Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-22T13:35:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_CarlaRobertadeOliveira_D.pdf: 7786553 bytes, checksum: 2b33335c5ecf4960d08954265cb09959 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A insulina estimula a atividade tiro sina quinase de seu receptor, resultando na fosforilação de substratos citosólicos, IRS-I e IRS-2, que se associam à fosfatidilinositol-3-quinase (PI 3-quinase), ativando-a. A resistência à insulina é uma condição fIsiopatológica associada ao envelhecimento. Entretanto, o mecanismo molecular envolvido nesta situação de resistência não é conhecido. Neste estudo, examinamos a regulação das proteínas envolvidas nas etapas iniciais da ação insulínica em fígado e músculo de ratos com diferentes idades, 2, 5, 12 e 20 meses. Não houve mudanças na concentração do receptor de insulina, em ambos os tecidos, em ratos com 2 e 20 meses de idade (idosos), determinado pelo "immunoblotting" com anticorpo anti-receptor de insulina. Entretanto o grau de fosforilação, refletindo a autofosforilação do receptor, mostrou um especillcidade tecidual, diminuindo em fígado, para 66±7% (p<0,05), mas não em músculo, nos ratos com 20 meses. Curiosamente, os níveis protéicos teciduais de IRS-l diminuiram precocemente (5 meses) para 51±9% (p<0,001) e permaneceram em níveis reduzidos, em músculo, porém não em fígado. Nas amostras de animais com 2 e 20 meses, previamente imunoprecipitadas com anticorpos anti¬IRS-l e' anti-IRS-2 e incubadas com anticorpo antifosfotirosina, houve redução do grau de fosforilação para 39±9% (p<0,001) e 55±12% (p<0,001) respectivamente em fígado e para13±2% (p<0,01) e 10±3% (p<0,05) em músculo, respectivamente. A associação IRS-l/PI 3-quinase diminuiu significativamente para 27±14% (p<0,01) e 20±1O% (p<0,005) em fígado e músculo de ratos senis, respectivamente. A associação IRS-2/PI 3-quinase apresentou uma variação tecido específica, sem alteração no tecido hepático e diminuindo signillcantemente para 5001 % (p<0,05) em músculo dos ratos com 20 meses. Estes dados sugerem que alterações, nas etapas iniciais da transmissão do sinal insulínico, podem contribuir para a resistência à insulina observada em animais senis. A seguir, constou também dos objetivos deste estudo investigar o efeito do captopril, inibidor da enzima conversora da angiotensina, que aumenta a sensibilidade à insulina, nas etapas iniciais da ação insulínica, em ratos senesce. Os animais com 20 meses que receberam o captopril apresentaram um aumento da sensibilidade à insulina, demonstrado pelo teste venoso de tolerância à insulina, acompanhado de um aumento na autofosforilação, induzido pela insulina de seu receptor de 462±253% (p<0,05) em fígado e de 697±78% (p<0,001) em músculo dos ratos. Houve, concornitantemente, um aumento no grau de fosforilação do IRS-l para 25O±17% (p<0,001) e 280±50% (p<0,05) no fígado e músculo respectivamente. E a associação IRS-l/PI 3-quinase aumentou para 305±20% (p<0,001) em fígado e para 267±48% (p<0,05) em músculo. Corno o captopril age, tanto diminuindo os níveis de angiotensina 11 corno elevando os níveis de bradicinina, estes efeitos foram simulados, na tentativa de isolar o efeito predominante nas etapas inicias da ação insulfuica. A administração de losartan, um inibido r do receptor de angiotensina 11, não induziu efeitos no grau de fosforilação do IRS-l, nos tecidos estudados. A administração aguda de bradicinina aumentou o grau de fosforilação, induzido pela insulina, em seu receptor e no IRS-l de fígado e músculo dos ratos senis. Tais dados demonstram que o captopril modula as etapas iniciais da ação insulínica e que estes efeitos podem ser simulados pela administração de bradicinina / Abstract: Insulin initiates its metabolic and growth-promoting effects by binding to the a subunit of its receptor, thereby activating the kinase in the J3 subunit. This event leads to tyrosyl phosphorylation of its cytosolic substrate, insulin receptor substrate-l (IRS-l), which in tum associates with and activates phosphatidylinositol 3-kinase (pI 3-kinase). The clínical use of angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEi) has been associated with increased insulin sensitivity. However, the exact molecular mechanism is unknown. In the present study, we have examined the phosphorylation status of the insulin receptor and IRS-l, as well as the association between IRS-l and PI 3-kinase in the liver and muscle of rats treated acutely with captopril, using immunoprecipitation with anti¬peptide antibodies to the insulin receptor, IRS-l, and immunoblotting with antiphosphotyrosine and anti-PI 3-kinase antibodies. Insulin stimulation increased receptor autophosphorylation to 462:1=253% (p<0.05) in the liver and 697:1:78% (p<0.001) in the muscle of ACEi treated rats. There were also increases to 250:1:17% (p<O.OOI) and 280:1:50% (p<0.05) in the insulin-stimulated IRS-l phosphorylation levels in the liver and muscle, respectively, of animals treated with captopril. The insulin-stimulated IRS-l association with PI 3-kinase in the liver rose to 305:1:200/0 (p<0.001) and in the muscle to 267:1:48% (p<0.05). The losartan, an angiotensin receptor (ATl) blocker, had no significant effect on insulin-stimulated IRS-l phosphorylation in both tissues. The acute administration of bradykinin increased insulin¬stimulated tyrosine phosphorylation of the insulin receptor and of IRS-l in the liver and muscle. These data demonstrate that ACE inhibitors modulate the early steps of insulin signalling, and that this effect may be simulated by the administration of bradykinin / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores : Gustavo Antonio de Souza, Marcelo Alvarenga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T18:11:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CezarJunior_OlavoPedroso_D.pdf: 210070 bytes, checksum: 373d42d115f8ec8b7f306b27f88b8dbc (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Orientador: Claudia Herrera Tambeli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-20T01:36:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macedo_CristinaGomesde_M.pdf: 777542 bytes, checksum: 9fba5bed6fd851b4349bf4812dda8d33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Disfunções temporomandibulares são condições dolorosas que envolvem a articulação temporomandibular e os músculos mastigatórios com maior prevalência, severidade e duração no sexo feminino. Recentemente foi demonstrado que a testosterona apresenta um efeito protetor ao diminuir o risco de ratos desenvolverem dor na Articulação Temporomandibular (ATM), o que explica pelo menos em parte, a menor prevalência de dor no sexo masculino. No entanto, o mecanismo através do qual a testosterona induz o efeito protetor em machos não é conhecido. