Classical midgut carcinoids belong to neuroendocrine tumors of the gastroenteropancreatic tract (GEP-NETs) and are associated with serotonin overproduction. The term midgut is derived from the tumors’ embryological site of origin: enterochromaffin cells in the lower jejunum, ileum, caecum and the ascending colon. Despite their rather benign nature, these tumors can metastasize to mesentery and liver, putting patients at risk for the so-called carcinoid syndrome. This syndrome is characterized by flushes, diarrhoea and valvular heart disease due to the excessive serotonin secretion by tumor cells. Treatment of metastatic disease is currently ineffective and T cell immunotherapy has been suggested as a novel approach. We propose a number of midgut carcinoid-associated proteins as potential antigens for immunotherapy. Chromogranin A (CGA), tryptophan hydroxylase 1 (TPH-1), vesicular monoamine transporter 1 (VMAT-1), caudal type homeobox transcription factor 2 (CDX-2), islet autoantigen 2 (IA-2) and survivin represent interesting candidates based on their fairly restricted neuroendocrine tissue expression. In pursuit of potential antigens we identified a novel splicing variant of VMAT-1, lacking the second last exon. The variant, denoted VMAT1Δ15, encodes a differently translated C-terminal compared to the native form, is localized in the endoplasmic reticulum (ER) instead of large dense core vesicles and is unable to accumulate serotonin. We identify several immunogenic HLA-A*0201-binding peptide epitopes derived from our proposed antigens by analyzing CD8+ T cell responses in blood from midgut carcinoid patients. We demonstrate immune recognition of midgut carcinoid tumors in patients and in vitro generation of activated CD8+ T cells recognizing these peptide epitopes in blood from healthy controls. Patients also exhibit increased frequencies of circulating regulatory T cells (Tregs) with suppressive quality and patient lymphocytes display a decreased proliferative capacity compared to healthy controls. Midgut carcinoid tumors are frequently infiltrated by T cells, however always in the presence of Foxp3-expressing Tregs. Midgut carcinoid-associated antigens recognized by CD8+ T cells are of great interest for cellular therapies such as modified DC vaccines or adoptive T cell transfer. However, the systemic and local suppression of Th1 immunity must be considered and likely corrected in order to obtain clinically effective immunotherapies.

Regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen sind essentiell für das Gleichgewicht des intestinalen Immunsystems. Eine Einschränkung ihrer Suppressionsfunktion wird bei Patienten mit Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX)-Syndrom beobachtet und führt im Tiermodell zu lymphoproliferativen Erkrankungen und intestinalen Entzündungen. Von entscheidender Bedeutung für Homöostase und Suppressionsfunktion regulatorischer T-Zellen ist das Signalmolekül Interleukin-2 (IL-2). Im Gegensatz zu Effektor-T-Zellen exprimieren Foxp3+CD4+ T-Zellen den hochaffinen IL-2-Rezeptor αβγ konstitutiv. IL-2 wird von regulatorischen T-Zellen nicht in relevanten Mengen exprimiert. Sie sind somit auf von anderen Zellen sezerniertes IL-2 angewiesen. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass im Tiermodell regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen durch Applikation eines IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex nicht nur in mesenterialen Lymphknoten und Milz, sondern auch lokal in der Lamina propria mucosae des Kolons der Versuchstiere expandiert werden. Als relevante Quelle von IL-2 in situ könnten aktivierte proliferierende T-Zellen dienen. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Proteinexpression proliferierender Einzelzellen mittels Matrix assisted laser desorption/ionisation-Time of flight-Massenspektrometrie-Imaging (MALDI-Imaging) analysiert. Es gelang die Identifikation präferentiell in lymphoiden Geweben exprimierter Peptidmassen. Obwohl die Einzelzellanalyse mittels MALDI-Imaging prinzipiell möglich erscheint, ist ein Nachweis von Zytokinen wie IL-2 derzeit aufgrund fehlender Sensitivität im Proteinmassebereich zwischen 10kDa und 20kDa nicht möglich. Die therapeutischen Möglichkeiten der Expansion regulatorischer Foxp3+ T-Zellen durch stabile IL-2-Rezeptor-Agonisten und die Rolle von IL-2 für die intestinale Immunregulation sollten weiter untersucht werden.

