A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-03-28T13:31:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Giseli_Ritterbusch.pdf: 1007939 bytes, checksum: 6829555e6aeec4b59e73c9a7f0f29087 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-03-28T20:59:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Giseli_Ritterbusch.pdf: 1007939 bytes, checksum: 6829555e6aeec4b59e73c9a7f0f29087 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T20:59:38Z (GMT). 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Um dos objetivos do presente trabalho foi realizar um estudo exploratório, afim de conhecer a opinião de diferentes segmentos da avicultura sobre a situação atual da ocorrência de BI nos planteis brasileiros e os custos que ela representa. Diante disso, surge então a necessidade do desenvolvimento de vacinas alternativas e seguras para controle da BI, entre elas a utilização de vacinas vetoriais. Dessa forma, com o objetivo de desenvolver uma vacina efetiva no controle da BI, amostras variantes de VBI foram clonadas em adenovírus humano recombinante e utilizadas para transfectar células HEK293, originando adenovírus recombinantes carreadores do gene N do VBI. Estes vírus foram purificados e utilizados como vacinas recombinantes para imunização de aves SPF. Com base nos dados obtidos, observou-se que apesar das diferentes estratégias de vacinação, a BI ainda é considerada uma doença de alta prevalência que continua causando significativas perdas econômicas na produção avícola de corte e postura no Brasil. Os resultados obtidos demonstraram que a vacina recombinante não induziu uma resposta sorológica detectável pelo teste de Elisa comercial utilizado, bem como não reduziu os escores de lesões nos tecidos das aves vacinadas e desafiadas. Assim, a vacina recombinante carreada por adenovírus defectivo expressando o gene N do VBI foi construída e caracterizada, porém se mostrou ineficaz e não induziu suficiente proteção às aves experimentalmente imunizadas frente ao desafio com VBI. / The infectious bronchitis virus (IBV) is the etiologic agent of Infectious bronchitis (IB), a highly contagious disease that causes great economic losses in the poultry industry. The IBV is an enveloped virus that has RNA single strand genome, encoding four structural proteins, among them Nucleoprotein (N), which is produced abundantly in viral infection and is known immunogenic. The IB control is done by immunization of birds by applying live attenuated vaccine, followed by vaccination using inactivated antigen, wherein the Massachusetts serotype is the only released for use in Brazil. One of the goals of the present work was to conduct an exploratory study in order to know the opinion of different segments of the poultry industry on the current situation of the occurrence of BI in Brazilian squads and the costs that it represents. Therefore, the development of alternative and safe vaccines to BI control is necessary, including the use of vectors. In order to develop an effective vaccine to IB control, samples from IBV field variants were cloned into recombinant human adenovirus and used to transfect HEK293 cells, resulting in recombinant adenovirus carriers of the N gene of the IBV. These recombinant viruses were purified and used as vaccines to immunization of SPF chickens. Based on the obtained data, it was observed that despite the different vaccination strategies, IB is still considered highly prevalent disease that causes significant economic losses in Brazilian poultry industry. The results here obtained showed that the recombinant vaccine does not causes detectable positive serological responses by commercial Elisa test in vaccinated chickens and does not reduce the tissues damage in vaccinated and challenged chickens. Thus, the recombinant vaccine carried by defective adenovirus expressing N gene of IBV was constructed and characterized, but seemed to be ineffective and did not induce sufficient protection to experimentally immunized chickens against IBV challenge.

Les anticoagulants antivitamines K (AVKs) sont des molécules qui par inhibition de l’activation des PVKDs, empêchent ou retardent la coagulation sanguine. Aujourd’hui, le traitement par AVKs est la première cause d’accidents iatrogènes médicamenteux chez l’homme. Cependant le bénéfice par rapport au risque étant largement supérieur. Elles sont également utilisées dans le contrôle des populations de rongeurs nuisibles. Les AVKs agissent en inhibant l’enzyme VKORC1. Des phénomènes d’hypersensibilité et de résistance aux AVKs sont apparus et plusieurs mutations spontanées ont été découvertes dans le gène vkorc1. Ces mutations ont alors été associées à la résistance sans que ce lien n’ait jamais été démontré. Le travail, présenté dans ce mémoire, a pour objectif de confirmer ou d’infirmer ces liens de causalité. Cette étude a permis de démontrer la responsabilité des mutations Leu120Gln, Leu128Gln et Tyr139Phe, Ser et Cys dans l’apparition du phénotype résistant aux AVKs de 1ère génération chez le rat sauvage. Les propriétés catalytiques expliquent de plus le coût biologique associé à l’apparition de cette résistance chez certaines lignées de rats sauvages. Ainsi, les mutations en position 139 sont responsables d’un détournement de la