O estudo teve como objetivo avaliar a razão de custo-efetividade, sob a perspectiva do Sistema Único de Saúde SUS, do tratamento da anemia de pacientes em Terapia Renal Substitutiva. Duas alternativas foram comparadas: um novo medicamento recentemente registrado no Brasil, o Ativador Contínuo de Receptor de Eritropoetina (Continuous Erythropoietin Receptor Activator), CERA, e outro, atualmente disponível no sistema de saúde brasileiro, a Eritropoetina Recombinante Humana - Epo-rHu. Métodos: Um modelo de Markov simulou o curso de uma coorte de pacientes em Terapia Renal Substitutiva tratados com CERA e Epo-rHu por quatro anos. A qualidade de vida associada ao uso dos medicamentos foi estimada de forma indireta, por meio de entrevista qualificada com os profissionais cuidadores, previamente submetida e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local. Foi realizada análise de sensibilidade no modelo proposto através da variação dos parâmetros: dose dos medicamentos, custo das estratégias, taxa de desconto e efetividade utilizados para sua construção. Resultados: A média da qualidade de vida atribuída aos pacientes tratados foi 6,3 para a Epo-rHu, 7,8 para o CERA e 9,3 para os pacientes transplantados. O modelo demonstrou que a estratégia mais custo-efetiva é a terapêutica com a Epo-rHu, com um custo por QALY de R$ 21.052,00. O custo incremental por QALY ganho associado ao CERA foi de R$ 72.974,00. Conclusão: A utilização mensal do medicamento CERA está associada à maior qualidade de vida quando comparada a Epo-rHu. No entanto, a terapia com o novo medicamento não se mostrou mais custo-efetiva frente ao tratamento com Epo-rHu / This study sought to determine the cost-effectiveness of anemia treatment in dialysis patients for Brazilian Public Health System. Two alternatives were compared: a new drug, the Continuous Erythropoietin Receptor Activator, CERA, recently registred in Brazil, and another one, provided nowadays by the National Health System, Epo-rHu (Recombinant Human Eythropoietin). Methods: A Markov cohort of dialysis patients treated with CERA and Epo-rHu for four years was used to perform the base case analysis. The model outputs were QALYs and costs. The quality of life associated with each drug was measured by interviews applied to health care professionals. These interviews were previously submitted and approved by the local ethics committee. A sensitivity analysis was applied to the model to test it, varying the values of drugs dosage, costs, discount rate and effectiveness. Results: The average quality of life assigned by health care professionals to the patients treated with Epo-rHu, CERA and to kidney transplant receptors were respectively 6,3, 7,8 and 9,3. The model showed that Epo-rHu treatment was more cost-effective than CERA treatment. The cost-effectiveness ratio of Epo-rHu therapy was R$ 21.052,00. In addition, the cost per QALY gained of CERA therapy was R$ 72.974,00. Conclusion: Anemia treatment with CERA is associated with improvement in quality of life compared to Epo-rHu therapy. However, the new drug is not more cost-effective than the drug provided by the Brazilian Public Health System

Novos marcadores genéticos foram caracterizados para jacaré-de-papo-amarelo (Caiman latirostris) pela construção de bibliotecas enriquecidas de DNA microssatélite. Um microssatélite foi desenvolvido a partir de uma biblioteca enriquecida de DNA microssatélite (ACC/TGG)n e 12 a partir de uma biblioteca enriquecida de DNA microssatélite (AC/TG)n. Esses marcadores foram testados em indivíduos da espécie Caiman latirostris e resultaram em sete novos microssatélites polimórficos. Adicionalmente quatro marcadores microssatélites de Alligator mississipiensis previamente transferidos para Caiman latirostris foram utilizados. Amostras de sangue jacarés-de-papo-amarelo originárias de várzeas associadas ao Rio Piracicaba e alguns de seus tributários no estado de São Paulo, Brasil, foram avaliadas quanto à variação genética entre populações e o parentesco entre indivíduos. Foi detectada variabilidade entre indivíduos originários de sitos diferentes, mesmo entre aqueles com pequena distância geográfica. Os resultados sugerem que os grupos amostrados em cada sítio são compostos predominantemente por indivíduos aparentados. Uma possível combinação de alta taxa de mortalidade e baixa taxa de natalidade pode ser a explicação do baixo número de indivíduos dispersos com sucesso por geração entre os sítios estudados. Esses marcadores podem auxiliar na compreensão dos processos metapopulacionais que aparentemente ocorrem na espécie. / New genetic markers were characterized for the broad-snouted caiman (Caiman latirostris) by constructing libraries enriched for microsatellite DNA. One microsatellite was developed from a (ACC/TGG)n enriched microsatellite DNA library and 12 from a (AC/TG)n enriched microsatellite DNA library. These markers were tested in Caiman latirostris individuals and resulted in seven new polymorphic microsatellites for the specie. Additionally four Alligator mississipiensis microsatellite markers previously transferred for Caiman latirostris were used. Samples from broad-snouted caimans from small wetlands associated with the Piracicaba River and some of its tributaries in the state of São Paulo, Brazil were used to study the genetic variation between populations and parentage between individuals. Genetic variability was detected among individuals from different sites, even those within a small geographic distance. The results suggest that the groups sampled at each site are composed predominantly of related individuals. A possible combination of high mortality and low natality rates in the fragmented Caiman latirostris populations may explain the low number of successfully dispersed individuals per generation observed between the sites studied. These markers might help to understand the metapopulation processes that are occurring within this species.

