La comunicación celular es un proceso fundamental para la supervivencia de los organismos. Gracias a las distintas vías de comunicación, las células reciben e interpretan mensajes del exterior, los cuales inducen respuestas necesarias para el correcto funcionamiento de dichas células y del organismo que estas constituyen. Los canales iónicos activados por ligandos (LGIC) son proteínas integrales de membrana encargadas de transducir la señal proveniente del exterior hacia el interior celular. Sus vías de transducción son muy variadas, pero en general llevan a dos respuestas fundamentales según el receptor implicado, respuesta de excitación o respuesta de inhibición. Dentro del grupo LGIC existen tres familias de receptores, cada una conformada por varios miembros relacionados evolutivamente. Dichas familias se clasifican como: canales catiónicos activados por glutamato, canales activados por ATP y los receptores pertenecientes a la familia Cys-loop. En el presente trabajo de tesis doctoral estudiamos los mecanismos de activación de dos miembros de la familia de receptores Cys-loop, el receptor de acetilcolina de músculo adulto (AChR) y el receptor de serotonina homopentamérico tipo 3A (5-HT3AR). El AChR es considerado el modelo, tanto estructural como funcional, para todos los miembros de esta familia. Para un mejor entendimiento de los mecanismos que llevan al correcto funcionamiento de dichos receptores, es necesario: a) conocer su estructura molecular y los mecanismos que gobiernan su activación, y b) definir un modelo cinético que logre representar los estados en los cuales se encuentra el receptor y los pasos afectados por mutaciones o moduladores. En base a estudios de mutagénesis dirigida, determinamos el aporte de los residuos 15 de M1 de las subunidades ,  y  para el correcto funcionamiento del AChR. Además, definimos la relación entre el volumen del residuo en dicha posición y el efecto provocado sobre la eficiencia de gatillado del canal. Observamos que para la subunidad  el aumento del volumen del residuo en 15 lleva a una disminución en la constante de gatillado del canal. En cambio, para las otras subunidades, ocurre el efecto opuesto. Demostramos que los residuos 15 de M1 y 11 de M2 de la subunidad  interaccionan directamente. Dicha interacción explicaría la realción observada entre el volumen del residuo en 15 de M1 y la eficiencia del canal, donde la interacción 11-15 se vuelve más significativa al aumentar el volumen del residuo en 15, llevando a una reducción en la eficiencia del gatillado del canal. Debido a la baja conductancia del canal del 5-HT3AR, solo han sido propuestos hasta el momento modelos cinéticos basados en el análisis de corrientes macroscópicas. Utilizando el receptor de serotonina de alta conductancia (5-HT3AR-AC) obtuvimos corrientes macroscópicas y registros de canal único. En base a dichos registros, definimos un modelo cinético que describe con alto grado de exactitud los datos experimentales. Este es el primer modelo que, además de representar lo observado a nivel de corrientes macroscópicas, describe también la activación del receptor a nivel de canal único. Por otro lado, realizamos mutaciones sobre el 5-HT3AR-AC en los residuos 10 y 14 del segmento M4. Dichos residuos fueron demostrados como importantes en el gatillado del AChR y presentan un patrón de conservación particular entre las subunidades de estos dos receptores. Confirmamos que ambos residuos son importantes para el correcto funcionamiento del 5-HT3AR, donde las mutaciones en 10 afectaron la activación del receptor a nivel de canal único y las mutaciones en 14 solo mostraron efectos a nivel de las corrientes macroscópicas. Utilizando los datos obtenidos a partir del receptor mutado en 10 de M4, realizamos el análisis cinético en base al esquema propuesto. Determinamos que las velocidades afectadas fueron fundamentalmente de apertura y cierre del canal, similar a lo demostrado para el residuo equivalente del AChR. Nuestros resultados brindan importante información sobre la intervención de los segmentos transmembranales en el correcto funcionamiento de receptores de la familia Cys-loop. Asimismo, muestran cómo la función de determinados aminoácidos se ha conservado durante la evolución. Además, definimos el primer modelo cinético para el 5-HT3AR, el cual representa correctamente la activación de este receptor, tanto a nivel de corrientes macroscópicas como de canal único. La utilización de este modelo será de gran apoyo al entendimiento de los efectos generados por mutaciones o la acción de moduladores de la funcionalidad de dicho receptor. / Cellular communication is a fundamental process for survival of the organisms. Thanks to different signaling pathways, cells can receive messages from the environment which induce responses that allow appropriate functioning of these cells and the organism that they constitute. Ligand-gated ion channels (LGIC) are integral membrane proteins involve in transduction of signals from the external side of the cell. These signaling pathways are diverse, but in general, they can generate one of both responses: excitatory or inhibitory response. The LGIC group is composed by three different families of receptors: the glutamate-activated cationic channels, the ATP-gated channels, and the Cys-loop receptors. In the present thesis we studied the mechanism of activation of two members of the Cys-loop receptor family, the nicotinic acetylcholine receptor (AChR) and the homopentameric serotonin type 3A receptor (5-HT3AR). The AChR has been the structural and functional model of all members of this family. For a better understanding of the mechanisms that lead to the correct functioning of these receptors is necessary to: a) know its molecular structure and the mechanisms which govern its activation, and b) define a kinetic model that describes its activation and elucidate how mutations or modulators can affect the transitions between different conformational states. By combining site-directed mutagenesis with electrophysiological studies we determine the contribution of residues at position 15 of M1 in ,  and  subunits to the correct functioning of the AChR. We also define the relationship between the volume of the residue at this position and efficacy for channel gating. We show that the increase in the volume of residue at 15 of M1 of the  subunit impairs channel gating, whereas the opposite effect is observed for the same position in  and  subunits. Furthermore, we demonstrate that there is a direct interaction between residues at 15 of M1 and 11 of M2 of the  subunit. This explains the relationship between the volume of the residue at 15 of M1 and the efficiency of channel: the increase in the volume of the residue at 15 of M1 may restrict the movement of M2 through its interaction with the residue at 11 of M2, thus leading to a reduction in channel gating efficiency. Due to the low conductance of the 5-HT3AR, different kinetics models proposed until now have been based on macroscopic currents. Using the high conductance form of this receptor (5-HT3AR-HC) we recorded macroscopic currents and single-channel events. On the basis of these recordings we defined a kinetic model that closely describes the experimental data. In addition, we introduced mutations at positions 10 and 14 of the M4 transmembrane segment of the 5-HT3AR-HC. Residues at these positions have been shown to be important for the correct functioning of the AChR, and they show a particular conservation pattern among 5-HT3R and AChR subunits. We demonstrate that these residues are important for the appropriate functioning of the 5-HT3AR. Mutations at 10 of M4 affect the single-channel properties, and mutations at 14 of M4 affect the decay rate of macroscopic currents and the potency for activation. With the single-channel data obtained for 5-HT3AR-HC mutated at 10 of M4, we performed kinetic analysis on the basis of the scheme proposed in this thesis. The analysis reveals that mutations at 10 affect mainly opening and closing rates from the slowest open state. This result is similar to that previously reported for AChR, indicating that the function of this position is conserved among members of the same family. Our results provide important information about the involvement of transmembrane segments in the correct functioning of receptors from the Cys-loop superfamily. These results reveal how the function of some amino acids has been conserved along evolution. In conclusion, we defined the first kinetic model for the 5-HT3AR, which perfectly represents the activation of this receptor at both macroscopic and single-channel level. Moreover, our kinetic model provides a foundation for studying the contribution of residues to receptor function and for understanding molecular mechanisms of drug modulation.

El nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans es un organismo modelo para el estudio del sistema nervioso y enfermedades humanas. Este nematodo del suelo ofrece un gran potencial para análisis genéticos, en parte debido a su rápido ciclo de vida (3-días), pequeño tamaño (1,5 mm de largo) y fácil cultivo en el laboratorio.Progresos sustanciales en la identificación de genes que codifican para un gran número de proteínas responsables de la liberación de neurotransmisores, la detección postsináptica y las señales corriente abajo, han avanzado nuestro entendimiento de la mecanística de cómo las neuronas se comunican he interactúan. Caenorhabditis elegans es también un valioso modelo para el estudio de agentes antihelmínticos relacionados al sistema nervioso. Los receptores “Cys-loop” musculares de nematodos son de importancia clínica porque son blancos de drogas antihelmínticas. Los nematodos parásitos causan sustanciales muertes y morbidez en humanos y pérdidas en el ganado y animales domésticos. C. elegans es entonces una valiosa plataforma para el estudio de blancos antihelmínticos porque comparte características fisiológicas y farmacológicas con los nematodos de vida parasitaria, y es sensible a la mayoría de las drogas antihelmínticas. También ha emergido como un organismo modelo útil para el estudio de enfermedades neuromusculares humanas y testeo de drogas. En este trabajo de Tesis nosotros exploramos a diferentes niveles los receptores involucrados en la coordinación de la locomoción de los gusanos. En C. elegans los músculos de la pared del cuerpo reciben innervación de las neuronas motoras colinérgicas (excitatorias) y GABAérgicas (inhibitorias). La acetilcolina (ACh) liberada desde las neuronas motoras estimula la contracción muscular sobre un lado del cuerpo, y simultáneamente activa una neurona motora inhibitoria que se proyecta hacia el lado opuesto del cuerpo y libera GABA, el cual relaja los músculos. Debido a que C. elegans contiene un receptor de GABA y dos tipos farmacológicamente diferentes de receptores de ACh (AChR), el AChR sensible a levamisol (L-AChR) y el AChR sensible a nicotina (N-AChR), decidimos dividir este trabajo en dos capítulos para una lectura más conveniente. En el Capítulo I, exploramos los AChRs. El AChR es un miembro de la familia de receptores “Cys-loop”, la cual media la transmisión sináptica rápida en vertebrados e invertebrados. AChR pueden ensamblarse de cinco subunidades tipo-α idénticas ‒ formando receptores homoméricos ‒ como el receptor de vertebrados α7 o el N-AChR de C. elegans (ACR-16) o de diferentes subunidades α y no-α formando receptores heteroméricos, como los nicotínicos musculares de vertebrados y los L-AChRs musculares de nematodos. El músculo de C. elegans contiene siete diferentes subunidades de AChRs, cinco de las cuales han sido mostradas como componentes del L-AChR adulto. Para dilucidar la razón de tal diversidad de subunidades, exploramos sus roles funcionales en células musculares de la Larva 1 (L1). Por medio de ensayos de canal único y corrientes macroscópicas demostramos que las subunidades tipo-α UNC-38 y UNC-63 como la no-α UNC-29 son requeridas para L-AChRs funcionales. Asimismo exploramos en detalle la contribución de las subunidad tipo-α LEV-8 y ACR-8. Nuestro estudio revela que la subunidad LEV-8 es un componente del L-AChR nativo en L1 pero se comporta como una subunidad no esencial. Esta juega un rol clave en el mantenimiento de una baja velocidad y extendido de la desensibilización de los L-AChRs. También mostramos que en ausencia de la subunidad tipo-α ACR-8, la propiedades de los canales de L-AChRs no son modificadas, por lo tanto indicando que ACR-8 no es un componente del L-AChR en L1. Este estudio revela que las células L1 expresan un tipo principal de L-AChR compuesto de cinco diferentes subunidades: UNC-38, UNC-63, UNC-29, LEV-1, y LEV-8. El análisis de una doble mutante nula lev-8;acr-8, la cual muestra un fenotipo descoordinado y es resistente a levamisol, revela que ACR-8 puede reemplazar a LEV-8 en su ausencia, por lo tanto atribuyéndosele un rol a esta subunidad. En el Capítulo II, exploramos el UNC-49R. Los canales de cloro activados por GABA juegan un importante rol inhibitorio en el sistema nervioso de vertebrados e invertebrados. El receptor muscular de GABA de C. elegans está codificado por el gen unc-49, el cual es traducido en tres subunidades: UNC-49A, UNC-49B y UNC-49C. Ha sido mostrado que en el estado adulto de C. elegans el receptor de GABA está compuesto de las subunidades B y C. Los UNC-49Rs comparten superposiciones estructurales y farmacológicas con los receptores GABAA de mamífero en algunos aspectos y difieren grandemente en otros. Estas diferencias podrían ser explotadas en el diseño de drogas antiparasíticas. Sin embargo, la información sobre las propiedades funcionales de los receptores de nematodos es todavía escasa. Por medio de ensayos de corrientes macroscópicas y de canal único desciframos como los receptores de GABA de células musculares al estadio L1 de C. elegans son activados y modulados por agonistas y agentes antihelmínticos. Mostramos que muscimol, el cual es un agonista selectivo de los GABAARs, y piperazina, un antihelmíntico ampliamente utilizado, son ambos capaces de activar al UNC-49R. Los efectos de estas drogas a nivel molecular están relacionados con efectos comportamentales en ensayos de parálisis. Es interesante el hecho de que nuestros resultados revelan que la ivermectina (IVM), la cual es un modulador de muchos receptores “Cys-loop”, inhibe los receptores de GABA como también los L-AChRs de C. elegans, ambos involucrados en el movimiento coordinado. Más aún, la IVM muestra efectos sinérgicos sobre la parálisis inducida por ambos agonistas GABAérgicos y colinérgicos. Por lo tanto, reforzando la importancia de la investigación sobre la combinación de drogas antihelmínticas como estrategia tendiendo a reducir el incremento de problemas de resistencia a drogas. En general, nuestros estudios en el capítulo II proveen nueva información concerniente a la activación de los GABAARs en el músculo de C. elegans. Mostramos por primera vez la actividad de canal único del UNC-49R nativo, como también que muscimol y piperazina son agonistas de este receptor. Nuestro estudio también provee más información sobre los complejos y pleiotrópicos efectos de la IVM. La IVM es un inhibidor de los receptores de GABA y L-AChR. La elucidación de las bases estructurales y mecanísticas bajo las acciones pleiotrópicas de la IVM en la familia de receptores “Cys-loop” puede abrir puertas para el diseño de nuevas drogas. En resumen, en esta Tesis doctoral caracterizamos el L-AChR y la activación del UNC-49R, ambos involucrados en la locomoción coordinada. La caracterización de estos receptores “Cys-loop” en un organismo genéticamente manipulable y modelo de nematodos parásitos provee nuevas avenidas de exploración para drogas selectivas, como también para definir los determinantes estructurales de la activación y modulación en la familia de receptores “Cys-loop”. / The free-living nematode Caenorhabditis elegans is a model organism to study the nervous system and human diseases. This soil nematode offers great potential for genetic analysis, partly because of its rapid (3-day) life cycle, small size (1.5-mm-long adult) and ease of laboratory culture. Substantial progress in the identification of genes encoding for a large number of proteins responsible for neurotransmitter release, postsynaptic detection and downstream signaling has advanced our understanding of the mechanisms by which neurons communicate and interact. Caenorhabditis elegans is also a valuable model for the study of anthelmintic agents related to the nervous system. Nematode muscle Cys-loop receptors are of clinical importance because they are targets of anthelmintic drugs. Nematode parasites cause substantial mortality and morbidity in humans and losses in livestock