catalyse avec production majoritaire d’hydroxyvitamine K directement éliminable par l’organisme. Chez l’homme, 29 mutations sur 30 ont été caractérisées. Alors que ces mutations ont été observées chez des patients résistants aux AVKs, la causalité de ces mutations n’a été démontrée que pour 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His). Les autres mutations ne seraient pas responsables du phénotype observé / The antivitamines K (AVKs) are molecules which can be inhibiting the activation of PVKDs, preventing or delaying the blood clotting. Today, the treatment by AVKs is the first cause of iatrogenic accidents medicated in humans. In addition, the benefits are significantly higher than the risk so they are used to control the populations of rodent pests. The AVKs are acting as inhibitor for the enzyme VKORC1. The phenomena of hypersensitivity and the resistance to AVKs have been emerged and several spontaneous mutations have been discovered in the gene vkorc1. These mutations were associated with resistance despite the fact that this link has been never been demonstrated. The objective of this work is to confirm or deny these causal links. This study helps to demonstrate the responsibility of the mutations Leu120Gln, Leu128Gln and Tyr139Phe, Ser or Cys in the emergence of the phenotype resistant to AVKs 1ST generation among the wild rat. The catalytic property explains the biological cost associated with the emergence of this resistance in some strains of wild rats. Thus, the mutations at position 139 are responsible for the misappropriation of the catalysis with majority production of hydroxyvitamine K which is directly consumable by the body. In humans, 29 mutations out of 30 have been characterized. While these mutations have been observed in patients resistant to AVKs, the causality of these mutations has been demonstrated only for 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His) and the other mutations would not be responsible for the phenotype observed

Vetores lentivirais são ferramentas fundamentais para modificação celular. Sua utilização ganhou destaque devido à capacidade desses em integrar ao genoma de células que estão ou não em divisão. Grande parte dos vetores desenvolvidos são derivados do genoma do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1), portanto, modificações foram necessárias a fim de evitar a formação de Partículas Competentes em Replicação (RCLs) e garantir uma utilização segura. Com as modificações, foram produzidos os vetores lentivirais de terceira geração utilizados atualmente. Esses vetores podem ser usados para expressão constitutiva de genes, produção de proteínas recombinantes, produção de animais transgênicos e terapia gênica. Com isso, torna-se necessário o desenvolvimento de vetores lentivirais para aplicação em pesquisa básica e ensaios clínicos. Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo a construção de vetores de expressão lentivirais aplicáveis à: 1- expressão constitutiva de genes de interesse e 2-vetores com promotores específicos para expressão de proteínas em megacariócitos. Esse trabalho descreve a construção desses vetores, sua importância e discute suas possíveis aplicações. As sequências selecionadas para produção dos vetores foram: os genes Runx1C e VkorC1 e os promotores proPF4 e proITGA2b. Todas as sequências encontram-se clonadas em vetor de clonagem e estoques de bactérias com esses vetores congeladas em glicerol foram confeccionados. Para a confecção dos vetores lentivirais, o gene Runx1C foi subclonado no vetor lentiviral base p1054-CIGWS sob controle do promotor forte CMV, enquanto o promotor proITGA2b foi subclonado no vetor base p1054-FVIII, em substituição ao promotor CMV, de forma a controlar a expressão de FVIII. Os dois vetores produzidos apresentam ainda o gene para proteína verde GFP precedida do sítio de ligação do ribossomo IRES, com expressão controlada pelo mesmo promotor interno do vetor. O trabalho possibilitou, portanto, a produção de dois vetores lentivirais bi-cistrônicos: p1054-Runx1C e pL-proITGA2b-FVIII. A construção p1054-Runx1C ainda não foi sequenciada, mas foi confirmada por restrição enzimática e apresenta potencial para aplicação em estudos de diferenciação hematopoética. Já a construção pL-proITGA2b-FVIII foi sequenciada, porém sem confirmação da região de ligação do proITGA2b ao vetor. Reações de PCR e de restrição enzimática confirmaram a ligação e sequenciamento mostrou 67% de similaridade entre a região sequenciada e o promotor ITGA2b depositado no banco de dados. Análise funcional foi realizada através da transfecção desse vetor em células HEK-293T. As células transfectadas apresentaram expressão positiva para GFP e secreção de FVIII no sobrenadante celular, evidenciando que o promotor proITGA2b clonado no vetor encontra-se ativo. Esse vetor apresenta potencial para aplicação em terapia gênica para hemofilias, pois apresenta expressão do fator de coagulação direcionado a megacariócitos e plaquetas, células que estão diretamente relacionadas ao processo de coagulação, representando grandes veículos para secreção desses fatores. Ainda, os dois vetores lentivirais gerados apresentam segurança e eficiência elevadas, pois são vetores de terceira geração auto-inativantes (SIN) e