O grupo de organoclorados, Bifenilas Policloradas (PCBs) é de difícil degradação e persistente no meio ambiente, tendo sido associado a diversos problemas nos organismos devido ao potencial toxicológico. Biodegradação constitui uma ferramenta eficaz e barata para remoção destes contaminantes do ambiente. O isolado RHA1 (fcb) de Rhodococcus sp. foi geneticamente construído com a introdução do operon de degradação hidrolítica de 4-clorobenzoato (fcb) para evitar a formação de produtos tóxicos durante a degradação de ácidos clorobenzóicos. Com o intuito de se obter informações sobre o processo adaptativo do recombinante Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) em substratos contendo PCBs, foram feitos dois ensaios avaliando-se a sobrevivência e o crescimento deste isolado. Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) foi inoculado (104 células.g-1) em substrato turfoso previamente irradiado a 50 KGy, contendo ou não 200 mg.Kg-1 de bifenilo. Em outro ensaio, além do recombinante, as bactérias Escherichia coli e Arthrobacter sp. foram inoculados em sedimento coletado na região do Estuário de Santos, contendo PHAs e PCBs, também irradiado (50 KGy). O crescimento das bactérias em ambos os substratos foi monitorado através de contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs). Algumas colônias eram selecionadas aleatoriamente para extração de DNA, detecção do operon fcb através de amplificação por PCR e sequenciamento do gene 16S rRNA. Aumento no número de UFCs nos tratamentos inoculados com o recombinante foi observado até 150 dias no ensaio com substrato turfoso e 70 dias na amostra ambiental. Entretanto, houve queda no número de UFCs após os 10 dias nos tratamentos inoculados com E. coli e Arthrobacter sp. Os genes fcbA e fcbB do operon fcb foram detectados nas colônias isoladas dos tratamentos inoculados com o isolado RHA1 (fcb) em ambos os substratos. A análise das seqüências pertencentes às colônias isoladas do tratamento inoculado com o isolado RHA1 (fcb) feita através de BLAST nos sites do NCBI e Ribossomal Database Project, apresentou 99% de identidade com a seqüência do gene ribossomal 16S de Rhodococcus sp. isolado ZC–3 (AM076672.1). Somente as seqüências referentes ao tratamento inoculado com E. coli foram analisadas, as quais apresentaram 99% de identidade com a seqüência do gene ribossomal 16S de E. coli isolado K-12 MG 1655 (U00096.2). Estes resultados sugerem que Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) cresce na turfa irradiada (até 150 dias) na presença e ausência de PCB e nesta amostra de sedimento irradiada (até 70 dias), com aparente estabilidade do operon fcb durante este período e nestas condições. A possível presença dos genes fcbB e fcbA em bactérias nativas crescidas em meio K1 com ácido 4- clorobenzóico isoladas do sedimento antes da irradiação, sugere a presença de bactérias do local com potencial biodegradador deste composto. / The group of organochlorates Biphenyl Polychlorates (PCBs) is of difficult degradation and persistent in the environment, being associated to several problems in the organisms due to its toxicological potential. The isolate RHA1 (fcb) from Rhodococcus sp. was genetically built with the introduction of the operon of hydrolytic degradation 4-chlorobenzoate (fcb) to avoid the formation of toxic products during the degradation of chlorobenzoic acids. In order to obtain information about the adaptative process of the recombinant Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) in substrates containing PCBs, two essays were made evaluating the survival and growth of this isolate. Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) was inoculated (104 cells.g-1) in peat substrate previously irradiated with 50 kGy, with and without 200 mg.kg-1 of biphenyl. In another essay, besides of the recombinant, the bacteria Escherichia coli and Arthrobacter sp. were inoculated in soil, also irradiated (50 kGy), from the Estuário de Santos region containing PHAs and PCBs. The growth of the bacteria in both substrates was monitorated counting the Colony Forming Units (CFUs). Some colonies were selected randomly for DNA extraction, fcb operon detection through PCR, and sequencing of the 16S rRNA gene. Rising in the number of CFUs in the recombinant inoculated treatments was observed until 150 days in the essay with peat substrate, and until 70 days in the environmental sample. Nonetheless, there was a reduction in the number of CFUs after 10 days in the treatment inoculated with E. coli and Arthrobacter sp. The genes fcbA and fcbB from the operon fcb were detected in the isolated colonies of the treatments inoculated with the isolate RHA1 (fcb) in both substrates. The analysis of the sequences belonging to the colonies isolated from the treatment inoculated with the isolate RHA1 (fcb) through BLAST in the NCBI and Ribosomal Database Project sites showed 99% identity with the sequence of the gene 16S ribosomal from Rhodococcus sp. isolate ZC-3 (AM076672.1). Only the sequences referring to the treatment inoculated with E. coli were analyzed, which showed 99% identity with the sequence of the 16S ribosomal gene from E. coli isolate K-12 MG 1655 (U00096.2). These results suggest that Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) grows in the peat irradiated (until 150 days), in the presence and absence of PCB and in this irradiated sediment sample (until 70 days), with apparent stability of the fcb operon during this period and in these conditions. The possible presence of the fcbA and fcbB genes in native bacteria grown in K1 medium with 4-chlorobenzoate acid isolated from sediment before irradiation suggests the presence of native bacteria with biodegradation potential of this compound.

