Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Human parathyroid hormone (hPTH) is a polypeptide with 84 amino acids and it is the most important peptide regulator for calcium and phosphate ion homeostasis, maintaining bone structure. Recombinant human parathyroid hormone, rhPTH (1-34), produced by DNA technology in Escherichia coli contain the active amino-terminal fragment of the full length hPTH and is currently being used worldwide for the treatment of osteoporosis at high risk of fractures in postmenopausal women and men with osteoporosis primary or hypogonadal. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid chromatography (SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH 1-34) in biopharmaceutical formulations. A gradient RP-LC method was carried out on a Zorbax 300 SB C18 column (150 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 40 ºC. The mobile phase A consisted of 0.1 M sodium sulphate buffer, pH 2.3, and the mobile phase B was acetonitrile. The SE-LC method was carried out on a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7.8 mm i.d.), maintained at 25 ºC. The mobile phase consisted of 0.1 M phosphoric acid buffer, pH 2.5, run isocratically at a flow rate of 0.7 mL/min. Cromatographic separation was obtained with retention times of 12.2 min, and 13.2 min, and was linear over the concentration range of 1-250 μg/mL (r 2 = 0.9997) and 2-300 μg/mL (r 2 = 0.9993), respectively, for RP-LC and SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The limits of detection and quantitation were 0.44 and 1.47 μg/mL, respectively, for the RP-LC and 0.79 and 2.63 μg/mL, for the SE-LC. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.49% and 100.22%, with bias lower than 1.12% and than 0.81%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of related proteins and higher molecular weight forms showed significant differences (p< 0.05) compared to intact molecule. The validated methods were applied for the determination of rhPTH and related proteins in biotechnology-derived products, giving lower mean differences of the estimated content/potencies of 0.64% and 1.31% for the RP-LC and SE-LC related to the in vivo bioassay, and of 0.98% and 0.31% higher, compared to the in vitro cell culture assay, respectively. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biotechnology-derived medicine. / O hormônio da paratireóide humano (hPTH) é um polipeptídio constituído de 84 aminoácidos e tem função essencial como regulador da homeostase dos íons cálcio e fosfato, e manutenção da estrutura óssea. O hormônio da paratireóide humano recombinante, rhPTH (1-34), é produzido pela tecnologia do DNA em Escherichia coli, apresenta a sequência de aminoácidos responsável pela porção biologicamente ativa do paratormônio natural e é usado clinicamente para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pósmenopausa e de homens com osteoporose primária ou hipogonadal. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de rhPTH (1-34) em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método por CL-FR, foi utilizada coluna Zorbax 300 SB C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 40 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,1 M, pH 2,3, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas em gradiente. No método por CL-EM foi utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i.), mantida a 25 ºC. A fase móvel foi contituída de tampão ácido fosfórico 0,1 M, pH 2,5, eluída em vazão isocrática de 0,7 mL/min. Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 12,2 e 13,2 min, sendo linear na faixa de concentração de 1-250 μg/mL (r2 = 0,9997) e 1-300 μg/mL (r2 = 0,9993), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e quantificação foram 0,44 e 1,47 μg/mL, respectivamente, para o método por CL-FR e 0,79 e 2,63 por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,49 e 100,22, com bias inferior a 1,12 e 0,81, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p<0,05). O métodos propostos foram aplicados para avaliação da potência de rhPTH (1-34) e de proteínas relacionadas em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com os bioensaios, observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,64% e 1,31% inferiores para os métodos por CL-FR e CL-EM, em relação ao bioensaio in vivo, e 0,98% e 0,31% superiores, respectivamente, em relação ao in vitro. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.

La famille des NADPH oxydases est constituée de complexes multi protéiques, dont un des composants est la sous unité catalytique NOX. Il s'agit de protéine transmembranaire qui assure le transport des électrons à travers la membrane, à partir d'un donneur d'électrons, le NADPH, à un accepteur final, l'oxygène moléculaire. Il en résulte la production de superoxydes, précurseur d'espèces réactives de l'oxygène. Les NOX sont impliquées dans divers processus physiologiques et pathologiques qui les ont placés au rang des cibles thérapeutiques à forte valeur ajoutée.Les NOX sont reportées comme des protéines membranaires propres aux eucaryotes supérieures. Ainsi toutes les données fonctionnelles disponibles pour cette famille d'enzyme, ont été le fruit des études structure-fonction et de données putatives indirectes. D'où l'idée et l'intérêt d'identifier chez les procaryotes des candidats homologues aux Nox eucaryotes et susceptibles d'être de bons modèles pour des études structurales. En se servant d'outils bio-informatiques, nous avons définis des signatures de séquences propres aux NOX et avons identifié chez les procaryotes des centaines de séquences homologues. SpNox de chez Streptococcus Pneumoniae, a été sélectionnée et surexprimée chez E. Coli. SpNox a été purifiée et a fait l'objet d'une caractérisation fonctionnelle et biochimique approfondie. Au vue des résultats obtenus, SpNox se rapproche de part ses propriétés structurales et mechanistiques des NOX eucaryotes. Ainsi elle se présente comme le premier modèle procaryote de protéine NOX. Les premiers cristaux de cette famille de protéines ont été obtenus et son rôle in vivo reste à exploiter.En parallèle à l'approche procaryote, nous avons mené une étude structure-fonction sur la protéine NOX2 des neutrophiles PLB-985. Deux arginines conservées chez toutes les NOX eucaryotes ont été sélectionnées et leur rôle a été étudié par mutagenèse dirigée. Apres évaluation des propriétés enzymatiques des mutants NOX2, nous avons pu identifier l'arginine 513 comme étant impliquée dans la spécificité de NOX2 vis a vis du NADPH. Ces résultats nous ont permis de proposer une nouvelle orientation du NADPH dans son site d'ancrage à la protéine NOX2. / The NADPH oxidase complex was the first identified example of a system that generates reactive oxygen species in a dedicated manner. NOX are proteins