O aumento na procura por produtos naturais pelo mercado farmacêutico, cosmético e alimentício demanda pesquisas no desenvolvimento desses produtos. Esses são direcionados à obtenção de substâncias de origem vegetal ou animal, assim como, para produtos biotecnológicos. Investigações quanto à atividade antibacteriana de proteínas e peptídeos são realizadas. Dentre essas substancias, podemos citar as lisozimas, proteínas que hidrolisam as ligações β 1-4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglicosamina, presentes no peptidoglicano da parede celular bacteriana. Além disso, apresentam atividade de quitinase, ou seja, quebram a ligação glicosídica da quitina presente na parede fúngica. As lisozimas apresentam alta especificidade pela parede microbiana indicando aparente ausência de efeitos tóxicos aos humanos. Assim, tornando-a candidata a agente antimicrobiano em formulações cosméticas e farmacêuticas. A lisozima de ovo de galinha tem atividade antimicrobiana, entretanto não havia estudos relacionados com os micro-organismos contaminantes normalmente encontrados em produtos farmacêuticos e cosméticos. Além disso, a lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1) não possui ainda sua atividade antimicrobiana definida. Os objetivos do trabalho foram:1) Obtenção da lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1); 2) Avaliação a atividade antimicrobiana da MdL1 e de lisozima de ovo de galinha, Hen Egg White Lysozyme (HEWL), frente à Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Avaliação da toxicidade da lisozima em cultura de células de fibroblastos (ATCC CCL-92). A MdL1 foi obtida por meio de expressão gênica em Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrada utilizando polietilenoglicol 6000 e dialisada contra água deionizada através da membrana com porosidade seletiva de 12kDa. A homogeneidade foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes; e a atividade catalítica foi avaliada utilizando células liofilizadas de Micrococcus luteus como substrato. A atividade antimicrobiana foi determinada por método específico para cada enzima. A toxicidade in vitro das amostras foi avaliada pela viabilidade celular de fibroblastos ATCC CCL-92. A MdL1 obtida apresentou características de homogeneidade adequadas e atividade de 108,35 U/mg. A HEWL mostrou-se ativa contra S. aureus, M. luteus e C. albicans. A MdL1 apresentou-se ativa contra M. luteus, apenas. Devido a ausência de atividade antimicrobiana a MdL1 não foi submetida a avaliação citotóxica. Em relação à HEWL não demonstrou citotoxicidade na avaliação prévia realizada. / The increase in the search for natural products by pharmaceutical, cosmetic and food markets requires researches in these products development. These are directed to obtaining substances of vegetal or animal origin, as well as biotechnological products. The research in relation to antibacterial activity of proteins and peptides is carried out. Among these substances, it is possible to mention the lysozyme, protein that catalyze the break of 1,4-beta-D glucosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetilglicosamine which are present in peptidoglicane of the bacterial cell wall. Besides, there is kitinase activity, that is, they break the glicosidic bond of chitin which is present in fungal wall. The lysozymes show high specificity by microbial wall indicating apparent absence of toxicological effects to human beings. Therefore, it becomes the candidate to antimicrobial ingredient in cosmetic and pharmaceutical dosage forms. The hen egg white lysozyme has antimicrobial activity, however there were no studies related to spoiled microorganism usually found in pharmaceutical and cosmetic products. In addition, there were not studies about microbial activity of recombinant Musca domestica lysozyme 1 (MdL1). The aim of this research was: 1) To obtain MdL1; 2) Evaluation of MdL1 and hen egg white lysozyme (HEWL) antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Evaluation of lysozyme toxicity in fibroblast cells culture (ATCC CCL-92). The MdL1 was expressed as recombinant protein in Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrated using polyethylene glycol 6000 and dialyzed against deionized water through the selective porosity of 12kDa membrane. The homogeneity was analyzed by electrophoresis in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the catalytic activity was evaluated using lyophilized cells of Micrococcus luteus as substract. The antimicrobial activity was evaluated using specific methods for each enzyme. The sample toxicity was evaluated by cell viability using ATCC CCL-92 fibroblasts. The MdL1 obtained presented suitable homogeneity characteristics and activity of 108.35 U/mg. The HEWL has showed activity against S. aureus, M. luteus e C. albicans. MdL1 only showed activity against M. luteus. Due to the absence of antimicrobial activity of MdL1 in the evaluated concentration it was not submitted to the cytotoxicity test. Regarding HEWL, it has not showed citotoxicity in the previous test.