Toxoplasma gondii é um protozoário coccídio intracelular obrigatório conhecido por sua habilidade em parasitar uma ampla gama de espécies hospedeiras. A região apical do parasito é rica em organelas que, em função dos produtos liberados, estão envolvidas no processo de adesão e invasão da célula hospedeira. As proteínas liberadas por micronemas (MICs), solúveis e transmembrana, possuem domínios adesivos essenciais para a virulência do parasita. Algumas dessas proteínas são encontradas associadas entre si na superfície do taquizoíta, formando complexos como TgMIC1/MIC4/MIC6 e TgMIC3/MIC8. Em estudos anteriores demonstramos a que o subcomplexo TgMIC1/MIC4 (Fração LAC+) liga-se à lactose e estimula macrófagos a secretar IL-12. Verificamos, utilizando células HEK293 transfectadas, que um dos principais mecanismos responsáveis pela produção de IL-12 decorria do reconhecimento de N-glicanos do ectodomínio de TLR2 pelo domínio de reconhecimento de carboidrato de TgMIC1. O objetivo do presente estudo foi o de investigar a capacidade de TgMIC1 e TgMIC4 de ativar macrófagos murinos e qual o papel desempenhado por TLR2 e/ou TLR4 no desencadeamento dessa ativação. Mostramos que macrófagos derivados de medula óssea de camundongos C57Bl/6, estimulados com TgMIC1 e TgMIC4, utilizadas isoladamente ou em combinação, secretam altos níveis de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-?, IL-6, IL-12 e IL-1?, produzem altos níveis de óxido nítrico, e têm aumentadas suas capacidades migratória e fagocítica. Os ensaios que utilizaram macrófagos de camundongos C57Bl/6 nocauteados revelaram que a ausência de expressão de TLR2 ou de TLR4 prejudicou os efeitos ativadores exercidos por TgMIC1 e TgMIC4. Macrófagos TLR2-/- tiveram as manifestações de ativação celular significantemente reduzidas em relação aos macrófagos selvagens. Por outro lado, esses efeitos foram mais afetados pela ausência de TLR4, uma vez que as respostas obtidas frente ao estímulo com TgMIC1 ou TgMIC4 eram similares às verificadas em células não estimuladas (controle negativo). Concluímos que TgMIC1 e TgMIC4 interagem com os receptores do tipo toll 2 e 4 expressos por macrófagos, levando à ativação celular manifesta por alta produção de citocinas e outros mediadores inflamatórios, e aumento das capacidades migratória e fagocítica. A interação com TLR4 é preponderante em relação à estabelecida com TLR2 no desencadeamento de ativação celular / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular coccidian protozoan known for its ability to parasitize a wide range of host species. The parasite\'s apical region is rich in organelles that, because of the products it releases, are involved in the processes of adhesion and invasion of the host cell. The soluble and transmembrane proteins released by the micronemes (MICs), have adhesive domains that are essential for the parasite virulence. Some of these proteins can be found associated with each other on the taquizoite surface, as it is the case of TgMIC1/MIC4/MIC6 or TgMIC3/TgMIC8 complexes. Our group has demonstrated in previous studies that the TgMIC1/TgMIC4 subcomplex (LAC+ fraction) binds to lactose and stimulates macrophages to release IL-12. Using HEK293 transfected cells, we showed that one of the main mechanisms leading to IL-12 release by macrophages, was the recognition of N-glycans of the TLR2 ectodomain by the carbohydrate recognition domain of TgMIC1. Thus, the objective of this study was to address whether TgMIC1 and TgMIC4 activate murine macrophages and what is the role of TLR2 and TLR4 in macrophage activation. Our results show that the stimulation of C57BL/6 mice bone marrow derived macrophages with TgMIC1 and TgMIC4, alone or in combination, induce the release of high levels of proinflammatory cytokines such as TNF-?, IL-6, IL-12 and IL-1?, and also nitric oxide; and increases phagocytic activity and cell migration activity. The assays using knockout C57Bl/6 macrophages showed that the absence of TLR2 or TLR4 expression impaired the activating effects of TgMIC1 e TgMIC4. TLR2-/- macrophages presented significantly reduced cell activation manifestations compared to WT macrophages. On the other hand, these effects were more affected in the absence of TLR4, once the responses obtained with TgMIC1 or TgMIC4 stimulation were similar to those observed in non stimulated cells (negative control). We conclude that TgMIC1 and TgMIC4 interact with the receptors Toll like 2 and 4 expressed in macrophages, leading to cell activation, resulting in high cytokine and inflammatory mediators production, and increased migratory and phagocytic capacity. The interaction with TLR4 is predominant over that established with TLR2 in the triggering of cell activation

