina en sustitución de Na+ por Li+. Se determinó que la secreción de insulina aumenta significativamente sobre el nivel basal solamente al incubar en solución fisiológica con 3 g/L de glucosa a 37ºC, no observándose tal efecto a 3ºC, 17ºC y 27ºC. La secreción basal de insulina es insensible a la temperatura, pero sus mecanismos de regulación aún se desconocen. La ausencia de Ca2+ inhibe casi completamente la secreción de insulina estimulada por glucosa. La sustitución de Na+ por Li+ restaura la sensibilidad a la glucosa por parte de la célula beta () a 3ºC. Además, se concluyó que la presencia de Na+ no es indispensable en el mecanismo de secreción de insulina a 3ºC o 37°C. Se indica la necesidad de que se realicen nuevos experimentos conducentes a dilucidar el mecanismo por el cual el Li+ restaura la secreción de insulina inducida por glucosa a 3°C. Finalmente, se sugiere estandarizar las técnicas de trabajo para el aislamiento de islotes de Langerhans, sobre todo en la etapa de digestión pancreática

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se infectaron dos grupos de ratones de la cepa Balb/c, de dos y ocho meses de edad con 2000 tripomastigotes sanguíneos del clon Dm28c de Trypanosoma cruzi. Los resultados mostraron que este modelo, una vez transcurrido los 4 meses post infección, provoca un 100% y 60% de mortalidad en los ratones de dos y ocho meses de edad, respectivamente. El nivel máximo de parasitemia alcanzado por el grupo de mayor edad fue de 3,2 x 105 parásitos/mL, mientras que la máxima parasitemia en los ratones de menor edad fue de 5,1 x 105 parásitos/mL. A nivel histopatológico en los ratones de ocho meses las mayores alteraciones se localizaron en tejido cardiaco, y se observó que al transcurrir el tiempo de infección, en estas lesiones se inducían fenómenos de reparación. Por otro lado, en los ratones de dos meses las mayores alteraciones se ubican en músculo esquelético y no se observó ningún tipo de reparación en el tejido dañado. Estas diferencias observadas dentro de una misma cepa de ratón nos indica que la edad sería un factor importante en el desarrollo de la infección con T. cruzi, puesto que se ha postulado que la muerte del animal sería el resultado de la activación de mecanismos autoinmunes y probablemente al disminuir la efectividad del sistema inmune con la edad, se favorecería la supervivencia de los animales infectados de mayor edad

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Autores en los 70’s y 80’s reportaron que el Enriquecimiento Ambiental (EA) aumentaba selectivamente el sueño REM. Ellos relacionaron estos resultados con los procesos de aprendizaje que serían mayores en ratas que tienen EA. Sin embargo, durante los últimos años se ha propuesto que la relación entre sueño y aprendizaje podría involucrar factores mucho más sutiles que aumentos o disminuciones de cantidad de estados de sueño, tales como la alternancia entre sueño NREM y sueño REM o componentes circadianos. Este estudio evaluó los efectos del EA sobre el sueño de la rata usando mediciones tradicionales, como cantidad de estado, y otras más sutiles, tales como análisis de la arquitectura del sueño, transiciones entre estados y mecanismos regulatorios circadianos y homeostáticos. Para ello se utilizaron dos grupos de 4 ratas Sprague Dawley cada uno bajo un esquema de luz:oscuridad 12h:12h, que fueron registrados de forma continua. El grupo control o ratas no enriquecidas (RNE) fue mantenido bajo condiciones estándares de laboratorio, mientras que el grupo experimental o ratas de ambiente enriquecido (RAE) fue mantenido en condiciones ambientales enriquecidas, que consistían en cajas de mayor tamaño con túneles, material para hacer nido, rueda para correr y comida novedosa. Estas condiciones se mantuvieron posteriores a la cirugía y durante todo el registro. El diagnóstico de estados de sueño fue realizado de forma automática por un programa computacional. Se observó que RAE presentó significativamente mayor cantidad de sueño REM durante la fase de luz y mayor fracción sueño REM /No REM. Además, en RAE el sueño REM se presentó en fase avanzada y los episodios de REM fueron más largos, hubo más alternancias entre los estados dentro de los bloques de sueño y la homeostasis de corto plazo de sueño REM fue más precisa / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1060250 y por la Fundación Puelma, Universidad de Chile