apresentam elementos regulatórios que melhoram o transporte e integração do DNA ao genoma hospedeiro. / Lentiviral vectors are fundamental tools for cell modification that gained prominence due to their ability to integrate the genome of non-dividing cells. Most of developed lentiviral vectors are derived from the genome of Human Immunodeficiency Virus (HIV-1), so modifications were necessary in order to avoid the formation of Competent Replication Particles (RCLs) and ensure safer operations. The modifications led to development of third generation lentiviral vectors currently used. These vectors can be used for constitutive gene expression, production of recombinant protein, production of transgenic animals and gene therapy. It\'s evident the need to develop lentiviral vectors for application in basic research and clinical trials. Thus this study aimed to construct lentiviral expression vectors applicable to: 1- constitutive expression of genes of interest and 2-vectors with specific promoters for expression of proteins in megakaryocytes and platelets. This paper describes the construction of these vectors, their importance and discuss their possible applications. Sequences were selected for production of the vectors: genes Runx1C and VkorC1 and proPF4 and proITGA2b promoters. All four sequences are cloned into cloning vectors and stocks of bacteria with these vectors frozen in glycerol were prepared. Lentiviral vectors were engineered from subcloning the sequence Runx1C into the basic lentiviral vector p1054- CIGWS under control of the strong CMV promoter, and from subcloning proITGA2b promoter into p1054-FVIII basic vector, replacing the CMV promoter in order to control the expression of FVIII. Both vectors exhibit the green fluorescence protein GFP gene preceded by a ribosome binding site IRES under control of vector\'s internal promoter. Therefore, this work resulted in the production of two bi-cistronic lentiviral vectors: p1054-Runx1C and pLproITGA2b-FVIII. The p1054-Runx1C construction has not yet been sequenced, but it was confirmed by digestion and has potential for use in hematopoietic differentiation studies. Though, pL-proITGA2b-FVIII construct was sequenced, but the technique didn\'t allow to confirm the binding region between proITGA2b and the vector. Although PCR reaction and digestion confirmed the construction. Sequence analysis showed 67% similarity between the sequenced region and ITGA2b promoter deposited in the database. Functional analysis was performed by transfection of this vector in HEK-293T cells. The transfected cells showed positive expression of GFP and FVIII secretion in cell supernatant, indicating that the proITGA2b promoter cloned into the vector is active. This vector has potential usage in gene therapy for hemophilia, since it can be used to express coagulation factors in megakaryocytes and platelets and these cells are directly related to the clotting process, representing great vehicles for secretion of these factors. Even more, the two lentiviral vectors generated have higher safety and efficiency, as they are self-inactivating (SIN) third-generation vectors and have regulatory elements that enhance transport and integration of DNA into the host genome.

LOPAP, proteína isolada da toxina de lagartas Lonomia obliqua, possui ação ativadora de protrombina, efeito pró-coagulante e ação citoprotetora em células do endotélio humano, em cultura. Tem cadeia única com 181 resíduos de aminoácidos e 21 kDa. Sua estrutura terciária é formada por oito folhas-b fechadas em uma extremidade, mantidas juntas por pontes de hidrogênio, em formato de barril. Está classificada como pertencente ao grupo das Lipocalinas (proteínas de transporte). Neste trabalho estudou-se o LOPAP, que foi produzido recombinante em cultivo de Pichia pastoris em biorreator e purificado. Avaliou-se sua estabilidade quanto às atividades enzimática e citoprotetora, e sua estrutura secundária. Não foi detectada ativação de protrombina para o r-LOPAP obtido, mas foi observada ação citoprotetora. Considerando estes resultados e a análise de sua estrutura secundária por dicroísmo circular, concluiu-se que a proteína foi expressa com tamanho e sequência corretos, mas sem uma estrutura terciária correta, o que é determinante para a atividade enzimática. / LOPAP, a protein isolated from the toxin of Lonomia obliqua caterpillars, has prothrombin activation action, procoagulant effect and cytoprotection action in human endothelium cells culture. It has only chain with 181 amino acid residues and 21 kDa of size. Its tertiary structure is made by eight b-sheets closed at one end, hold together by hydrogen bonds, barrel-shaped. It is classified as belonging to the Lipocalin group (proteins of transport). This work studied the LOPAP, which was produced recombinant in Pichia pastoris culture in bioreactor, was purified, and it was evaluated its stability related to enzymatic and cytoprotection activities, and its secondary structure. It was not detected prothrombin activation for the r-LOPAP obtained, but it was observed a cytoprotective effect. Regarding these results and the analysis of its secondary structure, by circular dichroism, it was concluded that the protein was expressed with correct size and sequence, but without a correct tertiary structure, which is determinant for the enzymatic activity.