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-14T14:08:17Z No. of bitstreams: 1 Karin Florencio Lins de Paiva Fontes.pdf: 1183202 bytes, checksum: cd071de0a1543bbb031923846a82c239 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-14T14:08:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karin Florencio Lins de Paiva Fontes.pdf: 1183202 bytes, checksum: cd071de0a1543bbb031923846a82c239 (MD5) Previous issue date: 2013-01-19 / Equine Infectious Anemia (EIA), considered one of the most important viruses in horses in the world, is caused by a lentivirus of the Retroviridae family. It is a chronic infection without treatment, mainly prevalent in regions with hot and humid climate, favorable for transmission by blood-sucking insects. According to the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply (MAPA), the restriction of transit and slaughter of infected animals are the strategies for the control of EIA in Brazil, which causes losses in equine breeding. The official diagnosis of the disease is carried out by detection of circulating antibodies by Agar Gel Immunodiffusion (AGID) and ELISA. The p26 protein from EIAV is highly conserved and used in most diagnostic tests, since it induces a strong humoral response. The aim of this work was the production of a p26 recombinant protein in Escherichia coli for use in serologic tests. The p26 gene sequence was optimized with respect to E. coli codon usage, in order to maximize protein production, and was added with a marker sequence of six histidine residues (6xHis-tag) for later protein detection and purification. The sequence was synthesized and cloned downstream of the gene of a maltose binding protein (MBP2*) on the pMAL-c4X expression vector. The E. coli gene induction was performed by Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside and the resulting protein (MBP2*.p26mod) was detected by SDS-PAGE gel and Western blot with monoclonal anti-HIS. The MBP2*.p26mod was visualized as a 68.5 kDa band, the recombinant fusion protein was cleaved with factor Xa resulting in two bands of 42.5 and 26 KDa, corresponding to MBP2* and p26mod respectively. The MBP2*.p26mod purification was performed with affinity chromatography by nickel resin and yielded 78.12 mg/L of bacterial culture. The MBP2*.p26mod protein was intensely immunoreactive at AGID test where precipitation lines were observed only among the positive sera, including reference OIE serum, and the protein MBP2*.p26mod, showing high analytical sensitivity and specificity of the recombinant protein. / A Anemia Infecciosa Equina (AIE), considerada uma das viroses mais importantes em equinos no mundo, é causada por um lentivírus da família Retroviridae. É uma infecção crônica, sem tratamento, prevalente principalmente em regiões de clima quente e úmido, favorável à transmissão por insetos hematófagos. Segundo o Ministério da Agricultura e Pecuária e Abastecimento (MAPA), a restrição do trânsito e abate de animais infectados são as estratégias para o controle da AIE no Brasil, o que ocasiona perdas na equinocultura. O diagnóstico oficial da doença é realizado pela detecção de anticorpos circulantes através da imunodifusão em gel de Agar (IDGA) e de ELISA. A proteína p26 do vírus da AIE é altamente conservada e utilizada na maioria dos testes de diagnóstico, uma vez que induz uma forte resposta humoral. O objetivo com este trabalho foi a produção de uma proteína p26 recombinante em Escherichia coli para uso em testes diagnóstico sorológico. A sequência do gene p26 foi otimizada com relação aos códons preferenciais e ao conteúdo GC para uso em E. coli, a fim de maximizar a produção de proteínas, e foi adicionado à sequencia um marcador de seis resíduos de histidina (6xHis-tag) para posterior detecção e purificação protéica. A sequencia foi sintetizada e clonada a jusante do gene de uma proteína ligante de maltose (MBP2*) no vetor de expressão pMAL-c4X. A indução gênica da E. coli transformada foi realizada com isopropil β-D-tiogalactopiranosídeo e a proteína resultante (MBP2*.p26mod) foi detectada por SDS-PAGE em gel e Western blot com anticorpo monoclonal anti-HIS. A MBP2*.p26mod foi visualizada como uma banda de 68,5 kDa, a qual foi clivada com fator Xa resultando em duas bandas de 42,5 e 26 KDa, correspondentes à MBP2* e à p26mod respectivamente. A purificação MBP2*.p26mod foi realizada por cromatografia de afinidade com resina de níquel e foi obtido um rendimento de 78,12 mg/L de cultura bacteriana. A proteína MBP2*.p26mod foi intensamente imunoreativa no teste de IDGA, onde foram observadas linhas de precipitação únicas entre os soros positivos, inclusive o soro de referência OIE, e a proteína MBP2*.p26mod, demonstrando altas especificidade e sensibilidade analíticas da proteína recombinante.