involved in the transmembrane transfer of electrons to the molecular oxygen, resulting in the production of superoxides. In addition to ROS related damages, deregulation of Nox-dependant ROS production induces pathological consequences. Accordingly, the Nox family became a potential drug target, making the understanding of their function at molecular basis crucial.In the literature, it has always been reported that Nox proteins exist only in eukaryotes. Since eukaryotic membrane proteins have proven to be difficult to study, all the data available on Nox enzymes are obtained from putative assignments or structure-function studies.In our project, to overcome the difficulty of working on eukaryotic membrane proteins, we used an original approach based on bioinformatics tools. Through using specific filters and a novel program, we were able to identify hundreds of prokaryotic candidates. Among them, we selected SpNox, as a prokaryotic model from Streptococcus Pneumoniae. We have developed its expression in E. Coli as well as a multistep purification scheme. We also conducted an extensive enzymatic and mechanistic characterization of the purified enzyme. Our data support a strong structural and functional homology with known NOX enzymes. Finally, crystallization trials are performed leading to first crystals ever obtained for this family of protein. The understanding of Nox's physiological function in bacteria remains to investigate.In parallel to the prokaryotic approach, a structure-function study was conducted on the human model NOX2 in the PLB-985 neutrophils. Conserved arginines among eukaryotic Nox sequences were selected. Site directed mutagenesis followed by activity tests, lead us to identify a crucial role for arginine 513. It is implicated in the specificity towards NADPH as an electron donor for NOX2. With these data, we were able to suggest a new orientation of the NADPH, notably the phosphate moiety, in the binding site.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Erythropoietin is a endogenous glycoprotein which stimulates the erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of renal anaemia. The chromatographic method for the potency evaluation of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in pharmaceutical products was validated in the present work. A size-exclusion liquid chromatography method (SE-LC) was validated using a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7,8 mm I.D.), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase consisted of 0.001 M monobasic potassium phosphate, 0.008 M dibasic sodium phosphate and 0.2 M sodium chloride buffer, pH 7.4, run isocratically at a flow rate of 0.5 mL/min with detection at 214 nm. The chromatographic separation was obtained within 30 min and it was linear in the concentration range of 5-150 μg/mL (r2=0.9991). Validation parameters were evaluated such as sensitivity, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. The specificity was evaluated by the peak purity of the Recombinant Human Erythropoietin Biological Reference Preparation of European Pharmacopoeia (rhEPO-SBR) storage under stress conditions. The proposed method was applied for the analysis of erythropoietin in pharmaceutical products, evaluating also the dimmers and high-molecular-mass forms. Moreover, was performed the analysis of erythropoietin by reversedphase liquid chromatography (RP-LC), evaluating the sulphoxides and deamidates forms. The correlation with the methods was established, showing mean differences between the estimated potencies of 2.50% lower for the bioassay, and 9.29% higher for the RP-LC, compared with the sizeexclusion liquid chromatography method, with significative correlation, conform calculated for the Pearson s correlation coefficient (r=0,9629 e r=0,9422, respectively). The alternative established represents a contribution towards the reduction or replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / A eritropoietina é uma proteína endógena que estimula a eritropoiese. É clinicamente usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foi validado método cromatográfico por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos, empregando coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7,8 mm I.D.), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel foi composta de fosfato de potássio monobásico 0,001M, fosfato de potássio dibásico 0,008M e cloreto de sódio 0,2M, pH 7,4, eluída isocraticamente, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 30 min, sendo linear na faixa de concentração de 5-150 μg/mL (r2=0,9991). Avaliaram-se os parâmetros de sensibilidade, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estudou-se também a especificidade, através da determinação da pureza do pico da Eritropoietina Humana Recombinante Substância Biológica de Referência da Farmacopéia Européia (rhEPO-SBR) submetida à degradação sob condições forçadas. O método proposto foi utilizado para análise de eritropoietina em produtos farmacêuticos, determinando-se as formas diméricas e de alta massa molecular. Paralelamente, efetuaram-se análises por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), determinando-se as formas de sulfóxidos/desamidados. Estabeleceu-se correlação entre os métodos, demonstrando que os produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias 2,50% menores pelo bioensaio, e 9,29% maiores para CL-FR, em relação ao método por cromatografia líquida por exclusão molecular, com correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de pearson (r=0,9629 e r=0,9422, respectivamente). Desse modo, pesquisou-se alternativa no contexto da redução ou substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

Submitted by Caroline Periotto (carol@ufscar.br) on 2016-10-03T12:28:31Z No. of bitstreams: 1 DissGGS.pdf: 4226904 bytes, checksum: 7820ca73512d90a4017fd20d94821cd9 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T18:49:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissGGS.pdf: 4226904 bytes, checksum: 7820ca73512d90a4017fd20d94821cd9 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T18:50:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissGGS.pdf: 4226904 bytes, checksum: 7820ca73512d90a4017fd20d94821cd9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T18:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissGGS.pdf: 4226904 bytes, checksum: 7820ca73512d90a4017fd20d94821cd9 (MD5) Previous issue date: 2015-04-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The use of Escherichia coli cultures to obtain heterologous proteins poses as a successful application of biotechnology for the production of drugs and enzymes. However, the stress caused by the synthesis of the recombinant protein as well as by the culture conditions may trigger physiological responses