Les anticoagulants antivitamines K (AVKs) sont des molécules qui par inhibition de l'activation des PVKDs, empêchent ou retardent la coagulation sanguine. Aujourd'hui, le traitement par AVKs est la première cause d'accidents iatrogènes médicamenteux chez l'homme. Cependant le bénéfice par rapport au risque étant largement supérieur. Elles sont également utilisées dans le contrôle des populations de rongeurs nuisibles. Les AVKs agissent en inhibant l'enzyme VKORC1. Des phénomènes d'hypersensibilité et de résistance aux AVKs sont apparus et plusieurs mutations spontanées ont été découvertes dans le gène vkorc1. Ces mutations ont alors été associées à la résistance sans que ce lien n'ait jamais été démontré. Le travail, présenté dans ce mémoire, a pour objectif de confirmer ou d'infirmer ces liens de causalité. Cette étude a permis de démontrer la responsabilité des mutations Leu120Gln, Leu128Gln et Tyr139Phe, Ser et Cys dans l'apparition du phénotype résistant aux AVKs de 1ère génération chez le rat sauvage. Les propriétés catalytiques expliquent de plus le coût biologique associé à l'apparition de cette résistance chez certaines lignées de rats sauvages. Ainsi, les mutations en position 139 sont responsables d'un détournement de la catalyse avec production majoritaire d'hydroxyvitamine K directement éliminable par l'organisme. Chez l'homme, 29 mutations sur 30 ont été caractérisées. Alors que ces mutations ont été observées chez des patients résistants aux AVKs, la causalité de ces mutations n'a été démontrée que pour 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His). Les autres mutations ne seraient pas responsables du phénotype observé

Le maintien de l'intégrité du patrimoine génétique est essentiel à la survie des organismes vivants. Face aux nombreuses sources de stress génotoxiques qui induisent des dommages de l'ADN, les cellules ont mis en place des mécanismes complexes capables de détecter et réparer ces lésions. Parmi ces sources, figurent les rayonnements ultraviolets (UV) contenus dans la lumière solaire, qui modifient la structure de l'ADN et peuvent conduire à l'introduction de mutations. Chez l'homme, la grande majorité des dommages de l'ADN produits par les rayonnements est éliminée par le système NER (Nucleotide Excision Repair), un système capable d'exciser les nucléotides lésés et de les remplacer. Une déficience de cette voie de réparation peut mener à l'apoptose (mort programmée des cellules), et augmente la susceptibilité de développer des maladies graves telles que le cancer. Le système NER met en œuvre de nombreuses protéines impliquées dans des mécanismes variés tels que la détection, la signalisation, ou la réparation de l'ADN. La protéine eucaryote KIN17, récemment découverte dans le noyau de la cellule humaine, semble appartenir à ce système de réparation. Cependant, son rôle précis dans la réponse aux dommages de l'ADN reste à ce jour inconnu. C'est pourquoi, nous avons entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine (domaine K2) afin d'améliorer la connaissance de ses fonctions, de ses partenaires biologiques, et de ses modes de fonctionnement. La première partie de ce manuscrit est consacrée à la préparation de l'échantillon de protéine en vue d'une analyse structurale par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Le travail a dans un premier temps consisté à choisir et optimiser le système d'expression de domaines structuraux d'une autre protéine : la proline déshydrogénase PRODH. Dans un second temps, la meilleure stratégie de préparation de l'échantillon a été appliquée à la protéine KIN17 pour produire, puis résoudre la structure tridimensionnelle du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire. Nous avons montré que la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine adopte un repliement caractéristique de la famille structurale « Winged Helix » des protéines de liaison aux acides nucléiques. Cependant, l'analyse des détails structuraux du domaine K2, la comparaison avec des protéines de fonction connue de la même classe structurale, et des études électrophorétiques, révèlent l'incapacité de ce domaine à lier l'ADN et l'ARN de manière autonome. En revanche, nous avons mis en évidence, par une étude RMN complémentaire, l'existence d'une surface ultra conservée impliquée dans des interactions de type protéine-protéine intra-moléculaires entre le motif « Winged Helix » de la région 51-160 et la région N-terminale 1-50 de KIN17 humaine.