Zurzeit existieren keine validen Biomarker, welche die Krankheitsaktivität oder das Rezidiv-Risiko von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen objektivierbar machen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Biomarker des Immunmonitorings auf ihren Nutzen bei der Beurteilung der Krankheitsaktivität von Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) untersucht. Hierzu wurde bei 98 Patienten mit CED, nach positivem Votum der Ethikkommission, die intrazelluläre ATP-Konzentration der CD4+-Zellen gemessen, um diese mit der Krankheitsaktivität der Patienten in Bezug zu setzen. Die Patientendaten wurden zuvor mithilfe von standardisierten Fragebögen erhoben, um daraufhin die Krankheitsaktivitätsindices CDAI, HBI und SCCAI aus den klinischen Daten zu ermitteln. Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen der ATP-Konzentrationen und der Krankheitsaktivität der Patienten festgestellt. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass Einzelmessungen der intrazellulären ATP-Konzentration von Lymphozyten nicht die Krankheitsaktivität von Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen widerspiegeln. Ein signifikanter Unterschied der intrazellulären ATP-Konzentration CD4+-Zellen wurde allerdings zwischen Patienten mit und ohne Infliximab-Therapie nachgewiesen. Die Patienten, die unter einer Infliximab-Therapie standen, hatten signifikant niedrigere intrazelluläre ATP-Konzentrationen der Lymphozyten (p<0,01, Mann-Whitney-U). Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass Infliximab als TNF-α-Blocker die Immunantwort bzw. die Aktivität von Lymphozyten inhibiert. Mithilfe der intrazellulären ATP-Konzentration wäre somit evtl. ein Werkzeug gegeben, um die Effektivität der Inhibierung der lymphozytären Immunreaktion durch TNF-α-Blocker zu kontrollieren. Weiterhin wurde bei 99 CED-Patienten die Anzahl regulatorischer T-Zellen im peripheren Blut bestimmt. Hierfür wurden die Zellen mithilfe von CD4-, CD25-, CD127- und FoxP3-Antikörpern angefärbt und mittels der FACS-Analytik quantifiziert. Anschließend wurde die so ermittelte Anzahl regulatorischer T-Zellen (CD4+CD25highCD127-FoxP3+-Zellen) mit der Krankheitsaktivität der Patienten korreliert. Auch dabei wurde keine signifikante Korrelation nachgewiesen. Bei der Unterteilung der Patienten in Gruppen mit erhöhter und erniedrigter Krankheitsaktivität deutete sich ein Unterschied bezüglich der Anzahl regulatorischer T-Zellen an, der jedoch nicht signifikant war (p=0,073, Mann-Whitney-U-Test). Diese Ergebnisse führten zu der Annahme, dass sich die durchflusszytometrisch quantifizierte Anzahl regulatorischer T-Zellen ebenfalls nicht als Surrogatmarker für die Krankheitsaktivität von Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen eignet. Zudem wurde postuliert, dass die Quantifizierung von Tregs keine Hilfe bei der Unterscheidung zwischen den beiden Erkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulcerosa liefern kann. Der tendenzielle Unterschied in der Anzahl von Tregs zwischen Patienten mit niedriger und erhöhter Krankheitsaktivität zeigt jedoch, dass regulatorische T-Zellen bei der Pathogenese von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen eine Rolle zu spielen scheinen. Allerdings deutet sich auch eine Abhängigkeit von weiteren pathogenen Faktoren in der komplexen Ätiologie von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen an. Bei 35 der CED-Patienten wurde zusätzlich eine weitere Methode zur Quantifizierung regulatorischer T-Zellen angewendet. Hierbei handelte es sich um einen DNA-Methylierungsassay, welcher die regulatorischen T-Zellen anhand einer spezifischen Demethylierungsregion der DNA (TSDR) ermittelt. Diese TSDR ist bei den Tregs demethyliert, während sie bei allen anderen Zellen des Blutes methyliert ist. Die Ergebnisse dieses Assays korrelierten jedoch nicht mit der Krankheitsaktivität der Patienten und korrelierten auch nicht mit den Ergebnissen für die Anzahl regulatorischer T-Zellen aus der FACS-Analytik. Diese Tatsache könnte zum einen darauf beruhen, dass in der FACS-Analytik im Gegensatz zum DNA-Methylierungsassay auch aktivierte T-Effektorzellen quantifiziert werden, welche nur transient FoxP3 exprimieren. Zum anderen werden mittels des DNA-Methylierungsassays auch CD8+FoxP3+-Zellen quantifiziert, welche keine oder geringe regulatorischen Eigenschaften besitzen und in der Durchflusszytometrie nicht quantifiziert werden. Zudem könnte eine fehlende Korrelation zwischen den Ergebnissen der beiden Verfahren auch daran liegen, dass sich die quantifizierten Tregs aus der Durchflusszytometrie auf die Gesamtheit der CD4+-Zellen beziehen, während sich die Tregs des DNA-Methylierungsassays auf die gesamten DNA-haltigen Zellen des Vollblutes beziehen. Zur besseren Vergleichbarkeit könnte in zukünftigen Studien ein Quotient aus Tregs und CD4+-Zellen gebildet werden. Zusammenfassend hat sich im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass sich weder mithilfe der intrazellulären ATP-Konzentrationen von Lymphozyten noch der Anzahl regulatorischer T-Zellen eine Aussage bezüglich der Krankheitsaktivität oder des Rezidivrisikos von CED-Patienten treffen lässt. Da die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen derzeit nicht heilbar sind, werden weitere Surrogatmarker zum Objektivieren der Krankheitsaktivität benötigt, um Krankheitsrezidiven zeitnah entgegenwirken zu können.