and domestic animals. C. elegans is a valuable platform for the study of anthelmintic targets because it shares physiological and pharmacological characteristics with parasitic nematodes, and it is sensitive to most anthelmintic drugs. It has also emerged as a useful model organism for studying human neuromuscular diseases and for drug testing. In this Thesis we have explored at different levels the receptors involved in worm coordinated locomotion. In C. elegans, the body wall muscles receive innervations from both cholinergic (excitatory) and GABAergic (inhibitory) motor neurons. Acetylcholine released from motor neurons stimulates muscle contraction on one side of the body, and simultaneously activates an inhibitory motor neuron that projects to the opposite side of the body to release GABA. Since muscle cells contain one GABA and two different pharmacological types of acetylcholine receptors (AChR), the levamisole-sensitive AChR (L-AChR) and the nicotine-sensitive AChR (N-AChR), we decided to divide this work into two chapters for a more suitable lecture. In Chapter I, we explored AChRs. The AChR is a member of the Cys-loop receptor family, which mediates fast synaptic transmission in vertebrates and invertebrates. AChRs can assemble from five identical α-type subunits, forming homomeric receptors, such as vertebrate α7 or C. elegans ACR-16 (N-AChR) or from different α and non-α subunits forming heteromeric receptors, such as vertebrate and C. elegans muscle L-AChRs. Caenorhabditis elegans muscle contains seven different AChR subunits, five of which have been shown to be components of the adult levamisole-sensitive AChRs (L-AChRs). To elucidate the reason for such subunit diversity, we explored their functional roles in the larva 1 (L1) muscle cells. By single-channel and macroscopic current recordings we demonstrate that the -type UNC-38 and UNC-63 as well as the non- UNC-29 subunits are required for functional L-AChRs. We explored in detail the contribution of the α-type LEV-8 subunit. Our study reveals that it is a component of native L1 L-AChRs but behaves as a non-essential subunit. It plays a key role in maintaining a low rate and extent of desensitization of L-AChRs. We also show that in the absence of the α-type ACR-8 subunit, L-AChR channel properties are not modified, thus indicating that ACR-8 is not a component of L1 L-AChRs. This study reveals that L1 muscle cells express a main L-AChR type composed of five different subunits: UNC-38, UNC-63, UNC-29, LEV-1, and LEV-8. The analysis of a double lev-8; acr-8 null mutant, which shows an uncoordinated and levamisole-resistant phenotype, reveals that ACR-8 can replace LEV-8 in its absence, thus attributing a functional role to this subunit. In Chapter II, we have explored the UNC-49R. The GABA-gated chloride channels play an important inhibitory role in the nervous system of vertebrates and invertebrates. The C. elegans muscle GABA receptor is encoded by the unc-49 gene, which is translated into three subunits: UNC-49A, UNC-49B, and UNC-49C. In adult C. elegans the GABA receptor has been shown to be composed of B and C subunits. UNC-49 receptors share significant structural and pharmacological overlap with mammalian GABAA receptors in some aspects and differ greatly in others. These differences could be exploited in parasitic drug design. However, the information about functional properties of nematode receptors is still scarce. By analyzing at the macroscopic and single-channel level we deciphered how GABA receptors from C. elegans L1 muscle cells are activated and modulated by agonists and anthelmintic agents. We show that muscimol, which is a GABAAR selective agonist, and piperazine, a widely used anthelmintic, are both able to activate the UNC-49R. The effects of these drugs at the molecular level are related to behavioral effects in paralysis assays. Interestingly, our results reveal that ivermectin, which has been shown to modulate several Cys-loop receptors, inhibits C. elegans GABA receptors as well as L-AChRs, which are also involved in the coordinated movement. Moreover, ivermectin shows synergistic effects on the paralysis induced by both GABAergic and nicotinic agonists, thus reinforcing the importance of research on anthelmintic drug combinations as a strategy tending to reduce the increasing problem of drug resistance. In general, our study from chapter II provides novel information regarding GABAA receptor activation in C. elegans muscle. It shows for the first time single-channel activity of UNC-49 native receptor, and reveals that muscimol and piperazine, a widely used anthelmintic agent, are agonists. Our study also provides further information about the complex and pleiotropic effects of IVM: IVM is an inhibitor of C. elegans GABAR and levamisole-sensitive AChRs. Elucidation of the structural and mechanistic bases underlying the pleiotropic actions of IVM at the Cys-loop receptor family may open doors for novel drug design. In summary, in this doctoral thesis we characterized the L-AChR and the activation of the UNC-49R, both involved in the coordinated locomotion.The characterization of these Cys-loop receptors in a genetically tractable organism and model of parasitic nematodes provides new avenues of exploration for selective drugs as well as for defining structural determinants of activation and modulation in Cys-loop receptor family.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000409596-Texto+Completo-0.pdf: 723209 bytes, checksum: caf0c117dfa3ea5f2b501cc60cc59052 (MD5) Previous issue date: 2008 / Introduction: Memory is the acquisition, consolidation and evocation of information. It always involves an emotional component, which is added to the information of a cognitive nature. When a memory is the consequence of a particularly stressful and traumatic situation, it involves emotions of that nature and is established through the amygdala and hippocampus and is more resistant to extinction and to be forgotten. Anxiety and stress influence the initial phase of the consolidation of memory through several modulatory paths, the effect of which is incorporated within the rest of the content of each memory. In the case of particularly intense stress, there is tendency for the evocation of the traumatic memory to be reiterated, causing persistent avoidance of any stimulus associated with it. TOP is an efficacious medicine in the treatment of epilepsy, which has among its side effects, which are concentration dependent, a reduction in working memory and verbal fluency, leading to confusion and numbness. Materials, methods and assessed hypotheses: The action of TOP (10mg/kg) in the consolidation and extinction of long-term memory was assessed in 84 Wistar rats divided into 6 experimental groups and one control group. The action of TOP on consolidation was assessed by administering it immediately following, or three hours after the training. In order to assess extinction, TOP was administered for 14 days before, or 5 days during the extinction. In all the experiments, the animals initiated tests 15 days after the training. The training consisted of measuring the latency time taken to descend from the platform, in an inhibitory avoidance paradigm, when they received a 1 mA shock for 2 seconds. The action of TOP in consolidation and extinction was assessed in repeated tests, without shock, in which the latency of the descent from the platform was measured at the times T1 to T5 and in the final test T6, 48 hours after. A counter-test was also carried out in order to assess whether there was a direct effect of TOP in the loss of memory when administered for 5 days without there occurring an extinction procedure. Results: When administered post-training, TOP interfered with the consolidation of memory. The result was more efficient when it was administered 3 h after training. TOP failed to induce memory extinction when administered when administered for 14 days prior to