Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-04-01T20:41:57Z No. of bitstreams: 2 Tese - Mônica Canêdo Silva Maia - 2015.pdf: 2190840 bytes, checksum: b52ab9d3f319bc193309f78f9ef2e243 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-04T11:56:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Mônica Canêdo Silva Maia - 2015.pdf: 2190840 bytes, checksum: b52ab9d3f319bc193309f78f9ef2e243 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-04T11:56:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Mônica Canêdo Silva Maia - 2015.pdf: 2190840 bytes, checksum: b52ab9d3f319bc193309f78f9ef2e243 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-12-03 / Controlled ovarian stimulation has become an integral part of infertility treatment. Treatment options with recombinant gonadotrophins add more to knowledge on folliculogenesis and ovarian steroidogenesis. The role of recombinant luteinizing hormone is controversial undergoing ovarian stimulation and has been widely debated. Objective: To compare the effects of supplementation with recombinant luteinizing hormone (rLH) for controlled ovarian stimulation with recombinant follicle stimulating hormone (rFSH) in a protocol with GnRH-antagonist in cycles of IVF/ICSI. Methods: Case-control study with 113 patients attended at a university center in the city of Goiania, aged between 34-42 years, who were divided into two groups according to an ovarian stimulation scheme: Group I (n= 60): rFSH (control group) and Group II (n= 53): rFSH + rLH (treated group). These groups were comparable for age, BMI, duration of infertility, serum FSH, LH and estradiol. Numbers of oocytes collected and in metaphase II, fertilization rate, embryos rate and rates of chemical and clinical pregnancy were analyzed. Data analysis was conducted using the statistical software BioStat ® 5.3. Differences in proportions were assessed by chi-square test and means by Wilcoxon Mann- Whitney test. P < 0,05 was considered statistically significant. Results: The mean age of patients in Group I was 37.3±2.1 years and Group II 37.9±2.4 years (P > 0.05). The comparability of the other main characteristics (duration of infertility, BMI, FSH, LH and basal estradiol) were also observed between Groups I and II (P > 0.05). There was no significant difference between the two groups regarding: number of oocytes retrieved (Group I= 4.9 ± 2.1, Group II= 5.7 ± 2.6, P= 0.061), number of oocytes in metaphase II (Group I= 3.4 ± 1.6, Group II= 4.0 ± 1.9, P= 0.060), fertilization rate (Group I= 65.3%, Group II= 69.4 %, OR 1.20, 95% CI 0.85-1.70, P= 0.282), embryos rate (Group I= 85.4%, Group II= 88.5%, OR 1.31, 95% CI 0.73-2.36, P= 0.355), rate of chemical pregnancy (Group I= 20.0%, Group II= 24.5%; OR 1.30, 95% CI 0.53-3.16, P= 0.562) and clinical pregnancy rate (Group I= 20.0%, Group II= 22.6%, OR 1.17, 95% CI 0.47-2.89, P= 0.731). Conclusion: In this study it was concluded that supplementation with r-LH showed no benefit with respect to variables during controlled ovarian stimulation with GnRH antagonists. / A estimulação ovariana controlada tornou-se parte integrante no tratamento da infertilidade. As opções de tratamento com gonadotrofinas recombinantes adicionaram mais conhecimento da foliculogênese e esteroidogênese ovariana. O uso do hormônio luteinizante recombinante é controverso em pacientes que passam por estimulação ovariana e tem sido amplamente debatido. Objetivo: Comparar os efeitos da suplementação de LHr para a estimulação ovariana controlada com FSHr em um protocolo com antagonista de GnRH em ciclos de FIV/ICSI. Métodos: Estudo caso-controle com 113 pacientes atendidas em um centro universitário na cidade de Goiânia, idade entre 34 a 42 anos, as quais foram divididas em dois grupos de acordo com a estimulação ovariana: Grupo I (n= 60): FSHr (grupo controle) e Grupo II (n= 53): FSHr + LHr (grupo tratado). Estes grupos foram comparáveis para idade, IMC, duração da infertilidade, níveis séricos de FSH, LH e estradiol. Foram analisados número de ovócitos coletados e em metáfase II, taxa de fertilização, taxa de clivagem embrionária, taxas de gravidez química e clínica. A análise de dados foi realizada pelo programa estatístico Bioestat 5.3®. As diferenças de proporções foram avaliadas por teste de Qui-quadrado e as médias pelo teste Wilcoxon Mann-Whitney. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Resultados: A média de idade das pacientes do Grupo I foi 37,3 ± 2,1 anos e do Grupo II de 37,9 ± 2,4 anos (p > 0,05). A comparabilidade das outras principais características (duração da infertilidade, índice de massa corporal, FSH, LH e estradiol basal) foram também observadas entre os Grupos I e II (p > 0,05). Não houve diferença significativa entre os dois grupos em relação ao: número de ovócitos captados (Grupo I= 4,9 ± 2,1; Grupo II= 5,7 ± 2,6; p= 0,061), número de ovócitos em metáfase II (Grupo I= 3,4 ± 1,6; Grupo II= 4,0 ± 1,9; p= 0,060), taxa de fertilização (Grupo I= 65,3%; Grupo II= 69,4%; OR 1,20; IC 95% 0,85-1,70; p= 0,282), taxa de clivagem embrionária (Grupo I= 85,4%; Grupo II= 88,5%; OR 1,31; IC 95% 0,73-2,36; p= 0,355), taxa de gravidez química (Grupo I= 20,0%; Grupo II= 24,5%; OR 1,30; IC 95% 0,53-3,16; p= 0,562) e taxa de gravidez clínica (Grupo I= 20,0%; Grupo II= 22,6%, OR 1,17; IC 95% 0,47-2,89; p= 0,731). Conclusão: Neste estudo concluiu-se que a suplementação com LHr não demonstrou benefício em relação às variáveis analisadas durante a estimulação ovariana controlada com antagonistas de GnRH.