Les acides chlorogéniques (CGAs) représentent une famille d'esters formés d'un dérivé de l'acide cinnamique conjugué à l'acide quinique ou shikimique. Ces métabolites secondaires produits par la voie des phénylpropanoides sont largement répandus chez les végétaux terrestres et sont une source majeure d'antioxydants alimentaires. Les esters hydroxycinnamoyl-CoA sont les précurseurs des CGAs et d'autres composés phénoliques tels que les lignines. Ces intermédiaires activés sont synthétisés à partir d'un acide hydroxycinnamique et du coenzyme A par la 4-coumarate CoA ligase (4CL) appartenant à la superfamille des enzymes formant des adénylates. Nicotiana tabacum 4CL2 a été utilisée pour la production d'esters et sa structure a été résolue par remplacement moléculaire. Deux gènes codant pour des hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransférases chez Coffea canephora ont été clonés. CcHCT et CcHQT, qui appartiennent à la superfamille des acyltransférases acyl-CoA-dépendantes, ont été surexprimées dans E. coli et purifiées à homogénéité. L'analyse par diffraction aux rayons X de cristaux de CcHCT a permis de déterminer sa structure par remplacement moléculaire. Un modèle a été dérivé par homologie de séquence pour CcHQT afin de proposer les déterminants de la préférence pour l'acide quinique ou shikimique. Des modélisations moléculaires ont été réalisées afin d'identifier les résidus potentiellement impliqués dans les intéractions enzyme-substrat. L'analyse par chromatographie liquide haute performance des réactions enzymatiques ont montré que ces enzymes sont capables de synthétiser l'acide 5-O-caféoylquinique mais aussi le diester 3,5-O-dicaffeoylquinique, qui est un composé majeur du grain de café avant mûrissement. La production de variants par mutagenèse dirigée a permis l'identification de résidus importants pour la catalyse des réactions de mono- et de diacylation. L'approche combinée de la biologie structurale et de l'enzymologie s'avère particulièrement utile pour mieux comprendre le rôle de HCT et HQT.

Les acides chlorogéniques (CGAs) représentent une famille d'esters formés d'un dérivé de l'acide cinnamique conjugué à l'acide quinique ou shikimique. Ces métabolites secondaires produits par la voie des phénylpropanoides sont largement répandus chez les végétaux terrestres et sont une source majeure d'antioxydants alimentaires. Les esters hydroxycinnamoyl-CoA sont les précurseurs des CGAs et d'autres composés phénoliques tels que les lignines. Ces intermédiaires activés sont synthétisés à partir d'un acide hydroxycinnamique et du coenzyme A par la 4-coumarate CoA ligase (4CL) appartenant à la superfamille des enzymes formant des adénylates. Nicotiana tabacum 4CL2 a été utilisée pour la production d'esters et sa structure a été résolue par remplacement moléculaire. Deux gènes codant pour des hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransférases chez Coffea canephora ont été clonés. CcHCT et CcHQT, qui appartiennent à la superfamille des acyltransférases acyl-CoA-dépendantes, ont été surexprimées dans E. coli et purifiées à homogénéité. L'analyse par diffraction aux rayons X de cristaux de CcHCT a permis de déterminer sa structure par remplacement moléculaire. Un modèle a été dérivé par homologie de séquence pour CcHQT afin de proposer les déterminants de la préférence pour l'acide quinique ou shikimique. Des modélisations moléculaires ont été réalisées afin d'identifier les résidus potentiellement impliqués dans les intéractions enzyme-substrat. L'analyse par chromatographie liquide haute performance des réactions enzymatiques ont montré que ces enzymes sont capables de synthétiser l'acide 5-O-caféoylquinique mais aussi le diester 3,5-O-dicaffeoylquinique, qui est un composé majeur du grain de café avant mûrissement. La production de variants par mutagenèse dirigée a permis l'identification de résidus importants pour la catalyse des réactions de mono- et de diacylation. L'approche combinée de la biologie structurale et de l'enzymologie s'avère particulièrement utile pour mieux comprendre le rôle de HCT et HQT.

The granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is a hematopoietic cytokine that stimulates and regulates the proliferation and differentiation of neutrophil precursor cells of the bone marrow. The recombinant hormone (rhG-CSF) non-glycosylated, filgrastim, is used to treat the neutropenia induced by chemotherapy and bone marrow transplantion. The identification and characterization was carried out by electrophoresis and western blotting, showing the typical band in the region of 18.8 kDa. The neutropenia mouse bioassay was standardized with the BALB/c strain, previously treated with ifosfamide and used for the potency assessment of pharmaceutical products. A gradient reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) was validated for the analysis of rhG-CSF in pharmaceutical formulations. The LC method was carried out on a Jupiter C4 column 300 Å (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at ambient temperature. The mobile phase A consisted of water:acetonitrila (90:10, v/v) with 0.1% trifluoroacetic acid and the mobile phase B was water:acetonitrile (20:80, v/v) with 0.1% trifluoroacetic acid, run at a flow rate of 0.5 mL/min with detection at 280 nm. The chromatographic separation was obtained with the retention time of 31.9 minutes and the method was linear in the range of 10 300 μg/mL. Validation parameters such as sensitivity, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness were evaluated giving results in the acceptable range. The specificity was evaluated by the peak purity of the rhG-CSF biological reference preparation subjected to oxidative conditions. The proposed method was applied for the analysis of filgrastim pharmaceutical products, evaluating the sulphoxides and deamidates forms as well. Moreover, the size-exclusion chromatography (SE-LC) was performed for the potency evaluation of 7 filgrastim, dimers and high-molecular-mass forms. Samples of pharmaceutical formulations were subjected to aggregation, degradation and than each one evaluated by the neutropenia mouse bioassay giving biological activities of 14.60%, 13.47% and 15.63%, for the dimers, high-molecular-mass substances and the sulphoxides/deamidates, respectively. The pharmaceutical samples were analysed by the chromatographyc methods and compared to the bioassay showing mean difference between the estimated potencies of 2.04% lower for the RP-LC, and 4.03% lower for the SE-LC, with significant correlation (p>0.05). Due to the reduced bioactivity of the rhG-CSF-related proteins, the SE-LC is proposed in combination with the RP-LC as an alternative to the bioassay for the potency assessment of filgrastim in pharmaceutical dosage forms. The alternative established represents a contribution towards the replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / O fator estimulador da colônia de granulócitos humanos é uma citocina hematopoiética que estimula e regula a proliferação e diferenciação de células precursoras de neutrófilos da medula óssea. O hormônio recombinante (rhG-CSF) sob a forma nãoglicosilada, filgrastima, é usado para o tratamento de neutropenias. Realizou-se a identificação de filgrastima em produtos farmacêuticos por eletroforese, transferência e detecção com anticorpos específicos, demonstrando-se banda única na região de peso molecular de, aproximadamente, 18,8 kDa. Avaliou-se a atividade pelo ensaio biológico da neutropenia em camundongos da linhagem BALB/c, pré-tratados com ifosfamida. Desenvolveu-se e validou-se o método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), utilizando coluna Júpiter C4 300 Å (250 mm x 4,6 mm, i.d.), mantida a temperatura ambiente. A fase móvel A foi constituída de água/acetonitrila (90:10, V/V)/ 0,1% ácido trifluoroacético e a fase móvel B de água/acetonitrila (20:80, V/V)/ 0,1% ácido trifluoroacético, eluída em gradiente na vazão de 0,5 mL/min com detecção no ultravioleta a 280 nm. A análise cromatográfica viabilizou a separação da filgrastima no tempo de retenção de 31,9 min, sendo linear na faixa de concentração de 10 300 μg/mL. Avaliaram-se os parâmetros de precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estudou-se também a especificidade, através da determinação da pureza do pico da Substância biológica de referência de rhG-CSF, submetida à degradação sob condições oxidativas. O método proposto foi utilizado para análise de filgrastima em produtos farmacêuticos, determinando-se as formas de sulfóxidos e desamidados. Paralelamente, efetuaram-se avaliações de potência por cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM), determinando