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar se o efeito protetor da testosterona é mediado pela ativação do sistema opióide endógeno no sistema nervoso central e quais os subtipos de receptores opióides estão envolvidos nesse efeito protetor sobre o desenvolvimento de dor na ATM em ratos. Para o procedimento experimental foram usados ratos machos Wistar (230-300 g), intactos, gonadectomizados (Gx) e sham gonadectomizados (sham Gx) e a injeção de formalina 0,5% na ATM foi usada como estímulo nociceptivo. Para testar o envolvimento de um mecanismo neural central dependente da ativação do sistema opióide, os animais receberam injeção de naloxona, antagonista não seletivo de receptores opióides, CTOP, Naltrindole e Nor-BNI, antagonistas opióides seletivos para os subtipos de receptores opióides mu (µ ), delta e capa (µ ), respectivamente na região do núcleo sensorial trigeminal, antes do teste da formalina na ATM. A administração da Naloxona (15?g) antagonista não seletivo ou a combinação dos antagonistas de receptor µ opióide CTOP (30µ g/10µ l) mais o de receptor µ opióide Nor- BNI (90µ g/10µ l) aumentou significativamente a nocicepção induzida pela formalina 0,5% na ATM em ratos sham Gx, mas não em ratos Gx (31.09%, n = 6 e 26,9%, n = 6; respectivamente) A resposta de ratos intactos a estes tratamentos foi semelhante à de ratos sham Gx. Em contraste, a administração de cada antagonista de receptores opióides sozinhos ou a combinação de CTOP (30µ g/10µ l) mais o antagonista do receptor delta opióide Naltrindole (90µ g/10µ l) ou de Nor-BNI (90µ g/10µ l) mais Naltrindole (90µ g/10µ l) não afetou a nocicepção induzida pela formalina 0,5% em ratos Gx, intactos e sham Gx. Estes resultados sugerem que o efeito protetor da testosterona no desenvolvimento da dor na ATM depende da liberação de opióides endógenos e a subseqüente ativação dos receptores opióides mu e capa no sistema nervoso central. Conclui-se que a ativação individual dos subtipos de receptores é insuficiente enquanto que a co-ativação dos receptores opióides µ e k é necessária para mediar o efeito protetor da testosterona / Abstract: Temporomandibular Joints (TMJ) dysfunctions are painful conditions involving the masticatory muscles and temporomandibular joint with higher prevalence, severity and duration in females. Recently it was shown that testosterone has a protective effect by reducing the risk of rat develop pain in TMJ, which explains at least in part, the lower prevalence of pain in males. However, the mechanism through which the testosterone induces protective effect in males is not known. Thus, the aim of this study was to investigate whether the protective effect of testosterone is mediated by activation of endogenous opioid system in the central nervous system and what subtypes of opioid receptors are involved in this protective effect on the development of TMJ pain in rats. For the experimental procedure Intact, gonadectomized and sham Wistar (230-300g) male rats were used and all experimental procedures were approved by the Ethics Committee in Animal Research at the UNICAMP. The TMJ injection of 0.5% formalin was used as a nociceptive stimulus. The nociceptive behavior was quantified for 45 minutes and used as a quantitative nociceptive behavior measure that was defined as the cumulative total number of seconds that the animal spent rubbing the orofacial region asymmetrically with the ipsilateral fore or hind paw plus the number of head flinches counted during the observation period. Administration of the opioid receptor antagonist naloxone 15 mg or the combination of the mu-opioid receptor antagonists CTOP (30µ g/10µ l) plus the kappa-opioid receptor antagonist nor-binaltorphimine (90µ g/10µ l), significantly increased TMJ 0.5% formalin-induced nociception in sham (31.09%, n=6 and 26.9%, n=6; respectively) but not in gonadectomized rats. The response of intact rats to these treatments was similar to that of sham rats. In contrast, the administration of each opioid receptor antagonist alone or the combination of CTOP (30µg/10µ l) plus the delta-opioid receptor antagonist Naltrindole (90µ g/10µ l) or of Nor-binaltorphimine (90µ g/10µ l) plus Naltrindole (90µ g/10µ l) did not affect TMJ 0.5% formalin-induced nociception in intact, sham and gonadectomized rats. These findings suggest that the protective effect of testosterone on TMJ pain development depends on the release of endogenous opioids and on the subsequent activation of mu and kappa opioid receptors in the central nervous system. The conclusion is that the selective activation of individual receptor subtypes is insufficient while the co-activation of µ and k opioid receptors is necessary to mediate the protective effect of testosterone / Mestrado / Fisiologia Oral / Mestre em Odontologia