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-26T11:51:30Z No. of bitstreams: 1 luciana-de-santos-almeida.pdf: 1492447 bytes, checksum: fb4ac7dc61ce8aa49ecd3124c10c4ec4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-26T11:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 luciana-de-santos-almeida.pdf: 1492447 bytes, checksum: fb4ac7dc61ce8aa49ecd3124c10c4ec4 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A Era da Engenharia Genética ou Biotecnologia Moderna, que teve início nos anos 1970, encontra diversas aplicações em vários segmentos de atividades, dentre eles a saúde e alimentos. Na área de saúde têm -se o destaque para a indústria de biofármacos, que tem tido um crescimento acelerado nos últimos anos, pelo fato desses novos medicamentos serem voltados para a terapêutica de doenças que aflige uma parcela considerável da população mundial. Como exemplo pode-se citar o interferon alfa 2b humano recombinante, que faz parte do Programa de Medicamentos de Dispensação Excepcional do Ministério da Saúde, e está incluído no Protocolo Clínico para Hepatite C. Como forma de atender à demanda da população brasileira quanto às necessidades desse biofármaco, Bio-Manguinhos assinou em 2004 um Contrato de Transferência de Tecnologia como o Centro de Engenharia Genética e Biotecnologia de Cuba (CIGB), com o propósito de nacionalizar a produção do referido medicamento. Este trabalho teve como objetivo realizar uma pesquisa qualitativa para elencar os Requerimentos Fundamentais para Transferência, Registro Sanitário, Estabelecimento e Parâmetros de Estabilidade de Bancos de Células de E. coli que expressa o interferon alfa 2b humano recombinante. Foi elaborado um questionário, que serviu como fonte de coleta de dados, que foi enviado por e-mail a diversas Agências Regulatórias e pesquisadores da academia científica. Esse questionário teve como objetivo elencar os principais testes/requisitos que os Bancos de Células devem apresentar. O índice geral de retorno dos questionários foi igual a 39,3%, sendo que o índice de respostas dos pesquisadores foi igual a 62,5% e das Agências Regulatórias igual a 8,3%. O índice de marcação dos itens ficou em torno de 80% e ficou estabelecido que aqueles itens que tiveram um índice maior que 50% seriam os requerimentos indispensáveis a serem descritos. Não foi possível validar o trabalho pelo índice de retorno dos questionários por parte das Agências Regulatórias. Porém, acredita-se que aquilo que foi descrito pode servir como um passo inicial na elaboração de uma norma específica relativa ao Controle de Banco de Células de procariotos, pois representa a opinião de experientes pesquisadores da comunidade científica. E ainda contribuir nos requisitos específicos que serão futuramente estabelecidos pela ANVISA, relativos ao registro de um produto biogenérico/biossimilar. / The Age of Genetic Engineering and Modern Biotechnology, which began in the 1970s, has had several applications in various business activities, among of which are health and food. In health area the emphasis has been on the biopharmaceutical industry that has had a rapid growth in recent years, because these new drugs are aimed towards the therapy of diseases that afflict a significant part of the world’s population. As an example, it can be mentioned the recombinant human interferon-alpha 2b, which is part of the Drugs of Exceptional Dispensation Program of the Ministry of Health, also is it in the Clinical Protocol for Hepatitis C. In order to meet the demand of the Brazilian population for this drug, in 2004, Bio-Manguinhos signed an Agreement on Technology Transfer with the Center for Genetic and Biotechnology Engineering of Cuba (CIGB), so that this medicine could be produced at national level. This study aimed at doing a qualitative research to list the Fundamental Requirements for Transfer, Registration, Establishment and Stability Parameters of Banks of E. coli Cells expressing recombinant human interferon-alpha 2b. A questionnaire was compiled for data collection. It was sent by e-mail to a number of regulatory agencies and researchers of the scientific academy. This questionnaire aimed at listing the main tests / requirements that banks must submit Cells. The overall rate of return of questionnaires was 39.3%, and the rate of responses from researchers was 62.5% and from regulatory agencies was 8.3 %. The rate of items marked was around 80%, then it was agreed that those items that had a rate higher than 50% would be the essential requirements to be described. The work was not validated due to the low rate of return of questionnaires from the Regulatory Agencies. However, it is believed that what was described can serve as the first step in developing a specific standard relating to control the Banks of Prokaryotes Cells, since it represents the expertise opinion of researchers in the scientific community. Yet, it contributes to the specific requirements that shall eventually be established by ANVISA for the registration of a biogeneric / biosimilar product.