on the cell and also cause changes in the cell morphology, impacting on the rheology of the culture broth. This study aimed to evaluate changes in cell morphology, on the rheology of the broth and the effect of different temperatures and inducers in the cellular responses during recombinant protein production by E. coli in batch cultures. Five medium cell density cultures were conducted with two clones of rE. coli, using defined medium containing glycerol as main carbon source and different inducers (IPTG and lactose), at two different temperatures (37°C and 27°C). All experiments were performed in 5 L bench bioreactor, equipped with a monitoring and control system. Samples were collected throughout the experiments and rheological parameters were measured using a concentric cylinder rheometer. The morphological characteristics of the microorganism were also examined by optical microscopy associated with image analysis. The concentrations of cellular suspension (optical density and dry cell weight) as well as of sugars and metabolites (HPLC), the plasmid retention (subculture on plates with and without antibiotic), the concentration of viable cells (colony forming units), the production of recombinant protein (densitometry), the concentration of soluble proteins (Bradford protein assay) and the presence of polysaccharide in the broth (phenol–sulfuric method) were also monitored. It was found that broths, initially behaving as Newtonian fluids, undergo a change in rheological behavior during the growth phase, exhibiting a Bingham fluid behavior. During the induction phase, the consistency index and the initial shear stress seemed to follow the changes in cell concentration or the stress caused by the protein synthesis, respectively. In addition, the intensity of the variation of both rheological parameters seemed to be dependent upon the used inducer. The morphology analysis showed that rheological properties could not be explained by changes in cell length. The correlation between the cell concentration (measured by dry-weight method) and the optical density when lactose was employed as inducer, due to galactose accumulation within the cells as a result of the inability of the bacteria to metabolize this carbon source. The presence of a small amount of PspA and genetic material in the culture broth was probably due to permeabilization and lysis of a small part of the population. Carbon recovery analysis was performed for all cultures, leading to values close do 100 % before induction, in all studied cases. After induction, a sharp decrease on the recovery was observed. However, by including the carbon present in the polysaccharide quantified in the cultivation broth, it was possible to recover all supplied carbon as biomass, CO2 and polysaccharide. Finally, the highest production of protein was obtained at 37°C when induced by IPTG, reaching 125 mgPspA/gMS. The results contribute to a deeper understanding of the heterologous proteins production by rE. coli and allow the definition of intensification strategies for protein production. / O uso de cultivos de Escherichia coli para obtenção de proteínas heterólogas tem se mostrado uma área de aplicação bem sucedida da biotecnologia para a produção de fármacos e enzimas. Contudo, o estresse provocado pela síntese da proteína recombinante e pelas condições de cultivo pode desencadear respostas fisiológicas na célula, assim como provocar mudanças na morfologia celular e na reologia do caldo de cultivo. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar as mudanças na morfologia celular, na reologia dos caldos e o efeito de diferentes temperaturas e indutores sobre as respostas celulares durante o processo de produção de proteínas recombinantes por rE. coli em cultivos em batelada. Foram acompanhados cinco cultivos de média densidade celular de dois clones de rE. coli, conduzidos em meio definido contendo glicerol como principal fonte de carbono e como indutores IPTG e lactose em duas temperaturas (37°C e 27°C). Todos os cultivos foram realizados em biorreator de bancada de 5 L dotado de sistema de monitoramento e controle. Durante esses cultivos, amostras foram coletadas e os parâmetros reológicos foram avaliados por meio de um reômetro de cilindros concêntricos. As características morfológicas do microrganismo foram também acompanhadas com auxílio de microscopia ótica associada a programa de análise de imagens digitalizadas. Foram ainda monitoradas a concentração celular da suspensão (por medida de densidade ótica e massa seca), a concentração de açúcares e ácidos orgânicos (por HPLC), a retenção plasmidial (repicagem em placas com e sem antibiótico), a concentração de células cultiváveis (por contagem de unidades formadoras de colônia), a produção de proteína recombinante (por densitometria), a concentração de proteína solúvel (pelo método de Bradford) e a presença de polissacarídeo no caldo (pelo método fenol sulfúrico). Verificou-se que os caldos, inicialmente newtonianos, passam por uma mudança de comportamento reológico durante a fase de crescimento, passando a se comportar como um fluido Binghamiano. Durante a fase de indução, o índice de consistência e a tensão de cisalhamento inicial tiveram respostas ligadas à concentração celular e ao estresse causado pela síntese de proteína, respectivamente, e a intensidade desta resposta dependeu do indutor usado. A análise do comprimento celular não permitiu associar as mudanças reológicas com mudanças significativas na morfologia da população durante o cultivo. Verificou-se alteração na correlação entre a concentração celular (medida pelo método da massa seca) e a densidade ótica quando lactose foi empregada como indutor, em função do acúmulo de galactose no interior das células devido à incapacidade da bactéria em metabolizar essa fonte de carbono resultante da hidrólise da lactose. Foi possível observar a presença uma pequena quantidade de PspA e de material genético no caldo de cultivo, provavelmente devido a permeabilização e lise de pequena parte da população. Contabilizou-se a recuperação do carbono para todos os experimentos, obtendo-se valores próximos de 100 % antes da indução em todos os casos. Após a indução foi verificada uma acentuada queda nessa recuperação. Porém, incluindo o carbono presente no polissacarídeo quantificado no caldo de cultivo, foi possível recuperar todo o carbono fornecido na forma de biomassa, CO2 e polissacarídeo. Por fim, a maior produção de proteína foi obtida a 37°C e induzida por IPTG, alcançando 125 mgPspA/gMS, em cultivo caracterizado pela curta duração da fase de indução (apenas 4 horas). Os resultados contribuem para ampliar a compreensão do processo de produção de proteínas heterólogas por rE. coli e permitem definir estratégias de intensificação da produção de proteína.