O sistema de expressão em Escherichia coli foi o primeiro a ser utilizado para produzir produtos farmacêuticos recombinantes e tem muitas vantagens quando comparado com sistemas eucarióticos, como o fácil cultivo, baixo custo e alto potencial de produção. O fator estimulador de colônias de granulócito (G-CSF) atua principalmente promovendo a maturação dos neutrófilos e estimulando sua atividade fagocítica e quimiotática, além de estar envolvido com o processo de segmentação nuclear dessas células. O fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (rhG-CSF) tem sido produzido por engenharia genética em Escherichia coli, e é usado no tratamento de diversas patologias, sobretudo em neutropenias provocadas pela quimioterapia usada no tratamento de tumores, pela radioterapia e pelo uso de drogas que suprimem a produção de células mieloides. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo a expressão da proteína rhGCSF em bactérias Escherichia coli. A clonagem do gene rhG-CSF no vetor de expressão pET-28a(+) foi realizada nos sítios de restrição das enzimas EcoRI e XhoI, e a expressão da proteína recombinante em cepas de bactéria Escherichia coli BL21DE3 foi obtida com sucesso. A proteína rhG-CSF, fundida à cauda de seis histidinas, foi purificada com êxito e identificada pelas técnicas de Western Blotting e por espectrometria de massas. São necessários estudos para avaliar a integridade estrutural e atividade biológica da proteína produzida, que se confirmada, possibilita que esta seja produzida em escala piloto. / The expression system in Escherichia coli was the first to be used to produce recombinant pharmaceuticals and has many advantages compared to eukaryotic systems, such as easy cultivation and high production potential at low costs. The granulocyte colony (G-CSF) stimulating factor acts primarily by promoting the maturation of neutrophils and stimulating their phagocytic and chemotactic activity. G-CSF is also involved with the process of neutrophils nuclear segmentation. The recombinant human granulocyte colonies stimulating factor (rhG-CSF) has been produced by genetic engineering in Escherichia coli, and it is used to treat of several conditions, especially neutropenia caused by chemotherapy used in the treatment of tumors, by radiotherapy and by the use of drugs that suppress the production of myeloid cells. The present study aimed the expression of rhG-CSF protein in Escherichia coli bacteria. The cloning of rhG-CSF gene in the expression vector pET- 28a (+) was carried out on the restriction sites of the EcoRI and XhoI enzymes. Expression of the recombinant protein in Escherichia coli BL21DE3 was successfully achieved. The rhG-CSF protein, fused with a six histidine tag, was obtained and successfully purified and identified by the Western Blotting and by mass spectrometry techniques. Studies are needed to assess the structural integrity and biological activity of the protein produced, which, if confirmed, enables the production on a pilot scale.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:23:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Adilson Bosetto 2015 PDF.pdf: 2419034 bytes, checksum: 3fdc9e711199e04fe0746f89b07c4bea (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / The application of enzymes in industrial processes, in its broad sense, has shown the market evolution for innovative alternatives for preserving the environment. Brazil has a great potential to develop some technologies, which allow the use of such materials as substratum for products with higher added value, due to the large amount of lignocellulose as waste that comes from agriculture. Therefore, the analysis of genes expression related to microbial degradation of plant cell wall has caught the researchers attention, mainly because it is associated to the possibility of controlled large-scale synthesis of enzymes applied in biofuel production. In this context, the Gram-negative bacterium C. crescentus is found as a promising microorganism for biotechnological exploitation due to its ability on degrading xylan, the major component of plant hemicellulose. There are several genes in the bacterial genome that codify to Xylanases and &#946;-Xylosidases. In order to purify and biochemically characterize the &#946;-Xylosidase III protein of C. crescentus, xynB3 gene (CCNA_00856) that contains 1,623 nucleotides and encodes a protein with conserved domains of &#946;-Xylosidase with 540 amino acid residues has been studied. Therefore, xynB3 gene was isolated from genomic DNA of C. crescentus NA1000 by Polymerase Chain Reaction (PCR) using specific primers. The single amplification product was cloned into pJet1.2Blunt vector in non-cohesive sites and reintroduced in vector of pTrcHisA expression within the reading frame to produce a histidine tag at the amino-terminus area of fusion protein. The obtained construction was denominated pTrcHis-xynB3 and the confirmation of its gene identification was figured out by the DNA sequence after insertion into the TOP10 E. coli strain and subsequent experimental tests of expression in different temperature of growth, IPTG concentrations and induction times. The recombinant protein was overexpressed into inclusion bodies, thus, in a non-soluble form. Different induction and purification protocols were used to obtain the &#946;-xylosidase III pure of C. crescentus, in native or non-native