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-05-04T13:28:46Z No. of bitstreams: 1 Luis Eduardo Pereira de Andrade Ferreira.pdf: 1304369 bytes, checksum: 620d432e3b7c65dcc3630bba676e1517 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T13:28:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luis Eduardo Pereira de Andrade Ferreira.pdf: 1304369 bytes, checksum: 620d432e3b7c65dcc3630bba676e1517 (MD5) Previous issue date: 2014-08-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The efficiency of different biotechnologies applied to reproduction of the bovine female is closely related to the quality of ovulatory follicles. The recombinant bovine somatotropin (bST-r) has been described as stimulating follicle and oocyte. In this work we evaluated its influence on superovulatory response and embryo quality in Bos indicus cows, located at State of Pernambuco, Brazil.. Twenty cows, 10 in control group and 10 in treatment group (BST) were used. The animals in the BST group were treated with 500 mg of r-bST and controls with sterile saline solution every seven days totaling four applications until beginning of superovulation protocol (SOV). This began on a random day of estrous cycle considered D0, with the introduction of intravaginal Progesterone device (P4) combined with 2 mg of estradiol benzoate. At D4 it started follicular stimulation with 200mg of Follicle Stimulating Hormone in eight decreasing doses, with two daily applications. At D6 0.5 mg of cloprostenol was administered, with the P4 being removed in D7 and 24 hours after 1500 IU of Human Chorionic Gonadotropin was administered, and artificial insemination was performed 12 and 24 hours later. In D15 and 16 collections of embryos were carried out by non-surgical method, evaluated, classified and stored for later evaluation by fluorescence microscopy. All animals underwent monitoring of follicular dynamics in the days of treatment, collection and during the SOV protocol and collection of embryos; body condition score (BCS) was evaluated every seven days. The results were analyzed by ANOVA with a significance level of 5% . The BST group showed follicular diameter and number of follicles significante higher at some moments and it was seen a significant reduction of ECC (p<0.05). In other hand, only a numeric increase (p<0.05) was observed in the number of corpus luteum, total and viable embryos. It was observed a higher proportion of embryonic development stages more mature in BST group. So it was concluded that r-bST favors a strengthening of the SOV, however not targeting the ultimate goal, or a greater number of embryos, although numerically this occurred. Further study are necessary on application form and dosage used, based upon high variability of the results showed in other studies. / A eficiência das diferentes biotécnicas aplicadas à reprodução da fêmea bovina está intimamente relacionada à qualidade dos folículos ovulatórios. A somatotropina recombinante bovina (r-bST) tem sido descrita como estimuladora dos folículos e oócitos. Nesse trabalho avaliou-se sua influência na resposta superovulatória e na qualidade dos embriões de vacas Bos indicus, localizadas no agreste meridional de Pernambuco. Foram utilizadas 20 vacas, 10 no grupo controle e 10 no grupo tratamento (BST). Os animais do grupo BST foram medicados com 500 mg de r-bST e as controles com solução fisiológica estéril de sete em sete dias somando-se quatro aplicações até o inicio do protocolo de superovulação (SOV). Este se iniciou em dia aleatório do ciclo estral com a introdução do implante intravaginal de Progesterona (P4), associado a 2 mg de Benzoato de Estradiol, sendo considerado D0. No D4 se iniciou a estimulação folicular com 200 mg do Hormônio Folículo Estimulante, em oito doses decrescentes, com duas aplicações diárias. No D6 foi aplicado 0,5 mg de Cloprostenol, sendo a P4 retirado no D7 e 24 horas depois aplicado 1500 UI de Gonadotrofina Coriônica Humana, e inseminação feitas 12 e 24 horas depois. Nos D15 e 16 foram realizadas as coletas dos embriões, pelo método não cirúrgico, avaliados, classificados e armazenados para avaliação do total de células por fluorescência. Todos os animais passaram por acompanhamento da dinâmica folicular nos dias de tratamento, da coleta e durante o protocolo de SOV e coleta dos embriões, sendo avaliados de sete em sete dias o seu escore de condição corporal (ECC). Os resultados obtidos foram analisados por ANOVA com nível de significância de 5%. O grupo BST apresentou diâmetro folicular e número de folículos mais elevados em alguns momentos e redução do ECC (p<0,05), sendo observada elevação numérica (p>0,05) no número de corpos lúteos, embriões totais e viáveis, além de uma maior proporção de estádios embrionários mais maduros. Assim, conclui-se que o r-bST possivelmente potencializa os resultados da SOV, apesar de não atingir o objetivo final que seria um maior número de embriões, mesmo sendo visto nestas condições experimentais um aumento numérico dos mesmos. Mais estudos com relação a forma de aplicação e a dose utilizada são necessário, devido a alta variabilidade dos resultados.