Cytokines are soluble signalling mediators within the immune system, and have been shown to be of importance in the development of type 1 diabetes (T1D). This thesis studied the production of cytokines in experimental models of T1D and during transplantation of insulin-producing islets of Langerhans. We have demonstrated that the transcriptional TNFα-inhibitor MDL 201,449A, previously shown to reduce immune-mediated diabetes induced in mice by multiple low doses of streptozotocin, was not TNFα-specific, but also inhibited IFNγ and IL-10 in spleen cells. Furthermore, when the inhibitor was removed from in vitro cultures, a rebound phenomenon of increased cytokine secretion occurred. The thesis also investigated whether plastic adhesion, a method generally employed to deplete macrophages, influenced cytokine production in spleen cells. We observed that plastic adhesion increased TNFα, IFNγ and IL-10 release, and decreased IL-4 secretion. Plastic adhesion depleted only ~30% of the macrophages, but as much as ~60% of the regulatory T cells. Thirdly, we found that “control” treatments for islet transplantations, i.e. syngeneic and sham transplantations, exerted a clear effect on cytokine production from spleen cells, possibly due to a decrease in regulatory T cells that may be caused by the surgery and/or anaesthesia. Moreover, spleen cells from mice exposed to surgery exhibited a decreased proliferative capacity to concanavalin A stimulation. We also perceived a marked difference in cytokine response depending on the mouse strain used in the experiments. Finally, we aimed to elucidate if, besides autoimmune activities, also high glucose- and free fatty acid concentrations as seen in diabetes could cause changes in cytokine production. We observed that spleen cells cultured in varying glucose concentrations had different cytokine production profiles. The free fatty acid palmitate might also influence cytokine release, but this effect was obscured by the cytokine-suppressive action of the ethanol used to dissolve the palmitate.

Allergic asthma is an immunological disease, mediated by CD4+ Th2 cells, and its prevalence has increased over recent decades. Features of allergic asthma include airway hyperresponsiveness (AHR), airway eosinophilia, excessive airway mucus production, and increased IgE and Th2 cytokine levels. Airway remodeling with pulmonary fibrosis is noted in the progress of asthma. In this thesis, a murine model of allergic asthma was used to investigate the effect of cyclophosphamide (CY) on asthma and the involvement of regulatory T cells (Treg), and the role of Granulocyte-macrophage colony stimulating-factor (GM-CSF) in allergic asthma by using GM-CSF knockout mice. CY is a cytotoxic agent, which paradoxically augments several immune responses. The first part of this thesis was aimed to study the effects of CY in a murine model of allergic airway inflammation. BALB/c mice were immunized with ovalbumin (OVA) on days 0 and 14, and challenged with aerosolized OVA from days 21 to 27. Some mice additionally received CY on days -2 and 12. In the CY-treated animals, pronounced worsening of inflammatory features was noted, including increases in eosinophil infiltration, epithelial thickness, mucus occlusion and eosinophil numbers in bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Increased total and OVA-specific serum IgE were also noted in the CY-treated animals. In cell cultures from peritracheal lymph nodes, the Th2 cytokines IL-4 and IL-5 were elevated in animals treated with CY. It was hypothesized that the effects of CY could be caused by reduced immunosuppression mediated by Treg. mRNA expression of the immunosuppressive cytokines IL-10 and TGF-beta was reduced in the lungs of CY-treated mice. The expression of FoxP3, a marker of naturally occurring Treg, was significantly reduced in spleens, thymuses and peritracheal lymph nodes after the second injection of CY, and in the lung tissue after allergen challenge in CY-treated mice. Furthermore, lung IL-10-producing CD4+ T cells and CTLA-4+-bearing CD4+ T cells were reduced after allergen aerosol challenge in CY-treated mice. Thus CY worsened the features of allergic pulmonary inflammation in this model, in association with increased production of IgE and Th2 cytokines. The reduction in expression of FoxP3 and immunosuppressive cytokines by CY suggests that toxicity to Treg may contribute to the increased inflammation. GM-CSF plays a role in the growth, development, and maturation of bone marrow hemopoietic cells into mature blood cells, and has been proposed to be involved in potentiating the