as formas diméricas e de alta massa molecular. Amostras de produtos farmacêuticos foram submetidas a condições de agregação e degradação e, então, avaliadas pelo bioensaio da neutropenia em 5 camundongos, obtendo-se atividades biológicas de 14,60%, 13,47% e 15,63%, para os dímeros, substâncias de alta massa molecular e sulfóxidos/desamidados, respectivamente. Estudou-se a correlação entre métodos e demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias 2,04% menor por CL-FR, e significativa de 4,03% menor por CL-EM, em relação ao ensaio biológico. Devido à reduzida bioatividade das formas alteradas, conclui-se sugerindo a adoção do método por CL-EM para a avaliação de potência de filgrastima, em combinação com CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

Erythropoietin is a glycoprotein which stimulates the erythropoiesis, clinically used for the treatment of renal anaemia. The biological and chromatographic methods for the potency evaluation of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in pharmaceutical products were validated in the present work. The normocythaemic mice bioassay was carried out in female BALB/c strain, with multiple injections schedule and reticulocytes counted by automated flow cytometry. The dose-response curve was linear (r2=0.9708) in the concentration range of 1 to 64 IU/mL. A reversed-phase liquid chromatography method (RP-LC) was developed and validated using a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase A consisted of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and mobile phase B consisted of 0.08% TFA:acetonitrile (30:70, v/v), run in linear gradient: 0.1-60 min, 0.1-100% of B at flow rate of 0.5 mL/min with detection at 280 nm. The chromatographic separation was obtained within 60 min and it was linear (r2=0.9997) in the concentration range of 10-150 μg/mL. The procedures were validated evaluating parameters such as, the specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, and limit of quantitation, as well as, the limit of detection evaluated in the validation of the chromatographic method. The methods were applied for the potency evaluation of the alfa and beta rhEPO in pharmaceutical products, which were analysed by the chromatographic method and compared to the bioassay showing mean differences between the estimated potencies of 11.2% higher for the RP-LC. The alternative established represents a contribution towards the replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / Eritropoietina é uma glicoproteína que estimula a eritropoiese e é usada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foram validados métodos biológico e cromatográfico para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos. O ensaio biológico foi validado em camundongos normocitêmicos, fêmeas, da linhagem BALB/c, com protocolo de injeções múltiplas e contagem automatizada dos reticulócitos por citometria de fluxo. A curva doseresposta foi linear (r2=0,9708) na faixa de concentração de 1 a 64 UI/mL. Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) empregando coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B composta de acetonitrila/ácido trifluoracético 0,08% (70:30, v/v), eluída em gradiente linear: 0,1 60 min, 0 100% de B, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 280 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 60 min, sendo linear (r2=0,9997) na faixa de concentração de 10-150 μg/mL. Ambos procedimentos foram validados com base nos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de quantificação, bem como limite de detecção, avaliado na validação do método cromatográfico. Os métodos foram aplicados na avaliação de potência de rhEPO alfa e beta em produtos farmacêuticos e estudou-se a correlação entre os métodos. Demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias de potência 11,2 % superiores para o CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.Eritropoietina é uma glicoproteína que estimula a eritropoiese e é usada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foram validados métodos biológico e cromatográfico para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos. O ensaio biológico foi validado em camundongos normocitêmicos, fêmeas, da linhagem BALB/c, com protocolo de injeções múltiplas e contagem automatizada dos reticulócitos por citometria de fluxo. A curva doseresposta foi linear (r2=0,9708) na faixa de concentração de 1 a 64 UI/mL. Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) empregando coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B composta de acetonitrila/ácido trifluoracético 0,08% (70:30, v/v), eluída em gradiente linear: 0,1 60 min, 0 100% de B, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 280 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 60 min, sendo linear (r2=0,9997) na faixa de concentração de 10-150 μg/mL. Ambos procedimentos foram validados com base nos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de quantificação, bem como limite de detecção, avaliado na validação do método cromatográfico. Os métodos foram aplicados na avaliação de potência de rhEPO alfa e beta em produtos farmacêuticos e estudou-se a correlação entre os métodos. Demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias de potência 11,2 % superiores para o CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

Les acides chlorogéniques (CGAs) représentent une famille d'esters formés d'un dérivé de l'acide cinnamique conjugué à l'acide quinique ou shikimique. Ces métabolites secondaires produits par la voie des phénylpropanoides sont largement répandus chez les végétaux terrestres et sont une source majeure d'antioxydants alimentaires. Les esters hydroxycinnamoyl-CoA sont les précurseurs des CGAs et d'autres composés phénoliques tels que les lignines. Ces intermédiaires activés sont synthétisés à partir d'un acide hydroxycinnamique et du coenzyme A par la 4-coumarate CoA ligase (4CL) appartenant à la superfamille des enzymes formant des adénylates. Nicotiana tabacum 4CL2 a été utilisée pour la production d'esters et sa structure a été résolue par remplacement moléculaire. Deux gènes codant pour des hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransférases chez Coffea canephora ont été clonés. CcHCT et CcHQT, qui appartiennent à la superfamille des acyltransférases acyl-CoA-dépendantes, ont été surexprimées dans E. coli et purifiées à homogénéité. L'analyse par diffraction aux rayons X de cristaux de CcHCT a permis de déterminer sa structure par remplacement moléculaire. Un modèle a été dérivé par homologie de séquence pour CcHQT afin de proposer les déterminants de la préférence pour l'acide quinique ou shikimique. Des modélisations moléculaires ont été réalisées afin d'identifier les résidus potentiellement impliqués dans les intéractions enzyme-substrat. L'analyse par chromatographie liquide haute performance des réactions enzymatiques ont montré que ces enzymes sont capables de synthétiser l'acide 5-O-caféoylquinique mais aussi le diester 3,5-O-dicaffeoylquinique, qui est un composé majeur du grain de café avant mûrissement. La production de variants par mutagenèse dirigée a permis l'identification de résidus importants pour la catalyse des réactions de mono- et de diacylation. L'approche combinée de la biologie structurale et de l'enzymologie s'avère particulièrement utile pour mieux comprendre le rôle de HCT et HQT. / Chlorogenic acids (CGAs) represent a family of esters formed between a cinnamic acid derivative and quinic or shikimic acid. CGAs are secondary metabolites produced via the phenylpropanoid pathway by higher plants and are a major source of dietary antioxidants. Hydroxycinnamoyl-CoA esters are the precursors for CGAs and other phenolic compounds such as lignins. These activated intermediates are synthesized from a hydroxycinnamic acid and coenzyme A by 4-coumarate CoA ligase (4CL), which belongs to the adenylate-forming enzyme superfamily. Nicotiana tabacum 4CL2 was used to produce hydroxycinnamoyl-CoA esters and its structure was solved by molecular replacement. Two genes encoding hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferases from Coffea canephora were cloned. CcHCT and CcHQT, which belong to the acyl-CoA-dependent acyltransferase superfamily, were overexpressed in E. coli and purified to homogeneity. X-ray diffraction analysis of CcHCT crystals resulted in a structural solution by molecular replacement. A homology model was derived for CcHQT in order to propose some determinants of the preference for quinic or shikimic acid. Docking experiments were carried out in order to identify potential residues involved in enzyme-substrate interactions. High performance liquid chromatography analysis of enzymatic reactions showed that these enzymes are capable of synthesizing 5-O-caffeoylquinic acid but also the diester 3,5-O-dicaffeoylquinic acid, which is a major component of the coffee grain before ripening. The production of variants by site-directed mutagenesis enabled the identification of residues important for catalysis of the mono- and diacyltransfer reactions. The combined approach of structural biology and enzymology provides molecular insights into the role of HCT and HQT in CGA biosynthesis.