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T22:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brito_VaniaNieto_D.pdf: 17655224 bytes, checksum: 75de87a92111468f9002287b57e1c7fe (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O timo e o local de maturacao dos linfocitos T que coordenam a resposta imune apos o reconhecimento de antigenos; apesar disso, torna-se alvo em diversas infeccoes. O P. brasiliensis, causador da paracoccidioidomicose, e capaz de invadir o timo e induzir atrofia deste orgao em animais experimentais. Neste estudo, foi analisada a influencia da virulencia fungica (cepas Pb18 e Pb265), da linhagem murina (A/J e B10.A) e de citocinas pro-inflamatorias (TNF e IFN-g) nesse fenomeno. As leveduras da cepa virulenta Pb18 persistiram no timo por um periodo maior e induziram alteracoes histopatologicas mais intensas, embora o isolado Pb265, de baixa virulencia, tambem tenha causado atrofia. O padrao de atrofia, caracterizado por perda de peso do orgao, aumento na taxa de apoptose e perda de delimitacao corticomedular foi semelhante nas duas linhagens, contudo os camundongos B10.A apresentaram tambem alteracoes quantitativas nas subpopulacoes de timocitos e linfocitos T esplenicos. A infeccao fungica também provocou a depressao da resposta proliferativa frente a ConA de timocitos e esplenocitos de camundongos B10.A por um periodo mais prolongado do que de animais da linhagem A/J. Em ambas as linhagens, a infeccao provocou aumento na porcentagem de linfocitos T esplenicos de fenotipo CD4+CD8+. Houve reducao no numero de celulas timicas positivas para TNF e IFN-g apos infeccao com o P. brasiliensis. Utilizando-se camundongos deficientes para o receptor p55 de TNF ou para a producao de IFN-g, verificou-se que o TNF medeia o aumento na apoptose de timocitos pos-infeccao enquanto a perda de peso e da delimitação corticomedular sao desencadeadas pelo IFN-g. Nossos resultados indicam que a atrofia timica observada na paracoccidioidomicose experimental envolve a interacao de fatores relacionados ao fungo e ao hospedeiro, que podem influenciar o curso da doenca / Abstract: Thymus is the site of T cells maturation that orchestrates specific immune response following antigen recognition. In spite of this, it can be a target during many infectious diseases. Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis, is able to invade the thymus inducing atrophy in experimental models. In this study, it was analyzed the influence of fungal virulence (Pb18 and Pb265 isolates), murine strain (A/J e B10.A) and proinflammatory cytokines (TNF e IFN-g) in this phenomenon. Yeasts from virulent strain Pb18 persisted for a larger period in the thymus and induced stronger histopathological alterations, although poorly virulent Pb265 also has induced thymic atrophy. The pattern of atrophy that embodied organ weight decreases, increases in the apoptotic levels and the loss of corticomedullary delimitation was similar in both strains. However, B10. A strain also presented quantitative changes in the thymic and splenic T cell subpopulations. This strain showed a decreased proliferative response of thymocytes and splenocytes to Concanavalin A for a larger period than A/J strain, as well. Both strains had augmentation in the percentage of splenic CD4+CD8+ T cells. There was reduction in the amount of cells positive to TNF and IFN-g in the thymus after infection with P. brasiliensis. By using mice deficient to production of IFN-g or to p55 receptor of TNF it was seen that the TNF mediates the increase of apoptosis that takes place in the thymus after the infection, whereas organ weight decreases and loss of corticomedullary delimitation are performed by IFN-g. Our results suggest that thymic atrophy observed during experimental paracoccidioidomycosis involves interaction of fungal and host related factors and, most probably, influences the course of disease / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / RESUMO A confirmaÃÃo diagnÃstica de leishmaniose visceral ou calazar à realizada atravÃs da detecÃÃo do parasito por mÃtodos diretos, atravÃs do encontro de formas amastigotas no interior de macrÃfagos ou monÃcitos, em aspirado esplÃnico, hepÃtico, medula Ãssea, histopatolÃgico de linfonodo e esfregaÃo do sangue perifÃrico, com ampla variaÃÃo de sensibilidade de acordo com o sÃtio pesquisado, constituindo-se o padrÃo-ouro a visualizaÃÃo de Leishmania sp. A pesquisa de anticorpos especÃficos para triagem diagnÃstica da leismaniose visceral atravÃs do ELISA, reaÃÃo de imunofluorescÃncia indireta e os testes de aglutinaÃÃo direta possuem sensibilidade alta e especificidade limitada pelas reaÃÃes cruzadas com tripanosomatÃdeos e micobactÃrias, incluindo-se tuberculose, hansenÃase, doenÃa de Chagas, e ainda, leishmaniose tegumentar e histoplasmose. O teste intradÃrmico de Montenegro à sempre negativo durante a fase ativa da doenÃa, e baseia-se na memÃria imunolÃgica dependente de linfÃcitos Th1. O ojetivo deste trabalho foi evidenciar a relevÃncia do teste rÃpido para detecÃÃo de anticorpo anti-leishmania chagasi utilizando o antÃgeno recombinante rK39 que apresentou sensibilidade de 99,2%. Foram realizados testes sorolÃgicos pelo ELISA que apresentou sensibilidade de 80%, e a reaÃÃo de imunofluorescÃncia indireta para calazar com sensibilidade de 82%. O gold-standard diagnÃstico empregado para todos exames foi a pesquisa microscÃpica direta do parasito no aspirado de medula Ãssea e a positividade foi de 71%, em uma pesquisa realizada em hospitais terciÃrios de Fortaleza-CE. A reaÃÃo imunoenzimÃtica para teste rÃpido em fita contendo antÃgeno rK39 apresentou elevada sensibilidade e especificidade permitindo diagnÃstico imediato e inÃcio precoce do tratamento, alÃm de confirmar alta densidade de epÃtopos exclusivamente para o gÃnero Leishmania, pois nÃo houve reaÃÃes cruzadas dentre vÃrias doenÃas testadas. Detectamos tÃtulos de anticorpos IgG anti-leishmania