O estresse oxidativo, causado por níveis aumentados de espécies reativas de oxigênio (ROS), pode causar danos celulares. Várias enzimas, como as subunidades da alquil-hidroperóxido redutase (AhpC e AhpF) e as superóxido dismutases (SOD), são responsáveis por remover as ROS. Os mecanismos de regulação da expressão gênica de C. crescentus para os genes ahpC, sodA, sodB e sodC, foram analisados com fusões de transcrição ao gene repórter lacZ, permitindo a quantificação da expressão por ensaios da atividade de b-galactosidase, e RT-PCR quantitativo. As culturas foram cultivadas em meio PYE ou M2 e a expressão de cada gene foi avaliada na presença de peróxido de hidrogênio (H2O2), tert-butil hidroperóxido (tBOOH), paraquat, menadiona, pirogalol, FeSO4 ou DDPi. Em C. crescentus ahpC é induzido por peróxidos e regulado por OxyR. As SODs são induzidas principalmente por superóxidos, sodB e sodC possuem indução de fase na fase estacionária e possivelmente estão sob o controle do sigma J, enquanto o gene sodA é regulado por sigma F e sigma J. / Oxidative stress, caused by increased levels of reactive oxygen species, can lead to damage in all cellular components. Several enzymes, as subunit of alkyl hydroperoxide reductase (AhpC and AhpF) and superoxide dismutases (SOD), are responsible for removing ROS. Mechanisms of gene expression of C. crescentus for genes ahpC, sodA, sodB and sodC, were evaluated with transcription fusions with the lacZ reporter gene were constructed, allowing the quantification of expression by b-galactosidase activity assays, furthermore we analyze of the gene expression by qRT-PCR assay. The cultures were grown in PYE and M2 media, and gene expression was evaluated in the presence of hydrogen peroxide (H2O2), tert-butyl hydroperoxide (tBOOH), paraquat, menadione, pyrogallol, FeSO4 or DPPi. In C. crescentus ahpC is induced by peroxides and is under the control of OxyR. The SODs are mainly induced by superoxide, sodB and sodC are induction in stationary phase and are possibly under the control of sigma J, while the sodA gene is regulated by sigma F and sigma J.

Caulobacter crescentus pertence ao grupo das proteobactérias e apresenta a característica distinta de diferenciação celular a cada divisão. Este trabalho visou desvendar os mecanismos de reparo de DNA em C. crescentus. Identificamos 44 genes pertecentes ao regulon SOS através da construção de um mutante para o repressor deste, LexA. Caracterizamos funcionalmente alguns dos genes do regulon, como CC_2272 (que codifica uma proteína da família das endonucleases III) e CC_2433. A cepa deficiente em LexA apresentou morfologia filamentosa, e por esse motivo, buscamos também desvendar quais seriam os fatores genéticos responsáveis por esta morfologia. Investigamos também os processos de controle do ciclo celular após a introdução de danos na molécula de DNA pela luz UVC, em mutantes deficientes para diferentes vias de reparo. Estes experimentos nos mostraram que as células procariontes possuem mecanismos para acoplar a progressão do ciclo celular a integridade do material genético. Este trabalho abre novas e excitantes possibilidades no campo da biologia bacteriana. / Caulobacter crescentus belongs to the proteobacteria group and exhibts the distinctive feature of cellular differentiation after each division. This work aimed to reveal the DNA repair mechanisms in C. crescentus. We have identified 44 genes belonging to the SOS regulon through the construction of a mutant strain to its repressor. We have functionally characterized some of its genes, like CC_2272 (that encodes an endonuclease III family protein) and CC_2433. The lexA strain showed filamentous morphology, e because of that, we have tried to discover which the genetic factors responsible for this morphology were. We have also investigated the cell cycle control processes after the introduction of damages in the DNA by the UVC light, in mutant strains deficient in different repair pathways. These experiments showed us that prokaryotic cells possess mechanisms to couple the cell cycle progression to the integrity of the genetic material. This work opens new and exciting possibilities in the field of bacterial biology.

