Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4425.pdf: 4096750 bytes, checksum: d77921e33ac24b167ed701cea4759eb0 (MD5) Previous issue date: 2012-04-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / Plant cell walls are composed of approximately 65% cellulose microfibrils and pectin. The latter is proteolytically degraded by the so-called pectinases enzymes (also known as pectinolytic enzymes). Pectinases may be either depolymerizing. They are produced by plants, filamentous fungi, bacteria, and yeast. Due to the wide commercial use of pectinase, one has testified a growing number of studies devoted to understand the activities of such enzymes. Bioinformatics tools were employed throughout this work in order to study fungal polygalacturonase (PG) under two aspects. Firstly, all stored fungal PG sequences in databases (2093) were analyzed in order to evaluate through searching for sequential motifs and phylogenetic studies the possibility to classifying the enzymes as either Endo- or Exo-PG. After excluding those with less than 70 amino acids, those that corresponded to the hypothetical protein , and those that were neither PG nor fungal PG, there were 957 sequences left. Those sequences were separated according to genus and species. For each group, multiple sequence alignments were made by using ClustalW software. The alignments were analyzed and the sequences displaying 100% identity were then expunged, thus resulting in a database of unique sequences of fungal PG. By means of the alignment, the study of structural motifs, and the construction of phylogenetic trees, one was able to classify all the sequences according to their mode of action in either Endo- or Ex-PG. Throughout the second part of our research, protein homology-modeling methods were employed while constructing a three-dimensional model of a L. gongylophorus fungal polygalacturonase, symbiont of leaf-cutting ant. The model was validated by PROCHECK, VERIFY 3D, and WHAT IF software. By analyzing the 3D model of the L. gongylophorus PG, a catalytic mechanism of the enzyme was outlined, which may take place by inverting the configuration of sugar anomeric carbon (substrate). / A parede celular de células de plantas é composta de aproximadamente 65% de rede de celulose e rede de pectato. Essa última é proteoliticamente degradada por enzimas chamadas pectinases ou enzimas pectinolíticas. As pectinases podem ser despolimerizantes ou desesterificantes e são produzidas por plantas, fungos filamentosos, bactérias e leveduras. Impulsionado pelas aplicações comerciais que pectinases representam, é crescente o estudo para o melhor entendimento sobre as atividades dessas enzimas. Ferramentas de bioinformática foram usadas neste trabalho para estudar poligalacturonases (PG) de fungos, sob dois aspectos. Na primeira parte do trabalho, todas as sequências de PG de fungos depositadas em bancos de dados (2093) foram analisadas e avaliadas quanto à possibilidade de classificação das enzimas em Endo- ou Exo-PG através de busca de motivos sequenciais e estudos filogenéticos. Após exclusão daquelas com menos de 70 aminoácidos, das que correspondiam a 'proteína hipotética' e ainda das que não eram PG ou mesmo não eram PG de fungos restaram 957 sequências. Essas sequências foram separadas por gênero e espécie e para cada grupo foram realizados alinhamentos múltiplos de sequências usando o programa ClustalW . Os alinhamentos foram analisados e as sequências com 100% de identidade foram retiradas, resultando em um conjunto de dados com 417 sequências únicas de PG de fungos. Através dos alinhamentos, do estudo de motivos estruturais e da construção de árvores filogenéticas foi possível classificar todas as sequências de acordo com seu modo de ação em Endo- ou Exo-PG. Na segunda parte do trabalho foi usado o método de modelagem por homologia na construção do modelo tridimensional de uma poligalacturonase do fungo L. gongylophorus, simbionte de formigas cortadeiras. O modelo foi validado com os programas PROCHECK, VERIFY 3D e WHAT IF. Através da análise do modelo 3D da PG do L. gongylophorus foi possível propor um mecanismo de ação da enzima, que deve ocorrer com inversão da configuração do carbono anomérico do açúcar (substrato).