function of inflammatory cells in allergic inflammation. In the second part of this thesis, GM-CSF knockout (KO) mice were used to investigate the role of GM-CSF. In allergic KO mice, airway eosinophils were only shown in the perivascular, but not peribronchial areas in the lung, compared to the allergic wild-type (WT) mice in which eosinophil infiltration appeared in both areas. Eosinophil numbers were drastically reduced in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of KO mice. IL-5 production in the lung tissue and BALF in allergic KO mice was reduced; similar results were also found in peritracheal draining lymph nodes after in vitro stimulation assays. However, IL-4 and IL-13 production, airway hyperresponsiveness (AHR), and serum IgE production were not affected in allergic KO mice. Surprisingly, lung IFN-gamma mRNA and BALF levels were increased in allergic KO mice. Lung mRNA levels of CCR3, a key chemokine receptor on eosinophils, were significantly reduced in allergic KO mice, whereas expression of the chemokines eotaxin and RANTES were at similar levels in allergic KO and WT mice. Lung mRNA levels of the IFN-gamma-inducible chemokines Mig (CXCL9) and IP-10 (CXCL10), which are antagonists of CCR3, and their receptor CXCR3 were increased in allergic KO mice, compared with allergic WT mice. Data obtained from flow cytometry showed more eosinophils survived in the lung of WT mice than KO mice. Another allergy model, a peritoneal allergy model was performed to investigate inflammation in a different model. Leukocyte subpopulations such as neutrophils, eosinophils, macrophages, and lymphocytes were reduced in the peritoneal lavage fluid of allergic KO mice. The findings revealed that GM-CSF is essential for IL-5 production, pulmonary airway eosinophilia and eosinophil survival. In the absence of GM-CSF, over-production of IFN-???? may induce chemokines, including Mig and IP-10, which are antagonists for CCR3 and may reduce airway eosinophil infiltration. In this thesis, a murine model of allergic asthma has been used to obtain novel findings on the regulation of allergic inflammation. The results with CY are relevant to the treatment of asthma patients with CY and other cytotoxic agents. The findings in the GM-CSF KO mice suggest that GM-CSF is a potential therapeutic target in asthma, and that in assessment of new therapeutic agents for asthma, effects on GM-CSF should be considered.

Le développement d’un lymphome gastrique du MALT (LGM) émane d’un processus inflammatoire chronique initié par Helicobacter pylori.A partir du matériel issu d’un modèle animal de LGM, préalablement développé au laboratoire, basé sur des infections chez des souris thymectomisées à la naissance, la réponse inflammatoire gastrique favorable à l’émergence de LGM a été étudiée. Une dérégulation de cytokines et chimiokines au stade LGM a été identifiée permettant de recruter, faire proliférer et faire émerger des infiltrats lymphoïdes. La susceptibilité des souris thymectomisées à développer des lymphomes n’est pas liée à un déficit en lymphocytes T régulateurs. Cinq microARNs ont été retrouvés dérégulés au stade lymphome agissant probablement en synergie pour favoriser la prolifération lymphocytaire en particulier via un mécanisme anti-apoptotique. Enfin, nous décrivons un modèle original de LGM basé sur l’utilisation de souris C57BL6 exprimant la chimiokine APRIL humaine au niveau des lymphocytes T infectées par des espèces du genre Helicobacter. Ce modèle est prometteur pour une meilleure compréhension de la lymphomagénèse gastrique. / The development of gastric MALT lymphoma (GML) originates from a chronic inflammatory process initiated by Helicobacter pylori.The gastric inflammatory response was investigated in a mouse model of GML previously described by the laboratory using BALB/c mice thymectomized at day 3 post-birth and infected by H. pylori. A deregulation of numerous cytokines and chemokines at GML stage was identified which explained the recruitment, proliferation and emergence of lymphoid infiltrates. The susceptibility of thymectomized mice to develop lymphoma was not linked to a deficiency in regulatory T cells. A deregulation of 5 microRNAs was observed at lymphoma stage. These microRNAs may be involved in cell survival and lymphocyte proliferation and act in synergy to promote the development of GML. Finally, we described an original model of GML based on infection by Helicobacter species of transgenic C57BL6 mice expressing the human form of the cytokine APRIL in T cells. This model is promising for a better understanding of gastric lymphomagenesis.