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O aumento na procura por produtos naturais pelo mercado farmacêutico, cosmético e alimentício demanda pesquisas no desenvolvimento desses produtos. Esses são direcionados à obtenção de substâncias de origem vegetal ou animal, assim como, para produtos biotecnológicos. Investigações quanto à atividade antibacteriana de proteínas e peptídeos são realizadas. Dentre essas substancias, podemos citar as lisozimas, proteínas que hidrolisam as ligações β 1-4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglicosamina, presentes no peptidoglicano da parede celular bacteriana. Além disso, apresentam atividade de quitinase, ou seja, quebram a ligação glicosídica da quitina presente na parede fúngica. As lisozimas apresentam alta especificidade pela parede microbiana indicando aparente ausência de efeitos tóxicos aos humanos. Assim, tornando-a candidata a agente antimicrobiano em formulações cosméticas e farmacêuticas. A lisozima de ovo de galinha tem atividade antimicrobiana, entretanto não havia estudos relacionados com os micro-organismos contaminantes normalmente encontrados em produtos farmacêuticos e cosméticos. Além disso, a lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1) não possui ainda sua atividade antimicrobiana definida. Os objetivos do trabalho foram:1) Obtenção da lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1); 2) Avaliação a atividade antimicrobiana da MdL1 e de lisozima de ovo de galinha, Hen Egg White Lysozyme (HEWL), frente à Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Avaliação da toxicidade da lisozima em cultura de células de fibroblastos (ATCC CCL-92). A MdL1 foi obtida por meio de expressão gênica em Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrada utilizando polietilenoglicol 6000 e dialisada contra água deionizada através da membrana com porosidade seletiva de 12kDa. A homogeneidade foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes; e a atividade catalítica foi avaliada utilizando células liofilizadas de Micrococcus luteus como substrato. A atividade antimicrobiana foi determinada por método específico para cada enzima. A toxicidade in vitro das amostras foi avaliada pela viabilidade celular de fibroblastos ATCC CCL-92. A MdL1 obtida apresentou características de homogeneidade adequadas e atividade de 108,35 U/mg. A HEWL mostrou-se ativa contra S. aureus, M. luteus e C. albicans. A MdL1 apresentou-se ativa contra M. luteus, apenas. Devido a ausência de atividade antimicrobiana a MdL1 não foi submetida a avaliação citotóxica. Em relação à HEWL não demonstrou citotoxicidade na avaliação prévia realizada. / The increase in the search for natural products by pharmaceutical, cosmetic and food markets requires researches in these products development. These are directed to obtaining substances of vegetal or animal origin, as well as biotechnological products. The research in relation to antibacterial activity of proteins and peptides is carried out. Among these substances, it is possible to mention the lysozyme, protein that catalyze the break of 1,4-beta-D glucosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetilglicosamine which are present in peptidoglicane of the bacterial cell wall. Besides, there is kitinase activity, that is, they break the glicosidic bond of chitin which is present in fungal wall. The lysozymes show high specificity by microbial wall indicating apparent absence of toxicological effects to human beings. Therefore, it becomes the candidate to antimicrobial ingredient in cosmetic and pharmaceutical dosage forms. The hen egg white lysozyme has antimicrobial activity, however there were no studies related to spoiled microorganism usually found in pharmaceutical and cosmetic products. In addition, there were not studies about microbial activity of recombinant Musca domestica lysozyme 1 (MdL1). The aim of this research was: 1) To obtain MdL1; 2) Evaluation of MdL1 and hen egg white lysozyme (HEWL) antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Evaluation of lysozyme toxicity in fibroblast cells culture (ATCC CCL-92). The MdL1 was expressed as recombinant protein in Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrated using polyethylene glycol 6000 and dialyzed against deionized water through the selective porosity of 12kDa membrane. The homogeneity was analyzed by electrophoresis in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the catalytic activity was evaluated using lyophilized cells of Micrococcus luteus as substract. The antimicrobial activity was evaluated using specific methods for each enzyme. The sample toxicity was evaluated by cell viability using ATCC CCL-92 fibroblasts. The MdL1 obtained presented suitable homogeneity characteristics and activity of 108.35 U/mg. The HEWL has showed activity against S. aureus, M. luteus e C. albicans. MdL1 only showed activity against M. luteus. Due to the absence of antimicrobial activity of MdL1 in the evaluated concentration it was not submitted to the cytotoxicity test. Regarding HEWL, it has not showed citotoxicity in the previous test.