Os dados obtidos neste trabalho contribuem para o conhecimento da família Gymnophthalmidae, acrescentando dados genéticos de três novos genes para a tribo Ecpleopodini e descrição de 11 novos cariótipos para a família, pertencentes às tribos Ecpleopodini, Heterodactylini, Iphisiini e Gymnophthalmini. As análises filogenéticas obtidas para a tribo Gymnophthalmini pretenderam investigar o posicionamento de Scriptosaura Catimbau, espécie descrita recentemente que apresenta 2n=48, que foi recuperada como grupo irmão de Nothobachia ablephara, relacionados ainda à Calyptommatus. Já em Ecpleopodini, as análises foram realizadas para a investigação das relações filogenéticas entre os gêneros da tribo e do posicionamento de Kaieteusosauros hindsi. Foi recuperado o monofiletismo da tribo e do clado composto pelos gêneros Anotosaura, Dryadosaura (2n=44, 20M+24m) e Colobosauroides (2n=44, 20M+24m), entretanto, as relação entre os demais gêneros, inclusive de Kaieteurosaurus, não puderam ser estabelecidas e, com base nos dados citogenéticos, nota-se o predomínio de cariótipos com divisão entre macro e microcromossomos. Apesar de a família Gymnophthalmidae apresentar uma elevada diversidade cariotípica, as tribos Heterodactylini e Iphisiini apresentaram um cariótipo altamente conservado, sendo que as oito espécies descritas apresentam cariótipos compostos por 42 cromossomos com divisão clara entre macro e microcromossomos (18M+24m) e Ag-RONs em um par de microcromossomos. Os motivos que contribuem para a manutenção deste número diplóide nessas tribos ainda deverão ser investigados, mas aparentemente, este pode ser o cariótipo ancestral para a subfamília Gymnophithalminae e teria originado a diversidade cariotípica da tribo Gymnophthalmini por ocorrência de eventos de fissão e fusão cêntrica. Novos estudos cariotípicos e moleculares devem ser conduzidos para estabelecimento de tendências cromossômicas e evolutivas na tribo Ecpleopodini, que parece apresentar uma divergência rápida e simultânea, e para um melhor conhecimento da família que apresenta uma diversidade cromossômica elevada e sistemática longe de estar bem estabelecida. / This study contributes to knowledge of the family Gymnophthalmidae, adding new genetic data of three genes for the tribe Ecpleopodini and description of 11 new karyotype for the family, belonging to the tribes Ecpleopodini, Heterodactylini, Iphisiini and Gymnophthalmini. Phylogenetic analysis for the tribe Gymnophthalmini aimed to investigate the position of Scriptosaura Catimbau, recently described species which has 2n = 48 and was recovered as sister group of Nothobachia ablephara, both related to Calyptommatus. In Ecpleopodini, the analysis was performed to investigate the phylogenetic relationships among genera of the tribe and the placement of the species Kaieteusosauros hindsi. It was recovered the monophyly of the tribe and a clade composed of the genera Anotosaura, Dryadosaura (2n = 44, 20M+24m) and Colobosauroides (2n = 44, 20M+24m), however, the relationship among other genera, including Kaieteurosaurus, could not be established and, based on cytogenetic data, it can be seen the predominance of karyotype with a division into macro and microchromosomes. Although the family gymnophthalmids exhibit a high karyotypic diversity, the tribes and Heterodactylini Iphisiini showed a conservative karyotype, and the eight described species present karyotypes composed of 42 chromosomes with a clear division between macro and microchromosomes (18M +24 m) and Ag-NORs in a pair of microchromosomes. The reasons that contributed to the maintenance of this diplod number in the two tribes are still to be investigated, but apparently, this may be the ancestral karyotype for the subfamily Gymnophithalminae and may have originated the karyotypic diversity in the Gymnophthalmini for a series of fission events centric. New karyotypic and molecular studies should be conducted to establish trends in chromosomal and evolution in the tribe Ecpleopodini, which seems to have a simultaneous and rapid divergence, and to a better understanding of the family that has a high diversity and systematic chromosome far from well established.

Organismos do gênero Acanthamoeba são muito pouco investigados no Brasil, não se conhecendo a diversidade genética e o potencial patogênico das espécies prevalentes no país. Este estudo examinou a presença de Acanthamoeba em 118 amostras de solo e água de diversas regiões do Brasil e, como resultado, 38 novas culturas axenicas foram estabelecidas. A partir do sequenciamento da subunidade menor do gene ribossômico foi possível genotipar, avaliar o polimorfismo genético das amostras brasileiras e também inferir relações filogenéticas entre isolados clínicos e de ambiente do Brasil e entre esses e as demais espécies/isolados de Acanthamoeba. Para alguns grupos de isolados brasileiros, o potencial patogênico, inferido por indicadores indiretos de virulência (termo- e osmotolerância, secreção de peptidases e efeito citopático), foi também investigado. / Organisms of the genus Acanthamoeba are poorly investigated in Brazil, not knowing the genetic diversity and pathogenic potential of the species prevalent in the country. This study examined the presence of Acanthamoeba in 118 soil and water samples from different regions of Brazil and as a result, 38 new axenic cultures were established. From the sequencing of small subunit ribosomal gene was possible to genotype, to assess the genetic polymorphism of Brazilian samples and also to infer phylogenetic relationships among clinical and environmental isolates from Brazil and between these and other species/isolates of Acanthamoeba. For some groups of Brazilian isolates, pathogenic potential, inferred by indirect indicators of virulence (thermo-and osmotolerance, secretion of peptidases and CPE), was also investigated.