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-05-25T18:55:01Z No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-30T12:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Metagenomics studies allow the direct analysis of a genetic material in an environmental sample and when linked to bioinformatics it gives a powerful tool to explore the role of new genes and proteins not studied before. Constant decreases in the quantity of fossil fuels and their effects in the global economy and natural environment has accelerated researches in alternative fuels such as the second generation ethanol, which can be produced by vegetation biomass. However, this process demands previous hydrolysis of the lignocellulolytic material by hydrolytic enzymes to provide fermentable sugar. β-glucosidases are enzymes which plays an important role at the final step of cellulose breakdown to glucose, thus being considered the rate limiting enzyme in this process of biomass degradation. Many β-glucosidases are already known, however there is an interest to find new enzymes which are tolerant to glucose inhibition and which exhibits high activity at lower temperatures. In this study we searched for β-glucosidases (GH1) using sequences from a metagenomics database from rivers and lakes in the Amazon region developed in our laboratory. We found 3 complete open reading frames (ORFs) related to β-glucosidases and one of them was selected to be produced in E.coli in a heterologous way and to be biochemically characterized. The coding sequence of the protein named AmBgl1-LP was cloned in the plasmid pET-28a and produced an enzyme which has a molecular mass of 53,7 kDa. The enzymatic assays showed that the enzyme was active with an optimum pH of 5.5, optimum temperature of 35 °C and had a Ki for glucose of 23 mM. The enzyme does not apparently perform transgycosylation, according to the assays for pNPβGlu substrate. Supposedly, AmBgl1-LP suffers inhibition by pNPβGlu on concentrations higher than 10 mM. The enzyme showed to be capable of hydrolyzing cellobiose, pNPβGal and pNPβFuc. Thus, the enzyme is promising for use in cocktails for degradation of biomass. / A metagenômica permite estudar diretamente o material genético presente em uma amostra ambiental e quando aliada à bioinformática possibilita explorar o papel de novos genes e proteínas. A constante diminuição na quantidade de combustíveis fósseis e seus efeitos na economia global e no meio ambiente têm acelerado as pesquisas sobre combustíveis alternativos como, por exemplo, o etanol de segunda geração, o qual pode ser obtido a partir de biomassa vegetal. No entanto, o processo necessita que o material lignocelulolítico seja hidrolisado previamente por enzimas, para o fornecimento de açúcares fermentescíveis. As β-glicosidases são enzimas que participam da etapa final de degradação de celulose em glicose e são, portanto, consideradas passo limitante no processo. Muitas β-glicosidases já foram descritas, entretanto ainda há o interesse em encontrar enzimas que sejam resistentes à inibição por glicose e que exerçam sua atividade em temperaturas mais baixas. Neste sentido, o presente trabalho tratou da busca por β-glicosidases da família GH1 utilizando sequências obtidas a partir de um estudo metagenômico de rios e lagos da Amazônia, realizado em nosso laboratório. Foram encontradas 3 fases abertas de leitura (ORFs) correspondentes à esta classe de enzimas e uma delas foi selecionada para ser produzida em E.coli de forma recombinante e ser caracterizada bioquimicamente. A sequência que codifica a proteína denominada AmBgl1-LP foi clonada em vetor pET-28a e expressa em E.coli, rendendo uma enzima com massa molecular de 53,7 kDa. Os ensaios de atividade enzimática revelaram que a enzima é ativa em pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 35 °C. Além disso, a enzima possui um Ki para glicose de 23 mM. A enzima aparentemente não realiza transglicosilação, frente aos ensaios com o substrato pNPβGli. Aparentemente a enzima sofre inibição por este substrato em concentrações maiores que 10 mM. A AmBgl1-LP mostrou-se capaz de hidrolisar celobiose, além de pNPβGal e pNPβFuc. Desta forma, a enzima mostra-se promissora para utilização em coquetéis para degradação de biomassa.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2531.pdf: 1826513 bytes, checksum: 1b4aeefe4e23520d603b495bbd0b8832 (MD5) Previous issue date: 2009-04-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Using recombinant DNA techniques, the lipase BTL2 gene of Bacillus thermocatenulatus was cloned in E. coli BL321 under control of the strong temperature-inducible &#955;PL promoter. It was investigated, initially, in this work, the influence of different variables in cell growth and expression of lipase BTL2 by recombinant E. coli, through experiments performed in agitated flasks with LB medium. First, it was studied the influence of temperature of growth (between 27 ° C and 34.2 °C) and heat shock temperature (between 37.8 °C and 46.2 °C) in the expression of lipase BTL2 by E. coli recombinant, using statistical design of experiments. The results of this study, where the shock was performed in the early exponential phase, indicated as the best Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, yielding cellular concentration of 0.6 g dry weight / L and enzyme activity of 121.000 U/g.wet.cel. Then, it was