extinction, though it facilitated extinction when administered for 5 days during extinction. When TOP was administered for a week and there was no extinction procedure, it did not provoke memory loss. Suggestion: TOP may be of use in the treatment of patients with post-traumatic stress, as well as those considered borderline that exhibit self-destructive behavior related to childhood trauma. / Introdução: A memória é aquisição, consolidação e evocação de informações. Envolve sempre um componente emocional, que se acrescenta às informações de índole cognitiva. Quando a memória é conseqüência de uma situação estressante e traumática, envolve emoções dessa índole e se estabelece através da amídala e do hipocampo, sendo mais resistentes à extinção e ao esquecimento. A ansiedade e o estresse influenciam a fase inicial da consolidação da memória, através de várias vias modulatórias, cujo efeito se incorpora ao restante do conteúdo de cada memória. No caso de estresse particularmente intenso, há tendência à evocação reiterada da memória traumática, provocando uma esquiva persistente a qualquer estímulo que seja associado à mesma. O TOP é um medicamento eficaz na epilepsia, que tem entre seus efeitos colaterais, que são concentração dependente, a diminuição da memória de trabalho e da fluência verbal, provocando confusão e torpor. Materiais, métodos e hipóteses avaliadas: Foi avaliada a ação do TOP (10mg/kg) na consolidação e extinção da memória de longa duração em 84 ratos Wistar, divididos em 6 grupos caso e um grupo controle. A ação do TOP sobre a consolidação foi avaliada por sua administração imediatamente após, ou 3 horas após o treino. Na avaliação da extinção, o TOP foi administrado por 14 dias antes, ou 5 dias durante a extinção. Em todos os experimentos os animais iniciaram os testes 15 dias após o treino. O treino consistiu em medir o tempo de latência para descer da plataforma no paradigma de esquiva inibitória, momento em que receberam um choque de 1 mA por 2 segundos. A ação do TOP sobre a consolidação e extinção foi avaliada em testes repetidos, sem o choque, em que se mediu a latência de descida da plataforma nos tempos T1 a T5 e no teste final T6, 48 horas após. Foi realizada também uma contra prova para avaliar se havia ação direta do TOP na perda da memória quando administrado por 5 dias sem passar pelo procedimento de extinção. Resultados: O TOP administrado pós-treino interferiu com a consolidação da memória. O resultado foi mais eficaz quando administrado 3 h após o treino. O TOP não induziu a extinção da memória quando administrado antes da extinção por 14 dias, porém a facilitou quando administrado por 5 dias durante a mesma. O TOP administrado por uma semana, sem passar pelo procedimento de extinção, não provocou a perda da memória. Sugestão: O TOP talvez possa ser um medicamento que auxilie pacientes com estresse pós-traumático, assim como aqueles considerados “borderline”, que apresentam um comportamento autodestrutivo relacionado a traumas na infância.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-20T15:33:03Z No. of bitstreams: 1 Anael Viana Pinto Alberto.pdf: 4150812 bytes, checksum: 9ce0a5d780533302dcc603ae65f510fe (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-20T15:33:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anael Viana Pinto Alberto.pdf: 4150812 bytes, checksum: 9ce0a5d780533302dcc603ae65f510fe (MD5) Previous issue date: 2012-10-31 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / ATP e outros nucleotídeos são liberados para o meio extracelular por vias reguladas ou pela perda da integridade de membrana. Uma vez fora da célula, esses compostos podem ativar receptores P2: P2X (receptores ionotrópicos) e P2Y (receptores acoplados a proteínas G). Além disso, O receptor P2X7 é um importante membro da família P2X, já que sua ativação pode levar a abertura de um poro membranar que permite a passagem de moléculas de até 900 Da. Os eosinófilos são as principais células efetoras em respostas alérgicas e estão associados com diversos processos fisiológicos e patológicos. Nesse trabalho investigamos a expressão de receptores P2 e suas funções em eosinófilos. Nesse contexto, nosso primeiro passo foi investigar a expressão e funcionalidade dos receptores P2X por patch clamping. Nossos resultados sugerem a presença de P2X1, de P2X2 e de P2X7. Em seguida, avaliamos por microfluorimetria a funcionalidade dos receptores P2Y, e verificamos com base na ordem de potência a possível presença de P2Y2, de P2Y4, de P2Y6 e de P2Y11. Além disso, confirmamos nossos dados por imunofluorescência. Realizamos também ensaios de migração in vitro e in vivo, para verificar se os nucleotídeos extracelulares poderiam atrair eosinófilos. O ATP foi capaz de induzir a migração dos eosinófilos, enquanto a suramina, um bloqueador P2, aboliu esse efeito, tanto in vitro, utilizando transwell, como in vivo, utilizando um modelo de pleurisia alérgica em ratos. Em seguida, avaliamos o possível papel da panexina-1 como poro associado ao receptor P2X7. Nesse trabalho utilizamos inibidores de hemicanais em experimentos de patch clamp e em ensaios de permeabilização de corante. Os resultados indicam que os inibidores de hemicanais não bloquearam a geração de corrente ou a captação de corante após a ativação do receptor P2X7 em macrófagos de ratos e camundongos. Demonstramos que eosinófilos de rato expressam receptores P2X e P2Y por imunofluorescência. Além disso, demonstramos que a ativação de receptores P2 pode aumentar a migração de eosinófilos in vitro e in vivo. Além disso, foi demonstrado que inibidores de panexina-1 não bloqueiam a captação do corante ou a corrente gerada pela ativação do receptor P2X7. Os nossos resultados demostraram que panexina-1 não é o poro associado ao receptor P2X7 em macrófagos / ATP and other nucleotides are released from cells through regulated pathways or following the loss of plasma membrane integrity. Once outside the cell, these compounds can activate P2 receptors: P2X ionotropic receptors and G protein-coupled P2Y receptors. . Additionally, P2X7 receptor is an important member of the P2X family of ionotropic receptor as its activation opens a non-selective pore allowing the passage of molecules up to 900 Da. Eosinophils represent major effector cells in the allergic inflammatory response and they are, in fact, associated with several physiological and pathological processes. Here we investigate the expression of P2 receptors and roles of those receptors in murine eosinophils. In this context, our first step were to investigate the expression and functionality of the P2X receptors by patch clamping, our results suggest the presence of P2X1, P2X2 and P2X7. Next we evaluate by microfluorimetry the expression of P2Y receptors, our results based in the ranking order of potency suggests the presence of P2Y2, P2Y4, P2Y6 e P2Y11. Moreover, we confirmed our findings by immunofluorescence assays. We also did in vitro and in vivo migration assays to verify whether nucleotides could attract eosinophil. ATP increased migration of eosinophils, while suramin a P2 blocker abolished this effect in both in vitro, using trasnwell, and in vivo, using a model of rat allergic pleurisy. Next, we evaluated the putative role of pannexin-1 as the pore associated to the P2X7 receptor. We used hemichannels inhibitors in patch clamp and dye uptake experiments. The results indicate that they do not interfere with current generation or dye uptake after activation of P2X7R in rat and mouse macrophages. We have demonstrated that rat eosinophils express P2X and P2Y receptors by immunofluorescence. In addition, the activation of P2 receptors can increase migration of eosinophils in vitro and in vivo. Moreover, we demonstrated that specific inhibitors of pannexin-1 did not interfere with the dye uptake or current generated by the P2X7 activation. Our results showed that pannexin-1 is not the pore associated to the P2X7 receptor in macrophages.