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado. Por outro lado, o BCGr pUS977dtbPW8, quando submetido a seis sub-cultivos consecutivos in vitro não apresentou diferença significativa na capacidade de expressar o DTB, demonstrando portanto a persistência da estabilidade funcional da linhagem recombinante. A estabilidade estrutural da construção pUS977dtbPW8 também foi avaliada por PCR confirmando a presença do gene dtb em colônias do BCGr pUS977dtbPW8 . Adicionalmente, foi possível avaliar preliminarmente in vitro a capacidade soroneutralizante dos soros de camundongos imunizados com BCGr pUS977dtbPW8 após 30 e 60 dias em células VERO. A ação citotóxica da toxina diftérica entre as diluições de 1/4 e 1/16 foram neutralizadas com o pool de soros imunes com 60 dias. Finalmente, em nosso estudo foi possível avaliar o potencial da vacina BCG como vetor de expressão de um antígeno de Corynebacterium diphtheriae in vitro e in vivo. / The diphtheria vaccine currently used in Brazil (DTP), despite its history of high efficacy in the prevention of diphtheria, is associated with episodes of toxicity and vaccine reactogenicity in the vaccinee, resulting from the presence in the vaccine of residual proteins derived from the production process or detoxification. Strategies for the development of new vaccines more effective and economically viable against diphtheria have been the subject of intense investigation. The alternative proposed by our group is the use of the vaccine against tuberculosis (Mycobacterium bovis BCG Moreau sub strain) as a vector for the gene that encodes the 58.3 kDa fragment B of the diphtheria toxin (DTB). In our project the dtb gene was cloned into the bifunctional vector pUS977 for cytoplasmic expression and recombinant BCG (rBCG) clones, selected after transformation of BCG, were tested for expression of the DTB polypeptide and antigenicity against polyclonal antibodies anti- diphtheria toxoid by immunoblotting. The integrity and identity of the DNA sequence encoding the dtb gene carried by the plasmid construct pUS977dtbPW8 was confirmed by DNA Sequencing and Analysis of Similarity. The immunogenicity of the rBCG expressing the DTB was investigated in BALB/c mice and the results revealed a specific seroconversion (IgG). Also, infectivity and microbicidal activity were analyzed in the intracellular environment by infecting human monocytes (THP-1 cell line) with rBCG. The data obtained indicated intracellular survival within 12 days. In this context, splenocytes collected from mice at days 30 and 60 after immunization were removed and assayed for live bacteria. The results showed that rBCG persisted viable up to 60 days in the absence of selective pressure and cell viable counts did not change significantly during testing. Additionally, the rBCG subjected to six consecutive sub-cultures in vitro showed no significant difference in the ability to express the DTB, thus demonstrating the functional stability of the recombinant vaccine. The structural stability of the construct pUS977dtbPW8 was also confirmed by PCR detection of the dtb gene in rBCG colonies. Also, it was possible to have a preliminary evaluation of the neutralizing capacity of sera from mice immunized with BCGr 30 and 60 days after immunization. The cytotoxic action of diphtheria toxin, between dilutions 1/ 4 and 1/16, was neutralized by mice sera in an in vitro assay using VERO cells. Finally, in our study it was possible to evaluate the potential of BCG as a vector for expression of an antigen of Corynebacterium diphtheriae in vitro and in vivo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4595.pdf: 1437433 bytes, checksum: f83e0ea8c49064050b3f382c7d942d28 (MD5) Previous issue date: 2012-08-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Diseases caused by Streptococcus pneumoniae are one of the main problems of public health in the world. The pneumococcal surface protein A(PspA) is a potential canditate as carrier in a conjugate vaccine against this bacteria. Considering the inherent high losses of the purification and conjugation steps, it is fundamental to adopt a strategy of cultivation and expression that allows the obtainance of large quantities of protein. Thus, the use of Escherichia coli as expression system as well as its cultivation in complex medium constitutes promising alternatives for reducing the cost and increasing the productivity of the process. The goal of this work was to study the influence of the temperature and cultivation medium composition over the production of a PspA belonging to clade 4 protein fragment (PspA4Pro) during rE coli cultivations, aiming at to evaluate the possibility of employing vegetable-based nitrogen sources (soybean protein hydrolisates) instead of the Triptona, an animal-derived nitrogen source. The experiments were carried out in both shakers and benchscale bioreactor, using a complex medium which contained glucose and glycerol as carbon sources, lactose as inducer and Soytone, Phytone or Triptone as nitrogen sources, besides yeast extract. Samples were collected during the experiments to follow the cell growth (measurements of absorbance, dry cell weight and permittivity signal from biomass sensors), the carbon sources consumption and the production of organic acids by HPLC analysis. The stability of the plasmid (agar plates with or without kanamycin) and the production of recombinant