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El estrés es la forma que posee el organismo para afrontar una situación agobiante y/o amenazadora. Frente a una situación de estrés, el organismo responde activando el Sistema Nervioso Simpático, lo que produce un aumento en la liberación de catecolaminas, que se traduce en una respuesta simpaticomimética conocida como “respuesta de pelea o huida”. Existen etapas del desarrollo en las cuales es especialmente delicado para el equilibrio del organismo, el enfrentarse a situaciones de estrés. Por ejemplo, durante el embarazo, un estrés crónico que cambie el ambiente en el cual se desarrolla el individuo, tiene efectos importantes que programan permanentemente su desarrollo postnatal. En el presente trabajo estudiamos el efecto que produce el estrés por frío, sobre las características farmacológicas de los receptores β-adrenérgicos cardíacos de la descendencia. Para tal efecto, se sometió a ratas Sprague-Dawley preñadas, a estrés por frío crónico intermitente (4ºC por 3h/día) durante todo el periodo de gestación y se evaluó el efecto que causa este estrés en la descendencia, comparándola con un grupo control, en el cual la madre se mantuvo a 20ºC durante la gestación. Las crías adultas se sacrificaron y se estudiaron los cambios a nivel cardíaco de los receptores β-adrenérgicos mediante técnica de radioligando, los cambios en la actividad del Sistema Nervioso Simpático a través de la determinación de Noradrenalina (NA) y su metabolito por HPLC y los niveles plasmáticos de las hormonas sexuales por ELISA, comparando en cada caso entre machos y hembras buscando diferencias entre género. Hubo diferencias evidentes entre géneros, al momento del sacrificio las ratas hembras estresadas tuvieron menor peso corporal junto con un mayor peso ventricular que las ratas controles, algo que en ratas machos no variaba. En cambio, las ratas machos tenían una menor concentración de receptores β-adrenérgicos y una mayor actividad nerviosa simpática a nivel cardíaco (medida como el recambio de NA) comparada con las ratas hembras. Pero, comparando entre el mismo sexo no hubo cambios en la concentración de receptores β-adrenérgicos, en la concentración de NA ni tampoco en la activación nerviosa a nivel cardíaco por efecto del estrés. Sin embargo, hubo un cambio en la afinidad de los receptores β-adrenérgicos (reflejada en el aumento en la IC50 del Atenolol y del Propranolol). Por lo tanto, existen diferencias fisiológicas entre ratas machos y hembras, estas últimas presentan una mayor concentración de receptores β-adrenérgicos lo que podría indicar una mayor susceptibilidad a la respuesta frente al estrés. Por otro lado, el estrés por frío crónico intermitente no produce variaciones en la concentración de receptores β-adrenérgicos, pero sí cambia la respuesta funcional de estos receptores, lo que podría afectar las respuestas del organismo a situaciones de estrés futuras / Stress is the way that possesses the organism to affront an oppressive or threatening situation. Facing a stressful situation, the organism activates the Sympathetic Nervous System, resulting in an increased release of catecholamines, which is translated into a sympathomimetic response known as the “fight or flight response”. There are some stages of development which facing a stressful situation is particularly sensitive to the balance of the body. For example, during pregnancy, a stressful situation that changes the environment of the foetus, will have important effects that permanently programs postnatal development. In the present work we study the effect produced by cold stress on the pharmacological characteristics of heart β-adrenergic receptors in the offspring. To this end, we submitted pregnant Sprague-Dawley rats to chronic intermittent cold stress (4°C for 3h/day) throughout the gestation period and assessed the effect that causes this stress in the offspring, compared with a control group in which the mother was kept at 20°C during pregnancy. The adult offspring were sacrificed and we studied the changes at cardiac β-adrenergic receptors by radioligand technique, changes in the Sympathetic Nervous System through the determination of Noradrenaline and its metabolite by HPLC and plasma levels sex hormones by ELISA, comparing in each case between males and females looking for differences between genders. There were obvious differences between genders, at the moment of sacrifice female rats had lower body weight along with an increased ventricular weight than control rats, which did not vary in male rats. In contrast, the male rats had a lower concentration of β-adrenergic receptors and increased sympathetic nerve activity (measured as the turnover of Noradrenaline) compared with female rats. But, comparing the same sex there was no change in the concentration of β-adrenergic receptors, in Noradrenaline concentration or nerve activation in the heart, caused by stress. However, there was a change in the affinity of β-adrenergic receptors (reflected in the increased in IC50 of Atenolol and Propranolol). Therefore, there are physiological differences between male and female rats, the latter have a higher concentration of β-adrenergic receptors which may indicate an increased susceptibility to stress. On the other hand, chronic intermittent cold stress does not cause variations in the concentration of β-adrenergic receptors, but changes the functional response of these receptors, which could affect the body’s responses to future stressful situations

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son las principales células no contráctiles presentes en el miocardio. Su función principal es preservar la estructura y el buen funcionamiento cardiaco, lo cual se realiza a través de la síntesis y secreción de componentes de la matriz extracelular. Después de un daño tisular, los fibroblastos cardiacos son células claves, del proceso reparativo y de cicatrización. Si este proceso se exacerba, se llega a fibrosis cardiaca rigidizando el corazón e incrementando el riesgo de arritmias, alterando fuertemente la función cardiaca. En este sentido, se ha demostrado que el aumento de AMPc, contribuye a disminuir el grado de fibrosis cardíaca, por regulación de procesos tales como adhesión, migración, secreción de colágeno y la diferenciación celular. En fibroblastos cardiacos se ha descrito que isoproterenol, un agonista de los receptores β-adrenérgicos, actúa vía Gs y estimula la producción de AMPc. Por otro lado, BK agonista del receptor B2 de cininas, activa su receptor vía Gq, y por sí mismo, no altera la producción de AMPc. Sin embargo, BK en