Ingeniero Civil en Biotecnología / Enfermedades como la sepsis, artritis reumatoide, tendinitis, entre otras, están ligadas a respuestas pro-inflamatorias anómalas. En ellas participan citoquinas pro-inflamatorias y factores de transcripción activados a partir de la vía de señalización mediada por receptores Tipo Toll y proteínas adaptadoras afínes. Estos receptores inician una cascada de señalización a partir de su homodimerización al ser inducidos por señales microbianas. Luego prosigue el reclutamiento de una serie de adaptadores proteicos que terminan finalmente con la transcripción de factores y producción de citoquinas proinflamatorias. En particular, este proyecto se enmarca en el estudio de las vías de señalización en las cuales está involucrado el receptor TLR4. Las enfermedades mencionadas pueden ser tratadas mediante el uso de fármacos, pero su uso resulta poco efectivo en etapas medio-avanzadas de la enfermedad y la presencia de efectos secundarios serios como osteoporosis, obesidad centrípeta, hipertensión, diabetes mellitus, entre otros. En vista de esto se plantea que la descripción de las interacciones del sistema mediado por TLR4 puede permitir diseñar nuevos tratamientos para estas enfermedades caracterizadas por respuestas inflamatorias anómalas. En función de lo anterior, se define el objetivo general de este trabajo que corresponde al estudio y reconstrucción in silico del acoplamiento e interacciones proteína-proteína producidas en la vía pro-inflamatoria activada por TLR4 y proteínas adaptadoras MAL, TRAM y MyD88. Por medio del uso de algoritmos de acoplamiento y herramientas de dinámica molecular se estudia el acoplamiento de los dominios TIR del homodímero de TLR4 y los adaptadores MAL, MyD88 y TRAM. Las interacciones propuestas son caracterizadas determinándose: área de contacto, tipos de interacciones y energía libre de los complejos. De manera adicional, se comparó los resultados con otros modelos presentados en publicaciones anteriores (Nuñez et al. (2007), Basith et al. (2011)). Los resultados obtenidos muestran que los adaptadores MAL y TRAM interactúan con el receptor TLR4 mediante la unión a la nueva superficie formada por la homodimerización de los dominios TIR de TLR4. En ambos casos, se observa que tanto MAL como TRAM se acoplan al receptor TLR4 orientando frente a frente sus lazos BB, lo que confirma la relevancia de este sector en las interacciones de esta vía. Otra zona importante de interacción corresponde al lazo CD del adaptador MAL y TRAM, el que según los resultados interactuaría con la Hélice B de TLR4. Por su parte, el estudio del complejo TLR4-MAL-MyD88, muestra que el adaptador MyD88 se une preferentemente a la nueva superficie que se produce a partir de la interacción TLR4-MAL. A partir de la estimación de la energía libre de unión vía MM-PBSA, se demuestra que los contactos y el acoplamiento de los modelos propuestos muestran estructuras de mayor estabilidad termodinámica que las presentadas por Nuñez (2007). Los resultados demuestran que zonas como los lazos BB, CD, hélice A y C son transversalmente relevantes dentro de la cadena de señalización y que presentan características generalizables al tipo de interacciones que se produce en esta vía mediada por el receptor TLR4. Finalmente, se destaca que la metodología planteada en este trabajo se transforma en un procedimiento novedoso y no descrito en trabajos anteriores relacionados a la descripción de interacciones vía TLR. Más aún, el conjunto de herramientas utilizadas permiten modelar las interacciones, probar hipótesis de interacción, brindar explicación a la acción de mutantes y encontrar sectores potenciales de interacción en cualquier tipo de sistema proteína-proteína.