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T13:14:34Z No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T13:14:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A eritropoetina (EPO) é um hormônio produzido, principalmente, pelos rins, que regula a produção de células vermelhas do sangue. Trata-se de uma glicoproteína com 166 aminoácidos, três sítios de N-glicosilação e um de O-glicosilação. Apresenta massa molecular na faixa de 30-34 kDa, sendo aproximadamente 40% correspondente aos glicídeos. A EPO está disponível como agente terapêutico produzido através da tecnologia do DNA recombinante em cultura de células de mamíferos. A EPO humana recombinante (rHuEPO) é usada para o tratamento de anemia associada à insuficiência renal crônica. Devido a relevância médica da rHuEPO, sua produção está sendo nacionalizada através do processo de transferência de tecnologia do Centro de Inmunología Molecular (CIM), de Cuba, para o Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos (Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. O controle de qualidade sobre o processo produtivo da rHuEPO e seu produto final é bastante rigoroso. Neste contexto, o mapeamento peptídico é um dos mais importantes ensaios usados no controle em processo da produção de proteínas recombinantes. Este ensaio assegura a integridade da estrutura primária das proteínas ao final das etapas de suas purificações. Sendo assim, o objetivo desta dissertação de mestrado foi definir uma metodologia de mapeamento peptídico da rHuEPO, visando o controle de processo da produção deste biofármaco em Bio-Manguinhos. Previamente, a preparação da rHuEPO fornecida pelo CIM foi avaliada quanto a sua homogeneidade e caracterizadapor eletroforeses em gel de poliacrilamida, cromatografia de fase reversa, cromatofocalização eespectrometria de massa. Para obter os peptídeos da rHuEPO, a hidrólise enzimática desta glicoproteína com a enzima tripsina foi avaliada em diferentes tempos de incubação e com relações enzima/substrato distintas. O fracionamento dos peptídeos foi feito por cromatografia líquida de fase reversa em coluna C18, empregando-se diferentes colunas cromatográficas e gradientes de eluição. As principais frações peptídicas isoladas da cromatografia de fase reversa foram analisadas por espectrometria de massa a fim de comprovar a identidade dos peptídeostrípticos da rHuEPO. A especificidade da metodologia desenvolvida foi avaliada através da comparação dos perfis peptídicos do hidrolisado tríptico da rHuEPO e do quimotripsinogênio A. A hidrólise tríptica usando-se relação enzima/substrato de 1/50 (p/p), concentração de rHuEPO de 1 mg/mL e incubação de 1 hora a 37o C hidrolisou mais de 99% da glicoproteína. As colunas cromatográficas de fase reversa Hi-Pore RP 318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 se mostraram aptas para o fracionamento dos peptídeos trípticos da rHuEPO. Em comparação à metodologia usada no CIM, o tempo de incubação de hidrólise foi reduzido em, pelo menos,2 horas e a duração da corrida cromatográfica para obtenção do mapa peptídico diminuiu em, pelo menos, 1 hora e 42 minutos. Na análise por espectrometria de massa das frações isoladas da cromatografia de fase reversa, seis peptídeos trípticos da rHuEPO foram observados. Tais frações peptídicas foram identificadas como pertencentes à EPO humana pelo programa Mascot Search Results. Dessa forma, ficou estabelecida uma metodologia de mapeamento peptídico especifica, simples e rápida para ser utilizada no controle em processo da produção da rHuEPO em Bio-Manguinhos. / Erythropoietin (EPO) is a hormone produced mainly by the kidney that regulates the production of red blood cells. It is a glycoprotein with 166 amino acids, three N-glycosylation and one O-glycosylation sites. It has a molecular weight in the range of 30-34 kDa, being approximately 40% of its content corresponding to carbohydrates. EPO is available as a therapeutic agent produced by recombinant DNA technology in mammaliancell culture. The recombinant human EPO (rHuEPO) is used to treat anemia associated with chronic renal disease. Due to rHuEPO medical relevance, its production technology is a subject of transference from the Centro de Inmunología Molecular(CIM), Cuba, to the Instituto de Tecnologia em Imunonobiologicos(Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. The quality control over production process of rHuEPO and its final