Organismos do gênero Acanthamoeba são muito pouco investigados no Brasil, não se conhecendo a diversidade genética e o potencial patogênico das espécies prevalentes no país. Este estudo examinou a presença de Acanthamoeba em 118 amostras de solo e água de diversas regiões do Brasil e, como resultado, 38 novas culturas axenicas foram estabelecidas. A partir do sequenciamento da subunidade menor do gene ribossômico foi possível genotipar, avaliar o polimorfismo genético das amostras brasileiras e também inferir relações filogenéticas entre isolados clínicos e de ambiente do Brasil e entre esses e as demais espécies/isolados de Acanthamoeba. Para alguns grupos de isolados brasileiros, o potencial patogênico, inferido por indicadores indiretos de virulência (termo- e osmotolerância, secreção de peptidases e efeito citopático), foi também investigado. / Organisms of the genus Acanthamoeba are poorly investigated in Brazil, not knowing the genetic diversity and pathogenic potential of the species prevalent in the country. This study examined the presence of Acanthamoeba in 118 soil and water samples from different regions of Brazil and as a result, 38 new axenic cultures were established. From the sequencing of small subunit ribosomal gene was possible to genotype, to assess the genetic polymorphism of Brazilian samples and also to infer phylogenetic relationships among clinical and environmental isolates from Brazil and between these and other species/isolates of Acanthamoeba. For some groups of Brazilian isolates, pathogenic potential, inferred by indirect indicators of virulence (thermo-and osmotolerance, secretion of peptidases and CPE), was also investigated.

A criação de seções em Eumaeini contribuiu significativamente para a classificação de uma tribo ainda com tantos problemas taxonômicos. No entanto, estudos ainda devem ser realizados no intuito de esclarecer relações filogenéticas entre gêneros e espécies das seções, além de reconstruir a história evolutiva de caracteres biologicamente relevantes (p. ex. órgãos sexuais secundários), fornecendo assim subsídios para a compreensão dos processos de especiação que contribuem para a diversidade do grupo. Dessa forma, o principal objetivo do presente trabalho é estabelecer uma classificação mais estável para seção Atlides, inferindo relações filogenéticas entre os gêneros e espécies da seção. Como desdobramentos desse objetivo, pode-se: testar o monofiletismo do gênero Theritas Hübner, com base em caracteres morfológicos; propor grupos monofiléticos dentro de Theritas, para posterior revisão das espécies; descrever nova espécie listada como sp. #128 na checklist do Atlas of Neotropical Lepidoptera; e fornecer subsídios pra o entendimento da evolução dos caracteres sexuais secundários encontrados na seção Atlides. Foram levantados 82 caracteres morfológicos: dois de cabeça, 65 de asas, dois de tórax, um de abdômen (externo), oito de genitália masculina e quatro de genitália feminina. As relações filogenéticas foram estudadas de acordo com o método cladístico. Testes assumindo pesos iguais e diferentes dos caracteres foram realizados. A pesagem dos caracteres seguiu o método de pesagem implícita com constante de concavidade (k) com valores iguais a 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 25, 50, 250 e 1000. Foram resultadas três árvores mais parcimoniosas no estudo com pesagem uniforme de caracteres (L=296, Ci= 50, Ri= 78). Como resultado do estudo cladístico tem-se que a seção Atlides não constitui um grupo monofilético da forma como havia sido proposta; o gênero Theritas Hübner não constitui um grupo monofilético, sendo desmembrado em três gêneros: Theritas Hübner, 1818 (sensu stricto), Denivia Johnson, 1992, revalidado e Margaritheclus Bálint, 2002, revalidado. A espécie listada como sp. #128 pertence à Denivia Johnson e foi descrita como Denivia silma Martins & Robbins, espécie nova. São propostas três novas combinações, uma em Margaritheclus Bálint e duas em Denivia Johnson, além de um sinônimo novo em Theritas Hübner. Os órgãos sexuais secundários mostraram-se homoplásticos, tendo a regulação gênica como uma explicação plausível para o padrão evolutivo apresentado. / The establishment of sections in Eumaeini contributed significantly to the classification of this tribe, which still has many taxonomic problems. However, many studies have yet to be performed, aiming to understand phylogenetic relationships of genera and species, and to reconstruct the evolutionary history of biologically relevant characters (ex. secondary sexual organs), providing supports for understanding speciation processes that contribute to the diversity of the group. Thus, the main objective of the present study is to establish a more stable classification for the Atlides section. As consequences of this objective, it was possible to test the monophyly of the genus Theritas Hübner, based on morphological characters; proposing monophyletic groups within Theritas, for further review of the species; describing a new species listed as sp. # 128 in checklist of the Atlas of Neotropical Lepidoptera; and providing guide lines for understanding the evolution of secondary sexual characters found in the Atlides section. A total of 82 morphological characters were collected: two from head, 65 from wings, two from thorax, one from external abdomen, eight from male genitalia and four from female genitalia. Phylogenetic relationships were studied according to the cladistic method. Tests assuming equal and different characters\' weights were performed. The characters\' weights were established using the implicit weighting method with values of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 25, 50, 250 and 1000 for the constant of concavity (k). Three most parsimonious trees were obtained with equal characters weights analyses (L=296, Ci= 50, Ri= 78). Cladistics results showed that Atlides section does not constitute a monophyletic group as it had been proposed; Theritas Hübner, 1818 does not constitute a monophyletic group and it has being dismembered into three genera: Theritas Hübner, 1818 (sensu stricto), Denivia Johnson, 1992, revalidated and Margaritheclus Bálint, 2002, revalidated. The new species listed as sp. # 128 belongs to Denivia Johnson and it was described as Denivia silma Martins & Robbins, new species. It was proposed three new combinations, one in Margaritheclus Bálint and two in Denivia Johnson, and one new synonym in Theritas Hübner. The secondary sexual organs proved to be homoplastic, with gene regulation as a plausible explanation for the evolutionary pattern presented.