chagasi persistentemente positivos em pacientes tratados adequadamente para calazar, corroborando com evidÃncias de que o rK39 nÃo define doenÃa em atividade e nem estabelece critÃrios de cura, fortalecendo que outras possibilidades diagnÃsticas sejam investigadas mediante um resultado positivo em indivÃduo procedente de zona endÃmica para calazar, em paciente portador de hepatoesplenomegalia febril e pancitopenia. O teste rÃpido rk39 deverà ter sua leitura imediatamente relizada e interpretada em atà no mÃximo 10 minutos, objetivando tomada de decisÃes clÃnicas, e que sua implantaÃÃo como mÃtodo auxiliar de diagnÃstico deveria fazer parte da rotina laboratorial, particularmente de serviÃos secundÃrios e terciÃrios de saÃde em regiÃes endÃmicas para leshmaniose visceral. / ABSTRACT The visceral leishmaniasis diagnostic confirmation or Kala-azar is performed by detection of the parasite through direct methods of amastigotes within macrophages or monocytes, spleen aspirated, hepatic, bone marrow, lymph node histopathological and peripheral blood smear, with wide variation in sensitivity in accordance with the site searched, being the gold standard of Leishmaniasis sp . The specific antibodies for diagnostic of visceral leishmaniasis by ELISA, indirect immunofluorescence reaction and direct agglutination tests have high sensitivity and specificity cross reactions with limited by trypanosomatids and mycobacterium, including tuberculosis, leprosy, Chagas disease , leishmaniasis cutaneous and histoplasmosis. The Montenegro intradermal test is always negative during the active phase of the disease, and is based on immune memory bound on lymphocyte Th1. The purpose of this work was to highlight the importance of quick test for the detection of antibody anti-leishmania chagasi using recombinant rK39 antigen that presented sensitivity of 99.2%. There were serological by ELISA tests that presented sensitivity of 80%, and the indirect immunofluorescence reaction to Kala-azar with sensitivity of 82%. The gold-standard diagnosis made for all examinations was the direct microscopic search on parasite bone marrow aspirated and positivity was 71%, in a survey in tertiary hospitals in Fortaleza-CE. The immunoenzymatic reaction to quick test in tape containing rK39 Antigen has high sensitivity and specificity allowing immediate diagnosis and in the early beginning of treatment, in addition to confirm high-density epitopes exclusively for the Leishmaniasis genus, because there was no cross reactions among several diseases tested. We found evidence of IgG anti-leishmaniasis chagasi antibodies persistently -positive in patients treated appropriately for kala-azar, supporting with evidence that rK39 does not define disease activity and establishes criteria for cure, strengthening that other homogenizing are investigated by a positive result in individual from endemic area of Kala-azar, in disease carrier of febrile hepatosplenomegaly and pancytopenia . The quick test Rk39 must be read and interpreted immediately up to a maximum of 10 minutes driving clinical decision-making, and that its deployment as diagnostic helper method should be part of the laboratorial routine services, particularly in secondary and tertiary health endemic regions of visceral leshmaniasis . Keywords: American visceral leishmaniasis. Kala-azar. Recombinant K39 Antigen. Kala-azar through rK39 antigen diagnostic.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-12-15T16:53:37Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Augusto Pereira - 2004.pdf: 6566857 bytes, checksum: 144c5557e8a138c6a21c528ad0262aa8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-12-15T17:01:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Augusto Pereira - 2004.pdf: 6566857 bytes, checksum: 144c5557e8a138c6a21c528ad0262aa8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-15T17:01:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Augusto Pereira - 2004.pdf: 6566857 bytes, checksum: 144c5557e8a138c6a21c528ad0262aa8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2004-05-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / An antigen of Paracoccidioides brasiliensis (Pb) was gel isolated and characterized. Endoproteinase Lys-C digested peptides of the purified protein which presented, molecular mass of 29-kDa and pI of 5.8, were subjected to sequence analysis of its amino acids. Search at databases comparing the sequence of amino acids from the three peptides of the native protein, revealed strong homology to triosephosphate isomerase (TPI: E.C. 5.3.1.1) from several sources. The complete cDNA and gene encoding PbTPI were obtained and both contained an open reading frame predicted to encode a 249 amino acid protein that presented all the peptides characterized in the native PbTPI. The Pbtpi gene contained 6 exons interrupted by 5 introns. Analysis performed with the deduced PbTPI suggested its usefulness in providing phylogenetic relatedness, as well as evidenced the correlation between the phylogeny provided by the deduced proteins and introns positions in the cognate genes. The immunological reactivity of PbTPI was examined. The complete coding cDNA of PbTPI was over expressed in an Escherichia coli host to produce high levels of recombinant fusion protein with glutathione S-transferase (GST) that has been purified by affinity chromatography. The purified recombinant TPI was recognized by sera of patients with confirmed Paracoccidioidomycosis and not by sera of healthy individuals. Thus, recombinant PbTPI can be a valuable addition to the still small arsenal of P. brasiliensis immunoreactive proteins, which could be tested for incorporation in assays for serodiagnosis of the disease. / Um antígeno de Paracoccidioides brasiliensis (Pb) foi isolado do gel e caracterizado. Os peptídeos digeridos por Endoproteinase Lys-C da proteína purificada, que apresentou uma massa molecular de 29-kDA e pI de 5.8, foram