product is quite rigorous. In this context, peptidemapping is one of the most important tests used in process control of recombinant proteins production. This test ensures the primary structure integrity of a protein after its purification processes. Thus, the objective of this dissertation was to define a methodology for peptide mapping of rHuEPO aiming to be used in the process control of this biopharmaceutical production in Bio-Manguinhos. Previously, the preparation of rHuEPO provided by CIM was characterized by polyacrylamidegel electrophoresis, reversed phase chromatography, chromatofocusing and mass spectrometry. In order to obtain rHuEPO peptides, the enzymatic hydrolysis of this glycoprotein with the enzyme trypsin was assessed at differents incubation times and enzyme/substrate ratio. Peptides fractionation was performed by reverse phase liquid chromatography, using distincts C18 columns and elution gradients. The main peptide fractions from reversed phase chromatography were analyzed by mass spectrometry to confirm the identity of rHuEPO tryptic peptides. The specificity of the developed methodology was evaluated by comparing peptides profiles from rHuEPO and Chymotrypsinogen A tryptic hydrolysates. The tryptic digestion using enzyme/substrate ratio of 1/50 (w/w), substrate concentration of 1 mg/mL and incubation for 1 hour at 37°C hidrolysated more than 99% of the glicoprotein. The reversed phase columns Hi-Pore RP318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 were able to fractionate the rHuEPO tryptic peptides. Compared to the methodology used in CIM, the hydrolysis incubation time was reduced by at least 2 hours and the chromatographic running time to obtain the peptide map was decreased by at least 1 hour and 42 minutes. The mass spectrometry analysis of the fractions isolated from reversed-phase chromatography showed six tryptic peptides of rHuEPO. These peptide fractions were identified as belonging to human EPO by the program Mascot Search Results. Thus it was established an specific, simple and fast peptide mapping methodology to use in process control of rHuEPO in Bio-Manguinhos.

O estudo teve como objetivo avaliar a razão de custo-efetividade, sob a perspectiva do Sistema Único de Saúde SUS, do tratamento da anemia de pacientes em Terapia Renal Substitutiva. Duas alternativas foram comparadas: um novo medicamento recentemente registrado no Brasil, o Ativador Contínuo de Receptor de Eritropoetina (Continuous Erythropoietin Receptor Activator), CERA, e outro, atualmente disponível no sistema de saúde brasileiro, a Eritropoetina Recombinante Humana - Epo-rHu. Métodos: Um modelo de Markov simulou o curso de uma coorte de pacientes em Terapia Renal Substitutiva tratados com CERA e Epo-rHu por quatro anos. A qualidade de vida associada ao uso dos medicamentos foi estimada de forma indireta, por meio de entrevista qualificada com os profissionais cuidadores, previamente submetida e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local. Foi realizada análise de sensibilidade no modelo proposto através da variação dos parâmetros: dose dos medicamentos, custo das estratégias, taxa de desconto e efetividade utilizados para sua construção. Resultados: A média da qualidade de vida atribuída aos pacientes tratados foi 6,3 para a Epo-rHu, 7,8 para o CERA e 9,3 para os pacientes transplantados. O modelo demonstrou que a estratégia mais custo-efetiva é a terapêutica com a Epo-rHu, com um custo por QALY de R$ 21.052,00. O custo incremental por QALY ganho associado ao CERA foi de R$ 72.974,00. Conclusão: A utilização mensal do medicamento CERA está associada à maior qualidade de vida quando comparada a Epo-rHu. No entanto, a terapia com o novo medicamento não se mostrou mais custo-efetiva frente ao tratamento com Epo-rHu / This study sought to determine the cost-effectiveness of anemia treatment in dialysis patients for Brazilian Public Health System. Two alternatives were compared: a new drug, the Continuous Erythropoietin Receptor Activator, CERA, recently registred in Brazil, and another one, provided nowadays by the National Health System, Epo-rHu (Recombinant Human Eythropoietin). Methods: A Markov cohort of dialysis patients treated with CERA and Epo-rHu for four years was used to perform the base case analysis. The model outputs were QALYs and costs. The quality of life associated with each drug was measured by interviews applied to health care professionals. These interviews were previously submitted and approved by the local ethics committee. A sensitivity analysis was applied