combinación con isoproterenol potencia la respuesta adrenérgica aumentando de manera sinérgica la producción de AMPc en relación a la activación solo por isoproterenol. El objetivo de este trabajo fue estudiar in vitro, en cultivos primaros de fibroblastos cardiacos de ratas neonatas, el cross-talk entre las vías de señalización Gs-Gq y determinar si el aumento en los niveles de AMPc modula la adhesión, migración, síntesis de colágeno y diferenciación en fibroblastos cardiacos. BK tiene un efecto sinérgico en los niveles de AMPc aumentados por isoproterenol. Del mismo modo, BK potencia la adhesión de fibroblastos cardiacos estimulada por Isoproterenol; sin embargo, BK no tiene efectos sobre la migración en los fibroblastos cardiacos inducida por isoproterenol. Por otro lado, BK e isoproterenol por separado disminuyen la síntesis de colágeno; sin embargo, la administración conjunta de ISO+BK induce una mayor disminución de la síntesis. El efecto sinérgico de BK sobre el aumento de AMPc inducido por ISO potencia la inhibición de la diferenciación celular de fibroblasto a miofibroblasto estimulada por TGF-β1. Finalmente, determinamos que el efecto sinérgico de BK sobre la señalización de ISO es gatillada vía Gq-PLC-CaMK-II, conduciendo al aumento sinérgico en la producción de AMPc / Cardiac fibroblasts are the major non-contractile cells present in the myocardium. Its main function is to preserve the structure and the proper functioning of the heart, which is done through the synthesis and secretion of extracellular matrix components. After tissue injury, cardiac fibroblasts are key cells of the reparative process and healing. If this process is exacerbated cardiac fibrosis is reached, stiffening the heart and increasing the risk of arrhythmia, altering strongly the heart function In this regard, it has been shown that the increase of cAMP, helps to reduce the degree of cardiac fibrosis, by regulating processes such as adhesion, migration, collagen secretion and cell differentiation. In cardiac fibroblasts has been reported that isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, acts via Gs and stimulates the production of cAMP. On the other hand, BK an agonist of B2 kinin receptor, activates its receptor Gq, and by itself does not alter cAMP production. However, in combination with isoproterenol enhances the adrenergic response, increasing the levels of cAMP in a synergistic manner, in relation to activation by isoproterenol alone. The aim of this work was to study in vitro, in cultured of neonatal rat cardiac fibroblasts, the cross-talk between signaling pathways Gs-Gq and determine if the increase in cAMP modulates adhesion, migration, collagen secretion and differentiation in cardiac fibroblasts. BK has a synergistic effect on cAMP levels increased by isoproterenol. Similarly, BK enhances the adhesion of cardiac fibroblasts stimulated by isoproterenol, but BK has no effect on migration in cardiac fibroblasts induced by isoproterenol. Furthermore, BK and isoproterenol separately decrease collagen synthesis, but the co-administration of ISO+ BK induces a greater decrease in the synthesis. The synergistic effect of BK in the cAMP levels induced by ISO, showed inhibit the cellular differentiation of fibroblasts into myofibroblasts stimulated by TGF-β1 Finally, we determined that the synergistic effect of BK on ISO signaling is triggered via Gq-PLC-CaMK-II, leading to the synergistic increase in cAMP production

Doctor en Farmacología / Autorizada por el autor, pero con restricción para ser publicada a texto completo en el Portal de tesis, hasta enero de 2017 / La Serotonina (5-HT) es un neurotransmisor detectado tempranamente durante el desarrollo del sistema nervioso central y recientemente se ha descrito su papel sobre los procesos de migración y morfología neuronal. Mediante la inhibición farmacológica de la síntesis de 5-HT durante el desarrollo embrionario, se ha determinado que la reducción en este neurotransmisor produce efectos a largo plazo reflejado en una disminución del peso del cerebro, alteración en la maduración neuronal y una disminución de la complejidad dendrítica. La 5-HT ejerce sus acciones a través de sus receptores ionotrópicos (5HT3) y metabotrópicos (5HT1, 5HT2, 5HT4-5HT7). Algunos de ellos se expresan tempranamente durante el desarrollo embrionario y más aún puede variar su distribución y/o niveles en forma dinámica durante el desarrollo pre y posnatal. Para efectos de esta Tesis se destacan los receptores 5HT1A y 5HT7 los cuales están presentes en estructuras cerebrales como el hipocampo. Interesantemente, el 5HT1A-R se expresa tempranamente durante el desarrollo embrionario; por lo cual se postula que la 5-HT tendría un efecto modulador sobre la migración, diferenciación y viabilidad celular. En cambio, solo se ha descrito una expresión dinámica del 5HT7-R durante el desarrollo posnatal; lo que sugiere una acción de este receptor en estadíos bien definidos. La sobre-expresión de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 en líneas celulares, ha permitido estudiar su acoplamiento a distintas cascadas transduccionales. Se ha descrito el acoplamiento a diversas proteínas G que permiten la activación o inhibición de proteínas efectoras como AC, fosfolipasas, regulación de canales iónicos y activación de las vías MAPK y PI3K-Akt, entre otras. Estas vías participan promoviendo la formación de neuritas y dendritas y han sido involucradas con la regulación de la plasticidad sináptica. En contraste, los efectores de estos receptores descritos en líneas celulares no han sido bien definidos en neuronas. Si bien existen algunos antecedentes que apoyan la idea de que la 5-HT regula la morfología neuronal, no se ha establecido la participación de un subtipo de receptor en particular. La activación del 5HT1A-R induce un aumento en el número y largo de neuritas en neuroblastoma de ratón. En relación a estos cambios morfológicos, se ha descrito que la vía de las Rho GTPasas regula el citoesqueleto a través de la modulación de la cofilina, importante regulador del citoesqueleto de actina. Se ha demostrado un acoplamiento entre el 5HT7-R y Gα12 y el aumento del crecimiento de neuritas en neuronas hipocampales, aunque no se ha dilucidado cuáles son sus efectores río abajo. De acuerdo a estos antecedentes se postuló la siguiente hipótesis: “Agonistas de los receptores 5HT1A y 5HT7 activan vías transduccionales que modulan el citoesqueleto, efectos que se asocian a cambios morfológicos de neuronas hipocampales en cultivos”. Los objetivos fueron: 1) Determinar en neuronas hipocampales con distinta madurez, el efecto de agonistas de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 sobre proteínas que participan en vías transduccionales, que tienen como blanco el citoesqueleto de microtúbulos y de actina, como Akt-GSK-3β, ERK y cofilina, respectivamente. 