A criação de seções em Eumaeini contribuiu significativamente para a classificação de uma tribo ainda com tantos problemas taxonômicos. No entanto, estudos ainda devem ser realizados no intuito de esclarecer relações filogenéticas entre gêneros e espécies das seções, além de reconstruir a história evolutiva de caracteres biologicamente relevantes (p. ex. órgãos sexuais secundários), fornecendo assim subsídios para a compreensão dos processos de especiação que contribuem para a diversidade do grupo. Dessa forma, o principal objetivo do presente trabalho é estabelecer uma classificação mais estável para seção Atlides, inferindo relações filogenéticas entre os gêneros e espécies da seção. Como desdobramentos desse objetivo, pode-se: testar o monofiletismo do gênero Theritas Hübner, com base em caracteres morfológicos; propor grupos monofiléticos dentro de Theritas, para posterior revisão das espécies; descrever nova espécie listada como sp. #128 na checklist do Atlas of Neotropical Lepidoptera; e fornecer subsídios pra o entendimento da evolução dos caracteres sexuais secundários encontrados na seção Atlides. Foram levantados 82 caracteres morfológicos: dois de cabeça, 65 de asas, dois de tórax, um de abdômen (externo), oito de genitália masculina e quatro de genitália feminina. As relações filogenéticas foram estudadas de acordo com o método cladístico. Testes assumindo pesos iguais e diferentes dos caracteres foram realizados. A pesagem dos caracteres seguiu o método de pesagem implícita com constante de concavidade (k) com valores iguais a 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 25, 50, 250 e 1000. Foram resultadas três árvores mais parcimoniosas no estudo com pesagem uniforme de caracteres (L=296, Ci= 50, Ri= 78). Como resultado do estudo cladístico tem-se que a seção Atlides não constitui um grupo monofilético da forma como havia sido proposta; o gênero Theritas Hübner não constitui um grupo monofilético, sendo desmembrado em três gêneros: Theritas Hübner, 1818 (sensu stricto), Denivia Johnson, 1992, revalidado e Margaritheclus Bálint, 2002, revalidado. A espécie listada como sp. #128 pertence à Denivia Johnson e foi descrita como Denivia silma Martins & Robbins, espécie nova. São propostas três novas combinações, uma em Margaritheclus Bálint e duas em Denivia Johnson, além de um sinônimo novo em Theritas Hübner. Os órgãos sexuais secundários mostraram-se homoplásticos, tendo a regulação gênica como uma explicação plausível para o padrão evolutivo apresentado. / The establishment of sections in Eumaeini contributed significantly to the classification of this tribe, which still has many taxonomic problems. However, many studies have yet to be performed, aiming to understand phylogenetic relationships of genera and species, and to reconstruct the evolutionary history of biologically relevant characters (ex. secondary sexual organs), providing supports for understanding speciation processes that contribute to the diversity of the group. Thus, the main objective of the present study is to establish a more stable classification for the Atlides section. As consequences of this objective, it was possible to test the monophyly of the genus Theritas Hübner, based on morphological characters; proposing monophyletic groups within Theritas, for further review of the species; describing a new species listed as sp. # 128 in checklist of the Atlas of Neotropical Lepidoptera; and providing guide lines for understanding the evolution of secondary sexual characters found in the Atlides section. A total of 82 morphological characters were collected: two from head, 65 from wings, two from thorax, one from external abdomen, eight from male genitalia and four from female genitalia. Phylogenetic relationships were studied according to the cladistic method. Tests assuming equal and different characters\' weights were performed. The characters\' weights were established using the implicit weighting method with values of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 25, 50, 250 and 1000 for the constant of concavity (k). Three most parsimonious trees were obtained with equal characters weights analyses (L=296, Ci= 50, Ri= 78). Cladistics results showed that Atlides section does not constitute a monophyletic group as it had been proposed; Theritas Hübner, 1818 does not constitute a monophyletic group and it has being dismembered into three genera: Theritas Hübner, 1818 (sensu stricto), Denivia Johnson, 1992, revalidated and Margaritheclus Bálint, 2002, revalidated. The new species listed as sp. # 128 belongs to Denivia Johnson and it was described as Denivia silma Martins & Robbins, new species. It was proposed three new combinations, one in Margaritheclus Bálint and two in Denivia Johnson, and one new synonym in Theritas Hübner. The secondary sexual organs proved to be homoplastic, with gene regulation as a plausible explanation for the evolutionary pattern presented.