Mobilização inadequada de células progenitoras hematopoéticas (CPH) tem sido observada em 10 - 30% dos pacientes submetidos a transplante de medula óssea (TMO) autogênico para tratamento de doenças onco-hematológicas. Os fatores relacionados com má resposta à mobilização ainda não estão totalmente estabelecidos. Apresentamos uma análise retrospectiva de pacientes submetidos à TMO autogênico com o objetivo de identificar variáveis associadas com resposta ruim ao regime de mobilização utilizado. Casuística e Métodos: Fizeram parte desta análise 307 pacientes com diferentes diagnósticos, tratados com TMO autogênico em uma única Instituição, no período de Abril de 2001 a Abril de 2007. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a um único regime de mobilização baseado na administração de ciclofosfamida (dose total de 60-120 mg/kg de peso IV) e fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) (dose diária de 6 - 17 ug/(kg de peso)/dia SC). O sucesso na resposta ao regime de mobilização foi definido quando um número maior ou igual a 2,0x10 (6) células CD34 + /(kg de peso) foi coletado do sangue periférico com até três procedimentos de leucaférese. Resultados: Dos pacientes analisados, 260 apresentaram sucesso na mobilização (84,7%). Nestes pacientes, um número mediano de 3,67 (2,0 - 46,0) células CD34+ /(kg de peso) foi coletado por paciente com um número mediano de 1 (1-3) procedimento de leucaférese. O insucesso na mobilização foi observado em 47 pacientes (15,3%): 24 (7,8%) que foram submetidos à coleta de CPH de sangue periférico, porém não coletaram número maior ou igual 2,0x10 (6) células CD34+/(kg de peso) com pelo menos três procedimentos de leucaférese; e, 23 (7,5%) foram submetidos à coleta de CPH por punção da medula óssea, por não terem atingido número mínimo de 10 células CD34+/mm3 no sangue periférico para realização de leucaférese. De acordo com análise univariada, os fatores associados com o insucesso foram: diagnóstico (P < 0,0001), tempo de doença (P < 0,0001), número prévio de ciclos de quimioterapia (P = 0,0001), exposição prévia a agentes alquilantes (P = 0.0003) e a mitoxantrone (P = 0,0006), contagem de plaquetas pré-mobilização <150.000/mm3 (P = 0,0006) e intervalo entre o início da mobilização e o pico de células CD 34+ no sangue periférico (P < 0,0001). Idade, sexo, atividade da doença e envolvimento medular ao início da mobilização, tratamento prévio com radioterapia e exposição a análogos da platina não mostraram correlação significativa na resposta à mobilização. Após análise multivariada, as variáveis que permaneceram associadas com insucesso na mobilização foram: diagnóstico (P = 0,0232), número prévio de ciclos da quimioterapia (P = 0,0167), tratamento prévio com mitoxantrone (P = 0,0285) e contagem de plaquetas pré-mobilização < 150.000/mm3 (P = 0,0423). Conclusão: A carga cumulativa de quimioterapia administrada, exposição prévia à mitoxantrone, contagem de plaquetas pré-mobilização e diagnóstico foram os fatores independentes relacionados com a falha na resposta à mobilização. Os achados obtidos podem auxiliar no reconhecimento de pacientes de risco para resposta ruim à mobilização e permitir um planejamento alternativo ou mais agressivo no regime de mobilização para este grupo de pacientes. / Inadequate stem cells mobilization is seen in 10-30% of patients undergoing autotransplantation for hematologic malignancies. Factors affecting peripheral blood progenitor cell (PBSC) mobilization have not been clearly established. We retrospectively reviewed the data of patients treated by autologous bone marrow transplantation (BMT) with the aim to identify factors associated with poor PBSC mobilization. Design and Methods: We evaluated 307 patients with different diagnoses, submitted to autologous BMT between April 2001 and April 2007. PBSC were collected following mobilization with cyclophosphamide (60-120 mg/kg of weight IV) and granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) (dose of 6-17 ug/kg of weight/day SC). Success in mobilization was defined when > ou = a 2,0x10(6) CD34+ cells/(kg weight) could be collected from the peripheral blood with a maximum of three leukapheresis procedures. Clinical and laboratory parameters at the time of mobilization were analyzed for correlations with the number of CD34+ cells collected. Results: Two hundred and sixty patients (84.7%) presented success in mobilization. In this group, a median of 3.67 (2.0-46.0) CD34+ cells/(kg weight) was collected per patient in a median of 1(1-3) leukapheresis procedure. Poor response to mobilization was observed in 47 patients (15.3%): 24 (7.8%) were submitted to PBSC collection but didn\'t collected at least 2.0 x 106 CD34+ cells/(kg weight) with three leukapheresis procedures and 23 (7.5%) didn\'t reach an absolute number count of 10 CD34+ cells/mm3 in the peripheral blood to start collection by leukapheresis. In univariate analysis poorer PBSC mobilization was associated with diagnosis (Pp < 0.0001), time interval from the diagnosis to mobilization (P < 0.0001), number of cycles of previous chemotherapy (P = 0.0001), previous treatment with alkylating agents (P = 0.0003) and mitoxantrone (P = 0.0006), platelet count <150.000/mm3 before mobilization (P = 0.0006) and interval between mobilization and peak of CD34+ cells in peripheral blood (P < 0.0001). No significant correlation was found with age, gender, disease status, marrow involvement at mobilization, prior radiation therapy and exposition to platin analogues. In the stepwise regression model, diagnosis (P = 0.0232), number of cycles of previous chemotherapy (P = 0.0167), previous treatment with mitoxantrone (P = 0.0285) and platelet count <150.000/mm3 before mobilization (P = 0.0423) were found to be independent negative predictive factors for CD34+ cells mobilization. Conclusion: Cumulative load of chemotherapy, exposition to Mitoxantrone, platelet count just prior to mobilization and diagnosis were independent factors related to poor progenitor cells mobilization. These results could help in the previously recognition of patients at risk for poor or no response to mobilization and allow to plan an alternative or more aggressive regimen for this group of patients.