investigated the influence of the growth phase of the microorganism at the shock, through cultures with Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, the results of these experiments showed how heat shock condition at the end of exponential phase, resulting in activity of 258.000 U/g.wet.cel It investigated the influence of different initial concentrations of glucose in the medium on cell growth and expression of the enzyme. The best results were obtained from cell mass with 10 g/L glucose and &#956;max = 0,16 h-1, Yx/s = 0,19 g/g, resulting in 1.2 g / L dry cel, enzymatic activity of about 250.000 U / g.wet.cel. Lower concentrations of glucose and higher concentrations led to smaller cell, but did not affect enzyme activity in the final. Based on previous cultures of E.coli were conducted simulations to calculate the best condition for feed-batch. The experimental test was performed with 10 g/L glucose at the beginning of cultivation, Tcresc = 30 °C, Tchoque = 45 °C. In this test, we were able to achieve 15 g/L dry.cel &#956;max = 0,38 h-1 with enzyme activity of 231.000 U/g.wet.cel, with resulting in 100 times more enzyme in this test than in cultivation in shaker in the best condition. The results of the simulation, obtained using model of Monod, predicted quite well those obtained experimentally. There was no significant accumulation of organic acids and all aminoacids consumed by the moment of shock. From the heat shock, those who were not exhausted with concentration remained constant. The enzyme produced in the test batch was recovered by breaking the cells in a French press to obtain with this methodology 272.000 U/g wet cells, whereas the results of the samples, which were disrupted by sonication resulted in much lower value. Was then investigated the efficiency of the protocol of sonication that was being used, by subjecting the cells to successive rounds of sonication. The results showed that actually the first cycle only 50% of the enzyme was released, indicating that the maximum production achieved was actually around 462.000 U/gcél.úmida. Study characterization of enzyme kinetics showed that the temperature of maximum activity is 65 °C with activation energy equal to 142.3 kJ/mol. Study of stability in solvent showed that the enzyme retains activity in the presence of 2- propanol. / Utilizando técnicas de DNA recombinante, o gene da lípase BTL2 de Bacillus thermocatenulatus foi clonado em E. coli BL321 sob controle do promotor &#955;PL, com o qual a indução na produção da enzima é obtida através de choque térmico. Investigou-se, inicialmente, neste trabalho, a influência de diferentes variáveis no crescimento celular e na expressão da lípase BTL2 por E.coli recombinante, através de experimentos realizados em frascos agitados, com meio LB. Primeiramente, estudou-se a influência da temperatura de crescimento (entre 27°C e 34,2°C) e da temperatura de choque térmico (entre 37,8°C e 46,2°C) na expressão de BTL2 por E.coli recombinante, usando planejamento estatístico de experimentos. Os resultados desse estudo, onde o choque era realizado no início da fase exponencial, indicaram como as melhores temperaturas Tcresc=27°C e Tchoque=45°C, obtendose concentração celular de 0,6 g massa seca/L e atividade enzimática de 121.000U/gcél.úmida. A seguir, foi investigada a influência da fase de crescimento do microrganismo no momento do choque, através de cultivos com Tcresc=27°C e Tchoque =45°C, os resultados desses experimentos indicaram como melhor condição choque térmico no final da fase exponencial, obtendo-se nessa condição atividade de BTL2 de 258.000U/gcél. Úmida. Investigou-se assim a influência de diferentes concentrações iniciais de glicose no meio de cultivo no crescimento celular e expressão da enzima. Os melhores resultados de massa celular foram obtidos com 10g/L de glicose, obtendo-se 1,2 g/L de massa seca, &#956;max = 0,16 h- 1, Yx/s=0,19 g/g e atividade enzimática em torno de 250.000 U/gcél, úmida. Concentrações de glicose menores e maiores conduziram a menores concentrações celulares, mas não influenciaram na atividade enzimática final. Baseando-se em cultivos anteriores de E.coli foram realizadas simulações para cálculo de alimentação de meio em ensaio em batelada alimentada. O ensaio experimental foi realizado com 10 g/L de glicose no início do cultivo, Tcresc=30°C, Tchoque=45°C. Nesse ensaio, conseguiu-se atingir 15 g/L de massa seca, com &#956;max =0,38 h-1 e com atividade enzimática de 231.000 U/gcel.úmida, obtendo-se 100 vezes mais enzima nesse ensaio do que no cultivo em frasco agitado na melhor condição. Os resultados da simulação, obtidos usando modelo de Monod, previram bastante bem os obtidos experimentalmente. Não se observou acúmulo significativo de ácidos orgânicos e todos os aminoácidos.eram consumidos até o momento do choque. A partir do choque térmico, aqueles que não estavam esgotados permaneceram com concentração constante. A enzima produzida no ensaio em batelada foi recuperada rompendo-se as células em uma prensa francesa, obtendo-se com essa metodologia 272.000 U/g cel úmida, enquanto que os resultados das amostras , que eram rompidas por sonicação resultaram em valor muito menor. Investigou-se então a eficiência do protocolo de sonicação que vinha sendo utilizado, submetendo-se as células a sucessivos ciclos de sonicação. Os resultados mostraram que realmente no primeiro ciclo apenas 50% da enzima era liberada, o que indica que a máxima produção obtida estava na verdade em torno de 462.000U/gcél.