Este trabalho investigou a diversidade microbiana e a filogenia de arquéias e bactérias em consórcios anaeróbios metanogênicos, originados de sedimentos estuarinos enriquecidos com pentaclorofenol (PCP) e 2,6-diclorofenol (2,6-DCP). Para tanto foram construídas bibliotecas genômicas e utilizados métodos moleculares independentes de cultivo como a Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE) e o seqüenciamento de segmentos específicos do DNAr 16S microbiano. Os resultados da DGGE permitiram verificar alterações na estrutura das comunidades microbianas, as quais provavelmente ocorreram devido às adversidades ocorridas nos sistemas durante o período de incubação como a entrada de oxigênio nos frascos e o acúmulo de compostos clorados no meio de cultivo, principalmente o 2,6-DCP. A estimativa da diversidade beta, realizada pela comparação dos padrões de bandas da DGGE, também permitiu inferir que as alterações nas composições das comunidades de arquéias e bactérias foram devidas às duas estratégias empregadas para o enriquecimento da microbiota autóctone do estuário estudado, ou seja, a pasteurização/não pasteurização das amostras de sedimentos estuarinos. Os resultados das análises filogenéticas revelaram que as seqüências analisadas dos clones bacterianos foram relacionadas ao grupo das bactérias Gram-positivas com baixo conteúdo de G+C pertencentes à Ordem Clostridiales (100%) do Filo Firmicutes e as das arquéias relacionadas ao grupo das metanogênicas pertencentes às Ordens Methanobacteriales (7,1%), Methanosarcinales (14,3%), Methanomicrobiales (57,1%) e arquéias não identificadas (21,4%) do Filo Euryarchaeota. Em relação às bactérias, alguns clones foram identificados como pertencentes aos gêneros Sedimentibacter, Clostridium e Alkalibacter, os quais são representados por microrganismos que apresentam metabolismo fermentativo e requerem a presença de extrato de levedura para o crescimento. Provavelmente as bactérias analisadas neste trabalho fermentaram a glicose e o piruvato, os quais foram utilizados como doadores de elétrons, com conseqüente produção de lactato, etanol, butirato, acetato, formiato e hidrogênio/gás carbônico, que podem ter sido utilizados por outros grupos de microrganismos no processo global da digestão anaeróbia. Tais bactérias foram importantes para o processo global de degradação dos clorofenóis, pois também utilizaram como doadores de elétrons os produtos parcialmente degradados por outras bactérias fazendo com que não houvesse acúmulo desses compostos no sistema. Enquanto que algumas arquéias foram relacionadas a organismos hidrogenotróficos pertencentes aos gêneros Methanoculleus e Methanocalculus, Methanobacterium, e acetotróficos do gênero Methanosaeta, as quais utilizaram como substratos para a metanogênese os subprodutos da fermentação bacteriana, ou seja, o \'H IND.2\'/\'CO IND.2\', o formiato e o acetato, contribuindo assim para a manutenção do equilíbrio das demais reações ocorridas no sistema. Desta forma, os dados obtidos neste trabalho poderão auxiliar na compreensão do funcionamento de ecossistemas contaminados por compostos clorados, bem como contribuir para o desenvolvimento de novos processos biotecnológicos aplicados aos problemas ambientais. / This work aimed to investigate microbial diversity and phylogeny of archaea and bacteria microrganisms methanogenic in estuarine sediment samples enriched with organic sources under methanogenic and halophlic conditions. The samples were obtained from previous study on anaerobic degradation of pentachlorophenol (PCP) and 2,6-dichlorophenol (2,6-DCP). Microbial studies were done by the molecular methods without cultivation requirement, Denaturing Gradient Del Electrophoresis (DGGE) and specific segments of 16S rDNA sequencing. DGGE-profile showed structure changes in microbial community. Probably, as a consequence of \'O IND.2\' intake and accumulation of chlorinated compounds, mainly 2,6-DCP, in the culture medium. The beta diversity estimation showed that changes in arquaea and bacteria communities probably occurred as a consequence of the two enrichment strategies used for estuarine indigenous microorganisms, pasteurization and non-pasteurization of the estuarine sediments samples. Phylogenetic analysis indicated the presence of gram-positive bacterium with low G+C content related to Clostridiales Order (100%) belonging to Firmicutes Phylum, as well as related to methanogenic archaea from Methanobacteriales (7,1%), Methanosarcinales (14,3%) and Methanomicrobiales (57,1%) Order. Non-identified archaeas from Euryarchaeota Phylum were also found (21,4%). Concerning to bacterias, it was identified clones related to genera Sedimentibacter, Clostridium and Alkalibacter, which have fermentative metabolism and require yeast extract to grow. Probably, bacterial cells analised in this work fermented glucose and pyruvate producing lactate, ethanol, butirate, acetate, formiate and hydrogen/carbon dioxide. All these products could be used for other microbial groups in the global process of anaerobic digestion. The bacterial microorganisms were important to global process of chlorophenol degradation because