form. However, assays of enzymatic activity with different substrates neither demonstrated &#946;-xylosidase activity nor detectable levels of the protein. These results suggest that the enzyme was not active during the assays, due its expression in inclusion bodies. This suggests that this protein may have a toxic effect on E. coli when expressed at high levels. Thus, this trial contributes to additional data about the xylanolytic complex concerning the aquatic bacterium C. crescentus. / A utilização de enzimas em processos industriais, no seu sentido mais amplo, demonstra a evolução do mercado em relação a alternativas inovadoras de preservação do meio ambiente. Devido à grande quantidade de material lignocelulósico residuário, proveniente da agricultura, o Brasil é um país com elevado potencial para o desenvolvimento de tecnologias que possibilitem a utilização desses materiais como substrato para produtos de maior valor agregado. Dessa forma, o estudo da expressão de genes microbianos relacionados com a degradação da parede celular vegetal tem despertado a atenção de pesquisadores, principalmente pelo fato de estar relacionado com a possibilidade de síntese controlada e em larga escala de enzimas utilizadas na produção de biocombustíveis. Neste contexto, a bactéria gram-negativa Caulobacter crescentus encontra-se como um microrganismo promissor para a exploração biotecnológica em função da capacidade que tem de degradar o xilano, principal componente hemicelulósico das plantas. Essa bactéria contém em seu genoma vários genes que codificam para xilanases e &#946;-xilosidases. Dentre eles o gene xynB3 (CCNA_00856), que apresenta 1623 nucleotídeos e codifica uma proteína contendo domínios conservados de &#946;-xilosidase, com 540 resíduos de aminoácidos, denominada neste trabalho como &#946;-xilosidase III de C. crescentus. Com o objetivo de possibilitar em estudos futuros a caracterização bioquímica dessa proteína, foi estudado o gene xynB3. Para isso, xynB3 foi isolado a partir do DNA genômico de C. crescentus NA1000 por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando oligonucleotídeos específicos. O único produto de amplificação foi clonado no vetor pJet1.2blunt em sítios não coesivos e reintroduzido no vetor de expressão pTrcHisA dentro do quadro de leitura para a produção de uma cauda de histidinas na região amino-terminal da proteína de fusão. A construção obtida foi denominada pTricHis-xynB3 e após confirmação da identidade da mesma por sequenciamento de DNA foi inserida na cepa TOP10 de Escherichia coli e submetida a ensaios experimentais de expressão com diferentes temperaturas de crescimento, concentrações de IPTG e tempos de indução. A proteína recombinante foi super-expressa em corpos de inclusão, portanto, em uma forma não solúvel. Diferentes protocolos de indução e purificação foram empregados para obtenção da &#946;-xilosidase III de C. crescentus pura, em forma nativa ou não nativa. Entretanto, nos ensaios de atividade enzimática, com diferentes substratos, foram obtidos níveis de atividade de &#946;-xilosidase não detectáveis pelas ferramentas utilizadas. Esses resultados sugerem que a enzima não se mostrou ativa durante os ensaios, em função da formação de corpos de inclusão. Isso leva a crer que essa proteína pode apresentar efeito tóxico para E. coli quando expressa em níveis elevados. Assim, este trabalho contribui com dados adicionais a cerca do complexo xilanolítico da bactéria aquática C. crescentus.

Orientadores: Luciana Lasry Benchimol Reis, Matthew Ward Blair / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:28:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BrinezRodriguez_Boris_D.pdf: 6826443 bytes, checksum: 0422d2a5e7a57388d0cc9defcf04a3f2 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma cultura importante economicamente tanto para o consumo nacional como para a exportação. A seca é um dos principais estresses abióticos em todo o mundo e afeta cerca de 60% da área de cultivo de feijão. O avanço nas tecnologias de marcadores moleculares oferecem poderosos métodos para examinar as relações entre as características, gerando um grande volume de informações potencialmente úteis para assessorar os programas de melhoramento. O presente projeto teve como objetivo o desenvolvimento da Plataforma DArT para feijão comum junto à empresa DArT Pty Ltd, e o mapeamento destes marcadores juntamente com microssatélites e SNPs na população AND 277 x SEA 5 proveniente do CIAT (Colômbia), a fim de localizar os QTLs associados à tolerância à seca. O genitor SEA 5 é uma linhagem avançada do BAT 477, é tolerante à seca e de origem Mesoamericano e o genitor AND 277 é um genótipo resistente à mancha angular e antracnose e de origem Andina. Um total de 4.468 marcadores DArTs, 288 marcadores SNPs e 180 marcadores microssatélites polimórficos foram identificados na população e utilizados na genotipagem para construir um mapa genético saturado. A fenotipagem das 105 linhagens endogâmicas recombinantes (RILs) na geração F8 mais os dois genitores foi realizada avaliando 18 características associadas à tolerância a seca utilizando um delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições, aplicando um estresse terminal na fase vegetativa V3/V4. Dois mapas foram construídos, um integrando 80 SSR e 251 SNPs e outro com cinco SSR, 91 SNPs e 4.468 DArTs. A identificação dos QTLs foi realizada através da análise de mapeamento por intervalo composto (CIM) para o mapa SSR - SNPs e mapeamento de precisão (SML) para o mapa SSR-SNPs-DArT. Um total de 12 QTLs foram identificados para o tratamento não irrigado e 29 QTLs para o tratamento irrigado pela análise CIM. Para as análises SML, 23 QTLs foram identificados para o tratamento não irrigado e 11 QTLs para o irrigado. QTLs de maior efeito foram encontrados para clorofila, biomassa fresca do caule e da folha, Massa seco da folia, temperatura da folha, número de vagens, número de sementes, massa de sementes, dias para florescimento, massa seca das vagens e produtividade nos dois tratamentos. Todos os QTLs detectados sob condições de seca apresentaram o alelo do genitor SEA 5. Este estudo é importante para o melhoramento genético não só para entender melhor a herança genética de uma característica tão complexa como a tolerância à seca, bem como para encontrar ferramentas moleculares a serem utilizados para a seleção assistida por marcadores / Abstract: Common bean (Phaseolus vulgaris L.) is the most important food legume for consumption and for exportation. Drought is one of the main abiotic stresses in the world and affects about 60% of bean growing area across the world. The advance in technologies of molecular markers provide a powerful method to examine the relationships between traits, generating large amount of potentially useful information to assist the breeding programs. The objective of this project was the development of DArT platform for common beans with DArT Pty Ltd and the mapping of these markers with microsatellites and SNPs in the population AND 277 x SEA 5 from CIAT (Colombia), in order to locate the QTLs associated with drought tolerance. The SEA 5 parent is a drought tolerant advanced line (Mesoamerican) and the AND 277 is resistant to the angular leaf spot and antracnose (Andean). A total of 4.468 DArT markers, 288 SNP and 180 SSR polymorphic markers were identified in the population and used in genotyping to constructed a saturated genetic map. Phenotyping of 105 recombinant inbred lines (RILs) in F8 generation plus the genitors were performed evaluating 18 traits associated with drought tolerance using a completely randomized design with four replicates, applying terminal stress at vegetative phase V3/V4. Two maps were constructed, one integrating 80 SSR and 251 SNPs and another with five SSR, 91 SNPs and 4,468 DArTs. The identification of QTL analysis was performed by composite interval mapping (CIM) for the SSR - SNPs map and the precision mapping (SML) to map DArT-SSR-SNPs. A total of 12 QTLs were identified for the non-irrigated treatment and 29 QTLs for the irrigated treatment by CIM analysis. For SML analysis, 23 QTLs were identified for the non-irrigated and 11 QTLs for irrigated treatment. QTLs of major effect was found for chlorophyll, fresh biomass of stem and leaf dry weight, leaf temperature, number of pods, number of seeds, seed weight, days to flowering, dry weight of pods and yield in both treatments. All QTLs detected under dry conditions showed the allele of parent SEA 5. This study is important for genetic improvement not only to better understand the genetic inheritance of a trait as complex as drought tolerance, as well as to find molecular tools to be used for marker assisted selection / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_samuel_felix.pdf: 483417 bytes, checksum: 782ad0a9939b35b83a255622221d018c (MD5) Previous issue date: 2013-02-01 / Leptospirosis is a disease caused by pathogenic spirochetes of the Leptospira genus. This zoonosis of worldwide distribution causes veterinarian and public health issues, especially in underdeveloped and developing countries with tropical and subtropical climates. In veterinary medicine, leptospirosis is important both as a clinical problem, causing illness in domestic animals, and an economic problem, causing productive and reproductive losses in commercial herds. Vaccination of these animals is applied, however protection conferred by these conventional vaccines is limited, and the carrier status is not always avoided. Recombinant outer membrane proteins seem to be the most promising antigens to replace the traditional bacterins (whole cell inactivated preparations), but thus far none of the tested proteins have turned satisfactory results. The goal of this study was to assess recombinant antigens and vaccine preparations, regarding their capability of producing protective immunity in hamsters, against lethal leptospirosis. Moreover, heterologous protection was sought, and assessed. The prevalence anti-Leptospira antibodies in stray dogs from the city of Pelotas was assessed using serogroups Icterohaemorrhagie and Canicola antigens. Several experiments were conducted to assess the protective potential of previously described leptospiral proteins. Twenty seven proteins were used to immunize hamsters which were then challenged with virulent Leptospira. Furthermore, leading vaccine candidates, LipL32 and LigB, were assessed regarding their protective potential when co-administered with traditional bacterins in previously established heterologous challenge experiments. A total of 28.96% of the animals tested were seropositive for the disease in the prevalence assay. Of the 27 antigens tried, two were shown to have some protective potential. Although no protection was demonstrated in the coadministration experiment, leptospiral bacterins seem to have some immunestimulating activity. / A leptospirose