A principal fonte de proteínas para alimentação humana e animal é fornecida pelas sementes de cereais e leguminosas. O conteúdo de aminoácidos solúveis em endospermas de milho normal e mutantes opaco-2 e floury foram determinadas por HPLC. A análise indicou que a concentração total de aminoácidos solúveis variou entre os mutantes e seus tipos selvagens. Nos mutantes o10, o11 e o13, as concentrações foram aumentadas significativamente quando comparadas ao tipo selvagem W22, enquanto os mutantes o1, o2, o13, fl1 e fl2 exibiram baixas concentrações em relação ao seu respectivo tipo selvagem Oh43. Resultados similares foram obtidos para os mutantes o5, o7 e fl3 em relação aos seus tipos selvagens (B79, B37 e WT3, respectivamente). Para metionina, o mutante o2 e o tipo selvagem Oh43 apresentaram as mais altas concentrações deste aminoácido. Diferenças significativas não foram observadas para os outros aminoácidos analisados, tais como lisina e treonina. Os resultados sugerem que as altas concentrações sugeridas originalmente para estes mutantes devem ser devidas aos níveis destes aminoácidos incorporados nas proteínas de reserva, mas não na forma solúvel. / For human nutrition the main source of vegetable proteins are cereal and legume seeds. The content of total soluble amino acids in mature endosperms of wildtype and maize opaque and floury mutants have been determined by HPLC. The total absolute concentration of soluble amino acids among the mutants and their wild-type counterparts varied depending on the mutant. In the o10, o11 and o13 mutants the concentrations were significantly increased when compared to their wild-type counterpart W22, whereas the mutants o1, o2, o13, fl1 and fl2 exhibited lower concentrations when compared to the wild-type Oh43, Similar results were observed for o5, o7 and fl3 in relation to their specific wild-type counterparts (B79, B37 and WT3, respectively). For soluble methionine content, o2 and Oh43 exhibited the highest concentrations. Significant differences were not observed for other amino acids such as lysine and threonine. The results suggest that the high-lysine concentrations indicated originally for these mutants must be due to the amino acids incorporated into storage proteins, but not in the soluble form.

Este trabalho teve como objetivo principal modelar a Rede de Regulação Gênica do organismo modelo Halobacterium salinarum NRC-1, estabelecendo interações entre as entidades da rede por intermédio de experimentos inéditos de interação física: ChIP- *, RIP-* e dRNA-seq. Em contraponto com as abordagens clássicas de construção de redes, que estimam interações através de medições de expressão gênica, este trabalho as estabeleceu exclusivamente de interações físicas, permitindo que a estrutura final seja uma representação mais fiel ao fenômeno físico de regulação gênica, baseando-se nos fundamentos da Biologia Sistêmica. Em vista da abundância de dados públicos de expressão gênica para o organismo e do objetivo primário, um objetivo secundário foi traçado: identificar, computacionalmente, genes de fato controlados pelas interações fornecidas pela nova rede. Para isso, a estrutura estabelecida foi transformada numa Rede Bayesiana, e a identificação de genes foi efetuada através da análise de suas Tabelas de Probabilidade Condicionais. Finalmente, como os resultados obtidos para o objetivo secundário foram desfavoráveis a utilização de Redes Bayesianas, os resultados efetivos deste trabalho foram a criação de uma nova Rede de Regulação Gênica para a H. salinarum e uma análise em torno da efetividade de Redes Bayesianas neste contexto. / The main goal of this work was modeling the gene regulatory network of the model organism Halobacterium salinarum NRC-1, establishing new interactions between networks entities through unpublished physical interaction experiments: ChIP-*, RIP-* e dRNA-seq. Instead of using classical approaches to build network structures that estimates interactions using gene expression data, this work established them exclusively from physical interactions. Therefore, the final structure is a more reliable representation of the physical phenomenon of gene expression, built using the principles of systems biology. Considering the amount of public available gene expression data and the primary goal, another objective was proposed: a computational analysis to detect genes actually controlled by the interactions of the new network. To achieve this goal the established network was transformed in a Bayesian network, detecting genes through the analysis of their conditional probability tables. Lastly, as the results of the secondary goal went against the use of Bayesian networks, the effective results of this thesis were the creation of a new genetic regulatory network for H. salinarum and an analysis around Bayesian networks in this context.