contributed in the overall process utilizing the products partially degraded by other bacterias and preventing its accumulation in the system. Identified archaeal cells were related to hydrogenotrophs microorganisms of the genera Methanosaeta, Methanoculleus, Methanocalculus and Methanobacterium, which utilized the bacterial fermentation sub-products as acetate, \'H IND.2\'/\'CO IND.2\' and formiate as substrate for the methanogenesis, contributing for the maintenance of the balance of other reactions occurred in the system. The results of this work give advanced knowledge about understanding biotechnological process of contaminated ecosystems by chlorinated compounds. Therefore, it could contribute to development of new biotechnological processes applied to environmental problems.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:06:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ivana Cristina Lopes da Cunha.pdf: 2287821 bytes, checksum: b8be5da98e942cd7c40cc08eb0d09841 (MD5) Previous issue date: 2009-05-27 / The most important vector of Dengue virus is Aedes aegypti, an originally African mosquito species. The presence of this vector in the Americas dates back to the 17th-18th centuries; it is thought to have been first introduced into Brazil by the beginning of the 20th century. However, the process of invasion of the continent by Ae. aegypti remains poorly understood, and the relationships between the dynamics of vector introduction/establishment/expansion and dengue epidemiological trends have not been thoroughly assessed. Here we test a series of hypotheses regarding the origins, number, and spatial and temporal dynamics of the invasion of the Americas by Ae. aegypti. Key predictions were tested using a database composed of over 3000 mitochondrial ND4 gene sequences. This database, which was compiled and completed in the course of the project, contains sequences from specimens collected in five regions of the Americas (from the United States to southern Brazil), in Africa, and in Asia. Analyses covered the following subjects: (i) genetic diversity; (ii) spatial patterns of haplotype occurrence; (iii) genealogical and phylogenetic relationships; (iv) population genetic structuring; and (v) historical demography. Results suggest two major, probably old events of Ae. aegypti introduction into the Americas. Both involved the early arrival of moderately divergent African populations to the Caribbean and North-Mesoamerica. One of these lineages dispersed to Venezuela and spread southwards in two invasion waves. The first wave reached northern Amazonia, where some sub-populations became isolated; we suggest that the spread of these vectors was involved in the first American dengue pandemic (1824-1828). The second, much more recent wave resulted in the colonization of most of South America by this lineage. In contrast, the second major lineage reached South America by the Brazilian Southeastern region, and dispersed northwards during the second pandemic (1845-1851); the persistence of this lineage in Brazil suggests that xi eradication campaigns were never completely successful. The secondary encounter of the descendants of both major lineages gave rise to the often-reported pattern of high genetic diversity. The data suggest that passive vector dispersal and the effects of control interventions on local populations produce a pattern of strong genetic structuring. The recent evolution of dengue epidemiological patterns in Brazil suggests that health sector reform and decentralization in the 1990s limited the efficacy of control interventions. We finally suggest how the results of studies on vector genetics can be incorporated into the design of better control-surveillance strategies; they can help identify more invasive or more diverse vector populations, or help define critical locations for entomological surveillance and control. Our data show how these interventions should be pursued even in localities already infested by the vector. We have developed, making use of data on population genetic variability, a comprehensive proposal on the process of invasion of the Americas by Ae. aegypti, and tentatively established the correspondence between the patterns of genetic diversity of this vector species and the spatial and temporal dynamics of dengue epidemiology in Brazil / O principal vetor do vírus Dengue é o Aedes aegypti, uma espécie originária da África. A presença do vetor nas Américas data dos séculos XVII-XVIII; a primeira introdução no Brasil aconteceu, provavelmente, no início do século XIX. Contudo, o processo de invasão do continente por Ae. aegypti ainda é mal compreendido, e as relações entre as dinâmicas de introdução/estabelecimento/expansão do vetor e as tendências epidemiológicas da doença não têm sido avaliadas de forma detalhada. Neste trabalho testamos uma série de hipóteses sobre as origens, número e dinâmicas espaciais e temporais da invasão das Américas por Ae. aegypti. As predições-chave foram testadas utilizando uma base de mais de 3000 seqüências de um fragmento do gene ND4 mitocondrial. Esta base, compilada e completada durante o desenvolvimento deste