to the model to test it, varying the values of drugs dosage, costs, discount rate and effectiveness. Results: The average quality of life assigned by health care professionals to the patients treated with Epo-rHu, CERA and to kidney transplant receptors were respectively 6,3, 7,8 and 9,3. The model showed that Epo-rHu treatment was more cost-effective than CERA treatment. The cost-effectiveness ratio of Epo-rHu therapy was R$ 21.052,00. In addition, the cost per QALY gained of CERA therapy was R$ 72.974,00. Conclusion: Anemia treatment with CERA is associated with improvement in quality of life compared to Epo-rHu therapy. However, the new drug is not more cost-effective than the drug provided by the Brazilian Public Health System

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Interleukin 11 (IL-11) is a multifunctional cytokine in the IL-6 type family of long-chain helical cytokines, which modulates the proliferation, differentiation and maturation of various types of hematopoietic cells. Recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) produced by DNA technology in Escherichia coli is currently being used worldwide for the prevention of thrombocytopenia and to reduce the need for platelet transfusions after myelosuppressive chemotherapy in patients with nonmyeloid malignancies. A stability-indicating reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) method was validated for the assessment of recombinant human interleukin-11 (rhIL-11) in biopharmaceutical formulations. The RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 25ºC. The mobile phase A consisted of 0.1% TFA and the mobile phase B was acetonitrile with 0.1% TFA, run as follows: time 0 to 0.1 min 40% of B; from 0.1 to 30 min linear up to 65% of B; from 30.01 to 31 min linear down to 40% of B, maintained up to 40 min. The flow rate was 1 mL/min, and using photodiode array (PDA) detection at 214 nm. Chromatographic separation was obtained with a retention time of 27.6 min, and was linear over the concentration range of 1 200 μg/mL (r2 = 0.9995). The limits of detection and quantitation were 0.34 and 1.12 μg/mL, respectively. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. The accuracy was 100.22% with bias lower than 1.25%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of the degraded products showed non-significant differences (p>0.05). The proposed method was applied to the assessment of rhIL-11 and related proteins in biopharmaceutical dosage forms, and the results were correlated to those of a bioassay, showing a higher mean difference of the estimated content/potencies of 2.60% for the RP-LC method, aiming to establish new alternatives to monitor stability, improve quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biological medicine. / A interleucina 11 (IL-11) é uma citocina multifuncional que pertence a família da interleucina- 6 e estimula a proliferação, diferenciação e maturação de células hematopoiéticas. A interleucina-11 humana recombinante (rhIL-11) é produzida pela tecnologia do DNA em Escherichia coli e é usada clinicamente para a prevenção de trombocitopenia grave e redução da necessidade de transfusão de plaquetas após quimioterapia mielossupressiva em pacientes com neoplasias malignas não mielóides. No presente trabalho foi desenvolvido e validado método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) para a avaliação de rhIL-11 em formulações de produtos farmacêuticos. Utilizou-se coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 25ºC. A fase móvel A foi constituída de TFA 0,1% e a fase móvel B de acetonitrila com 0,1% TFA, eluídas no seguinte gradiente: 0 0,1 min, 40% de B; 0,1 30 min, 40 65% de B; 30,01 a 31 min, 65 40% de B, mantendo-se nesta proporção até 40 min. Utilizou-se vazão de 1 mL/min e detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A eluição cromatográfica foi obtida no tempo de 27,6 min, sendo linear na faixa de concentração de 1 200 μg/mL (r2 = 0,9995). Os limites de detecção e quantificação foram 0,34 e 1,12 μg/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,20%, com bias inferior a 1,25%. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais não apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p>0,05). O método proposto foi aplicado para a avaliação da potência de rhIL-11 e de proteínas relacionadas em formulações farmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio, observando-se diferenças das médias de conteúdo/potência 2,60% superiores para o método por CL-FR. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.