2) Determinar el efecto de agonistas de los receptores serotoninérgicos 5HT1A y 5HT7 sobre la morfología de neuronas hipocampales con distinta madurez. Estos objetivos se desarrollaron utilizando antagonistas específicos para los receptores 5HT1A (WAY-100635) y 5HT7 (SB269970). En esta tesis se demostró que la distribución del receptor 5HT1A experimenta una polarización a mayor madurez del cultivo, encontrándose tempranamente en el soma y más tardíamente con una localización somato-dendrítica, sin variar el nivel del receptor. En contraste, la distribución somato-dendrítica del 5HT7-R fue independiente de la madurez del cultivo. A su vez, se detectaron las isoformas 5HT7a-R y 5HT7b-R y cuya relación no varió durante los días del cultivo in vitro (DIV). No obstante, ambas isoformas aumentan significativamente entre los 2 y 14 DIV. El 8OH-DPAT, agonista de los receptores 5HT1A (Ki 10 nM) y 5HT7 (Ki 52 nM), promueve la activación de la vía Akt-GSK-3β a los 2 DIV, efecto que involucraría la participación del 5HT7-R y, probablemente al 5HT1A-R. Adicionalmente, el 8OH-DPAT en neuronas más maduras (7 DIV), aumentó la activación de la Akt, efecto independiente de los receptores 5HT1A y 5HT7. Estos resultados sugieren que este agonista puede activar a otros receptores, lo que plantea una reevaluación de su acción como agonista selectivo del 5HT1A. Por otra parte, a pesar de la activación de la Akt, no se observaron cambios en la fosforilación de la GSK-3β, sugiriendo una disociación de ambas quinasas a este estadío. Adicionalmente, el 8OH-DPAT ó la 5-HT no modificaron significativamente el estado de fosforilación de las ERK1/2. La estimulación durante 24 horas con 8OH-DPAT en neuronas con 2 DIV aumentó significativamente el número de las neuritas primarias, acompañado de un aumento en el largo neurítico total; efectos no asociados a los receptores 5HT1A y 5HT7. Estos resultados sugieren que el 8OH-DPAT activa un receptor que incrementa el número de neuritas sin afectar su largo. Interesantemente, se observó que la estimulación con 8OH-DPAT disminuyó significativamente la fosforilación inactivante de la cofilina en Ser3; efecto insensible a la acción de los antagonistas de los receptores 5HT1A y 5HT7. Similarmente, a los 7 DIV se observó una disminución significativa de los niveles fosforilados de cofilina luego de la estimulación con 5-HT, efecto no asociado a los receptores 5HT1A y 5HT7, sugiriendo la participación de un receptor serotoninérgico desconocido sobre la dinámica de actina. Adicionalmente, la activación del 5HT7-R con 8OH-DPAT y 5HT a los 2 DIV durante 24 h disminuye el número de las dendritas primarias pero promueve el crecimiento. A este mismo estadío neuronal, la 5-HT a través de 5HT1A-R y 5HT7-R aumentó el crecimiento de dendritas secundarias. Por otro lado, se demostró a los 8 DIV que la 5-HT aumenta el número de dendritas primarias más cortas a través de un receptor serotoninérgico desconocido. Adicionalmente, los cambios inducidos por la 5-HT a los 8 DIV, indican que el 5HT1A-R promueve una reducción en el largo de las dendritas primarias, fenómeno observado por la reducción en el número de las dendritas primarias más largas (> 40 μm); efecto también observado en las secundarias más largas (> 20 μm). En apoyo, el análisis de Sholl muestra una disminución de la complejidad neuronal asociada a este receptor. Es decir, el 5HT1A-R inhibe el crecimiento y la complejidad dendrítica, probablemente al frenar el crecimiento o elongación de éstas, quedando por establecer los mecanismos moleculares asociados. En apoyo a este hallazgo, se ha descrito recientemente en hipocampo de ratón adulto que el 5HT1A-R produce una disminución de las dendritas terciarias. En contraste, a los 8 DIV el 5HT7-R promueve un aumento del crecimiento de dendritas primarias y secundarias, siendo este último efecto también observado por la estimulación del 5HT1A-R. En resumen, el 5HT1A-R promueve una disminución de la complejidad dendrítica, en contraste al efecto positivo de la activación del 5HT7-R observado a nivel de las neuritas y dendritas; sugiriendo que estos receptores pueden modular la morfología neuronal de forma diferencial dependiendo de la madurez del cultivo. Además, por primera vez se involucra la participación de los receptores 5HT1A y 5HT7 sobre la morfología neuronal en cultivo primario de hipocampo de rata. Además, este estudio muestra los efectos de agonistas serotoninérgicos sobre vías transduccionales relacionadas a la modulación del citoesqueleto y cambios en la morfología que depende de la madurez de neuronas hipocampales. / Serotonin (5-HT) is a neurotransmitter found early during development of the central nervous system and recently it has been involved in cell migration and neuronal morphology. The pharmacological inhibition of 5-HT synthesis during embryonic development suggests that its reduction produces long-term effects reflected as decreased brain weight, altered neuronal maturation and reduction of dendritic complexity. The 5-HT exerts its actions through ionotropic (5HT3) and metabotropic (5HT1, 5HT2, 5HT4-5HT7) receptors. Some of these receptors are expressed early during embryonic development and their distribution or levels can change dynamically during pre-and postnatal development. This thesis