projeto, contém dados de espécimes de cinco regiões das Américas (desde os Estados Unidos até o Sul do Brasil), da África e da Ásia. As análises incluíram os seguintes aspectos: (i) diversidade genética; (ii) padrões espaciais de ocorrência de diferentes haplótipos; (iii) relações genealógicas e filogenéticas; (iv) estruturação genética populacional; e (v) demografia histórica. Os resultados sugerem dois eventos principais, provavelmente antigos, de introdução de Ae. aegypti nas Américas. Ambos envolveram a chegada inicial de populações africanas moderadamente diferenciadas à região do Caribe/Norte-Mesoamérica. Uma destas linhagens se dispersou até a Venezuela e avançou para o sul em duas ondas. A primeira onda alcançou o norte da Amazônia, onde algumas sub-populações ficaram isoladas; sugerimos que a dispersão destes vetores foi a responsável pela primeira pandemia americana de dengue (1824-1828). A segunda onda, muito mais recente, resultou na colonização de grande parte da América do Sul. A segunda linhagem, pelo contrário, alcançou o continente Sul-americano pelo Sudeste do Brasil, e se dispersou em direção norte durante a segunda pandemia (1845- ix 1851); a persistência desta linhagem no país sugere que as campanhas de erradicação nunca alcançaram seu objetivo. O encontro secundário dos descendentes das duas linhagens principais é responsável pelo padrão repetidamente reportado de alta diversidade genética das populações locais. Os dados sugerem que a dispersão passiva do vetor e os efeitos das ações de controle geram um padrão de forte estruturação genética. Em conjunto, os dados genéticos e a evolução recente do perfil epidemiológico da dengue no Brasil indicam que a efetividade das intervenções de controle se viu comprometida pelo processo de descentralização do sistema de saúde nos anos 1990. Finalmente, mostramos como os resultados das análises genéticas podem ajudar no desenho de melhores estratégias de controle e vigilância; eles podem ajudar a identificar sub-populações mais invasivas ou mais diversas do vetor, ou a definir pontos críticos para o controle-vigilância entomológicos. Os dados sugerem que estas intervenções serão importantes inclusive em localidades já colonizadas pelo vetor. Em definitiva, temos desenvolvido, utilizando dados sobre variabilidade genética populacional, uma proposta capaz de dar conta do processo de invasão das Américas por A. aegypti e estabelecido as possíveis correspondências entre os padrões de diversidade genética desta espécie de vetor e as dinâmicas espaciais e temporais da epidemiologia da dengue no Brasil.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao maria regilda araujo fernandes.pdf: 889828 bytes, checksum: eeac21e7e2102f6042640b9c030c3870 (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 / The pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of Paracoccidioidomycosis (PCM). The main route of contamination is the inhalation of fungal propagules that convert to yeast in the host tissues. The urease is among the factors of virulence described for dimorphic fungus. It hydrolyzes the urea producing molecules of ammonia and carbamate. Pbure has 3,012 bp, corresponding to a predicted protein of 837 amino acids, predicted molecular mass of 90 kDa and pI 6.0. PbURE has signature to nickel-dependent enzyme for its activity. The phylogenetic relationship between PbURE and urease from other fungi was evaluated. The cDNA that encodes PbURE was inserted into the expression vector pET-32a and recombinant protein of 103 kDa was expressed. Polyclonal antibody were produced against PbUREr and used on Western blot, Far-Western blot and ELISA. The results showed that PbUREr interferes on interaction between P. brasiliensis and pulmonary epithelial cells A549. PbUREr was able to bind to proteins fibronectin and type IV collagen, components of the extracellular matrix (ECM). The interaction between PbURE and calnexin protein was identified by the technique of two-hybrid. / O fungo patogênico humano Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM). A principal via de contaminação é a inalação de micélios ou conídios do fungo que se convertem em leveduras no hospedeiro. Dentre os fatores de virulência descritos para fungos dimórficos está a urease, a qual hidrolisa uréia produzindo amônia e carbamato. Pbure possui 3.012 pb, correspondendo a uma proteína predita de 837 aminoácidos, massa molecular predita de 90 kDa e pI 6.0. PbURE possui assinatura de uma enzima dependente de níquel para sua atividade. A relação filogenética entre PbURE e ureases de outros fungos foi avaliada. O cDNA que codifica PbURE foi inserido no vetor de expressão pET-32a e a proteína recombinante de 103 kDa foi expressa. Anticorpo policlonal foi produzido contra PbUREr e utilizados nos ensaios de Western blot, Far-Western blot e ELISA. Os resultados mostram que PbUREr interfere na interação entre P. brasiliensis e células epiteliais pulmonares A549. PbUREr foi capaz de se ligar às proteínas fibronectina e colágeno tipo IV, componentes da matriz extracelular (MEC). A interação entre PbURE e a proteína calnexina foi identificada através da técnica de duplo-híbrido.