Memoria para optar al título de Química Farmacéutica / El cardiomiocito adulto es una célula terminalmente diferenciada con escasa capacidad replicativa y responsable de la contracción del miocardio. El ión calcio en conjunto con el AMP cíclico son los segundos mensajeros que regulan la contracción del cardiomiocito. Por otra parte la diabetes mellitus tipo II se asocia a un mayor riesgo cardiovascular (“cardiomiopatía diabética”), siendo muy frecuentes alteraciones sistólicas y diastólicas en el corazón de un paciente diabético. Dado que insulina es la principal hormona asociada a la diabetes es importante determinar si existe alguna relación entre ella y el calcio en el cardiomiocito adulto. En una investigación previa de nuestro Laboratorio se describió que insulina aumenta el calcio intracelular en cultivos primarios de cardiomiocitos neonatos, presentando esta respuesta dos componentes, uno rápido dependiente del calcio externo y el canal tipo L y receptor de ryanodina y otro lento dependiente de la vía transduccional IP3/receptor IP3. Interesantemente, este último componente media los efectos de insulina a nivel de la translocación del GLUT4 a la membrana plasmática y el posterior ingreso de glucosa a estas células. En base a estos antecedentes se propuso en esta memoria como hipótesis que insulina también aumenta los niveles intracelulares de Ca2+ en el cardiomiocito adulto a través de un mecanismo dependiente del Ca2+ extracelular y del almacenado en reservorios intracelulares. Nuestro objetivo consistió en estudiar la activación del sistema de señalización río abajo del receptor de insulina y su dependencia del calcio y el efecto tanto de insulina como IGF-1 en los niveles intracelulares de calcio en el cardiomiocito adulto de rata. Las células se expusieron a insulina 100 nM por distintos períodos de tiempo y se evaluó la activación del receptor mediante su autofosforilación en tirosina y de las proteínas kinasas Akt (Ser 473) y Erk 1/2 mediante Western blot. La presencia del receptor de insulina en el cardiomiocito de rata adulta se detectó por inmunofluorescencia en tyr1150/1151. Las tres proteínas evaluadas alcanzaron un máximo de activación significativo con respecto a los controles a los 5 min post- estímulo con insulina. Por otra parte, las células preincubadas con la sonda fluorescente para calcio Fluo3- AM se estudiaron por microscopía confocal para determinar cambios en los niveles de calcio intracelulares inducidos por insulina e IGF-1. Ambos péptidos no produjeron aumentos significativos en los niveles de calcio intracelulares tanto en medio de reposo sin calcio como en medio de reposo con calcio y evaluando distintas zonas celulares y concentraciones de los compuestos, mientras que conocidos estímulos (ionomicina y KCl), empleados como controles positivos, aumentaron el calcio intracelular. Asimismo, insulina e IGF-1 no modificaron la frecuencia de contracción del cardiomiocito adulto. Sin embargo, ensayos de fosforilación de la proteína Akt (Ser 473) en ausencia de calcio intracelular mediante el uso de BAPTA-AM mostraron niveles inferiores a los observados en presencia de este catión. En cambio, la fosforilación del receptor de insulina no se modificó al quelar el calcio intracelular en el cardiomiocito adulto. Estos resultados sugieren que probablemente las diferencias en cuanto a fenotipo y genotipo, así como las diferencias en las preferencias de sustratos energéticos de cardiomiocitos neonatos y adultos podrían constituir razones por las cuales ambos tipos celulares se comportan de manera distinta en cuanto a la relación insulina y calcio. En conclusión, insulina activa su vía transduccional en el cardiomiocito adulto. No obstante, ni insulina ni IGF-1 inducen cambios en los niveles intracelulares de calcio en el cardiomiocito adulto ya sea afectando la entrada desde el extracelular o la salida desde reservorios intracelulares de manera detectable con Fluo3- AM. Sin embargo, dado que este catión moduló la activación de la vía de señalización de insulina a nivel de la proteína kinasa Akt, futuras investigaciones deberán aclarar estas discrepancias / Cardiomyocytes are fully differentiated cells with limited proliferation capacity and responsible for myocardial contraction. Ca2+ and cyclic AMP are second messengers regulating cardiomyocyte contraction. On the other hand type II diabetes mellitus has been associated with increased cardiovascular risk (diabetic cardiomyopathy), being frequent systolic and diastolic alterations in the diabetic heart. Because insulin is the main hormone linked to diabetes, it is important to determine whether there is any relationship between this peptide hormone and calcium in the adult cardiomyocyte. In a previous work in our laboratory, we reported that insulin increased intracellular Ca2+ in primary cultured neonatal cardiomyocytes. This response has two components, a rapid one characterized by its dependence by external Ca2+ and the L-type Ca2+ channel/ryanodine receptor, and a slow component depending on IP3/IP3 receptor signaling pathway. Interestingly the latter component mediates insulin effects on GLUT4 translocation to the plasma membrane and subsequent glucose uptake. Based on this evidence, we propose that insulin also increases intracellular Ca2+ levels in isolated adult rat cardiomyocytes through a mechanism involving extracellular and intracellular Ca2+. The aim of this work was to study the activation of insulin receptor downstream signaling pathway and its regulation by Ca2+ as well as the effects of insulin and IGF-1 on the intracellular Ca2+ levels in isolated adult rat cardiomyocytes. To this end, cells were exposed to 100 nM insulin for different time periods and the activation of the insulin receptor was assessed by its tyrosine autophosphorylation and the phosphorylation of protein kinases Akt (Ser 473) and Erk 1/2 by Western Blot. The presence of tyr1150/1151 insulin receptor in the adult rat cardiomyocyte was investigated by indirect immunofluorescence. These three signaling proteins reached a maximum activation at 5 min after insulin stimulation. On the other hand, cells preincubated with the fluorescent probe for calcium Fluo3-AM were studied by confocal microscopy to determine changes on intracellular Ca2+ levels induced by insulin and IGF-1. Both peptides did not produce any significant increases in intracellular calcium levels both in presence and absence of extracellular calcium and evaluating different cell areas and concentrations of the compounds. Stimuli like ionomycin and KCl, used as positive controls, increased intracellular Ca2+ levels in cardiac cells. Furthermore, insulin and IGF-1 did not affect the frequency of adult cardiomyocyte contraction. However, Akt phosphorylation on Ser 473 was lower in cells cultured with the intracellular calcium chelator BAPTA-AM that those cultured with medium containing this cation. In contrast, insulin receptor phosphorylation was not modified by BAPTA-AM on isolated adult rat cardiomyocytes. These results suggest that probably the differences in phenotype and genotype, as well as differences in energy substrate preferences by neonatal and adult cardiomyocytes could explain why both cell types behave differently with regard to the relationship between insulin and calcium. In summary, insulin activates its canonical signaling pathway in adult cardiomyocytes. However, neither insulin nor IGF-1 changed intracellular Ca2+ levels in isolated rat adult cardiomyocytes. However Ca2+ modulated the activation of the canonical insulin receptor signaling pathway at the level of Akt and future research should clarify these discrepancies