focuses on 5HT1A and 5HT7 receptors, which are present in brain structures such as the hippocampus. Interestingly, the 5HT1A-R is expressed early during embryonic development, suggesting that 5-HT could have a modulating effect on cell migration, differentiation and viability. In contrast, a dynamics expression of 5HT7-R has been described during postnatal development, suggesting a role in well-defined neuronal stages. Overexpression of 5HT1A and 5HT7 serotonin receptors in cell lines has allowed studying their coupling to several transduction pathways. These receptors are coupled to several G protein allowing the activation or inhibition of effector proteins such as AC, phospholipases, regulation of ion channels and activation of MAPK and PI3K-Akt, among others. These pathways promote neurites and dendrites formation, and have been implicated in the regulation of synaptic plasticity. In contrast, the effectors of these receptors described in cell lines have not been well defined in neurons. Although some evidences support the idea that 5-HT regulates neuronal morphology, it has not been established which serotonergic receptors are involved. The 5HT1A-R activation induces an increase in both the number and length of neurites in mouse neuroblastoma. In relation to these morphological changes, it has been described that Rho GTPases pathway regulates the cytoskeleton through the modulation of cofilin, an important regulator of actin dynamics. Additionally, a link between 5HT7-R, activation of Gα12 and the increase of neurite outgrowth in hippocampal neurons has been described, but it has not been elucidated the transduction pathway involved. According to these evidences, the following hypothesis was proposed: “Agonists of 5HT1A and 5HT7 receptors activate pathways that modulate the cytoskeleton, effects that are associated with morphological changes in cultured hippocampal neurons." The aims were to: 1) Determine, the effect of 5HT1A-R and 5HT7-R agonist on proteins involved in transduction pathways, targeting microtubule and actin cytoskeleton like Akt-GSK- 3β, ERK and cofilin, respectively, on hippocampal neurons with different maturity. 2) Determine the effect of 5HT1A-R and 5HT7-R agonist on morphology of hippocampal neurons with different maturity. These objectives were developed using specific antagonists of 5HT1A (WAY-100635) and 5HT7 (SB269970) receptors. In this thesis it was shown that the distribution of 5HT1A receptor undergoes a polarization during the maturity of neurons, being early found in the soma and late with a somato-dendritic distribution but without changes on receptor levels. In contrast, the somato-dendritic distribution of 5HT7-R was independent of neuronal maturity. Besides, the isoforms “a” and “b” of 5HT7-R were detected without changes in their ratio during days in vitro (DIV). Nonetheless, both isoforms increased significantly from 2 to 14 DIV. The 8OH-DPAT, a 5HT1A (Ki 10 nM) and 5HT7 (Ki 52 nM) receptor agonist, promotes the activation of the Akt-GSK-3β pathway at 2 DIV, effect which involves the participation of 5HT7-R and probably the 5HT1A-R. Additionally, in more mature neurons (7 DIV) stimulation with 8OH-DPAT increased activation of Akt, an effect independent of 5HT1A and 5HT7 receptors. These results suggest that this agonist may activate other receptors, and hence demands a reconsideration of its action as selective 5HT1A agonist. Moreover, in spite of Akt activation, no changes were observed in the phosphorylation levels of GSK-3β, suggesting dissociation of both kinases at this stage. Additionally, neither 8OH-DPAT nor 5-HT altered the phosphorylation levels of ERK1/2. Stimulation for 24 hours with 8OH-DPAT at 2 DIV significantly increased the number of primary neurites, accompanied by an increase in the overall length of neurites; effects which are not related to 5HT1A and 5HT7 receptors. These evidences suggest that 8OH-DPAT targets an unknown receptor whose activation increases the number of neurites without affecting their length. Interestingly, it was observed that stimulation with 8OH-DPAT significantly decreased the inactivating phosphorylation of cofilin in Ser3; an effect insensitive to the antagonists of the 5HT1A and 5HT7 receptors. Similarly, a significant decrease of phosphorylated cofilin levels after stimulation with 5-HT was observed at 7 DIV; effect not associated to 5HT1A and 5HT7 receptors, suggesting the participation of an unknown serotonin receptor modulating actin dynamics. Additionally, the 5HT7-R activation with 8OH-DPAT and 5-HT at 2 DIV during 24 h decreases the number of primary dendrites but promotes its growth. At this neuronal stage, 5-HT stimulates secondary dendrite growth through both 5HT1A-R and 5HT7-R. Furthermore, this thesis demonstrated at 8 DIV that 5-HT increases the number of short primary dendrites via an unknown serotonergic receptor. Additionally, the changes induced by 5-HT at 8 DIV, indicate that 5HT1A-R promotes a reduction in the length of the primary dendrites, a phenomenon observed as reduction in the number of longer primary dendrites (> 40 um); effect also observed in longer secondary dendrites (> 20 um). In accordance, Sholl analysis shows a decrease in neuronal complexity associated with this receptor. Thus, 5HT1A-R inhibits primary dendritic growth and complexity, probably by slowing the growth or elongation, and the molecular mechanisms associated remains to be explained. In support of this finding, it has been recently described in adult mouse hippocampus, that 5HT1A-R promotes a decrease of tertiary dendrites. In contrast, this Thesis described that 5HT7-R induces an increased growth of primary and secondary dendrites at 8 DIV; being the latter effect also observed by 5HT1A-R stimulation. To summarize, the 5HT1A promotes a reduction of dendritic complexity in contrast to the positive effect of 5HT7 receptors observed in both neurites and dendrites; suggesting that these receptors differentially modulate the neuronal morphology depending on neuron maturity. Furthermore, we described for first time the participation of 5HT1A and 5HT7 on neuronal morphology in primary culture of rat hippocampal neurons. Additionally this study shows the effects of serotonergic agonists on transduction pathways related to cytoskeleton modulation and morphological changes depending on maturity of hippocampal neurons. / Conicyt