é uma doença causada por espiroquetas do gênero Leptospira. É uma zoonose de ampla distribuição geográfica, sendo um problema de saúde pública e veterinária, principalmente em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento de clima tropical e subtropical. Em medicina veterinária, a leptospirose é uma doença importante tanto para a clínica quanto para a produção, devido ao risco à saúde pública, perdas reprodutivas e óbitos. A vacinação animal é realizada como medida de prevenção da enfermidade, entretanto, a proteção conferida pelas vacinas comerciais é limitada e não evita a condição de portador. Os antígenos protéicos da membrana externa parecem ser a melhor alternativa para substituir as vacinas atualmente disponíveis, porém, após diversos estudos, nenhum apresentou resultados satisfatórios. O objetivo deste trabalho foi avaliar antígenos recombinantes e preparações vacinais, capazes de conferir proteção de amplo espectro, em hamsters, contra leptospirose letal. A prevalência da leptospirose em cães da cidade de Pelotas foi aferida em um ensaio de diagnóstico sorológico usando como antígeno cepas dos sorogrupos Icterohaemorrhagie e Canicola. Em uma série de experimentos de prospecção de alvos, grupos de hamsters foram vacinados com diferentes proteínas recombinantes e posteriormente desafiados com cepa virulenta de Leptospira sp. Após o desenvolvimento de modelo para avaliação de proteção contra desafios heterólogos, as proteínas rLipL32 e rLigBNI foram avaliadas quando coadministradas com bacterinas (preparações de células inteiras inativadas por calor) em hamsters, sofrendo posterior desafio com quatro cepas de sorogrupos diferentes. Uma soroprevalência de 28,96% foi encontrada nos ensaios de prevalência. Duas de 27 proteínas recombinantes triadas foram identificadas como possíveis imunógenos. Apesar da falta de proteção demonstrada no experimento de coadministração de proteína e bacterina contra desafio homólogo ou heterólogo, a bacterina parece ter ação imunoestimulante.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_karine_begnini.pdf: 1622668 bytes, checksum: 238f06c82a5dce8f22542c15f37944f4 (MD5) Previous issue date: 2012-02-15 / Bacillus Calmette-Guerin (BCG) is one of the great success stories of immunotherapy as a treatment for superficial urothelial carcinoma of the bladder. The high incidence of local side effects and presence of non-responder diseases has led to efforts to improve the therapeutic vaccine. Hence, we proposed that an auxotrophic recombinant BCG strain overexpressing Ag85B (BCG ΔleuD/Ag85B), could enhance cytotoxicity to the human bladder carcinoma cell line (5637). This rBCG was generated by incorporating an expression plasmid encoding the mycobacterial antigen Ag85B into the BCG ΔleuD strain. The inhibitory effect of BCG ΔleuD/Ag85B in 5637 cells was determined by the MTT method, morphology observation and the LIVE/DEAD assay. Gene expression profiles for apoptotic genes, cell cycle-related genes and oxidative stress-related genes were investigated by qRT-PCR. Bax, bcl-2 and p53 induction by BCG ΔleuD/Ag85B treatment were evaluated by Western blotting. BCG ΔleuD/Ag85B revealed a superior cytotoxicity effect than the strains used as controls in this study. The results demonstrated that the expression level of pro-apoptotic and cell cycle-related genes increased after BCG ΔleuD/Ag85B treatment, whereas mRNA levels of antiapoptotic genes decreased. Interestingly, BCG ΔleuD/Ag85B also increased the mRNA level of antioxidant enzymes in bladder cancer cell line. Bax and p53 protein levels were increased by BCG ΔleuD/Ag85B treatment. In conclusion, these results suggested that BCG ΔleuD/Ag85B enhanced cytotoxicity on superficial bladder cancer cells in vitro. The therapeutic model using rBCG may have potential for future clinical application in the treatment of bladder cancer. / O Bacilo Calmette-Guérin (BCG) constitui uma das grandes histórias de sucesso da imunoterapia como tratamento para carcinoma superficial da bexiga. Porém, a alta incidência de efeitos colaterais locais e a ocorrência de tumores resistentes ao tratamento têm impulsionado estudos visando melhorias da vacina terapêutica. Neste trabalho, propusemos que uma cepa auxotrófica de BCG superexpressando o antígeno Ag85B (BCG ΔleuD/Ag85B), é capaz de aumentar a citotoxicidade na linhagem celular humana de carcinoma superficial de bexiga (5637). A cepa de BCG recombinante foi gerada através da incorporação da sequencia do antígeno Ag85B em um plasmídeo de expressão micobacteriano na cepa de BCG ΔleuD. O efeito inibitório do BCGΔleuD/Ag85B em células 5637 foi determinada através das técnicas colorimétricas MTT e LIVE/DEAD, além de observação morfológica. Os perfis de expressão gênica para genes apoptóticos, genes relacionados ao ciclo celular e genes de estresse oxidativo foram avaliados por qRT-PCR. Os níveis protéicos de bax, bcl-2 e p53 foram avaliados por western blot. O BCG ΔleuD/Ag85B revelou citotoxicidade superior às cepas utilizadas como controle neste estudo. Os resultados obtidos demonstram níveis superiores de expressão de genes pró-apoptóticos e de genes relacionados com o ciclo celular após tratamento com BCG ΔleuD/Ag85B. Níveis inferiores de mRNA de genes antiapoptóticos foram detectados após o mesmo tratamento. Ainda, o tratamento com BCG ΔleuD/Ag85B também elevou os níveis de mRNA de enzimas antioxidantes em linhagem de células de câncer superficial de bexiga. As proteínas Bax e p53 mostraram-se elevadas após tratamento com BCG ΔleuD/Ag85B. Em conclusão, estes resultados sugerem que a cepa de BCG superexpressando Ag85B é capaz de aumentar a citotoxicidade sobre as células de câncer superficial de bexiga in vitro. Este modelo terapêutico usando BCG recombinante possui potencial para uma futura aplicação clínica em tratamento de câncer de bexiga.