submetidos à análise da seqüência de aminoácidos. Uma busca em bancos de dados de seqüências de aminoácidos comparados com os três peptídeos da proteína nativa revelou forte homologia com triose fosfato isomerase (TPI: E.C. 5.3.1.1) de vários organismos. O cDNA e o gene completos que codificam para PbTPI foram obtidos, e ambos contém uma provável ORF que codifica para uma proteína com 249 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbTPI nativa. O gene Pbtpi apresentou 6 exons interrompidos por 5 introns. Análises realizadas com a PbTPI deduzida sugerem sua utilidade em prover relações filogenéticas, como também evidenciou a correlação entre a filogenia gerada pelas proteínas deduzidas e as posições dos introns nos genes cognatos. A reatividade imunológica da PbTPI foi examinada. O cDNA completo que codifica para PbTPI foi altamente expresso no hospedeiro Escherichia coli, produzindo altos níveis de uma proteína recombinante fundida a glutathione S-transferase (GST), que foi purificada por cromatografia de afinidade. A TPI recombinante purificada foi reconhecida por soros de pacientes com paracoccidioidomicose confirmada e não por soros de indivíduos saudáveis. Assim, PbTPI recombinante pode ser uma adição valiosa para o pequeno arsenal de proteínas imunoreativas de P. brasiliensis, que poderiam ser testadas por incorporação em ensaios de sorodiagnóstico da doença.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dis Bruna D de S Silva 2010.pdf: 942780 bytes, checksum: 696823192ee17b463193f279bf7aed38 (MD5) Previous issue date: 2010-11-19 / Tuberculosis (TB) is a disease that afflicts mankind catastrophically, causing millions of new cases and deaths worldwide. It is estimated that one third of the world population is infected with the TB bacillus, Mycobacterium tuberculosis. Currently, the major challenges in TB control are the iden-tification of latent individuals, who are have increased chances to become ill, and the effective treat-ment of individuals with active disease. Understanding the immunology of this disease is of crucial importance for the development of new diagnostic tests and vaccines to combat this disease effec-tively. In order to elucidate the cellular immune response in tuberculosis, we evaluated the subpopu-lations of TCD4+ Th1, Th17 and T regulatory cells of patients with active pulmonary tuberculosis and rheumatoid arthritis against the recombinant antigen GLcB of M. tuberculosis. Peripheral blood mononuclear cells were obtained from twenty one patients with active pulmonary tuberculosis, re-cruited at Anuar Auad Hospital, twenty five patients with rheumatoid arthritis (RA), eleven individu-als with latent tuberculosis (TST+) and twelve healthy subjects (TST-). These cells were cultured, stimulated with antigen recombinant GLcB and Th1, Th17 and T regulatory subsets cells were eva-luated by flow cytometry. It was found that patients with active pulmonary tuberculosis have a high-er response of Th1 (8.2&#61617;1.9), Th17 (3.92.1) and T regulatory (2.81.2) antigen-specific recombi-nant GLcB when compared with individuals with latent infection (Th17=2.81.3; Treg=3.11.2) and healthy controls (Th17=1.40.8; Treg=0.60.3). Individuals with latent infection have only a signifi-cant percentage of Th1 cells specific (4.61.1) to GLcB when compared to controls (1.71.0). RA Patients that developed tuberculosis had immune response similar to those with only TB. Given these results, we conclude that the Th1 cells, Th17 and regulatory T cells are directly involved in active disease. / A Tuberculose (TB) é uma doença que atinge a humanidade de forma catastrófica, causando milhões de casos novos e de mortes no mundo todo. Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada com o bacilo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Atualmente, os principais desafios no controle da TB são: a identificação dos indivíduos latentes, que são os principais indivíduos com potencial desenvolvimento da doença e o tratamento efetivo dos indivíduos com doença ativa. O entendimento da resposta imunológica nessa doença é de crucial importância para o desenvolvimen-to de novos testes diagnósticos e novas vacinas para combater de forma efetiva essa enfermidade. Com o intuito de elucidar a resposta imune celular envolvida no desenvolvimento da tuberculose ativa, avaliamos as subpopulações de células TCD4+ Th1, Th17 e T reguladoras de pacientes com tuberculose pulmonar e pacientes com artrite reumatóide ativa frente ao antígeno recombinante GLcB do M. tuberculosis. Foram obtidas células mononucleares do sangue periférico de vinte e um pacientes com tuberculose pulmonar ativa, recrutados no Hospital de Doenças Tropicais Anuar Au-ad, vinte e cinco pacientes com artrite reumatóide, onze indivíduos com tuberculose latente (PT+) e doze indivíduos saudáveis (PT-). Estas células foram cultivadas, estimuladas com o antígeno recom-binante GLcB e as subpopulações Th1, Th17 e T reguladoras foram avaliadas através da análise das citocinas IFN-&#61543;, IL-17 e TGF-&#61538; e IL-10, respectivamente, por citometria de fluxo. Constatou-se que pacientes com tuberculose pulmonar ativa apresentam maior resposta de células Th1 (8.2&#61617;1.9), Th17 (3.92.1) e T reguladoras (2.81.2) específicas ao antígeno recombinante GLcB quando comparados com indivíduos com infecção latente (Th17=2.81.3; Treg=3.11.2), e controles saudáveis (Th17=1.40.8; Treg=0.60.3). Indivíduos com infecção latente apresentam somente porcentagem significativa de células Th1 (4.61.1) específicas ao GLcB quando comparado aos controles (1.71.0). Pacientes com AR não apresentaram diferença significativa na porcentagem destas células quanto à classificação em PT+ e PT-. Porém, pacientes com AR que desenvolveram tuberculose a-presentaram resposta semelhante aos pacientes com TB. Diante destes resultados, podemos concluir que as células Th1, Th17 e T reguladoras estão diretamente envolvidas na doença ativa.