úmida.Estudo de caracterização cinética da enzima mostrou que a temperatura de máxima atividade é 65°C, com energia de ativação igual a 142,3 kJ/mol. Estudo de estabilidade em solvente mostrou que a enzima mantém atividade na presença de 2-propanol.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV06MA014.pdf: 2536288 bytes, checksum: 2ced4e5eb18884533f8a66a86da4f665 (MD5) Previous issue date: 2006-07-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aujeszky s disease (AD) is an infect-contagious illness that causes serious economical damages to the producer and the swine industry. Aiming to develop mechanisms and to improve technologies that are faster, more sensitive and more specific for diagnosis and for use in free areas or in AD s eradication programs, the sequence codifier of the glycoprotein E (gE) of Aujeszky s disease virus (ADV) was amplified, cloned and expressed. Through genetic engineering the sequence of the gE gene was propagated in an host organism. The gE was amplified by the technique of polimerase chain reaction (PCR), cloned in the vector pGem®-T Easy and transformed in competent cells of Escherichia coli, DH-5a . The clone obtained was sub-cloned in the expression plasmid pFastBac 1, which contains the promoter gene of the polyhedrin. The obtained subclone was analyzed inside for certification of its correct plasmid orientation with the restriction endonucleases BamH I and EcoR I. The sub-clone with the correct orientation had its DNA extracted and used for transposition inside the bacmid (recombinant baculovirus and helper plasmid with competent DH10Bac cell). Colonies with inserted gE were selected by the phenotype of the colony, which expresses white color when cloned. White recombinant colonies had their DNA extracted and used for cotransfection in insect cells Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4). The recombinant-gE baculovirus was inoculated in cultured cells and expressed the recombinant gE by PCR and Western blotting . The recombinant-gE baculovirus containing only the gE gene of the VDA will be used for antigen and monoclonal antibodies production, which will aid in the development of a more sensitive, specific and safer for the use in VDA free regions / A doença de Aujeszky (DA) é uma enfermidade infecto-contagiosa que causa graves prejuízos econômicos ao produtor e à agroindústria suinícola. Com o objetivo de desenvolver insumos e aprimorar tecnologias que sejam mais rápidas, sensíveis e específicas de diagnóstico para uso em regiões livres ou em erradicação da DA, a seqüência codificadora da glicoproteína E (gE) do vírus da doença de Aujeszky (VDA) foi amplificada, clonada e expressada. Através da engenharia genética a seqüência do gene da gE foi propagada em um organismo hospedeiro. A gE foi amplificada pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) , clonada no vetor pGem®-T Easy e transformada em células competentes de Escherichia coli, DH-5a . O clone obtido foi subclonado no plasmídeo de expressão pFastBac 1, o qual possui o sítio promotor do gene da poliedrina. O subclone obtido foi analisado para certificação de sua orientação correta dentro do plasmídeo com as endonucleases de restrição BamH I e EcoR I. O subclone com a orientação correta teve seu DNA extraído e usado para a transposição dentro do bacmid (baculovírus recombinante e plasmídeo helper em célula competente DH10Bac ). As colônias com inserto gE foram selecionadas pelo fenótipo da colônia, a qual expressa cor branca quando clonada. As colônias brancas recombinantes tiveram seu DNA extraído e usado para a co-transfecção em células do inseto Trichoplusia ni (BTITn5B1- 4). O baculovírus gE-recombinante ao ser inoculado em cultivo celular, expressou a gE recombinante, comprovada pela técnica de PCR e Western blotting . O baculovírus gE-recombinante contendo apenas o gene da gE do VDA será utilizado para produção de antígeno e de anticorpos monoclonais, o que auxiliará no desenvolvimento de um teste de diagnóstico mais sensível, específico e mais seguro para uso em áreas livres do VDA

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaniellaRAM.pdf: 825529 bytes, checksum: f26b539b2cb49d4dbd7f0f77cd978d11 (MD5) Previous issue date: 2006-12-05 / Control of human visceral leishmaniasis in endemic regions is hampered in part by the lack of knowledge with respect of the role reservoirs and vector. In addition, there is not yet an understanding of how non-symptomatic subclinical infection might influence the maintenance of infection in a particular locality. Of worrisome is the limited accessibility to medical care in places with emerging drug resistance. There is still no available protective vaccine either for humans or other reservoirs. Leishmania species are protozoa that express multiple antigens which are recognized by the vertebrate immune system. Since there is not one immunodominant epitope recognized by most hosts, strategies must be developed to optimize selection of antigens for prevention and immunodiagnosis. For this reason, we generated a cDNA library from the intracellular amastigote form of Leishmania chagasi, the causative agent of South American visceral leishmaniasis. We employed a two-step expression screen of the library to systematically identify T and