Este trabalho investigou a diversidade microbiana e a filogenia de arquéias e bactérias em consórcios anaeróbios metanogênicos, originados de sedimentos estuarinos enriquecidos com pentaclorofenol (PCP) e 2,6-diclorofenol (2,6-DCP). Para tanto foram construídas bibliotecas genômicas e utilizados métodos moleculares independentes de cultivo como a Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE) e o seqüenciamento de segmentos específicos do DNAr 16S microbiano. Os resultados da DGGE permitiram verificar alterações na estrutura das comunidades microbianas, as quais provavelmente ocorreram devido às adversidades ocorridas nos sistemas durante o período de incubação como a entrada de oxigênio nos frascos e o acúmulo de compostos clorados no meio de cultivo, principalmente o 2,6-DCP. A estimativa da diversidade beta, realizada pela comparação dos padrões de bandas da DGGE, também permitiu inferir que as alterações nas composições das comunidades de arquéias e bactérias foram devidas às duas estratégias empregadas para o enriquecimento da microbiota autóctone do estuário estudado, ou seja, a pasteurização/não pasteurização das amostras de sedimentos estuarinos. Os resultados das análises filogenéticas revelaram que as seqüências analisadas dos clones bacterianos foram relacionadas ao grupo das bactérias Gram-positivas com baixo conteúdo de G+C pertencentes à Ordem Clostridiales (100%) do Filo Firmicutes e as das arquéias relacionadas ao grupo das metanogênicas pertencentes às Ordens Methanobacteriales (7,1%), Methanosarcinales (14,3%), Methanomicrobiales (57,1%) e arquéias não identificadas (21,4%) do Filo Euryarchaeota. Em relação às bactérias, alguns clones foram identificados como pertencentes aos gêneros Sedimentibacter, Clostridium e Alkalibacter, os quais são representados por microrganismos que apresentam metabolismo fermentativo e requerem a presença de extrato de levedura para o crescimento. Provavelmente as bactérias analisadas neste trabalho fermentaram a glicose e o piruvato, os quais foram utilizados como doadores de elétrons, com conseqüente produção de lactato, etanol, butirato, acetato, formiato e hidrogênio/gás carbônico, que podem ter sido utilizados por outros grupos de microrganismos no processo global da digestão anaeróbia. Tais bactérias foram importantes para o processo global de degradação dos clorofenóis, pois também utilizaram como doadores de elétrons os produtos parcialmente degradados por outras bactérias fazendo com que não houvesse acúmulo desses compostos no sistema. Enquanto que algumas arquéias foram relacionadas a organismos hidrogenotróficos pertencentes aos gêneros Methanoculleus e Methanocalculus, Methanobacterium, e acetotróficos do gênero Methanosaeta, as quais utilizaram como substratos para a metanogênese os subprodutos da fermentação bacteriana, ou seja, o \'H IND.2\'/\'CO IND.2\', o formiato e o acetato, contribuindo assim para a manutenção do equilíbrio das demais reações ocorridas no sistema. Desta forma, os dados obtidos neste trabalho poderão auxiliar na compreensão do funcionamento de ecossistemas contaminados por compostos clorados, bem como contribuir para o desenvolvimento de novos processos biotecnológicos aplicados aos problemas ambientais. / This work aimed to investigate microbial diversity and phylogeny of archaea and bacteria microrganisms methanogenic in estuarine sediment samples enriched with organic sources under methanogenic and halophlic conditions. The samples were obtained from previous study on anaerobic degradation of pentachlorophenol (PCP) and 2,6-dichlorophenol (2,6-DCP). Microbial studies were done by the molecular methods without cultivation requirement, Denaturing Gradient Del Electrophoresis (DGGE) and specific segments of 16S rDNA sequencing. DGGE-profile showed structure changes in microbial community. Probably, as a consequence of \'O IND.2\' intake and accumulation of chlorinated compounds, mainly 2,6-DCP, in the culture medium. The beta diversity estimation showed that changes in arquaea and bacteria communities probably occurred as a consequence of the two enrichment strategies used for estuarine indigenous microorganisms, pasteurization and non-pasteurization of the estuarine sediments samples. Phylogenetic analysis indicated the presence of gram-positive bacterium with low G+C content related to Clostridiales Order (100%) belonging to Firmicutes Phylum, as well as related to methanogenic archaea from Methanobacteriales (7,1%), Methanosarcinales (14,3%) and Methanomicrobiales (57,1%) Order. Non-identified archaeas from Euryarchaeota Phylum were also found (21,4%). Concerning to bacterias, it was identified clones related to genera Sedimentibacter, Clostridium and Alkalibacter, which have fermentative metabolism and require yeast extract to grow. Probably, bacterial cells analised in this work fermented glucose and pyruvate producing lactate, ethanol, butirate, acetate, formiate and hydrogen/carbon dioxide. All these products could be used for other microbial groups in the global process of anaerobic digestion. The bacterial microorganisms were important to global process of chlorophenol degradation because contributed in the overall process utilizing the products partially degraded by other bacterias and preventing its accumulation in the system. Identified archaeal cells were related to hydrogenotrophs microorganisms of the genera Methanosaeta, Methanoculleus, Methanocalculus and Methanobacterium, which utilized the bacterial fermentation sub-products as acetate, \'H IND.2\'/\'CO IND.2\' and formiate as substrate for the methanogenesis, contributing for the maintenance of the balance of other reactions occurred in the system. The results of this work give advanced knowledge about understanding biotechnological process of contaminated ecosystems by chlorinated compounds. Therefore, it could contribute to development of new biotechnological processes applied to environmental problems.