Summary<p>Immune homeostasis relies on a subtle balance between fight towards pathogens and inhibitory mechanisms that prevent inappropriate responses against self and environmental antigens (allergy). Regulatory T (Treg) cells play a central role in this balance. Optimizing Treg effects represents a promising approach for new stratetiges aiming to induce or restore tolerance against allo or self antigens. The first part of this work demonstrates that CD4+ lymphocytes that secrete IL-17A (Th17) promote allograft rejection in a murin model of skin transplantation with minor antigen disparities. Interestingly, Treg cells strengthen rather than inhibit Th17 effector mechanisms in this model. Indeed, we found that in vivo Treg depletion prevented IL-17 production by recipient T cells. An adoptive cotransfer of Treg with naive monospecific antidonor T cells in lymphopenic hosts biased the immune response towards a dominant Th17 phenotype. Finally, we observed that IL-6 was central for balancing Treg and Th17 cells as demonstrated by the prevention of Th17 differentiation, the enhanced Treg/Th17 ratio, and rejection blockade in the absence of IL-6. In conclusion, the ability of Treg to promote a Th17 pathway of rejection we described should be considered as a potential drawback of Treg-based cell therapy.<p>Based on the hypothesis that Treg promote Th17 immune response, we tested the effect of IL-17A neutralization in a model in which long-term skin allograft survival depends on a transient in vivo Treg expansion induced by exogenous IL-2. As expected, IL-2 administration prevented rejection of MHC class II disparate skin allografts. Surprisingly this treatment was inefficient in IL17A-/- recipients. We attested that IL-17A was not required for IL-2-mediated Treg expansion, recruitment or suppressive capacities. Instead, IL-17A prevented allograft rejection by inhibiting Th1 alloreactivity independently of Treg. Indeed, T-bet expression of naïve alloreactive CD4+ T cells and the subsequent Th1 immune response was significantly enhanced in IL-17A deficient mice. Our results illustrate, to our knowledge, for the first time a protective role of IL-17A in CD4+-mediated allograft rejection process.<p>In the last part of this work, we used the same mouse model of MHC class II-mismatched skin grafts in which long-term acceptance is achieved by a short-term administration of exogenous IL-2. We first confirmed that Tregs play a central role in preventing skin graft rejection as attested by the prompt donor skin destruction occuring after Treg cell depletion.<p>In the context of IL-2-mediated anti-rejection therapy, concomitant costimulatory blockade with CTLA4-Ig paradoxically restored skin allograft rejection and Th1 alloreactivity indicating that Treg-mediated suppresion absolutely required CD28-B7 or CTLA4/B7 interactions. Further experiments showed that CTLA4-Ig inhibited IL-2-driven Treg expansion, and prevented in particular the occurrence of ICOS+ Treg endowed with potent suppressive capacities. Restoring CD28 signaling was sufficient to counteract the deleterious effect of CTLA4-Ig on Treg expansion and functionality, in keeping with the hypothesis that costimulatory blockade inhibits Treg expansion and function by limiting the delivery of essential CD28-dependent signals. Inhibition of regulatory T cell function should therefore be taken into account when designing tolerance protocols based on costimulatory blockade.<p> <p>RÉSUMÉ<p>Le bon fonctionnement du système immunitaire résulte d’un équilibre entre les réponses immunes « effectrices » qui luttent contre les pathogènes et des mécanismes « régulateurs » permettant de les contrôler. Parmi ces mécanismes inhibiteurs, les lymphocytes T régulateurs (Treg) jouent un rôle crucial. En empêchant le débordement des réponses effectrices, ils préviennent l’apparition des allergies et des maladies auto-immunes ou inflammatoires. Dès lors, il est aisé d’imaginer le potentiel thérapeutique de ces cellules pour contrecarrer les phénomènes autoimmuns ou les réponses allogéniques responsables du rejet en transplantation. C’est donc l’étude des Treg chez la souris qui se trouve au centre des nos préoccupations dans ce travail.