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El estrés nociceptivo (NS) en ratones macho durante la lactancia, genera alteraciones metabólicas que se manifiestan en el estado adulto. El objetivo de este estudio fue determinar si algunas de dichas alteraciones que involucran al tejido adiposo epididimal están asociadas a una hiperactivación del Sistema Endocanabinoide (SEC). Al respecto, una parte fundamental del SEC lo constituyen los receptores tipo 1 para canabinoides/endocanabinoides (CB1R), su ligando endógeno Anandamida (ADA) y la enzima que degrada a ADA, la amido hidrolasa de ácidos grasos (FAAH). Doce horas posterior al nacimiento, crías macho de ratones de la cepa CD-1, de semejante tamaño de camada y peso corporal (PC), conformaron 2 grupos: Control (C) y Estrés (E), recibiendo ambos lactancia cruzada al azar. Durante la lactancia, el grupo E recibió diariamente una inyección subcutánea de suero fisiológico y ambos grupos se sometieron a un control diario de PC. A partir del día 30, el PC se evaluó cada 10 días en conjunto con la ingesta de alimento; ambos parámetros no mostraron diferencias significativas entre C y E, al igual que una prueba de tolerancia a la glucosa realizada a los 150 días de edad. Posteriormente, animales de 160 días fueron sacrificados para extraer sangre y panículo adiposo epididimal (PAE). Las concentraciones plasmáticas de corticosterona inmunoreactiva (ir-CTT), leptina y adiponectina se determinaron mediante ensayos de ELISA comerciales. En el PAE, se analizó la expresión de CB1R y adipofilina mediante RT-PCR y Western Blot, además de la actividad enzimática de la FAAH mediante su capacidad de hidrolizar ADA radioactiva y la actividad de la lipasa lipoproteica (LPL) mediante espectrofluorimetría utilizando un sustrato sintético. Los resultados mostraron cantidades significativamente mayores de grasa epididimal, ir-CTT, leptina y expresión proteica de CB1R y adipofilina en el grupo E. Contrariamente, la actividad de la FAAH como los niveles de adiponectina son significativamente menores en este grupo. No hubo diferencias significativas en la LPL (sólo tendencia a ser mayor en el grupo E), ni en la expresión de mRNA para CB1R y adipofilina. La mayor acumulación de grasa epididimal en el grupo E adulto, sugiere una reprogramación disfuncional de dicho tejido causada por el NS, reforzado a largo plazo por los niveles aumentados de leptina plasmática y molecularmente evidenciada por una hiperactividad de CB1R, debido a la acción concertada de su mayor expresión proteica con la menor actividad de la FAAH / FONDECYT 1070663/1100145

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El método de diagnóstico del botulismo conocido como Prueba de Protección en Ratón (PPR) fue implementado para su futuro uso frente a la sospecha de esta enfermedad durante brotes de mortalidad en aves silvestres acuáticas en Chile. Este bioensayo consiste en inocular un par de ratones (Mus musculus) con el suero de un ave sospechosa de presentar la enfermedad, siendo uno de ellos previamente protegido con la antitoxina correspondiente. Se considera un suero como positivo si el ratón no protegido muere y el ratón protegido vive. Debido a que la gran mayoría de los brotes de botulismo en aves son causados por la toxina botulínica tipo C1, decidimos implementar la PPR con la antitoxina tipo C. Para validar este diagnóstico se generaron experimentalmente, a partir de patos domésticos sanos, sueros positivos y negativos a la toxina botulínica tipo C1. Se utilizaron cuatro grupos de ratones; dos grupos fueron inoculados con suero positivo, siendo uno de ellos previamente protegido con la antitoxina tipo C; el otro grupo fue inoculado con suero fisiológico. La misma operación se realizó con los dos grupos de ratones restantes inoculados con suero negativo. Luego de obtener el resultado esperado, es decir, el grupo de ratones inoculados con suero positivo a la toxina botulínica tipo C1 e inyectados previamente con suero fisiológico murieron mostrando la signología característica, mientras que los ratones de los otros 3 grupos vivieron, aplicamos la PPR con sueros provenientes de aves acuáticas silvestres sospechosas de presentar botulismo aviar tipo C. Los sueros obtenidos a partir de aves capturadas en el humedal Laguna de Batuco y en el tranque de Relave Las Tórtolas resultaron negativos, sin embargo, los sueros de patos domésticos capturados en un Fundo Pangalillo, Melipilla, resultaron positivos, reportándose así el primer diagnóstico de botulismo aviar tipo C en Chile

Memoria para optar al titulo Profesional de Médico Veterinario / La amilina es una hormona de 37 aminoácidos secretada desde las células β pancreáticas junto con la insulina en respuesta a la estimulación de la glucosa. Si bien, cumple varias funciones fisiológicas en nuestro organismo, durante el estrés metabólico asociado a etapas prediabéticas, la amilina empieza a agregarse formando fibrillas y depósitos amiloides, relacionados con pérdida de masa y función de las células β. Esta citotoxicidad estaría dada por la unión y la pérdida de integridad de la membrana plasmática que conduce a la formación de canales iónicos que desestabilizarían el ambiente intracelular. Se estudió el efecto de amilina sobre la viabilidad y funcionalidad en células Min – 6, midiendo producción de insulina y porcentaje de toxicidad. Se postula que la inserción del péptido a la membrana se produciría en células dañadas producto del estrés. Se evidenció una alta toxicidad de amilina en todas las condiciones, con una potenciación de su efecto nocivo en células expuestas a un medio alto y bajo en glucosa y en presencia de un inhibidor del metabolismo celular. También, se observó un efecto protector del ión zinc que actuaría bloqueando los canales formados por amilina, reduciendo su toxicidad. No se encontraron condiciones adecuadas para medir secreción de insulina. Se concluye que amilina se inserta en membranas de células β débiles, formando canales los cuales son bloqueados por Zn2+, en forma parecida a la acción del péptido β amiloide en cerebro. / Proyecto FONDECYT No. 1030611