Tesis Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al título de Bioquímica / El receptor de alta afinidad de la neurotrofina NGF, TRKA, ha sido asociado con distintos tipos de cáncer, pudiendo encontrarse isoformas de este receptor. En el cáncer ovárico no se han descrito isoformas de este receptor, sin embargo, se ha determinado un aumento de la forma activa de TRKA, relacionándolo con una baja sobrevida. En una línea celular de ovario de hámster chino, el ectodominio de TRKA puede ser liberado mediante un corte proteolítico, quedando activado constitutivamente un fragmento del receptor formado por los dominios intracelular y transmembrana. La detección de este fragmento disminuye al expresar una forma inactiva de ADAM17 (una de las proteasas más estudiadas de la familia de proteínas ADAMs). Estos antecedentes llevaron a postular que en el cáncer ovárico epitelial humano se expresan isoformas del receptor TRKA, siendo una o más de ellas, cortada por ADAM17, resultando en la detección de una forma proteica fosforilada adicional del receptor, constituida sólo por sus dominios intracelular y transmembrana. Para lograr los objetivos de este trabajo se realizaron experimentos ex–vivo en muestras de tejidos ováricos humanos, con el fin de determinar la presencia de transcritos e isoformas del receptor TRKA, además de los niveles proteicos de ADAM17. También, se realizaron experimentos in-vitro con líneas celulares de ovario humano, para evaluar las isoformas de TRKA que experimentan un corte por efecto de ADAM17. Resultados de este trabajo mostraron la presencia de tres transcritos del receptor TRKA en ovario, con mayores niveles en muestras de cáncer más avanzado. Detectamos tres isoformas de este receptor en muestras de ovario y, adicionalmente, una isoforma de TRKA-p de 41kDa, cuyos niveles se encuentran aumentados en muestras de cáncer ovárico. Adicionalmente, encontramos mayores niveles proteicos de ADAM17 en muestras de cáncer ovárico avanzado, en comparación con muestras de tumores borderline. También se encontró una correlación positiva entre los niveles proteicos de ADAM17 y de TRKA en cáncer ovárico e, interesantemente, se observó una sob posici n (“merge”) s tincion s ambas proteínas al realizar la Inmunofluorescencia. Nuestros resultados muestran por primera vez la presencia de tres transcritos e isoformas de TRKA en ovario humano, además de una forma corta de TRKA-p (41 kDa), posiblemente producto de un corte proteolítico por la potencial acción de ADAM17. La presencia de una isoforma truncada fosforilada del receptor TRKA en cáncer ovárico epitelial tendría gran utilidad clínica, ya que podría servir como marcador pronóstico y como posible blanco terapéutico / TRKA is the high affinity receptor for the neurotrophin NGF. There are reports about isoforms of this receptor, but so far none have been detected in ovary. Phosphorylated TRKA receptor (p-TRKA) is highly expressed in epitelial ovarian cancer; nevertheless, it is not known if TRKA is post-translationally processed to smaller molecular forms in ovarian carcinoma. Earlier studies in cell lines have shown that TRKA is proteolytically cleaved by the metalloprotease ADAM17, resulting in an isoform containing the phosphorylated transmembrane and cytosolic domains of the receptor. Therefore, the aim of this study was the detection of isoforms of TRKA receptor in epithelial ovarian cancer, being one or more of them cleaved by ADAM17, resulting in an additional phosphorylated form of TRKA, containing its transmembrane and cytosolic domains. We analyzed the TRKA mRNA and protein levels, as well as protein levels of ADAM17, in human tissues. We also studied the cellular localization of these proteins in human cell lines. Using PCR analysis, we found three transcripts of TRKA in ovary, with higher levels in poorly differentiated epithelial ovarian cancer tissues. On the other hand, we found three isoforms of the receptor, as well as an additional form of 41 kDa by Western blot; with higher levels of these isoforms of TRKA in cancer samples. When ADAM17 was evaluated in ovarian tissues by immunohistochemistry, we found that this protein was mostly seen in epithelial cells, and a progressive increase in protein abundance with the progression of epithelial ovarian cancer. We also found a positive correlation between ADAM17 and TRKA protein levels in ovarian cancer, as well as a merge between both proteins by immunofluorescence. These results show for the first time the presence of isoforms of TRKA in ovary, as well as an additional form of 41 kDa of the receptor Besides, ADAM17 and the different isoforms of the TRKA receptor levels were found to be higher in more advanced stages of the disease. Also, a positive correlation was found between ADAM17 and TRKA receptor levels during different stages of ovarian cancer. This additional phosphorylated form of the TRKA receptor found in ovarian cancer tissues may be of great clinical significance, since it could be used as a new therapeutic target