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andressa_fisch.pdf: 708004 bytes, checksum: 48d7e7a2a394dafd06e3209289b60dde (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / Enzootic Pneumoniae (EP), caused by Mycoplasma hyopneumoniae, generates significant economic losses to the pig industry worldwide. The currently available vaccines confer partial protection against the EP and the development of new vaccine strategies have proven necessary. In this paper, humoral immune response in mice of six comercial bacterins against sexteen recombinant antigens previously characterized of M. hyopneumoniae was evaluated by indirect ELISA. Seroconversion Seroconversion was used to determine biologically significant reactivity. The antigen MHP_0067 was recognized by sera from one inoculated group. The antigens MHP_0513 and MHP_0580 were recognized by sera from four inoculated groups each. For other antigens, not seroconversion was detected. Identify potentially protective antigens underexpressed in these vaccines and associate them with conventional vaccination may promote increased levels of protection. These antigens are potential targets for the composition of a recombinant subunit vaccine associated with the commercial vaccine. / A Pneumonia Enzoótica Suína (PES), causada pela bactéria Mycoplasma hyopneumoniae, gera importantes perdas econômicas para a indústria suinícola em todo o mundo. As vacinas atualmente disponíveis diminuem as perdas produtivas, mas não impedem a infecção dos rebanhos. O desenvolvimento de novas estratégias vacinais têm se mostrado necessário. Neste trabalho, avalIou-se a resposta imune humoral induzida pela inoculação, em camundongos, de seis bacterinas comerciais contra quinze fatores de patogenicidade de M. hyopneumoniae previamente caracterizados por nosso grupo. A detecção de anticorpos foi realizada através de ELISA indireto. Soroconversão foi utilizada para determinar reatividade biologicamente significativa. O antígeno MHP_0067 foi reconhecido pelo soro de um único grupo inoculado. Os antígenos MHP_0513 e MHP_0580 foram reconhecidos pelos soros de quatro grupos inoculados cada. Para os demais antígenos não houve soroconversão pelos grupos inoculados com as bacterinas comerciais. Identificar antígenos potencialmente protetores ausentes nestas vacinas e associá-los à vacinação convencional pode promover o aumento dos níveis de proteção. Estes antígenos são potenciais alvos para a composição de uma vacina de subunidade recombinante associada à vacina comercial.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-10-02 / Avian Necrotic Enteritis (NE) is an acute enterotoxaemia caused by Clostridium perfringens A and C. The control of the disease is based on antibiotics added to animal feed. The ban of this practice by consumer markets, considered the biggest challenge to industrial aviculture, demanded the adoption of other alternatives for its control, among others, immunization with recombinant vaccines. The aim of this work was to produce and evaluate C. perfringens recombinant α toxin (rAT) vaccines adjuvanted with either Al(OH)3 (rAT+Al(OH)3 or recombinant B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli (rLTB) (rAT+rLTB), and a chimeric protein containing the α toxin fused to rLTB (rLTB-AT). The rAT+Al(OH)3 was innocuous and protected mice against a challenge with native α toxin (sT), and it was immunogenic and did not affect productivity parameters in broilers. The rAT+rLTB showed a dose-protection relationship in mice, while rLTB-AT did not protect mice against sT challenge. The rAT could be an alternative for controlling NE. / A Enterite Necrótica Aviar (ENA) é uma enterotoxemia aguda, causada pelos Clostridium perfringens A e C, cujo controle baseia-se na adição de antibióticos na ração. A restrição dessa prática pelo mercado consumidor, que tornou seu controle o maior desafio para o setor avícola, exigiu a adoção de novas estratégias para o controle, entre elas a imunização. Vacinas recombinantes vêm despertando grande interesse entre pesquisadores e empresas do setor. O objetivo deste trabalho foi elaborar vacinas de toxina α recombinante de C. perfringens (rAT) utilizando como adjuvantes Al(OH)3 (rAT+Al(OH)3) e subunidade B recombinante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (rLTB) (rAT+rLTB), e construir e avaliar uma proteína quimérica contendo rAT fusionada a rLTB (rLTB-AT). A rAT+Al(OH)3 foi inócua e protetora contra agressão de toxina α nativa (sT) em camundongos, e imunogênica em frangos de corte, sem afetar a produtividade. A rAT+rLTB demonstrou relação dose-proteção em camundongos, entanto a rLTB-AT não protegeu camundongos contra agressão de sT. A rAT demonstrou ser uma alternativa para controlar a ENA. Palavras-chave: Enterite Necrótica Aviar, Clostridium perfringens A, toxina α recombinante, vacinas.