INTRODUÇÃO: Não há tratamento ideal para o bócio multinodular (BMN). A cirurgia é o método mais utilizado, por proporcionar uma redução imediata do volume tiroidiano (VT), dos sintomas compressivos e permitir um diagnóstico histológico definitivo. O iodo radioativo (I¹³¹) é considerado uma excelente opção terapêutica em situações de contra-indicação cirúrgica ou recusa do paciente a este método. Entretanto doses elevadas de I¹³¹ são utilizadas para obtenção de resultados satisfatórios na redução do VT. Esta estratégia leva a uma maior exposição dos pacientes à radiação ionizante e a um maior custo devido à necessidade de internações. Administração prévia do TSH humano recombinante (rhTSH) ao I¹³¹ no tratamento do BMN, permite a utilização de doses menores deste radiofármaco, obtendo resultados satisfatórios na redução do VT e em menor tempo. Porém esta associação pode acentuar efeitos colaterais descritos neste tipo de terapia. OBJETIVOS: Avaliar a efetividade e segurança de pequenas e diferentes doses do estímulo prévio do rhTSH ao I¹³¹ em dose fixa, no tratamento do BMN. PACIENTES e MÉTODOS: Trinta portadores de BMN foram divididos em três grupos de 10 pacientes. Os pacientes do grupo I foram estimulados previamente com 0,1 mg de rhTSH ; Os pacientes do grupo II com 0,01 mg e o grupo III foi caracterizado como controle. Todos os participantes do estudo foram submetidos à mesma dose terapêutica de I¹³¹. As variáveis medidas foram: captação do I¹³¹ às 24 horas; VT e a menor área seccional transversal da traquéia (MATT) avaliados através da ressonância magnética (RM), antes, 2, 7, 180 e 360 dias, após o tratamento; dosagens seriadas de T3 total, T4 livre, TSH e anticorpos anti-tiroidianos. RESULTADOS: Após seis meses da terapia actínica houve redução no VT de 30,3 ± 16,5 % no grupo I, 22,6 ± 14,5 % no grupo II e 5,0 ± 14,6 % no grupo controle (p=0,01). Aos 12 meses de seguimento o VT reduziu 39,2 ± 16,9 % no grupo I, 38,8 ± 24,4% no grupo II e 23,4 ± 23,59 % no grupo controle (p=0,205). Houve elevação dos níveis dos hormônios tiroidianos e consequente redução das medidas de TSH nos primeiros trinta dias de maneira similar entre os grupos, porém em valores não considerados como tireotoxicose na maioria dos pacientes. Após doze meses do I¹³¹, oito pacientes desenvolveram hipotiroidismo, sendo três no grupo I, três no grupo II e dois no grupo placebo, não havendo diferença estatística entre os grupos. Os níveis de anticorpos antitireoglobulina (AATg) elevaram-se no sexto mês do estudo e retornaram aos níveis basais aos doze meses. Os níveis de anticorpos antitireoperoxidase (ATPO) foram mais elevados no grupo I que nos demais ao final do estudo. Não houve alteração significativa do VT e da MATT durante a primeira semana após o I¹³¹, em nenhum dos grupos estudados. CONCLUSÕES: O estímulo prévio do rhTSH a uma dose fixa de I¹³¹ levou a uma redução maior e mais significativa do bócio aos 6 meses de tratamento, que o uso isolado do I¹³¹. Após 12 meses esta tendência se manteve, entretanto sem significância estatística. / BACKGROUND: There is not an optimal treatment for multinodular goiter (MNG). Surgery is the main therapeutic option because it decreases thyroid volume, reduces compression symptoms and provide histological diagnosis. Radioiodine (131I) is an efficient therapeutic option for the treatment of MNG mainly when surgery is not indicated or when the patient refused it. However, high activities of 131I are frequently required for clinically significant results. This procedure increases the body radiation exposure and the hospitalization costs. Recombinant human TSH (rhTSH) allows a reduction in the administered activity of ¹³¹ I with effective thyroid volume (TV) reduction. However, this combination therapeutic can increase collateral effects. OBJECTIVE: To evaluate the efficacy and safety of low and intermediate doses of rhTSH compared to placebo, associated with a fixed activity of 131I in MNG treatment. PATIENTS and METHODS: Thirty patients with MNG received 0.1 mg of rhTSH (group I, n=10), 0.01 mg of rhTSH (group II, n=10), or placebo (control group, n=10). After 24 hours, 30 mCi of 131I was given to all patients. Radioactive iodine uptake (RAIU) was determined before and 24 hours after rhTSH. Before and 2, 7, 180 and 360 days after the TV was measured by magnetic resonance image (MRI). The smallest cross-sectional area of traqueal lumen (Scat) was also measured with MRI before, 2 and 7 days after treatment. Antithyroid antibodies, TSH, T3 and free T4 were assessed regularly. RESULTS: After 6 months, the decrease in TV was more significant in groups I (30.3±16.5%) and II (22.6±14.5%), than in control group (5.0±14.6%; p=0.01). After 12 months, TV decreased more in group I (39.2±16.9%) and group II (38.8±24.4%) than in group III (23.4±23.59%) but it was not statistically significant (p=0.205). During the first 30 days,total T3 and free T4 increased, without reaching thyrotoxic levels and TSH decreased. After 12 months, 8 patients developed hypothyroidism (3 in group I, 3 in group II and 2 in group III). Anti-thyroglobulin antibodies (anti-TG) titers increased after 6 months and returned to basal levels after 12 months similarly in all groups. There was more patients with anti-thyroperoxidase antibodies ( anti-TPO) titers incresead after 12 months on group I. There was not TV increase after ¹³¹I on the first week ,with or without rhTSH. CONCLUSION: The previous stimulus with rhTSH using a fixed 131I activity lead to a greater and more significant goiter reduction after six months of treatment than 131I alone. After twelve months this tendency was maintained, but without statistic relevance.