protein (Bradford and SDS-PAGE electrophoresis followed by densitometry) were also evaluated. Preliminary experiments were performed in shake flasks, incubated at 300rpm and 37ºC, employing both complex and defined media. The highest productivity was achieved in complex medium, with a 42% superior protein production. Subsequently, nine complementary experiments were conducted in shake flasks with complex medium, under the agitation of 300rpm and temperatures of 37ºC (growth phase) and 25, 31 or 37ºC (induction phase). The largest specific production of soluble PspA4Pro was verified at 25ºC, reaching, respectively, 209±6, 192±5mg/g dry cell mass for Phytone and Triptone, with final absorbance values (after 12h of induction) of 9.0±0.4 and 8.5±0.4. The best protein production for Soytone (124±4mg/g dry cell weight) was observed at 31ºC, yielding a final absorbance 8.0±0.4. From the results obtained in the preliminary tests, the nitrogen source Phytone was selected for experiments in bioreactor. Four batch cultures were conducted in bench-scale bioreactor (5L), containing a modified auto-induction complex medium (10g/L glucose, 60g/L glycerol and 20g/L lactose), being three of them with Phytone and one with Triptone, for comparison. The best results in terms of protein production (245±7mg of PspA4Pro soluble/g dry mass) were obtained in the presence of Phytone, corresponding to an increase of 16% towards the maximum value achieved in the cultivation with Triptone. These results demonstrate the potential of vegetable-based nutrients as alternatives to animal-derived nitrogen sources in complex media, contributing to adequate these media formulations to the current guidelines of good manufacturing practices. / Doenças causadas por Streptococcus pneumoniae constituem um dos principais problemas de saúde pública mundial. A proteína A de superfície de pneumococo (PspA) é candidata em potencial a ser carreadora em vacina conjugada contra essa bactéria. Considerando as altas perdas inerentes às etapas de purificação e conjugação da proteína, é fundamental adotar uma estratégia de cultivo e expressão que permita obter grandes quantidades de proteína. Nesse sentido, o emprego da bactéria Escherichia coli como sistema de expressão e o cultivo da mesma em meio complexo se apresentam como alternativas promissoras para redução do custo e aumento da produtividade do processo. O objetivo do presente trabalho foi estudar a influência da temperatura e da composição do meio de cultivo sobre a produção do fragmento da proteína PspA do clado 4 (PspA4Pro) em cultivos de rE. coli, visando avaliar a viabilidade de utilização de fontes de nitrogênio de origem vegetal (hidrolisados protéicos de soja) em substituição à Triptona, de origem animal. Os experimentos foram realizados em câmara incubadora e em biorreatores de bancada, utilizando meio complexo contendo glicose e glicerol e lactose como fontes de carbono, lactose como indutor e Soytone, Phytone ou Triptona como fontes de nitrogênio, além de extrato de levedura. Amostras foram coletadas ao longo dos experimentos para acompanhamento do crescimento celular (medida de absorbância, massa seca e permissividade por sensor de biomassa), do consumo das fontes de carbono e da produção de ácidos orgânicos por análises em cromatografia líquida de alto desempenho. A estabilidade do plasmídeo (plaqueamento em meio contendo ou não canamicina) e a produção de proteína recombinante (Bradford e eletroforese SDS-PAGE seguida por densitometria) também foram avaliadas. Experimentos preliminares foram realizados em frascos agitados e incubados a 300rpm e 37oC, empregando tanto o meio complexo como o definido. A maior produtividade foi obtida em meio complexo, a qual foi 42% superior a alcançada com meio definido. Em seguida, nove experimentos complementares foram conduzidos em frascos agitados em meio complexo sob agitação de 300rpm e à temperatura de 37ºC (fase de crescimento) e de 25, 31 ou 37ºC (fase de indução). Verificou-se que a temperatura de 25ºC proporcionou a maior produção específica de PspA4Pro solúvel, alcançando-se, respectivamente, 209±6, 192±5mg/g massa seca para o Phytone e para a Triptona, com absorbâncias finais (após 12h de indução) de 9,0±0,4 e 8,5±0,4. Já para o Soytone, a melhor produção de proteína (124±4mg/g massa seca) foi observada à temperatura de 31ºC, obtendo-se uma absorbância de final de 8,0±0,4. A partir dos resultados obtidos nos ensaios preliminares, a fonte de nitrogênio de origem vegetal Phytone foi selecionada para experimentos em biorreator. Quatro cultivos em batelada foram conduzidos em biorreator de bancada (5L), contendo meio complexo de autoindução modificado (10g/L glicose, 60g/L glicerol e 20g/L lactose), sendo 3 com Phytone e um com Triptona, para comparação. Os melhores resultados em termos de produção de proteína (245±7mg de PspA4Pro solúvel/g massa seca) foram obtidos na presença de Phytone, correspondendo a um aumento de 16% em relação ao valor máximo alcançado no cultivo com Triptona. Esses resultados comprovam o potencial dos nutrientes de origem vegetal como alternativa às fontes de nitrogênio de origem animal em meios complexos, contribuindo para adequar as formulações desses meios às atuais diretrizes de boas práticas de fabricação.