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Eléctrica / La próxima construcción del radiotelescopio "Cerro Chajnantor Atacama Telescope" (CCAT) traerá enormes desafíos para la instrumentación astronómica. Dentro de estos desafíos se encuentra el "CCAT Heterodyne Array Receiver", un arreglo modular de receptores heterodinos de doble banda con alta resolución espectral. Este se espera sea el primer arreglo de receptores heterodinos con 64 (base) y 128 pixeles (meta), substancialmente mas grande que cualquier arreglo de este tipo actualmente en operación. Sin embargo, estos receptores heterodinos de gran escala solo pueden ser construidos si es posible reducir considerablemente la complejidad de cada pixel. Esta tesis presenta el trabajo realizado en el desarrollo compacto de la electrónica de control de polarización para mezcladores de juntura "Superconductor-Insulator-Superconductor" (SIS) en arreglos heterodinos de gran escala. El objetivo principal de esta tesis corresponde a la programación del microprocesador, en un prototipo de canal singular, de la tarjeta de control de polarización para interactuar con el mezclador, y luego probar su funcionamiento en un setup de laboratorio. El software fue exitósamente programado y fue primero probado en un sistema de prueba para asegurar una interacción sin riesgos con el mezclador. Luego se probó experimentalmente que fue posible suministrar el voltaje de ajuste de alta precisión del mezclador y la corriente del las bobinas de campo magnético para suprimir los efectos de Josephson en el mezclador. Otras funciones específicas como el barrido de voltaje en el mezclador o la habilitación de la conexión con el mezclador también fueron testeadas. El PC de control es capaz de controlar todos estos parámetros y funciones junto con el monitoreo de la corriente y voltaje reales en el mezclador. El rol fundamental de la constante de tiempo electrónica de la tarjeta es presentado en conjunto con un análisis en términos de la distorsión de la curva de voltaje-corriente del mezclador y su influencia en el ruido electrónico. Los resultados muestran, de todas formas, que tanto la distorsión como el ruido se encuentran dentro de un rango adecuado debido al sector donde se espera ajustar el voltaje del mezclador. En conclusión, el software programado en el microprocesador crea una base de instrucciones que permiten al usuario hacer uso de la tarjeta de control de polarización para interactuar con el mezclador de manera segura. Esta interacción le permite realizar una calibración manual (aunque controlada remotamente) del mezclador, obteniendo los mismos resultados que el proceso actual. Esto representa un gran paso adelante en la reducción de la complejidad de hardware del sistema de control de polarización, siendo esto clave para el desarrollo de arreglo de receptores heterodinos de gran escala.

Orientador : Gilson Herbert Magalhães Dias / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-16T15:09:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morigaki_MiltonKoiti_D.pdf: 5341551 bytes, checksum: bb175c6e4449d1dd5d8c88e193226396 (MD5) Previous issue date: 1988 / Doutorado

Orientador : João Bosco Ribeiro do Val / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Eletrica / Made available in DSpace on 2018-07-18T13:59:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Venturini_NarciEdson_M.pdf: 5428150 bytes, checksum: cb42de60d96be56b43eb4a7e627ad189 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: Neste trabalho propomos um módulo receptor completo, onde o problema da eliminação da interferência intersimbólica, detecção dos símbolos e ajuste da fase de amostragem é resolvido de forma simples e integrada. Os módulos de equalização, recuperação de relógio e detecção, são projetados para funcionar com estimativas diretas de amostras da resposta impulsiva do canal, garantindo-se a integração dos módulos. Para reduzir a complexidade do receptor, restringimos a amostragem à taxa de símbolos. Primeiramente tratamos o caso em que as amostras pré-cursoras são de pequena monta, como em canais telefônicos, e posteriormente extendemos para canais com frentes de subida significativas. Nos dois casos a interferência intersimbólica devido às amostras pós-cursoras é eliminada com eficiência por um filtro com realimentação de decisões. Quando há poucas amostras pré-cursoras, optamos por não equalizá-Ias diretamente. Propomos um detector baseado em decisão direta, que utiliza estas amostras para melhorar a decisão, implementado com baixo custo e de grande eficiência. O detector proposto é facilmente analisável, obtendo-se a expressão de probabilidade de erro teórica para o mesmo, quando não há erros de decisão se propagando pelo filtro de realimentação. Quando erros de decisão propagados são levados em conta, conseguimos aproximações para a expressão de probabilidade de erro, confirmadas por simulações. O detector proposto apresenta desempenho sempre superior ao detector de limiar de cruzamento de zero. Demonstramos que existe uma classe de canais, para os quais o detector torna-se insensível à propagação de erros realimentados. Uma boa aproximação para estes canais é obtida quando usamos pré-conformação do canal, implementada com a adequação do pulso de transmissão. O trabalho em recuperação de relógio adota idéias de otimização. Propomos funções de fase, que quando maximizadas, determinam a fase que minimiza indiretamente a probabilidade de erro de detecção. Estas funções são calculadas com estimativas de um número reduzido de amostras da resposta impulsiva do canal, e apresentam características de unimodalidade. O problema de maximização das mesmas é resolvido da maneira mais simples possível, através de procedimentos de busca unidimensional. Comparamos o desempenho dos métodos de Fibonacci e do ajuste por quadráticas para determinação da fase ótima, chegando-se a um método de recuperação de relógio eficiente, rápido e facilmente implementável. Um filtro retropreditor linear é usado para resolver o problema da equalização das pré-cursoras, quando a borda de subida do canal for longa e significativa. Este filtro apresenta a restrição de funcionar apenas sobre canais de fase máxima. Para adequar esta restrição à estrutura de recepção proposta, conectamos o retropreditor ao receptor de tal forma que o sinal de erro usado para ajustar adaptativamente os seus coeficientes é gerado após a equalização das pós-cursoras do canal. Assim ele passa a atuar sobre um canal resultante, formado apenas por borda de subida. Como é provável que a borda de subida destes canais forme um canal de fase máxima, o retropreditor será adequado para a sua equalização, atuando seletivamente sobre as pré-cursoras / Abstract: Not informed. / Mestrado / Telecomunicações e Telemática / Mestre em Engenharia Elétrica