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Adilson Bosetto 2015 PDF.pdf: 2419034 bytes, checksum: 3fdc9e711199e04fe0746f89b07c4bea (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / The application of enzymes in industrial processes, in its broad sense, has shown the market evolution for innovative alternatives for preserving the environment. Brazil has a great potential to develop some technologies, which allow the use of such materials as substratum for products with higher added value, due to the large amount of lignocellulose as waste that comes from agriculture. Therefore, the analysis of genes expression related to microbial degradation of plant cell wall has caught the researchers attention, mainly because it is associated to the possibility of controlled large-scale synthesis of enzymes applied in biofuel production. In this context, the Gram-negative bacterium C. crescentus is found as a promising microorganism for biotechnological exploitation due to its ability on degrading xylan, the major component of plant hemicellulose. There are several genes in the bacterial genome that codify to Xylanases and &#946;-Xylosidases. In order to purify and biochemically characterize the &#946;-Xylosidase III protein of C. crescentus, xynB3 gene (CCNA_00856) that contains 1,623 nucleotides and encodes a protein with conserved domains of &#946;-Xylosidase with 540 amino acid residues has been studied. Therefore, xynB3 gene was isolated from genomic DNA of C. crescentus NA1000 by Polymerase Chain Reaction (PCR) using specific primers. The single amplification product was cloned into pJet1.2Blunt vector in non-cohesive sites and reintroduced in vector of pTrcHisA expression within the reading frame to produce a histidine tag at the amino-terminus area of fusion protein. The obtained construction was denominated pTrcHis-xynB3 and the confirmation of its gene identification was figured out by the DNA sequence after insertion into the TOP10 E. coli strain and subsequent experimental tests of expression in different temperature of growth, IPTG concentrations and induction times. The recombinant protein was overexpressed into inclusion bodies, thus, in a non-soluble form. Different induction and purification protocols were used to obtain the &#946;-xylosidase III pure of C. crescentus, in native or non-native form. However, assays of enzymatic activity with different substrates neither demonstrated &#946;-xylosidase activity nor detectable levels of the protein. These results suggest that the enzyme was not active during the assays, due its expression in inclusion bodies. This suggests that this protein may have a toxic effect on E. coli when expressed at high levels. Thus, this trial contributes to additional data about the xylanolytic complex concerning the aquatic bacterium C. crescentus. / A utilização de enzimas em processos industriais, no seu sentido mais amplo, demonstra a evolução do mercado em relação a alternativas inovadoras de preservação do meio ambiente. Devido à grande quantidade de material lignocelulósico residuário, proveniente da agricultura, o Brasil é um país com elevado potencial para o desenvolvimento de tecnologias que possibilitem a utilização desses materiais como substrato para produtos de maior valor agregado. Dessa forma, o estudo da expressão de genes microbianos relacionados com a degradação da parede celular vegetal tem despertado a atenção de pesquisadores, principalmente pelo fato de estar relacionado com a possibilidade de síntese controlada e em larga escala de enzimas utilizadas na produção de biocombustíveis. Neste contexto, a bactéria gram-negativa Caulobacter crescentus encontra-se como um microrganismo promissor para a exploração biotecnológica em função da capacidade que tem de degradar o xilano, principal componente hemicelulósico das plantas. Essa bactéria contém em seu genoma vários genes que codificam para xilanases e &#946;-xilosidases. Dentre eles o gene xynB3 (CCNA_00856), que apresenta 1623 nucleotídeos e codifica uma proteína contendo domínios conservados de &#946;-xilosidase, com 540 resíduos de aminoácidos, denominada neste trabalho como &#946;-xilosidase III de C. crescentus. Com o objetivo de possibilitar em estudos futuros a caracterização bioquímica dessa proteína, foi estudado o gene xynB3. Para isso, xynB3 foi isolado a partir do DNA genômico de C. crescentus NA1000 por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando oligonucleotídeos específicos. O único produto de amplificação foi clonado no vetor pJet1.2blunt em sítios não coesivos e reintroduzido no vetor de expressão pTrcHisA dentro do quadro de leitura para a produção de uma cauda de histidinas na região amino-terminal da proteína de fusão. A construção obtida foi denominada pTricHis-xynB3 e após confirmação da identidade da mesma por sequenciamento de DNA foi inserida na cepa TOP10 de Escherichia coli e submetida a ensaios experimentais de expressão com diferentes temperaturas de crescimento, concentrações de IPTG e tempos de indução. A proteína recombinante foi super-expressa em corpos de inclusão, portanto, em uma forma não solúvel. Diferentes protocolos de indução e purificação foram empregados para obtenção da &#946;-xilosidase III de C. crescentus pura, em forma nativa ou não nativa. Entretanto, nos ensaios de atividade enzimática, com diferentes substratos, foram obtidos níveis de atividade de &#946;-xilosidase não detectáveis pelas ferramentas utilizadas. Esses resultados sugerem que a enzima não se mostrou ativa durante os ensaios, em função da formação de corpos de inclusão. Isso leva a crer que essa proteína pode apresentar efeito tóxico para E. coli quando expressa em níveis elevados. Assim, este trabalho contribui com dados adicionais a cerca do complexo xilanolítico da bactéria aquática C. crescentus.