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El alcoholismo es un problema mundial de salud pública, por lo que es importante comprender sus bases neuro-farmacológicas para identificar nuevos blancos terapéuticos. Uno de los problemas del alcoholismo es la recaída, que corresponde a la pérdida de control sobre el consumo de alcohol cuando el paciente vuelve a beber después de un período de abstinencia. Estudios en modelos animales de alcoholismo han asociado un mayor valor placentero del alcohol al momento de la recaída. Este incremento del valor hedonístico del alcohol podría estar asociado a un mayor nivel del receptor (mu) μ-opioide (OPMR) en el circuito cerebral de recompensa. Para determinar el rol del OPMR en la recaída al consumo de alcohol, en este trabajo se presentan estudios destinados a evaluar la capacidad inhibitoria de distintas secuencias de RNAs de interferencia tipo horquilla (shRNAs) dirigidas a disminuir la expresión de OPMR in vitro, para ser utilizadas posteriormente en futuros estudios en modelos in vivo. Para ello se clonó el gen del receptor μ-opioide de rata (OPMRr) en el plásmido de expresión pHIV-GFP, generando pHIV-OPMRr-GFP. Se transfectaron células HEK-293T, que naturalmente no expresan OPMRr, con pHIV-OPMRr-GFP y se verificó la expresión de OPMRr mediante Western blot. Para lograr el silenciamiento de la expresión OPMRr se co-transfectó pHIV-OPMRr-GFP con cuatro secuencias distintas (A, B, C y D) de shRNAs dirigidos al RNA mensajero del OPMRr. Las secuencias A y D otorgaron el mayor grado de silenciamiento, inhibiendo en un 73% y 75% respectivamente la expresión de OPMRr. Se generaron lentivirus codificantes de los shRNAs más potentes en reducir su expresión para posteriores ensayos in vivo. En conclusión, mediante el uso de técnicas de biología molecular se clonó y expresó el gen del OPMRr en células en cultivo. Además, se identificaron 2 secuencias de shRNAs capaces de silenciar en más de un 70% la expresión del cDNA codificante para OPMRr y se generaron sus correspondientes lentivirus / Alcoholism is a worldwide public health problem. Therefore, it is important to understand its neuropharmacological bases to identify new therapeutic targets. One of the main problems of alcoholism is relapse, which is the loss of control over ethanol consumption when the patients start to drink again after a period of abstinence. Studies carried out on animal models of alcoholism have established an enhanced pleasurable value of ethanol consumption at the time of relapse. This alcohol enhanced hedonistic value could be associated to an increase in the μ-opioid receptor (OPMR) levels on the brain reward circuit. To determine the role of OPMR on ethanol consumption relapse, the ability of different short hairpin RNAs (shRNAs) to decrease OPMR expression in vitro was assessed. The best shRNAs are intended to be used in future in vivo studies. First, the rat μ-opioid receptor (OPMRr) gene was cloned into the expression plasmid pHIV-GFP, generating the pHIV-OPMRr-GFP plasmid. HEK-293T cells, which naturally do not express OPMRr, were transfected with pHIV-OPMRr-GFP and the OPMRr expression was determined by Western blot. To assess the silencing of the OPMRr in vitro, the pHIV-OPMRr-GFP plasmid was co-transfected with 4 shRNAs sequences (A, B, C y D) designed against the OPMRr messenger RNA. shRNAs A and D exhibit the highest silencing ability, inhibiting OPMRr expression by 73% and 75% respectively. For future in vivo assays, lentiviral vectors codifying for these shRNAs were generated. In conclusion, using molecular biology techniques it was possible to clone and express the gene of the OPMRr in HEK-293T cells. Two shRNAs sequences that inhibit the OPMRr cDNA expression over a 70% were identified and lentiviral vectors that codify for these shRNAs were generated / FONDECYT 11130241

A dor muscular afeta cerca de 11 a 24% da população mundial. É de origem multifatorial, podendo ser causada por fatores físicos, emocionais, psicológicos e sociais e é cada vez mais encontrada na prática clínica. Estudos tem demonstrado que o exercício físico é uma atividade que auxilia no controle da dor. Os receptores canabinóides do tipo 2 (CB2), expressos em tecidos periféricos e células inflamatórias, parecem estar envolvidos no controle da dor. Além disso, estudos tem demonstrado que tais receptores também estejam expressos no Sistema Nervoso Central, incluindo células microgliais. Sendo assim, o presente estudo investigou a participação de receptores CB2 e o envolvimento da micróglia espinal no controle da dor muscular por meio do exercício físico. Para isso, foram utilizados camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6, pesando entre 20 a 25g. O limiar nociceptivo foi avaliado pelo teste de filamentos de Von frey e pelo teste da placa quente. O modelo de dor muscular foi induzido pela injeção intramuscular de carragenina no músculo gastrocnêmio direito. Para verificar os níveis de citocinas pró-inflamatórias, Il-1β e TNF-α, foi realizado o ensaio de ELISA. A dor muscular pode gerar inflamação com aumento da temperatura local, sendo assim, utilizamos a técnica de termografia para verificar as alterações na temperatura local dos animais. Foram utilizadas as drogas, AM630, para investigar a participação de receptores CB2; o MAFP, para avaliar a participação de endocanabinóides e a minociclina, para investigar o envolvimento da micróglia. Após a terceira semana de natação, os animais apresentaram uma redução da alodínia mecânica e da hiperalgesia térmica induzidas pela carragenina i.m. O AM630, reverteu a antinocicepção induzida pelo exercício, em ambos os testes nociceptivos. O MAFP inibiu a nocicepção muscular nos animais exercitados, apenas no teste da placa quente. A minociclina bloqueou a nocicepção apenas nos animais sedentários com dor muscular. Os resultados do ensaio de ELISA demonstraram que o exercício reduziu os níveis de TNF-α, os quais se encontraram aumentados nos animais com dor muscular que não foram exercitados. Já os níveis basais de IL-1β apresentaram reduzidos apenas nos animais submetidos ao modelo de dor muscular e que realizaram o treinamento físico. Por meio da análise termográfica, foi encontrado uma redução da temperatura local nos animais exercitados com dor muscular. A micróglia parece estar envolvida na termorregulação local dos animais com dor muscular exercitados, pois quando a micróglia foi bloqueada pela minociclina, a temperatura corporal nestes animais foi aumentada. Sendo assim, concluímos que o exercício inibe a dor muscular induzida pela carragenina, os receptores CB2 participam deste controle da dor e a micróglia parece estar envolvida na gênese e manutenção da dor muscular, com a liberação de citocinas pró-inflamatórias. / Muscle pain affects approximately 11-24% of the population. It is of multifactorial origin, which may be caused by physical, emotional, psychological and social factors and is increasingly found in clinical practice. Studies have shown that physical exercise is an activity that helps to control pain. Cannabinoid receptor type 2 (CB2) expressed in peripheral tissues and inflammatory cells, appear to be involved in pain control. In addition, studies have shown that these receptors are also expressed in the central nervous system, including microglial cells. Thus, the present study investigated the participation of CB2 receptors and the involvement of the spinal microglia in the control of muscle pain by exercise. For this, were used C57BL/6 female mice, weighing between 20 and 25g. The nociceptive threshold was measured by Von Frey filaments test and hot plate test. The muscular pain model was induced by intramuscular injection of carrageenan in the right gastrocnemius muscle. To verify the levels of pro-inflammatory cytokines, we performed the ELISA assay. Muscle pain can lead to inflammation with increased local temperature, so we use thermography technique to check for changes in the local temperature of the animals. The following drugs were used, AM630, to investigate the involvement of CB2 receptors, MAFP to evaluate the role of endocannabinoids and minocycline to investigate