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_leandro_nizoli.pdf: 538110 bytes, checksum: 770c97bed302c0714288a9278ce94694 (MD5) Previous issue date: 2009-03-18 / Equine theileriosis is considered to be one of the most important parasitic diseases that affect horses, and has great economic impact on the equine industry. The disease is caused by the etiologic agent Theileria equi, which is classified as a hematozoan. The losses associated with equine theileriosis are related to clinical manifestation as well as restriction to international travel to positive horses. Chronic infected equines suffer the risk of the disease relapse which leads to losses in reproduction performance and are potentially disseminators of the disease. In the last years, studies on the immunologic diagnosis and vaccination against T. equi have focused to obtain distinct antigenic proteins. On the outer membrane of this protozoan, major surface proteins has been characterized and named as EMAs (equi merozoite antigen). Of these, EMA-1 has been used as antigen for diagnosis due to its conservation in diverse isolates. Its role as a potential immunogen has been well documented due its ability to stimulate a humoral response with production of specific antibodies in infected animals. Through this antibodies one can used as tool for immune diagnostic of this disease. EMA-1 is also a strong candidate to be use as a vaccine in the control of equine theileriosis. In this study we used the Pichia pastoris yeast as expression system for the production of the EMA-1 protein of T. equi and evaluated its antigenicity and immunogenicity. When tested for antigenicity, the recombinant protein was recognized by antibodies form chronic T. equi infected horses, suggesting that epitopes of the native were conserved in the recombinant protein. Also we were able to observe that this protein was immunogenic in mice. The data obtained in this study demonstrated that the yeast P. pastoris is an expression system of heterologous protein suitable for the production of EMA-1 from T. equi. / A Theileriose eqüina é considerada uma das principais doenças parasitárias que acometem os eqüinos, acarretando grande impacto econômico na equinocultura. A doença é causada pelo hematozoário Theileria equi. As perdas econômicas associadas à theileriose eqüina estão relacionadas tanto aos fatores clínicos, quanto à restrição ao trânsito internacional de animais soropositivos, já que animais portadores crônicos são passíveis de reagudizações, gerando perda de performance física e reprodutiva, e são potencialmente disseminadores da enfermidade. Nos últimos anos, os estudos sobre o diagnóstico imunológico e vacinação contra T. equi concentram-se na obtenção de frações antigênicas. Na membrana externa deste protozoário foram caracterizadas proteínas principais de superfície denominadas de EMAs (equi merozoite antigen). Dentre estas, a EMA-1 destaca-se como antígeno para diagnóstico em função de sua conservação entre diversos isolados. Seu papel também tem sido caracterizado como imunógeno por estimular forte resposta humoral com produção de anticorpos em animais infectados, podendo ser usado como ferramenta para imunodiagnóstico dessa doença. EMA-1 é também um potencial candidato como antígeno vacinal no controle da theileriose equina. Neste estudo utilizou-se o sistema eucariótico de expressão baseado na levedura metilotrófica Pichia pastoris, para a produção da proteína EMA-1 de T. equi e a avaliação quanto a sua antigenicidade e imunogenicidade. Quanto a sua antigenicidade, a proteína recombinante foi reconhecida por anticorpos de animais portadores crônicos de T. equi, sugerindo que epítopos nativos foram conservados na proteína recombinante. Também foi observado que a proteína recombinante foi capaz de gerar resposta imune em camundongos vacinados com esta proteína. Os dados obtidos neste estudo demonstram que a levedura P. pastoris é um sistema de expressão heterólogo adequado para a produção da proteína EMA-1 de T. equi, podendo ser utilizada como imunobiológico no desenvolvimento de testes diagnósticos e vacina recombinante.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present study describes an investigation of the attenuation/virulence and immunogenicity of a recombinant BoHV-5, a candidate vaccine strain. The recombinant BoHV-5gE/TKΔ was constructed out of a Brazilian BoHV-5 strain (SV507/99) and contains deletions in glycoprotein E (gE) gene as antigenic marker - and thymidine kinase (TK) gene for attenuation. In Chapter 1, we investigated the attenuation and immunogenicity of the recombinant in calves. Eighty-to-ninety days old calves (n=6) inoculated intranasally (IN) with the recombinant virus (titer of 107.5 TCID50) showed no clinical signs, and shed low titers of virus in nasal secretions. On day 30 post-infection (pi), all animals had neutralizing antibodies against BoHV-5, in titers from 4 to 8 and remained negative for antibodies to gE. Administration of dexamethasone (Dx) to four of these calves at day 42 pi (0.1mg/kg/day during 5 days) did not result in virus shedding or increase in antibody titers, indicating lack of viral reactivation. In a second experiment, intramuscular immunization (IM) of calves with 8 months of age (n=9) with the recombinant virus (107.5 TCID50/animal) did not result in virus shedding or clinical signs. Vaccinated animals developed neutralizing antibodies in titers from 2 to 8 at day 42 post-vaccination (PV) and remained negative for gE antibodies. Finally, 21 calves (approximately 10 months old) were vaccinated IM with the recombinant virus (107.3 TCID50). All vaccinated animals developed neutralizing antibodies in titers