Submitted by Bruna Rodrigues (bruna92rodrigues@yahoo.com.br) on 2017-10-16T11:32:32Z No. of bitstreams: 1 TeseTSSM.pdf: 23662587 bytes, checksum: 4ef26b2b65e46560d905cc700258cd0d (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (producaointelectual.bco@ufscar.br) on 2017-10-31T16:29:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseTSSM.pdf: 23662587 bytes, checksum: 4ef26b2b65e46560d905cc700258cd0d (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (producaointelectual.bco@ufscar.br) on 2017-10-31T16:29:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseTSSM.pdf: 23662587 bytes, checksum: 4ef26b2b65e46560d905cc700258cd0d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-31T16:41:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseTSSM.pdf: 23662587 bytes, checksum: 4ef26b2b65e46560d905cc700258cd0d (MD5) Previous issue date: 2017-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / In ethanol production process from hemicellulosic fraction, the use of xylooligomers (XOS) as substrate reduce the contamination risk, favoring its application at industrial scale. Thus, a biocatalyst, containing xylanases, xylose isomerase (XI) and yeast co-immobilized in calcium alginate gel, was developed and XOS simultaneous hydrolysis, isomerization and fermentation (SHIF) process was studied. Firstly, xylanases from Multifect CX XL A03139 (XAS-5), a commercial enzyme preparation, and the recombinant xylanase from Bacillus subtilis (XynA) were selected to compose biocatalyst beads. XAS-5 presented better conversion (78.7%) and higher xylose production in the hydrolysis of beechwood xylan, while XynA showed exclusive endoxylanase activity. The immobilization and stabilization of XynA were performed in chitosan-glutaraldehyde, chitosan-glyoxyl and agarose-glyoxyl. Although the enzyme was efficiently immobilized on all supports, the agarose-glyoxyl-XynA derivative was notable for exhibiting remarkable stabilization under tested conditions (8600 times). Studies of SHIF process were carried out with birchwood xylan, leading to ethanol production (0.160 g/g and 0.092 g/L.h) and xylose accumulation, which indicated XI activity decrease. Further experiments were then performed to to identify possible inhibitors of XI (pH, Ca2+, Mg2+ and xylooligosaccharides). Ca2+ was identified as an inhibitor, while Mg2+ acts as an activator of the enzyme, and both actions are potentiated at acidic pHs. XI is also inhibited by XOS, with a decrease of 31.6% in XI activity in the presence of 7.0 g/L of xylobiose. For this reason, it was decided to evaluate SIF process with a recombinant yeast, capable of expressing XI. In batch runs, GSE16-T18 (T18) yeast encapsulated in alginate gel was capable to ferment xylose efficiently, consuming 40 g/L of xylose in 4 h and producing 14.4 g/L of ethanol, with yield of 0.422 g/g and productivity of 3.61 g/L.h. Calcium alginate gel encapsulation also contributed to protect yeast from the action of inhibitors, such as acetic acid. The encapsulated T18 was able to perform 10 consecutive cycles in repeated batch (yeast extract-peptone medium with 40 g/L of xylose), keeping the same productivity and high yields. It also fermented efficiently sugarcane bagasse hydrolysate, containing 60 g/L of fermentable sugars and high grade of inhibitors. The modified yeast to be more tolerant to acetic acid, GSE16-T18 HAA1, was also studied, exhibiting superior performance in comparison to T18 for hydrolysate fermentations. Continuous experiments were conducted in a fixed bed reactor using the T18-HAA1 yeast immobilized, with different xylose concentrations (40, 60, 80 and 120 g/L) in the feed medium. The reactor was operated up to 15 days, without bacterial contamination, with yield of 0.45 g/g, productivity of 4.8 g/L.h and selectivity of 31 gethanol/gxylitol (60 g/L of xylose in the feed). For the concentrations higher than 60 g/L, the conversion decreased after 4 days of continuous operation, indicating loss of cell viability due to hazardous effect of ethanol when present at 30 g/L or more, as well as limitation of oxygen and nutrients in the system. / No processo de produção de etanol a partir da fração hemicelulósica, a utilização de xilooligômeros como substrato reduz o risco de contaminação, favorecendo o emprego da tecnologia em escala industrial. Para isso, um biocatalisador contendo xilanases, xilose isomerase (XI) e levedura co-imobilizadas em gel de alginato de cálcio foi desenvolvido e o processo de hidrólise, isomerização e fermentação simultâneos (SHIF) de xilooligômeros foi estudado. Primeiramente, as xilanases presentes no produto Multifect CX XL A03139 (XAS- 5) e a xilanase recombinante de Bacillus subtilis (XynA) foram selecionadas para compor os beads do biocatalisador. XAS-5 apresentou melhor conversão (78,7%) e maior produção de xilose na hidrólise da xilana de faia, enquanto XynA apresentou exclusiva atividade de endoxilanase. Realizou-se a imobilização e estabilização da XynA em quitosanaglutaraldeído, quitosana-glioxil e agarose-glioxil. Apesar da enzima ser eficientemente imobilizada nos três suportes, o derivado agarose-glioxil-XynA se destacou por apresentar uma estabilização notável nas condições testadas (8600 vezes). Estudos do processo SHIF foram realizados com xilana de bétula, observando-se produção de etanol (0,160 g/g e 0,092 g/L.h) e acúmulo de xilose, indicando redução da atividade da XI. Realizou-se então, um estudo para identificar possíveis inibidores da XI (pH, Ca2+, Mg2+ e XOS), constatando-se