Uma abordagem promissora para a obtenção de coquetéis enzimáticos eficientes para a etapa de hidrólise na produção de etanol de 2ª geração é o enriquecimento em termos de atividades que lhes faltam, mas podem ser obtidas através de sistemas heterólogos. O trabalho teve como objetivo avaliar o sistema toxina -antitoxina (TA) para estabilização plasmidial em E. coli na produção de expansina e endoglucanase recombinantes. Os resultados indicaram que o sistema de expressão com estabilização TA é tão eficaz quanto o dependente de antibiótico para estabilização plasmidial. Além disso, mostrou-se mais eficiente pelo fato de não permitir a sobrevivência de células sem o plasmídeo. Estudos indicaram a quantidade mínima de 0,05mM de IPTG para expressão das proteínas nesta linhagem, cerca de 20 vezes menos que a concentração usualmente aplicada no momento da indução. Sendo assim, o sistema de estabilização plasmidial TA mostrou-se uma ótima ferramenta para o desenvolvimento de uma plataforma alternativa para a produção de proteínas recombinantes. / A promising approach to obtain efficient enzyme cocktails for the hydrolysis step in the production of 2nd generation ethanol is the enrichment in terms of activities that are lacking, but can be obtained by heterologous systems. The study aimed to evaluate the toxina-antitoxin (TA) system for plasmid stabilization in E. coli in the production of recombinant expansin and endoglucanase. The results indicated that the expression system with TA stabilization is as effective as the antibiotic dependent for plasmid stabilization. Moreover, it proved to be more efficient by not allo wing the survival of cells without the plasmid. Studies have indicated the minimum amount of 0.05 mM IPTG for expression of proteins in this strain, about 20 times less than the concentration usually applied for induction. Thus, the plasmid stabilization TA system proved to be a great tool for the development of an alternative platform for producing recombinant proteins.

O cDNA da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) foi clonado em vetores plasmidiais (indutíveis) contendo ou não o cDNA do sinal de secreção BiP e da resistência ao antibiótico higromicina B. Esses vetores foram transfectados em células S2 e foram obtidas populações e subpopulações. A população S2MTGPV-H apresentou níveis 5x maiores na expressão da GPV em análise por FACS (~ 50% das células) e por ELISA (~ 0,65 µg/107 células). A seleção de subpopulações permitiu um aumento de aproximadamente 10x na expressão da GPV, especialmente na população S2MTGPV*-H. O tratamento com NaBu resultou em uma redução de aproximadamente 20% no crescimento celular e um aumento de 50% na GPV expressa pela população S2MTGPV*-H (~ 8,3 µg/107 células). O meio de cultura SF900 II permitiu um maior crescimento das células S2MTGPV*-H e uma maior síntese de GPV comparado com outros meios de cultura. Nossos dados mostram que a expressão da GPV pôde ser otimizada através da construção de vetores de expressão/seleção, subpopulações, da exposição da cromatina e do meio de cultura utilizado. / The cDNA encoding the entire rabies virus glycoprotein (RVGP) gene was cloned in plasmids (inductive) with or without a cDNA coding for the secretion signal and coding for the selection hygromicin antibiotic. These vectors were transfected into S2 cells and we had obtain cells populations and subpopulations S2MTRVGP-H cell population were shown to express 5 times higher of RVGP as evaluated by FACS (~ 50 %) and ELISA (~ 0.65 mg/107 cells at day 7). Sub-population selection allowed a higher RVGP expression, especially for the S2MTRVGP*-H. NaBu treatment leading to lower cell growth and higher RVGP expression allowed an even higher RVGP synthesis by S2MTRVGP*-H (~ 8.3 mg/107 cells at day 7 after induction). SF900II medium leading to a higher S2MTRVGP*-H cell growth allowed a higher final RVGP synthesis in this cell culture. The data show that RVGP synthesis may be optimized by the expression/selection vectors design, cell sub-populations selection, chromatine exposure and culture medium employed.