T-dependent B cell antigens. The first step was aimed at identifying the largest possible number of clones producing an epitope-containing polypeptide with a pool of sera from Brazilians with documented visceral leishmaniasis. After removal of clones encoding heat shock proteins, positive clones underwent a second step screen for their ability to cause proliferation and IFN-&#947; responses of T cells from immune mice. Six unique clones were selected from the second screen for further analysis. The clones encoded part of the coding sequence of glutamine synthetase, transitional endoplasmic reticulum ATPase, elongation factor 1&#947;, kinesin K-39, repetitive protein A2, and a hypothetical conserved protein. Humans naturally infected with L. chagasi mounted both cellular and antibody responses to these protein Preparations containing multiple antigens may be optimal for immunodiagnosis and protective vaccines against Leishmania / O controle da Leishmaniose Visceral em regi?es end?micas ? em parte dificultado pela falta de conhecimento em rela??o ao papel dos reservat?rios e vetores, n?o havendo ainda vacina dispon?vel. Leishmania s.p s?o protozo?rios que expressam m?ltiplos ant?genos reconhecidos pelo sistema imune dos hospedeiros. Devido ? aus?ncia de um ep?topo imunodominante reconhecido pela maioria dos hospedeiros, estrat?gias para a identifica??o e sele??o de novos ant?genos para a preven??o e imunodiagn?stico. Nossa estrat?gia foi construir uma biblioteca de cDNA da forma amastigota da L. chagasi, com subseq?ente realizad??o de dupla varredura da biblioteca para sistematicamente identificar ant?genos espec?ficos de c?lulas T e B. A primeira etapa teve como objetivo a identifica??o do maior n?mero de clones produtores de pept?deos atrav?s da utiliza??o de um pool de soro de indiv?duos com Leishmaniose Visceral. Os clones codificadores de prote?nas de choque t?rmico foram removidos e os clones restantes foram submetidos ? segunda etapa da varredura, que consistiu na avali??o capacidade destes ant?genos em induzir estimula??o e prolifera??a de linf?citos T de camundongos resistentes ? infec??o por L. chagasi. Seis clones foram selecionados ap?s a segunda varredura. Os clones codificaram parte da seq??ncia da glutamina sintetase, ATPase do ret?culo endoplasm?tico, Fator de alongamento 1 &#947;, Kinesina K-39 prote?na repetitiva A2, e prote?na hipot?tica conservada. Indiv?duos naturalmente infectados com L. chagasi desenvolveram respostas imunes celular e humoral frente a essas prote?nas. Formula??es contendo m?ltiplos ant?genos podem servir como excelentes m?todos para imunodiagn?stico e vacina??o

Made available in DSpace on 2015-03-03T15:02:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreaFA_TESE.pdf: 1420174 bytes, checksum: c5656fd03fcd0a38acd22f419f0567c7 (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vAgEGT-LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3?0.85)x108 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vAgEGT-LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9?1.42)x1014 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m3. A low MOI associated with a fed-batch process for vAgEGT-LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x107 and 5.3x107 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process. / A preocupa??o da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar alternativas de substitui??o dos inseticidas qu?micos por outros produtos menos agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utiliza??o de controle biol?gico contra pragas ? altamente desej?vel, pois reduz os riscos ambientais e p?blicos da utiliza??o de produtos qu?micos convencionais. Em particular, os v?rus do tipo baculov?rus s?o uma grande alternativa devido ? especificidade oferecida aos seus hospedeiros e a sua forma de propaga??o. No Brasil, o baculov?rus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) ? o principal agente de controle biol?gico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de processos com base na produ??o in vitro de baculov?rus. Deste modo, poder? aumentar a oferta de v?rus, suprindo a necessidade do mercado deste bioinseticida para o controle de A. gemmatalis. Neste trabalho, estrat?gias de produ??o in vitro do baculov?rus selvagem AgMNPV e do seu recombinante vAgEGT?-LacZ, como influ?ncia do isolado, da cin?tica e do modo de opera??o, foram analisadas como alternativa para futura amplia??o de escala na produ??o deste bioinseticida viral. A produ??o em batelada de tr?s isolados selvagens do baculov?rus AgMNPV (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5) utilizando o cultivo em shaker, foi realizada com a finalidade de selecionar o melhor produtor de corpos de oclus?o a partir das infec??es em c?lulas de inseto Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-SF21 para avalia??o comparativa com recombinante vAgEGT?-LacZ. A sele??o identificou o isolado AgMNPVMP5 como melhor produtor de corpos de oclus?o de (5,30?0,85) x108 OB/mL em 8 dias de infec??o. A produ??o in vitro do vAgEGT?-LacZ foi foco principal deste trabalho, pois n?o h?, na literatura, a produ??o deste recombinante em sistemas de cultivo em suspens?o. Foi realizado estudo da multiplicidade de infec??o para identificar a quantidade de in?culo viral para o cultivo. A partir da?, foram realizadas cinco bateladas sucessivas obtendo-se (8,9?1,42)x1014 corpos de oclus?o para um volume final de 10m? de suspens?o de c?lulas infectadas. O aumento da produ??o de corpos de oclus?o obtidos a partir do vAgEGT?-LacZ foi analisado utilizando a estrat?gia de cultivo em batelada alimentada utilizando baixa multiplicidade de infec??o. Esta estrat?gia permitiu aumento de tr?s vezes na produ??o de corpos de oclus?o quando comparada ? produ??o em cultivos em batelada (5,3x107 e 1,8x107 OB/mL, respectivamente). E ainda, o baculov?rus recombinante vAgEGT?-LacZ mostrou-se competitivo em rela??o ao baculov?rus selvagem AgMNPV-MP5