<p>Dans la première partie, nous avons démontré le rôle des lymphocytes CD4+ sécréteurs d’IL-17A (Th17) dans le rejet de greffe de peau présentant une disparité d’antigène mineur de transplantation. Dans ce modèle de rejet « Th17 », les données indiquent que, contrairement aux lignées Th1 et Th2, la réponse Th17 est favorisée par les Treg renversant ainsi le paradigme absolu du « Treg inhibiteur ». En effet, la déplétion des Treg dans notre modèle abolit l’expression des gènes caractéristiques de la voie Th17. De plus, dans un système de transfert adoptif chez la souris lymphopénique, l’ajout de Treg à une population T CD4+ effectrice naïve favorise leur différenciation en Th17. Enfin, en invalidant le gène de l’IL-6 dans notre combinaison allogénique mineure, nous avons mis en évidence la place importante de cette cytokine dans le rejet Th17 ainsi que dans la balance Th17/Treg en alloimmunité. <p>En partant du postulat que les Treg favorisent les réponses Th17, nous avons étudié l’impact de la déficience en IL-17A dans un modèle de greffe de peau réalisée en présence de quatités acrues de Treg. Pour cela, nous avons utilisé un modèle de rejet induit par une disparité isolée du CMH II au cours duquel les Treg sont amplifiés par l’injection d’IL-2 exogène durant les trois premiers jours de greffe. Dans ce système, l’expansion transitoire des Treg chez le receveur « sauvage » bloque le rejet dans 75% des cas jusqu’au jour 60 après la greffe sans le moindre traitement immunosuppresseur. Contre toute attente, l’absence d’IL-17A dans ce système restaure le rejet (receveurs IL-17A-/-). Nous avons démontré que l’IL-17A n’est pas requise pour l’expansion, la migration ou la fonction des Treg amplifiés par l’IL-2. En fait, les résultats suggèrent que l’IL-17A bloque le rejet en inhibant la réponse Th1 indépendamment des Treg. Ce point est appuyé par l’exacerbation de la voie Th1 chez le receveur IL-17A-/- et l’inhibition de l’expression de T-bet sous l’influence de l’IL-17A en culture mixte lymphocytaire. Paradoxalement, cette partie du travail rapporte donc un effet protecteur de l’IL-17A illustrant toute la complexité des rôles joués par cette cytokine. <p>La dernière partie du travail utilise le même modèle de greffe de peau allogénique (disparité du CMH II) dans lequel le rejet aigu est bloqué par l’expansion in vivo des Treg induite par l’IL-2 exogène. Nous avons confirmé que l’acceptation à long terme des greffons repose sur les propriétés inhibitrices des Treg amplifiés. Cette inhibition du rejet nécessite impérativement l’intégrité des interactions survenant entre les Treg et les cellules présentatrices d’antigènes du receveur via les molécules B7/CD28. L’ajout de CTLA4-Ig, un immunosuppresseur bloquant les interactions de ces molécules, conduit invariablement à l’accélération paradoxale du rejet. Cet effet pro-inflammatoire du CTLA4-Ig, s’explique par une action délétère sur la survie et la qualité des Treg. En conclusion, les données expérimentales obtenues dans ce dernier volet démontrent l’effet délétère potentiel de ce type de traitement dans les protocoles d’induction de tolérance basé sur l’emploi des Treg.<p> / Doctorat en sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die intestinale Immunhomöostase und Limitierung von (Auto)-Immunität. Sie exprimieren den Transkriptionsfaktor Foxp3 und an der Oberfläche die α-Kette des IL-2 Rezeptors (CD25). Im Tiermodell verhindern regulatorische T-Zellen Autoimmunopathien, Transplantatabstoßungen und entzündliche Darmerkrankungen. Da Foxp3+ regulatorische T-Zellen nur äußerst geringe Mengen an Interleukin-2 synthetisieren, sind sie auf eine adäquate Versorgung angewiesen. Konventionelle T-Zellen werden als bedeutende IL-2 Quelle für Treg-Zellen vermutet, doch über die Mechanismen und räumlich-zeitliche Dynamik der Treg-Effektor-Zellinteraktion ist bisher nur wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden Foxp3+ regulatorische T-Zellen in Mausgeweben analysiert und Zellinteraktionen mit Effektorzellen im Darm charakterisiert. Es wurde ein theoretisches Modell zur Evaluierung von Zell-Zellkontakten erarbeitet und experimentell überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass in der Akutphase einer T-Zell-induzierten Kolitis und im Kolon von gesunden Wildtyp-Mäusen Foxp3+ regulatorische T-Zellen an Ki-67+ proliferierenden T-Zellen akkumulieren. Diese Zellinteraktionen sind abhängig von Interleukin-2, da IL-2 defiziente Mäuse keine signifikanten Treg-Effektor-Zellakkumulationen aufweisen. Die Analyse der Genexpression konnte zeigen, dass Ki-67+ Zellen Interleukin-2 produzieren. Lokal sezerniertes Interleukin-2 könnte als Sensor für Entzündungsprozesse chemotaktisch auf Foxp3+ regulatorische T-Zellen wirken und die Akkumulation an proliferierenden, IL-2 produzierenden Effektorzellen bedingen. Dieser Mechanismus könnte einerseits zur lokalen Versorgung mit IL-2 dienen und gleichzeitig regulierend auf Effektorzellen in unmittelbarer Umgebung wirken. Dieser Prozess würde zur Erhaltung von regulatorischen T-Zellen in der Peripherie und zur Sicherung der intestinalen