the role of microglia. After the third week of swimming, the animals showed a reduction in mechanical allodynia and thermal hyperalgesia induced by carrageenan i.m. The AM630, reversed the antinociception induced by exercise in both nociceptive tests. MAFP inhibited muscle nociception in animal exercised only in the hot plate test. Minocycline blocked nociception only in the sedentary animals with muscular pain. The results of the ELISA assay showed that exercise reduced TNF-α levels, which were found in animals with increased muscle pain, which have not been exercised. Basaline levels of IL-1β showed reduced only in animals submitted to muscular pain model and underwent physical training. By thermographic analysis, we find a reduction in the local temperature of trained animals with muscular pain. Microglia appear to be involved in thermoregulation location of animal muscle pain exercised because when the microglia were blocked by minocycline, body temperature was increased in these animals. Thus, we conclude that exercise inhibits muscle pain induced by carrageenan, CB2 receptors participate in this pain control and microglia seems to be involved in the genesis and maintenance of muscle pain, with the release of pro-inflammatory cytokines. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Orientador: João Carlos Callera / Coorientador: José Antunes Rodrigues / Banca: Thiago dos Santos Moreira / Banca: Juliana Irani Fratucci de Gobbi / Resumo: A ativação de receptores GABAA e GABAB no núcleo parabraquial lateral (NPBL) com muscimol e baclofen, respectivamente, induz a ingestão de água e NaCl hipertônico em ratos. No presente estudo, investigamos os efeitos da injeção no NPBL bilateral de trans-4-aminocrotónic acid (TACA), um agonista não seletivo dos receptores GABAA e GABAC na ingestão de água e NaCl 1,8% induzida por depleção aguda de água e sódio. Foram utilizados ratos Wistar com cânulas de aço inoxidável implantadas bilateralmente no NPBL. Estes animais foram depletados de água e sódio com injeções do diurético furosemida (FURO 10 mg/kg de peso corporal) combinado com baixa dose do inibidor da enzima conversora de angiotensina captopril (CAP 5 mg/kg de peso corporal). Injeções bilaterais de um agonista seletivo do receptor GABAA, muscimol (0,5 nmol/0.2 μl) no NPBL aumentou a ingestão de NaCl 1,8% e água (34.6±6.9 e 29.2±2.8 vs. salina: 4.4±2.4 e 9.4±2.5 ml/210 min, respectivamente) em ratos tratados com FURO+CAP. Injeções bilaterais de TACA (0,5 e 2,0 nmol/0.2 μl) no NPBL não alterou a ingestão de NaCl 1,8% induzida pela depleção de sódio (6.1±2.2 e 5.2±1.4 ml/210 min vs salina: 3.8±1.0 e 4.6±1.3 ml/210 min, respectivamente). A combinação de um antagonista GABAC, Zapa sulphate (10 nmol/0.2 μl) e TACA (160 nmol/0.2 μl) injetados no NPBL não produziu nenhuma mudança na ingestão de NaCl 1,8% (6,8±1.7 ml/180 min). Injeções bilaterais isoladas de ZAPA sulphate no NPBL não mudou a ingestão de NaCl 1,8% e água. A Pressão Arterial e a Freqüência Cardíaca não foram alteradas por injeções de TACA no NPBL. O resultados do presente estudo mostram que injeções bilaterais de TACA não inibiram ou facilitaram a ingestão de água e o apetite ao sódio durante a depleção aguda de água e sódio promovida por FURO+CAP / Abstract: Activation of GABAA and GABAB receptors in the lateral parabrachial nucleus (LPBN), with muscimol and baclofen, respectively, induces water and hypertonic NaCl intake in rats. In the present study we investigated the effects of bilateral injection of trans-4-aminocrotonic acid (TACA), an agonist of GABAA and GABAC receptors into the LPBN on water and 1.8% NaCl intake induced by acute fluid depletion. Male Wistar rats with stainless steel cannulas implanted bilaterally in the LPBN were used. They were acutely depleted of water and sodium by injections of the diuretic furosemide (FURO 10 mg/kg, bw) combined with low dose of the angiotensin converting enzyme inhibitor captopril (CAP 5 mg/kg, bw). Bilateral injections of a selective GABAA receptor agonist, muscimol (0.5 nmol/0.2 μl) into the LPBN strongly increased NaCl 1.8% and water intake (34.6±6.9 e 29.2±2.8 vs saline: 4.4±2.4 e 9.4±2.5 ml/210 min) in FURO+CAP treated rats. Bilateral injections of TACA (0.5 and 2.0 nmol/0.2 μl) into the LPBN did not change sodium depletion-induced 1.8% NaCl intake (6.1±2.2 and 5.2±1.4 ml/210 min, respectively, vs saline: 3.8±1.0 and 4.6±1.3 ml/210 min). The combination of a GABAC antagonist, ZAPA sulphate (10 nmol/0.2 μl) and TACA (160 nmol/0.2 μl) injected into the LPBN produced no change of 1.8% NaCl intake (6.8±1.7 ml/180 min). Bilateral injections of ZAPA sulphate alone into the LPBN did not change water and 1.8% NaCl intake. Arterial blood pressure and heart rate were not altered by TACA injected into the LPBN. We concluded that bilateral injection of TACA not inhibit or facilitate sodium appetite during acute fluid depletion / Mestre

Submitted by FERNANDA DA SILVA VON PORSTER (fdsvporster@univates.br) on 2017-06-22T17:29:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016StephanieCristineHeppRehfeldt.pdf: 1376808 bytes, checksum: e08f7b650ff772d3630584abfa19f877 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Lisboa Monteiro (monteiro@univates.br) on 2017-06-26T18:30:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016StephanieCristineHeppRehfeldt.pdf: 1376808 bytes, checksum: e08f7b650ff772d3630584abfa19f877 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T18:30:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 2016StephanieCristineHeppRehfeldt.pdf: 1376808 bytes, checksum: e08f7b650ff772d3630584abfa19f877 (MD5) Previous issue date: 2017-06 / CAPES / Dentre os sistemas neurais responsáveis pela ingestão dos alimentos, destaca-se a via dopaminérgica mesolímbica que, por ação da dopamina (DA), impulsiona comportamentos gratificantes como a alimentação. Sendo assim, a obesidade pode estar intimamente relacionada à capacidade individual de liberação de DA, em resposta à ingestão de um alimento palatável de alta energia. Uma vez que os receptores de dopamina D2 e D4 integram o sistema de recompensa dopaminérgico e modulam respostas DA-dependentes, variantes nos genes DRD2, ANKK1 e DRD4 representam candidatos para estudos genéticos e podem implicar diretamente na predisposição dos indivíduos a ganharem de peso no futuro. Nesse sentido, esse trabalho teve por objetivo avaliar a associação dos polimorfismos rs2283265 do gene DRD2, rs1800497 do gene ANKK1, e o VNTR de 48pb no exon III do gene DRD4 com parâmetros antropométricos e bioquímicos em uma amostra de indivíduos adultos. Após assinar o TCLE, os participantes realizaram anamnese clínica e nutricional, avaliação antropométrica e coleta de sangue. Após a extração de DNA, os polimorfismos rs2283265 e rs1800497 foram genotipados pelo sistema de discriminação alélica TaqMan, em equipamento de PCR em Tempo Real (StepOnePlus®, Applied Biosystems), de acordo com os protocolos do fabricante. Já o VNTR de 48pb no exon III do gene DRD4 foi genotipado por PCR convencional conforme protocolo descrito anteriormente por Lichter et al. (1993). Dentre os 601 participantes incluídos no presente estudo, a média de idade observada foi de 25,4 anos, sendo 74,2% da amostra pertencente ao sexo feminino. Evidenciou-se uma associação significativa entre índices de gordura corporal e o alelo de risco 7R, do polimorfismo localizado no gene DRD4, bem como entre consumo diário de carboidratos e os alelos de risco dos polimorfismos rs2283265 e rs1800497, localizados nos genes DRD2 e ANKK1, respectivamente, corroborando com a literatura existente. Além disso, os resultados encontrados indicam uma possível associação entre os níveis elevados de HDL e polimorfismos e haplótipos de risco no sistema dopaminérgico. Uma vez que não há uma hipótese biológica clara que justifique tais achados, são necessários mais estudos para comprovar o efeito desses polimorfismos.