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RobertaVAC_DISSERT.pdf: 2111666 bytes, checksum: 5b317150d6db63bae04e852173ace9d2 (MD5) Previous issue date: 2009-12-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Visceral leishmaniosis caused by Leishmania chagasi, also known as calazar, presented, in the period from 1990 to 2005, tax of incidence in Brazil varying between 1 and 3 cases for 100 000 inhabitants. The Northeast region that up to the year of 2000 contributed with almost 90% of the registered cases is reducing his participation in the current decade, reaching 56% in 2005. Conventional leishmaniasis treatment is costly and it shows high toxicity, demanding more research for alternative treatments, with special interest in development of vaccines and diagnosis kits which include production of recombinant antigens by host cells. Escherichia coli has been the microorganism most studied and used as a host for recombinant protein production. Therefore, the aim of this work was to study the influence of induction on cellular growth and to verify the type of Leishmania chagasi antigens expression (intra or extracellular) during two recombinant E. coli clones (kmp11 and P36) cultivation in rotary incubator (shaker) using three different media (2xTY, TB, FASS+EL). For that, tests were carried out using conditions established in the literature for E. coli (37?C and 200 rpm) and media supplemented with antibiotics to guarantee that only competent cells grows. First, tests were carried out without induction in order to verify the two microorganisms kinetic behavior (growth and substrate consumption) in different media. Next, the induction was carried out through the addition of IPTG (1mM as final concentration), at the first hour of cultivation. It was observed that protein expression were intracellular for all clones and media tested, however the highest level of expression was clearly observed by the electrophoresis band density (intensity) for 2xTY medium and kmp11 protein. Although it contains the lowest substrate concentration, consequently, a reduced cellular concentration when compared to other media, it appeared that this medium and clone combination is the most indicated for recombinant protein production. Therefore, the objective of this work was achieved, since the interested proteins were produced. Consequently, this result motivates new studies for production optimization using different cultivation strategies / A leishmaniose visceral, causada pela esp?cie Leishmania chagasi, tamb?m conhecida como calazar, apresentou, no per?odo de 1990 a 2005, taxa de incid?ncia no Brasil variando entre 1 e 3 casos por 100 mil habitantes. A regi?o Nordeste, que at? o ano de 2000 contribuiu com quase 90% dos casos registrados, est? reduzindo sua participa??o na d?cada atual, chegando a 56% em 2005. O alto custo e toxicidade das drogas usadas no tratamento convencional dessa leishmaniose levaram a busca de tratamentos alternativos, com interesse especial na pesquisa e produ??o de ant?genos por microrganismos recombinantes para desenvolvimento de vacinas e kits de diagn?stico. A bact?ria Escherichia coli tem sido o microrganismo mais estudado e usado como hospedeiro para produ??o de prote?nas recombinantes. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo estudar a influ?ncia da indu??o no crescimento celular e a verifica??o do tipo de express?o (intra ou extracelular) de ant?genos de Leishmania chagasi atrav?s de cultivo de dois clones de E. coli recombinante (kmp11 e P36) em incubador rotativo (shaker) usando tr?s meios diferentes (2xTY, TB, FASS+EL). Para isso, foram realizados ensaios em condi??es estabelecidas na literatura para E. coli (37?C ? 200 rpm) e os meios suplementados com antibi?ticos para garantir somente o crescimento de c?lulas competentes. Na primeira etapa, foram realizados ensaios sem indu??o a fim de se verificar o comportamento cin?tico dos dois clones (crescimento e consumo de substrato) nos diferentes meios. Na segunda etapa, a indu??o foi realizada atrav?s da adi??o de IPTG (concentra??o final de 1mM), na primeira hora de cultivo. Foi observada que a express?o das prote?nas foi intracelular para todos os clones e meios testados, entretanto o maior n?vel foi verificado nitidamente pela densidade (intensidade) da banda nos g?is de eletroforese para o meio 2xTY e prote?na kmp11. Apesar de o meio 2xTY conter uma menor concentra??o de substratos, conseq?entemente, uma concentra??o celular reduzida quando comparada aos outros meios, pareceu que esta combina??o de meio e clone ? mais indicada para produ??o das prote?nas recombinantes testadas neste trabalho. O objetivo desse trabalho foi alcan?ado j? que a prote?na de interesse foi produzida. Conseq?entemente, este resultado motiva novos estudos para otimiza??o da produ??o usando diferentes estrat?gias de cultivo