Immunbalance beitragen.:Bibliographische Beschreibung Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Charakterisierung von intestinalen Foxp3+ regulatorischen T-Zellen 1.2 Mechanismen der Treg-vermittelten Immunregulation 1.3 Zielstellung der Arbeit 2 Publikation Cell-Cell-Neighborhood Relations in Tissue Sections - A Quantitative Model for Tissue Cytometry 3 Appendix A Herleitung des Modellsystems zur Berechnung der zufälligen Kontaktwahrscheinlichkeit 4 Appendix B Automatische Bildanalyse mit CellProfiler 4.1 Einleitung 4.2 Algorithmus der histologischen Bildanalyse mit CellProfiler 4.3 Validierung der Messdaten 4.4 Zusammenfassung 4.5 Detaillierte Darstellung des CellProfiler-Algorithmus 5 Unpublizierte Experimente Die Rolle von Interleukin-2 für die Akkumulation von Foxp3+ Treg-Zellen an Ki-67+ proliferierenden Effektorzellen im Darm 5.1 Einleitung 5.2 Material und Methoden 5.2.1 Mausgewebe 5.2.2 Immunfluoreszenzfärbung 5.2.3 Laser-Mikrodissektion 5.2.4 RNA Isolation, Reverse Transkription, quantitative Real-Time PCR 5.2.5 Sequenzierung 5.3 Ergebnisse 6 Abschließende Diskussion 7 Zusammenfassung der Arbeit Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit Lebenslauf Danksagung Literaturverzeichnis

La candidose oro-pharyngée (COP) est l’infection fongique opportuniste la plus commune chez les individus infectés par le VIH-1. La production des cytokines Il-17 et Il-22 par les lymphocytes Th17 est importante lors de la résolution de la COP, puisque ces cytokines induisent la production de peptides antifongiques et le recrutement des neutrophiles polymorphonucléaires. Toutefois, les lymphocytes Th17 sont préférentiellement déplétés chez les individus infectés par le VIH-1. Le modèle de COP chez la souris transgénique (Tg) CD4C/HIVMutA, exprimant les gènes nef, env et rev du VIH-1, permettra de déterminer si des altérations quantitatives et/ou fonctionnelles des sous-populations de lymphocytes T CD4+ causent la sensibilité à la candidose. Les sous-populations Th1, Th2, Th1Th17, Th17 et Treg, ainsi que leurs précurseurs, les lymphocytes T CD4+ naïfs, sont sévèrement déplétées dans les ganglions cervicaux de la souris Tg. Cependant, les lymphocytes T CD4+ naïfs conservent la capacité à se différencier in vitro en présence de cytokines polarisantes et à produire les cytokines typiques des diverses sous-populations. De plus, les cytokines requises pour la polarisation des lymphocytes T CD4+ naïfs n’étaient pas réduites dans les ganglions cervicaux des souris Tg, 7 jours après le début de l’infection. Les gènes S100a8, Ccl20, Il17 et Il22 étaient surexprimés en réponse à la COP chez la souris non-Tg, mais pas chez la souris Tg. Le traitement de souris Tg infectées à l’aide de la combinaison des cytokines Il-17 et Il-22 réduit significativement la charge fongique buccale de C. albicans et le nombre d’hyphes dans l’épithélium de la langue et restaure la capacité à surexprimer des gènes S100a8, Ccl20 et Il22. Ces résultats démontrent que la perturbation de l’induction de l’immunité innée par l’Il-17 et l’Il-22 augmente la susceptibilité à la COP chez la souris Tg. / Oropharyngeal candidiasis (OPC) is the most common opportunistic fungal infection in HIV-infected individuals. OPC resolution involves Il-17 and Il-22 production by Th17 cells through oral antifungal peptide production and polymorphonuclear neutrophil recruitment. Conversely, Th17 cells are preferentially depleted in HIV-infected individuals. The OPC model in transgenic (Tg) mice expressing nef, env and rev from the HIV-1 genome enables the study of the quantitative and functional defects of the CD4+ T-cell subpopulations. The Th1, Th2, Th1Th17, Th17 and Treg subpopulations, as well as naïve CD4+ T-cell precursors, are severely depleted in the cervical lymph nodes (CLNs) of Tg mice. However, the differentiation capacity of naïve CD4+ T-cells in response to polarizing cytokines was maintained in vitro in Tg mice, as well as their ability to produce the signature cytokines of the various subpopulations. Moreover, the polarizing cytokines were not reduced in the CLNs of Tg mice, 7 days after infection. The S100a8, Ccl20, Il17 and Il22 genes were up-regulated in response to OPC in non-Tg mice, but not in Tg mice. Treatment of infected Tg mice with a combination of Il-17 and Il-22 cytokines significantly reduced the oral fungal burdens of C. albicans as well as the number of hyphae in the tongue epithelium. Treatment also restored S100a8, Ccl20 and Il22 up-regulation in Tg mice. These results show that defective induction of innate immunity, normally mediated by Il-17 and Il-22, increases the susceptibility to OPC in these Tg mice.