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las acciones estrogénicas de los fitoestrógenos han sido ampliamente estudiadas en las últimas décadas. Estos efectos agonistas y/o antagonistas estrogénicos en diversos órganos, despertó el interés de la comunidad científica en la medicina tradicional y ancestral. El presente estudio in vivo, se realizó en útero de ratas impúberes de 21 días de edad, tratadas con dos extractos preparados a partir de la misma planta medicinal, pero procesados de forma distinta. Las ratas fueron inyectadas subcutáneamente con cada uno de los extractos o su vehículo y/o 17β estradiol; los cuernos uterinos fueron extraídos 6 y 24 h post-tratamiento y luego procesados histológicamente. Las variables no genómicas evaluadas fueron: número de eosinófilos uterinos, su distribución dentro del útero, porcentaje de eosinófilos degranulados y edema en estroma endometrial profundo y superficial. Entre las respuestas genómicas se evaluó hipertrofia celular en miometrio circular. En ausencia de estradiol, los extractos 21a (solución hidroalcohólica) y 22a (solución etanólica) no inducen eosinofilia uterina, pero generan edema en estroma, aunque de menor magnitud que el generado por estrógeno. Los dos extractos generaron una hipertrofia de miometrio circular de magnitud comparable a la generada por estradiol. La administración del extracto 21a, previo a la administración de 17β estradiol, disminuyó drásticamente la eosinofilia, efecto que no fue generado por el extracto 22a. Sin embargo, con ambos extractos se evidenció una mayor proporción de eosinófilos en los tejidos más profundos de útero (miometrio circular y estroma) y una mayor proporción de degranulados, en comparación a lo observado con 17β estradiol. La administración de cada extracto asociado a 17β estradiol, generó edema endometrial de mayor magnitud al generado por estrógeno, para el caso del extracto 22a la máxima respuesta se observó a las 6 h y para el extracto 21a a las 24 h. Se observó un efecto potenciador de la hipertrofia celular de miometrio circular a las 24 h, luego de administrar los extractos asociados a 17β estradiol. El extracto 21a mostró la capacidad de generar respuestas no genómicas (edema) y genómicas (hipertrofia), e inhibir la eosinofilia en útero de rata prepúber, por lo que posee algún principio activo con capacidad de disociar respuestas estrogénicas. Se hace necesario evaluar otras respuestas estrogénicas consideradas de riesgo, tales como hiperplasia uterina para visualizar potenciales aplicaciones terapéuticas.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Ratones de la cepa ACA fueron experimentalmente infectados con 2.000 trypomastigotes sanguíneos de la cepa Tulahuén o de la cepa Munantá de Trypanosoma cruzi para evaluar prepatencia, niveles de parasitemia, mortalidad acumulada y establecer su eventual correlación con el número de peudoquistes y la magnitud del daño inflamatorio, en el tejido cardiaco de los ratones así infectados. Mientras los ratones infectados con la cepa Tulahuén mostraron una prepatencia sanguínea de cinco días, con un nivel máximo de parasitemia de sólo 14,8 x 105 ± 2,21 x 105 parásitos/mL alcanzado a los 11 días y 100% de mortalidad acumulada a los 21 días post infección, los ratones infectados con la cepa Munantá mostraron una prepatencia de siete días, un nivel máximo de parasitemia de 41,57 x 105 ± 2,61 x 105 parásitos/mL (p < 0,001), alcanzado a los 17 días y 75% de sobrevida más allá de los seis meses de infección (p < 0,0002). El número de pseudoquistes y la magnitud del daño tisular observado en los ratones infectados con la cepa Munantá no fueron diferentes de lo obtenido en los ratones infectados con la cepa Tulahuén durante los primeros 15 días de infección. Sin embargo mientras en los ratones infectados con la cepa Tulahuén se observó un aumento significativo en el número de pseudoquistes (p < 0,01) y en la magnitud del infiltrado inflamatorio mononuclear y del daño tisular (p < 0,05) a los 19 días de infección, los ratones infectados con la cepa Munantá, mostraron no sólo una disminución en el número de peseudoquistes y de células inflamatorias mononucleares, sino también una lenta reparación del daño tisular