O interesse em células de inseto para a produção de proteínas complexas se deve a sua maior facilidade de cultivo e ao padrão equivalente de glicosilação quando comparado aos sistemas com células de mamíferos. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores que limitam ou inibem a produção da glicoproteína do vírus rábico (GPV) expressa na membrana citoplasmática de células de Drosophila melanogaster transfectadas, quando cultivadas em biorreator de bancada agitado e bubble-free, operado em modo descontínuo. Avaliaram-se as influências de oxigênio dissolvido (5 &lt; pO2 &lt;80%), da glicose (1 &lt; GLC0 &lt; 15g/L) e da glutamina (0.6 &lt; GLN0 &lt; 7g/L). Essas variáveis afetaram de forma diferenciada o crescimento celular (produção de células e velocidades específicas-&#181;X), o metabolismo celular (fatores de conversão - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN, YALA/GLN), assim como a expressão da proteína recombinante (concentração, teor celular e produtividade). O aumento do pO2 reduziu em 9 vezes o crescimento celular mas aumentou o teor celular de GPV em 1,4 vezes. Baixos valores de GLC0 e GLN0, claramente, limitaram o crescimento, de modo que incrementos na concentração desses substratos, até valores intermediários, aumentaram &#181;X,MAX em 3 vezes e 2,5 vezes, respectivamente, e a produção de células em 11 vezes e 3 vezes, respectivamente. O teor celular de GPV máximo não foi afetado pela GLC, mas aumentou em 100% para valores de GLN0 igual ou superiores a 3,5 g/L. As concentrações de lactato produzidas foram consideradas baixas (inferiores a 0,8 g/L) para exercer qualquer efeito de inibição sobre o crescimento ou a expressão da proteína. Por sua vez, as concentrações de amônio parecem inibir tanto a produção de GPV (NH4+~50mg/L) quanto o crescimento celular (NH4+~80mg/L). A condição de cultivo com de 30% de pO2, 10 g/L de GLC0 e 3,5 g/L de GLN0 resultou nos maiores valores de produtividade (9,1 &#181;g/L.h) e de concentração de GPV (1,2 mg/L). O metabolismo de GLC e GLN apresentou grande interdependência, com alterações em GLC0 afetando o metabolismo de GLN e vice-versa. Assim, em condições de excesso de GLC0, as células apresentaram um metabolismo mais ineficiente com reduções nos fatores YX/GLC (2,3 vezes) e YX/GLN (4,6 vezes) e maior geração de subprodutos, caracterizada por incrementos nos valores de YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) e YNH4/GLN (15%). O metabolismo da GLN apresentou resposta característica de substrato em excesso para toda a faixa de valores ensaiada, com redução de 25 vezes no valor de YX/GLN e inesperadamente também uma redução na geração de subprodutos de 7 vezes para YNH4/GLN e 12 vezes para YALA/GLN. O efeito sobre o metabolismo da GLC foi mais acentuado para valores mais elevados de GLN0, com redução de 3,6 vezes para YX/GLC e incrementos de 70% para YALA/GLC e para YLAC/GLC. Os resultados sugerem ainda que a célula utiliza duas vias para metabolizar a glutamina: glutaminólise, em condição de limitação em GLC; ou glutamato sintase - NADH-GOGAT, em condição de excesso em GLC. A célula demonstrou também capacidade de sintetizar GLN, a partir de amônio ou outros aminoácidos, quando atingiu concentrações abaixo de 50 mg/L. / The interest in using insect cells to produce complex proteins is due to its ease of cultivation and its glycosylation pattern equivalent to that of mammalian cells systems. The objective of this work was to identify the limiting or inhibiting factors for the production of a rabies virus glycoprotein (RVGP), expressed in the cytoplasmatic membrane of a transfected Drosophila melanogaster S2 cells, when cultivated in a bench stirred bubble-free bioreactor, in batch mode. The influence of dissolved oxygen (5 &lt; pO2 &lt; 80%), of initial glucose concentration (1 &lt; GLC0 &lt; 15 g/L) and of initial glutamine concentration (0.6 &lt; GLN0 &lt; 7 g/L) was evaluated. These variables affected in a different way cell growth (cell production and specific growth rate - &#181;X), cell metabolism (yield factors - YX/GLC, YX/GLN, YLAC/GLC, YALA/GLC, YNH4/GLN and YALA/GLN), as well as the recombinant protein expression (RVGP concentration, RVGP cell content and RVGP productivity). pO2 increase reduced 9 times cell growth, but increased 1.4 times RVGP cell content. Low initial glucose and glutamine concentrations clearly limited the cell growth, in such a way that raising these substrates concentrations up to intermediate values, increased &#181;X,MAX 3 times and 2.5 times, respectively, and increased cell production 11 times and 3 times, respectively. The maximum RVGP cell content was not affected by GLC0, but improved 100% when GLN0 was 3.5 g/L or