Les maladies allergiques sont de plus en plus fréquentent. Elles atteignent souvent l’enfant jeune chez qui l’allergie respiratoire et l’allergie alimentaire sont les principales pathologies. L’unique traitement curatif est l’immunothérapie spécifique d’antigène (ITA), largement développée dans l’allergie respiratoire et encore à ses débuts dans l’allergie alimentaire. Pour adapter au mieux la prise en charge du patient, le diagnostic précis de l’allergie est indispensable et il n’existe actuellement pas d’examen biologique totalement fiable. Seul, la présence d’IgE spécifiques permet de diagnostiquer une sensibilisation à un allergène mais pas une allergie cliniquement symptomatique. Dans une première partie, nous avons étudié l’intérêt d’un test fonctionnel, l’ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot), dans le diagnostic de l’allergie aux acariens chez l’enfant asthmatique. Le nombre de lymphocytes T circulants spécifiques d’acariens sécréteur d’interleukine (IL)-4 ou d’IL-13 était associé à la présence d’une allergie symptomatique, indépendamment des IgE spécifiques. Il était plus élevé dans le cas d’une rhinite allergique sévère et plus faible dans le cas d’une rhinite allergique légère. De plus, il variait au cours de l’année en fonction des saisons avec un pic en automne et un pic en début de printemps. Dans une deuxième partie, nous avons étudié l’intérêt de l’ELISpot dans le diagnostic de l’allergie au lait de vache chez l’enfant, confirmée par un test de provocation orale en double aveugle. Nous avons décrit que le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine et sécréteurs d’IL-4 et d’IL-13 était associé à l’allergie au lait de vache avec une sensibilité de 100%. Par ailleurs, le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine était également associé à la dose maximale de lait tolérée par l’enfant.Enfin, dans une troisième partie, nous avons étudié la réponse lymphocytaire T au cours d’une ITA sub-linguale (SLIT) d’une part et sous-cutanée (SCIT) d’autre part, chez des enfants asthmatiques allergiques aux acariens suivis pendant une année. Nous avons décrit une diminution des lymphocytes Th2 (sécréteurs d’IL-4 et IL-13) spécifiques d’acariens après 12 mois de SLIT associée à une augmentation des cellules sécrétrices d’IL-10 (Tr1) spécifiques d’acariens après 6 mois de SLIT. De plus, les lymphocytes T régulateurs (CD4+CD25hiCD127loFoxp3+) étaient augmentés après 12 mois de SCIT. Nous n’avons pas retrouvé de production accrue d’interféron γ (IFNγ) par les lymphocytes T spécifiques d’acariens au cours de la désensibilisation.Au total, ce travail nous a permis de décrire qu’un test fonctionnel, l’ELISpot, permet de réaliser un diagnostic fiable de l’allergie aux acariens et de l’allergie au lait de vache chez l’enfant. Par ailleurs, l’ITA induit une diminution des cellules Th2 et une augmentation des cellules Tr1 par voie sub-linguale ainsi qu’une augmentation des Treg Foxp3+ par voie sous-cutanée sans immunodéviation Th2/Th1, chez l’enfant allergique aux acariens. / Allergic diseases are steadily increasing steadily and especially in children. Allergen specific immunotherapy (desensitization) is the only curative treatment for which accurate diagnosis of allergy is essential. Currently, the presence of specific IgE diagnoses a sensitization to an allergen but not a clinically symptomatic allergy. In a first part, we studied the value of a functional test, the ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot) in the diagnosis of allergy to house dust mites (HDM). The number of circulating HDM-specific IL-4 and IL-13 secreting T cells was associated with the presence of symptoms, regardless of specific IgE and was higher in severe rhinitis than in mild rhinitis. In addition, it varied according to the season with a peak in autumn and a peak in early spring (wet periods with greater allergen exposure). In a second part, we studied the value of ELISpot for the diagnosis of cow's milk allergy in children, confirmed by double blind placebo control food challenge. We found that the number of casein-specific IL-4 and IL -13 secreting T-cells was associated with allergy to cow's milk. It was also inversely correlated to the cow’s milk tolerated cumulative dose. Receiver-operating characteristic (ROC) curve of combined IL-4 and IL-13 analysis was generated. AUC was 0,98 (95% CI 0.90-1.06). For a cut-off of 10 IL-4- and 12 IL-13 secreting T-cells, sensitivity and negative predictive value were 100%.Finally, in the third part, we monitored antigen specific T-cell response in HDM allergic children treated with sublingual ITA (SLIT) on the one hand and subcutaneous ITA (SCIT) on the other hand, during one year. We found a decrease in HDM specific Th2 cells after 12 months of SLIT associated with an increase in HDM specific IL-10 secreting T-cells after 6 months of SLIT. In addition, regulatory T cells (CD4 + CD25hiCD127loFoxp3+) were increased after 12 months of SCIT. In conclusion, this work has allowed us to describe a functional test, the ELISpot, as a reliable tool for the diagnosis of mite allergy and cow's milk allergy in children. In addition, in HDM allergic children, a decrease of Th2 cells and an increase of IL-10 secreting T-cells was found in children treated with SLIT to HDM as well as an increase in Foxp3+ Treg in children treated with SCIT.