Visando a construção de três biossensores bacterianos para os metais mercúrio, arsênio e chumbo, Cupriavidus metallidurans CH34 foi escolhida para obtenção dos fragmentos de DNA (por PCR) correspondentes aos operons mer, ars e pbr. Os fragmentos foram inseridos à montante do gene EGFP, no plasmídeo pBB-EGFP, obtendo três novos plasmídeos: pGHg, pGAs e pGPb. Estes foram clonados em C. metallidurans CH34 e Escherichia coli DH5<font face=\"Symbol\">&#945;. As linhagens recombinantes foram submetidas a várias situações de cultivo e diferentes intensidades de fluorescência, detectadas em microscopia e quantificadas por citometria de fluxo. As linhagens recombinantes C. metallidurans CH34 / pGHg, E. coli DH5<font face=\"Symbol\">&#945; / pGHg, C. metallidurans CH34 / pGAs e C. metallidurans CH34 / pGPb mostraram-se eficazes e, consequentemente, poderão ser utilizadas em rápidos diagnósticos de amostras contaminadas por mercúrio, arsênio e chumbo. / Aiming at the construction of three bacterial biosensors for metals mercury, arsenic and lead, Cupriavidus metallidurans CH34 was chosen to obtain the DNA fragments (by PCR) corresponding to operons mer, ars and pbr. The fragments were inserted upstream of the EGFP gene, in plasmid pBB-EGFP, getting three new plasmids: pGHg, pGAs and pGPb. They were cloned in C. metallidurans CH34 and Escherichia coli DH5<font face=\"Symbol\">&#945;. The recombinant strains were subjected to various conditions of cultivation. Different intensities of fluorescence were detected microscopy and quantified by flow cytometry. The recombinant strains C. metallidurans CH34 / pGHg, E. coli DH5<font face=\"Symbol\">&#945; / pGHg, C. metallidurans CH34 / pGAs and C. metallidurans CH34 / pGPb were effective and therefore may be used in rapid diagnosis of samples contaminated by mercury, arsenic and lead.

CspD é uma das quatro proteínas de choque frio de Caulobacter crescentus, sendo maior que as outras CSPs por possuir dois domínios de choque frio, e tem seu papel na célula ainda desconhecido. O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar os fatores in cis e in trans envolvidos na regulação da expressão do gene cspD em C. crescentus. Neste trabalho foi visto que a expressão de cspD é induzida pela carência de glicose no meio, mas não pela carência de nitrogênio. Esta indução é dependente do sinalizador ppGpp, indicando que ppGpp está envolvido na sinalização de carência de carbono. Um regulador de resposta de um sistema de dois componentes (SpdR) foi identificado como responsável pela indução em fase estacionária, sendo fosforilado pela histidina quinase cognata SpdS. Através de ensaios de EMSA e DNAseI footprinting pudemos verificar que a proteína SpdR se liga em uma sequência repetida invertida no promotor de cspD, e que essa ligação é dependente da fosforilação no resíduo de aspartato na posição 64 da proteína. Foi construído um mutante nulo do gene SpdR e este foi testado quanto à resistência a estresse oxidativo causado por H2O2 e viabilidade em fase estacionária; o mutante não apresentou diferença na resposta em relação à linhagem selvagem. / CspD is one of the four cold shock proteins of Caulobacter crescentus being larger than the other ones by possessing two cold shock domains, and its cellular role is still unknown. The aim of this work was to identify and characterize factors in cis and in trans involved in regulation of cspD expression in C. crescentus. In this work we determined that cspD expression is induced by glucose starvation but not by nitrogen starvation. This induction is dependent on the signalling molecule ppGpp, indicating that it is involved in carbon starvation signaling. A response regulator of a two-component system (SpdR) was identified as responsible for stationary phase induction, being phosphorylated by the cognate histidine kinase SpdS. EMSA and DNAseI footprinting assays showed that the SpdR protein binds to an inverted repeat at the cspD promoter, and that this binding is dependent on phosphorylation at the aspartate residue at position 64. A null spdR mutant strain was constructed and its resistance to H2O2 and stationary phase viability were determined, however the mutant showed no difference in response when compared to the wild type.