que Ca2+ é um inibidor enquanto Mg2+ é um ativador da enzima, sendo suas ações potencializadas em pHs ácidos. Comprovou-se também que XI é inibida por XOS, observando-se queda da atividade de XI (31,6%) na presença de 7,0 g/L de xilobiose. Desta forma, tornou-se interessante avaliar o processo SIF com uma levedura recombinante, capaz de expressar XI. Em ensaios em batelada, a levedura GSE16-T18 (T18), encapsulada em gel de alginato, mostrou-se eficiente na fermentação de xilose, consumindo 40 g/L de xilose em 4 h e produzindo 14,4 g/L de etanol, com rendimento de 0,422 g/g e produtividade de 3,61 g/L.h. O encapsulamento em gel de alginato de cálcio também protegeu a levedura da ação de inibidores, como o ácido acético. A T18 encapsulada foi capaz de realizar 10 ciclos consecutivos em bateladas repetidas (meio contendo extrato de levedura, peptona e 40 g/L de substrato), mantendo mesma produtividade e elevado rendimento, além de fermentar eficientemente hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, contendo 60 g/L de açúcares fermentescíveis e alto teor de inibidores. A levedura GSE16-T18 HAA1, modificada geneticamente para ser mais tolerante ao ácido acético, foi também estudada, com resultados superiores a T18 nas fermentações de hidrolisado. Fermentações em modo contínuo foram realizadas em reator de leito fixo utilizando a levedura T18-HAA1 imobilizada, com diferentes concentrações de xilose na alimentação (40, 60, 80 e 120 g/L). O reator foi operado por até 15 dias, sem ocorrência de contaminação por bactérias, com rendimento 0,45 g/g, produtividade em etanol de 4,8 g/L.h e seletividade de 31 getanol/gxilitol (60 g/L de xilose na alimentação). Para as concentrações superiores a 60 g/L, a conversão diminuiu após 4 dias de operação contínua, indicando perda de viabilidade celular devido à ação do etanol quando presente em concentrações acima de 30 g/L e da limitação de oxigênio e nutrientes no sistema.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado. Por outro lado, o BCGr pUS977dtbPW8, quando submetido a seis sub-cultivos consecutivos in vitro não apresentou diferença significativa na capacidade de expressar o DTB, demonstrando portanto a persistência da estabilidade funcional da linhagem recombinante. A estabilidade estrutural da construção pUS977dtbPW8 também foi avaliada por PCR confirmando a presença do gene dtb em colônias do BCGr pUS977dtbPW8 . Adicionalmente, foi possível avaliar preliminarmente in vitro a capacidade soroneutralizante dos soros de camundongos imunizados com BCGr pUS977dtbPW8 após 30 e 60 dias em células VERO. A ação citotóxica da toxina diftérica entre as diluições de 1/4 e 1/16 foram neutralizadas com o pool de soros imunes com 60 dias. Finalmente, em nosso estudo foi possível avaliar o potencial da vacina BCG como vetor de expressão de um antígeno de Corynebacterium diphtheriae in vitro e in vivo. / The diphtheria vaccine currently used in Brazil (DTP), despite its history of high efficacy in the prevention of diphtheria, is associated with episodes of toxicity and vaccine reactogenicity in the vaccinee, resulting from the presence in the vaccine of residual proteins derived from the production process or detoxification. Strategies for the development of new vaccines more effective and economically viable against diphtheria have been the subject of intense investigation. The alternative proposed by our group is the use of the vaccine against tuberculosis (Mycobacterium bovis BCG Moreau sub strain) as a vector for the gene that encodes the 58.3 kDa fragment B of the diphtheria toxin (DTB). In our project the dtb gene was cloned into the bifunctional vector pUS977 for cytoplasmic expression and recombinant BCG (rBCG) clones, selected after transformation of BCG, were tested for expression of the DTB polypeptide and antigenicity against polyclonal antibodies anti- diphtheria toxoid by immunoblotting. The integrity and identity of the DNA sequence encoding the dtb gene carried by the plasmid construct pUS977dtbPW8 was confirmed by DNA Sequencing and Analysis of Similarity. The immunogenicity of the rBCG expressing the DTB was investigated in BALB/c mice and the results revealed a specific seroconversion (IgG). Also, infectivity and microbicidal activity were analyzed in the intracellular environment by infecting human monocytes (THP-1 cell line) with rBCG. The data obtained indicated intracellular survival within 12 days. In this context, splenocytes collected from mice at days 30 and 60 after immunization were removed and assayed for live bacteria. The results showed that rBCG persisted viable up to 60 days in the absence of selective pressure and cell viable counts did not change significantly during testing. Additionally, the rBCG subjected to six consecutive sub-cultures in vitro showed no significant difference in the ability to express the DTB, thus demonstrating the functional stability of the recombinant vaccine. The structural stability of the construct pUS977dtbPW8 was also confirmed by PCR detection of the dtb gene in rBCG colonies. Also, it was possible to have a preliminary evaluation of the neutralizing capacity of sera from mice immunized with BCGr 30 and 60 days after immunization. The cytotoxic action of diphtheria toxin, between dilutions 1/ 4 and 1/16, was neutralized by mice sera in an in vitro assay using VERO cells. Finally, in our study it was possible to evaluate the potential of BCG as a vector for expression of an antigen of Corynebacterium diphtheriae in vitro and in vivo.