higher. The concentrations of produced lactate were considered low (below 0.8 g/L) to cause any inhibition effect on growth or protein expression. On the other hand, ammonium concentrations seem to inhibit RVGP production (NH4+~50 mg/L), as well as cell growth (NH4+~80 mg/L). Maximum productivity values (9.1 &#181;g/L.h) and RVGP concentration (1.2 mg/L) were attained for 30% pO2, 10 g/L of GLC0 and 3.5 g/L of GLN0 run. The metabolism of GLC and GLN showed a great interdependence, with GLC0 changes affecting the GLN metabolism, and viceversa. Thus, in glucose excess condition, cell metabolism was less efficient. This implied in reduction of yield factors - YX/GLC (2.3 times) e YX/GLN (4.6 times) - and in higher by-products generation, characterized by augmentation in YALA/GLC (51%), YLAC/GLC (11%) and YNH4/GLN (15%). The glutamine metabolism showed a substrate excess response pattern to the whole range of concentration studied, with reduction of YX/GLN (25 times) and, unexpectedly, a reduction of by-products liberation - YNH4/GLN (7 times) and YALA/GLN (12 times). The effect on glucose metabolism was more intense when the glutamine concentration was higher, showing a 3.6 times diminution YX/GLC and a 70% augmentation for YALA/GLC and YLAC/GLC. The results suggest that cells metabolize glutamine through two different pathways glutaminolysis, under glucose limitation, or glutamate synthase - NADH-GOGAT, under glucose excess. The cell, proved also to be able to synthesize glutamine from ammonium or other amino acids, when it reached concentrations below 50 mg/L.

Les effets anti-allergiques des bactéries lactiques sont suggérés par plusieurs études épidémiologiques, des essais cliniques et des modèles expérimentaux d’allergie. Cependant, les propriétés immunomodulatrices des bactéries lactiques sont sous-exploitées par les stratégies vaccinales développées pour combattre l’allergie et les mécanismes empruntés par ces bactéries pour moduler l’allergie restent peu caractérisés. Dès lors, nous avons caractérisé les propriétés immunomodulatrices qu’exerce Lactobacillus plantarum NCIMB8826, une bactérie lactique modèle, sur la cellule dendritique étant donné le rôle déterminant de cette cellule sur la réponse allergique. Nous montrons que L. plantarum induit une forte sécrétion d’IL-12 p40, d’IL-12 p70, de TNF-a mais une faible production d’IL-10. Cette faculté à induire la sécrétion de cytokines polarisantes dépend de TLR2, de TLR9, de MyD88, de NF-kB, des MAPKs (en particulier JNK, p38 et ERK 1/2), de la composition de l’acide lipotéichoïque de L. plantarum et de CD14. Nous montrons aussi que l’ADN génomique de L. plantarum est un agoniste de TLR9 et que CD14 et CD36 facilitent la liaison de la cellule dendritique avec L. plantarum. Ensuite, nous avons évalué le potentiel vaccinal d’une coadministration L. plantarum + Der p 1 dans un modèle murin d’allergie à Der p 1. Cette formulation vaccinale prévient la production d’IgE Der p 1-spécifique et atténue l’éosinophilie pulmonaire tout en stimulant une forte production d’anticorps IgG2a Der p 1-spécifiques et d’IFN-g par les cellules spléniques. Ces effets bénéfiques nous ont conduit à élaborer une bactérie lactique recombinante dérivée de L. plantarum produisant Der p 1 pour la vaccination contre l’allergie aux acariens. La forme antigénique que nous avons réussi à faire produire par L. plantarum correspond à une protéine de fusion entre la Maltose Binding Protein de E. coli et ProDer p 1 (le zymogène de Der p 1), la présence de ce partenaire de fusion étant indispensable à la production de ProDer p 1. En prophylaxie, la vaccination par cette bactérie recombinante prévient la production d’anticorps IgE-Der p 1-spécifiques et stimule la production d’anticorps IgG2a spécifiques, reproduisant les effets de la coadministration L. plantarum + Der p 1. Elle réduit de manière drastique la production d’IL-5 des cellules spléniques et des cellules ganglionnaires médiastinales et prévient l’éosinophilie pulmonaire mais n’a pas d’effet sur l’hyperréactivité bronchique. Der p 1 étant un des allergènes d’acarien les plus immunodominants, cet ensemble de données montre donc que cette bactérie recombinante constitue un vaccin prophylactique prometteur pour la prévention de l’allergie aux acariens. Des résultats préliminaires obtenus à partir de cellules dendritiques humaines et lymphocytes T autologues montrent la forte capacité de cette bactérie recombinante à induire le développement d’une réponse Th1 fortement polarisée (production d’IFN-g en l’absence de production d’IL-4 et d’IL-5), ce qui suggère que l’utilisation de cette bactérie recombinante pourrait être envisagée pour le traitement de l’allergie chez l’homme.