Submitted by Michele Mologni (mologni@unoeste.br) on 2017-06-13T13:30:56Z No. of bitstreams: 1 Viviane Cacefo.pdf: 1556310 bytes, checksum: 3f9d8dc2ff4a08b8acc2ec7e1a731117 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T13:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Viviane Cacefo.pdf: 1556310 bytes, checksum: 3f9d8dc2ff4a08b8acc2ec7e1a731117 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / C4 plants have been classified into three groups based on the enzymes used to decarboxylate C4 acids in the bundle sheath: NADP-ME, NAD-ME and PEPCK subtypes. Numerous molecular, biochemical and physiological evidences indicate that C4 plants could exhibit a certain degree of flexibility in the use of the three established decarboxylation mechanisms, depending on environmental factors. In this context, the objective of this work was to evaluate the modulation of the pathways of decarboxylation of the C4 photosynthesis in sugarcane (NADP-ME specie) under water deficit. The experiment was realized with two genotypes - RB92579 (tolerant to water deficit) and SP80-3280 (susceptible to water deficit) submitted to four treatments: control (normal conditions of water supply), moderate stress (-1,5 to -1,8 MPa), severe stress (below -2,0 MPa) and recovery (48 hours after rehydration). Leaf water potential, leaf gas exchange and biomass production were measured for the physiological characterization of the plants. Changes in the transcriptional responses of genes encoding C4-cycle enzymes (NADP-ME, NAD-ME, PEPCK, AspAT, AlaAT, PEPC, NADP-MDH and PPDK) and the activities of the enzymes NADP-ME, NAD-ME, PEPCK, AspAT and AlaAT were analyzed by RT-qPCR and spectrophotometry, respectively. Under water deficit conditions the genotypes SP80-3280 was more sensitive to drought stress in terms of increased loss of above ground biomass and lower leaf water potential. It also showed less capacity of photosynthetic recovery following rehydration compared to the tolerant genotypes RB92579. The analysis of transcriptionals and of the activities of enzymes involved in the C4 photosynthetic pathway showed that sugarcane uses the PEPCK pathway as a decarboxylation mechanism in addition to the NADP-ME, which was more evident under water deficit conditions for both the drought tolerant and susceptible genotypes. Finally, the results here obtained, together with the existing information, do not support the established classification of sugarcane (Saccharum spp.) as a classical NADP-ME C4 subtype, but instead should be considered as a NADP-ME + PEPCK species. / As plantas C4 são classificadas em três grupos de acordo com as enzimas utilizadas para descarboxilação de ácidos C4 na bainha dos feixes vasculares: subtipos NADP-ME, NAD-ME e PEPCK. Inúmeras evidências moleculares, bioquímicas e fisiológicas indicam que plantas C4 podem exibir certo nível de flexibilidade na utilização dos três mecanismos de descarboxilação, dependendo de fatores ambientais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a modulação das vias de descarboxilação da fotossíntese C4 em cana-de-açúcar (espécie NADP-ME) sob déficit hídrico. O experimento foi realizado com dois genótipos - RB92579 (tolerante ao déficit hídrico) e SP80-3280 (suscetível ao déficit hídrico) submetidos a quatro tratamentos: controle (condições normais de suprimento de água), estresse moderado (-1,5 a -1,8 MPa), estresse severo (abaixo de -2,0 MPa) e recuperação (48 hrs após a reidratação). Foram realizadas análises de potencial de água foliar, trocas gasosas foliares e biomassa para caracterização fisiológica das plantas. As alterações nas respostas transcricionais dos genes codificadores de enzimas do ciclo C4 (NADP-ME, NAD-ME, PEPCK, AspAT, AlaAT, PEPC, NADP-MDH e PPDK) e atividades das enzimas NADP-ME, NAD-ME, PEPCK, AspAT e AlaAT, foram analisadas por RT-qPCR e espectrofotometria, respectivamente. Em condições de déficit hídrico, o genótipo SP80-3280 foi mais sensível ao estresse por seca em termos de aumento da perda de biomassa e menor potencial de água foliar. Também mostrou menor capacidade de recuperação fotossintética após reidratação do que o genótipo tolerante RB92579. As análises transcricionais e das atividades das enzimas envolvidas na via fotossintética C4 mostraram que a cana-de-açúcar utiliza a via PEPCK como mecanismo de descarboxilação, além da NADP-ME, mais evidente em condições de déficit hídrico tanto para genótipos tolerantes à seca como para suscetíveis. Finalmente, os resultados aqui obtidos, juntamente com a informação existente, não suportam a classificação estabelecida da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) como um subtipo C4 NADP-ME clássico, mas considerá-la como uma espécie NADP-ME + PEPCK.