from 2 to 16 at day 30pv. A boost vaccination performed on those animals at day 240 pv resulted in a rapid and strong anamnestic antibody response, with VN titers reaching from 16 to 256 at day 14 post-booster. Serum samples of all animals remained negative for gE antibodies. Serum samples from vaccinated animals showed cross-neutralizing activity against nine field isolates of BoHV-5 and eight of BoHV-1. Chapter 2 describes an investigation of the immunogenicity and protection conferred by the recombinant virus against homologous (BoHV-5) and heterologous challenge (BoHV-1). A group of nine calves seronegative for BoHV-5 were vaccinated IM in a dose of 107.5 TCID50 of the recombinant virus and eight animals were maintained as non vaccinated controls. All vaccinated animals seroconverted 14 days postvaccination (pv), with neutralizing antibody titers from 2 to 4. At day 42 post-vaccination (pv), the vaccinated animals and controls were challenged by IN instillation of BoHV-5 or BoHV-1 isolates. After challenge, the length and magnitude of virus shedding was reduced in vaccinated animals compared to controls in both groups (challenged with BoHV-1 and BoHV-5). The vaccinated animals did not show systemic, respiratory or neurological clinical signs after challenge. Furthermore, the control animals challenged with BoHV-5 (n=4) developed severe neurological disease and were euthanized in extremis between days 13 and 14 post-challenge (pd). The challenge resulted in a strong and rapid anamnestic response in vaccinated animals, inducing neutralizing titers higher than in control animals. Antibodies to gE were detected only after challenge in both vaccinated and controls calves. These results indicate that recombinant BoHV-5 gE/TKΔ is an adequate candidate for a vaccine strain, with an antigenic marker, since it is attenuated and immunogenic for calves and provides homologous and heterologous (BoHV-1) protection. / O presente trabalho descreve a atenuação/virulência e imunogenicidade de uma cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) candidata a cepa vacinal. O recombinante BoHV-5gE/TKΔ foi construído a partir da cepa brasileira SV507/99 e contém deleções nos genes da glicoproteína E (gE) como marcador antigênico - e da enzima timidina quinase (TK), para atenuação. No capítulo 1, investigou-se a atenuação e imunogenicidade do recombinante em bezerros. Bezerros com 80 a 90 dias de idade (n=6), inoculados pela via intranasal (IN) com o vírus recombinante (título de 107,5 TCID50) não apresentaram sinais clínicos, e excretaram títulos baixos de vírus nas secreções nasais. No dia 30 pós-infecção (pi), todos os animais possuíam anticorpos neutralizantes contra o BoHV-5, em títulos entre 4 e 8, permanecendo soronegativos para a gE. Administração de dexametasona (Dx) a quatro desses bezerros no dia 42 pi (0.1mg/kg/dia durante 5 dias) não resultou em excreção viral ou em aumento dos títulos de anticorpos, indicando ausência de reativação viral. Em um segundo experimento, vacinação intramuscular (IM) de bezerros com 8 meses de idade (n=9) com o recombinante (107,5TCID50/animal) não resultou em excreção viral ou em manifestações clínicas. Os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 8 no dia 42 pós-vacinação (PV) e permaneceram negativos para anticorpos anti-gE. Finalmente, 21 bezerros (aproximadamente 10 meses de idade) foram vacinados com o recombinante (107,3 TCID50) pela via IM. Todos os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 16 no dia 30pv. Revacinação desses animais no dia 240 pv provocou uma resposta anamnéstica rápida e intensa, resultando em títulos neutralizantes entre 16 e 256 no dia 14 pós-revacinação. O soro de todos os animais permaneceu negativo para anticorpos contra a gE. Amostras de soro dos animais vacinados apresentaram atividade neutralizante cruzada frente a nove isolados de BoHV-5 e oito de BoHV-1. O capítulo 2 relata uma investigação sobre a imunogenicidade e proteção conferida pelo vírus recombinante frente a desafio homólogo (BoHV-5) e heterólogo (BoHV-1). Para isso, nove bezerros soronegativos para o BoHV-5 foram vacinados pela via intramuscular com uma dose de 107,5DICC50 do vírus recombinante e oito animais foram mantidos como controle. Todos os animais vacinados soroconverteram aos 14 dias pós-vacinação (pv), apresentando títulos de anticorpos neutralizantes entre 2 e 4. No dia 42 pós-vacinação (pv), os animais vacinados e os controles foram desafiados pela inoculação intranasal (IN) de isolados de BoHV-5 ou de BoHV-1. Após o desafio, a excreção de vírus pelos animais vacinados foi reduzida em comparação com os não vacinados, nos dois grupos (desafiados com BoHV-1 e BoHV-5). Os animais vacinados também não apresentaram sinais clínicos sistêmicos, respiratórios ou neurológicos pós desafio. Por outro lado, os animais controles inoculados com o BoHV-5 (n=4) desenvolveram doença neurológica severa e foram eutanasiados in extremis entre os dias 13 e 14 pós-desafio (pd). O desafio provocou uma resposta anamnéstica intensa e rápida nos animais vacinados, induzindo títulos neutralizantes superiores aos animais não vacinados. Anticorpos contra a gE foram detectados apenas após o desafio, tanto nos vacinados quanto nos controles. Esses resultados indicam que o recombinante BoHV-5 gE/TKΔ é um candidato adequado a cepa vacinal com marcador antigênico, pois é atenuado e imunogênico para bezerros, confere proteção homóloga e também contra o BoHV-1.