A gama-proteobactéria Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista humano frequentemente associado a pacientes com queimadura grave e aos portadores de fibrose cística. O estabelecimento de infecção depende de uma série de fatores que contribuem para a virulência deste patógeno, dentre eles a produção de sideróforos e outros sistemas de captação de ferro. Pioverdina é o principal sideróforo sintetizado por bactérias do gênero Pseudomonas e linhagens deficientes na sua produção são incapazes de estabelecer infecção em modelos animais. A regulação da biossíntese deste sideróforo envolve a agregação entre as células, indicando a dependência de contato para completa indução da sua produção. O contato com uma superfície altera o comportamento das células e diversos fenótipos são dependentes deste sinal mecânico. PrlC é uma oligopeptidase A putativamente envolvida na degradação de peptídeo-sinais e PA14_00800, uma pequena proteína com domínio de função desconhecida, codificada por um gene imediatamente à jusante de prlC. Existem poucos trabalhos na literatura sobre PrlC e seus homólogos e nenhuma informação sobre PA14_00800. Este trabalho teve como objetivo elucidar o envolvimento de PrlC e PA14_00800 na regulação da produção de pioverdina por células em contato com uma superfície. Para estabelecer uma correlação na expressão destes genes, um estudo da organização gênica foi realizado por RT-PCR, confirmando que eles fazem parte do mesmo operon e, portanto, que a expressão destes genes é regulada pelos mesmos fatores. Ensaios classicamente modulados pelo segundo mensageiro c-di-GMP, como formação de biofilme e motilidade, não apresentaram variações nas linhagens mutantes &#916;prlC, &#916;PA14_00800 ou &#916;operon, indicando que a deleção destes genes não altera significativamente os níveis de c-di-GMP nas células. A motilidade do tipo swarming é, no entanto, severamente afetada na linhagem &#916;PA14_00800 quando o meio de cultura não contém cloreto de cálcio e glicose, indicando um defeito na sinalização celular ou requerimento energértico desta linhagem nestas condições. PA14_00800 regula a fluorescência de P. aeruginosa em meio sólido e semissólido, mas não em meio líquido. Esta fluorescência depende tanto de pioverdina quanto de PQS, umamolécula de comunicação celular fluorescente, e a possibilidade de outros fatores estarem envolvidos neste fenótipo ainda está sob investigação. Análise do transcritoma por RNASeq com a linhagem &#916;PA14_00800 comparada à linhagem parental foi realizada a partir de colônias destas linhagens crescidas em M9 modificado. Genes envolvidos no sistema de secreção do tipo III e do tipo VI e na biossíntese de PQS apareceram dentre os genes diferencialmente expressos, bem como genes para o catabolismo de glicose. Este trabalho foi o primeiro a investigar o papel de PA14_00800 na fisiologia de P. aeruginosa, e os conhecimentos adquiridos aqui podem ser transpostos, com cautela, para compreensão da função dos homólogos de PA14_00800 em outras bactérias. / The gamma-proteobacterium Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen frequently associated with patients with severe burns and those with cystic fibrosis. The establishment of infection depends on several factors that contribute to the virulence of this pathogen, among them siderophore production and other iron uptake systems. Pyoverdine is the main siderophore synthesized by the bacteria of the genus Pseudômonas and pyoverdinedeficient strains are unable to establish infection in animal models. The regulation of biosynthesis of this siderophore involves cell aggregation, indicating contact dependency for complete induction of pyoverdine production. Surface contact alters cell behavior and several phenotypes are dependent on this mechanical cue. PrlC is an oligopeptidase A putatively involved in peptide-signals degradation and PA14_00800, a small protein with a domain of unknown function, encoded by a gene immediately downstream of prlC. There are few papers in the literature on PrlC and its homologues and no information on PA14_00800. This work aimed to elucidate the role of PrlC and PA14_00800 in surface-dependent regulation of pyoverdine production. To establish a correlation in the expression of these genes, a study of the gene organization was performed by RT-PCR, confirming that they are part of an operon and therefore the expression of these genes is regulated by the same factors. Traits classically modulated by the second messenger c-di-GMP, such as biofilm formation and motility, did not show variations in the &#916;prlC, &#916;PA14_00800 or &#916;operon, indicating that the deletion of these genes does not significantly alter the levels of c-di-GMP within the cells. Swarming motility is, however, severely affected in the strain &#916;PA14_00800 when the culture medium does not contain calcium chloride and glucose, indicating a cell signaling defect or energetic requirement under these conditions. PA14_00800 regulates surface-dependent fluorescence of P. aeruginosa, in solid and semi-solid medium. This fluorescence depends on both pyoverdine and PQS, a fluorescent cell-to-cell communication molecule, and the investigation of other putative factors involved in this phenotype is still under study. Transcriptomic analysis by RNASeq with the strain &#916;PA14_00800 compared to PA14 was performed from colonies ofthese strains grown in modified M9 1% agar. Genes involved in the type III and type VI secretion systems, in PQS biosynthesis and glucose catabolism were differentially expressed. This work was the first to investigate the role of PA14_00800 in the physiology of P. aeruginosa, and the knowledge obtained here can be cautiously transposed to understanding the role of PA14_00800 homologues in other bactéria.

O desenvolvimento embrionário é o resultado de uma sequência controlada de eventos modulados por sinais ambientais e mecanismos intracelulares. Em Hymenoptera, esse processo tem um caráter especial devido ao sistema de determinação do sexo (Haplodiploide). Neste sistema, os ovos fecundados se desenvolvem em fêmeas (diploides) e os ovos não fecundados em machos (haploides). Assim, eventos importantes, como a ativação do ovo e transição materno-zigótica, eventos iniciais da embriogênese, são elementos-chave para compreender o desenvolvimento de ambos os tipos de embriões. Ativação do ovo é um evento complexo acionado em resposta a estímulos externos, necessários para o início da embriogênese. Em abelhas a ativação ovo ocorre independentemente da fecundação e parece ser desencadeado durante a passagem pelo trato reprodutivo da mãe. Além disso, se o ovócito não for fecundado ele irá se desenvolver em um organismo haploide. No entanto, se o ovo recebe o espermatozóide até 30 minutos depois da ativação, o ovo se desenvolve em um organismo diploide. Em Drosophila, a ativação do ovo é também idependente da fecundação. O estímulo inicial que desencadeia o desenvolvimento é devido tensões mecânicas sofridas pelo ovócito durante a ovulação pela passagem através do trato reprodutivo. Neste modelo, o primeiro sinal de ativação inclui a ativação da via dependente de cálcio. Moléculas maternas que são incorporados no ovócito durante ovogênese, atuam durante a ativação do ovo, bem como no início da embriogênese. Os eventos iniciais da embriogênese também são caracterizados pela ausência de altos níveis de transcrição zigótica. As moléculas depositadas atuam na ativação do ovo, quebrando a dormência da divisão celular permitindo a ocorrência do início do desenvolvimento embrionário. Mas, o embrião em desenvolvimento gradualmente degrada e substitui essas moléculas herdadas da mãe, em um processo conhecido como transição materno-zigótica. Nosso principal objetivo foi o entendimento da comunicação entre as moléculas herdadas e as recém produzidas durante os primeiros passos do desenvolvimento de Apis mellifera. Para alcançar nosso objetivo, 16 bibliotecas de RNAseq (mRNA e miRNA) foram construídas utilizando amostras de RNA total de embriões diploides e haploides de diferentes idades e ovócitos maduros. A análise do transcriptoma mostrou que existem genes diferencialmente expressos entre os dois tipos de embriões já em 1 h de desenvolvimento. Além disso, nossa análise permitiu a identificação de mRNAs e miRNAs maternos e zigóticos, além de processos com que estas moléculas se relacionam. As análises mostraram também que um mesmo miRNA pode atingir diferentes mRNAs em cada tipo de embrião, na mesma fase de desenvolvimento. Além disso, um mesmo gene pode ser diferentemente regulado nos dois tipos de embriões. Por exemplo, broad/GB48272, que é classificado como materno em embriões dipoides é regulado por quatro miRNAs diferentes e em embriões haploides é classificado como zigótico, regulado por apenas um miRNA. Análise das bibliotecas de RNAseq e hibridação in situ mostrou o padrão de expressão de zelda em embriões jovens de abelhas. Zelda é um ativador chave do genoma zigótico em Drosophila e regula eventos importantes na embriogênese se ligando a um motivo conservado, TAGteam. Em A. mellifera, encontramos um motivo TAGteam putativo que tem sido relacionado à transcrição zigótica precoce. Além disso, a hibridização in situ e PCR mostraram três primiRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p e ame-mir-263b-5p) que se expressam durante a clivagem. A presença de pri-miRNAs evidenciou a início da transcrição zigótica durante a clivagem. Em suma, podemos dizer que este é o primeiro trabalho em Apis mellifera a descrever os eventos de iniciais do desenvolvimento embrionário comparando embriões haploides e diploides usando os recentes protocolos de bioinformática e os avanços da biologia molecular. / Embryonic development is the result of a precisely controlled sequence of events modulated by environmental signals and intracellular mechanisms. In Hymenoptera, this process takes a special character due the sex-determination system (haplodiploidy). In this system, fertilized eggs develop in females (diploid) and unfertilized eggs in males (haploid). Thus, important events such as egg activation and maternal-zygotic transition, events of the early embryogenesis are key elements to understand the development of both types of embryos. Egg activation is a complex event triggered in response to external stimuli and necessary for the onset of embryogenesis. In honeybees egg activation occurs independently of fertilization and seems to be triggered during the passage through mother\'s reproductive tract. Furthermore, if the egg is not fertilized it will develop into haploid organism. However, if the egg receives the sperm up to 30min after activation, this egg develops into a diploid organism. In Drosophila, the egg activation is also fertilization independent. Initial stimulus that triggers the development is due mechanical stresses suffered by the egg during ovulation and passage through the reproductive tract. In this model, the first activation signal includes activation of calciumdependent pathway. Maternal molecules that are incorporated into the oocyte during ovogenesis, act during egg activation, as well as in early embryogenesis. Early embryogenesis events are also characterized by absence of high levels of zygotic transcription. The deposited molecules drive egg activation, breaking cell division dormancy permitting the beginning of embryonic development. But, the developing embryo gradually degrades and substitutes these mother-inherited molecules, in a process known as mother-to-zygote transition. Our main objective was the understanding of the deep crosstalk among the inherited molecules and the newly ones produced during the first steps of Apis mellifera embryogenesis. To achieve our objective 16 deep sequenced RNA (mRNA, miRNA) libraries were constructed using different age diploid and haploid embryos, and mature oocytes. Genome-wide transcriptome analysis was performed and interactive regulatory networks were constructed. Our analysis permitted the identification of maternal and zygotic mRNAs and miRNAs and related processes. Based on expression profiles of mRNAs and miRNAs in mature oocytes and haploid and diploid embryos of 2, 6 and 18-24 h of development, we constructed integrative regulatory networks (miRNA:mRNA) showing that the same miRNA could target different mRNAs in each type of embryo, in the same phase of development. As example we cite broad/GB48272, which is classified as maternal in diploid embryos and regulated by four different miRNAs. However, in haploid embryos it is zygotic and regulated by only one miRNA. Analysis of RNAseq and in situ hybridization showed the expression pattern of zelda in early honeybee embryos. Zelda is a key activator of Drosophila early zygotic genome and regulates important events in early embryogenesis binding to TAGteam motif. In A. mellifera, we found a putative TAGteam motif that has been implicated in early zygotic transcription. Moreover, in situ hybridization and PCR assay showed three pri-miRNAs (ame-mir-375-3p, ame-mir-34-5p and ame-mir-263b-5p) expressed during cleavage. The presence of pri-miRNAs is the first evidence of early zygotic transcription during cleavage. In short, we could say that this is the first work on Apis mellifera describing the early embryonic developmental events comparing haploid and diploid embryos using modern bioinformatics tools and advanced molecular analysis.

NHE3 reabsorve a maior parte de Na+ em túbulos proximais e é agudamente modulado por Ang II de forma bimodal. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos crônicos da Ang II sobre a atividade, expressão e atividade promotora de NHE3. A atividade de NHE3 foi avaliada na presença de veículo, inibidor de NHE1, 2 e 3 e H+ ATPase. Houve redução da recuperação do pHi na presença do inibidor de NHE3. Células foram expostas por 24h a Ang II de 10-7M a 10-12 M e houve aumento de atividade com Ang II 10-11 M. Houve aumento na expressão de NHE3 e no seu RNAm. Actinomicina D não mostrou diferença entre os tempos de ½ vida do RNAm. Transfecções transitórias de fragmentos do promotor de NHE3 de rato mostraram que a atividade do fragmento -65/+31 aumentou na presença de Ang II. Mutações em sítios para a ligação de Sp1/Egr-1 e AP2 mostraram que o sítio Sp1/Egr-1 é fundamental para esse efeito. As vias que envolvem o citocromo P450, PI3K, PKA e MAPK são ativadas, porém, as vias da PLC e JAK/STAT não. Losartan aboliu os efeitos observados. Conclui-se que a exposição crônica à baixa concentração de Ang II promoveu aumento na atividade, expressão, nível de RNAm e atividade promotora do gene NHE3 via AT1R. O sítio de ligação para os fatores de transcrição Sp1/Egr-1 está envolvido nessa resposta. / NHE3 is the major responsible for the sodium reabsorption in proximal tubules and it is Ang II acutely modulated in a bimodal fashion. The aim of this study was to evaluate the chronic effects of Ang II on NHE3 activity, transcription and expression. The NHE3 activity was evaluated in the presence of vehicle, NHE1, 2 and 3 and H+ ATPase inhibitors. Presence of NHE3 inhibitor reduced the rate of pHi recovery. Cells were treated with Ang II 10-7M to 10-12 M for 24h and Ang II 10-11 M increased the pHi recovery rate. NHE3 protein and mRNA were increased in Ang II presence. NHE3 mRNA ½ life in Actinomycin D incubated cells was not affected by Ang II treatment. Transient transfections of fragments of rat NHE3 promoter showed that the activity of -65/+31 was increased in Ang II presence. Mutation at Sp1/Egr-1 and AP2 sites in the -60/+31 fragment showed that Sp1/Egr-1 integrity is required. Cytochrome P450, PI3K, PKA and MAPK signaling pathways are related with this effect, while PLC and JAK/STAT are not. Losartan abolished the observed effects. In conclusion, chronic treatment with low concentration of Ang II resulted in increase of NHE3 activity, protein expression, mRNA levels and promoter activity of NHE3 gene through AT1R. Sp1/Egr-1 site seems to be involved in this effect.