A via Unfolded Protein Response (UPR) é uma via de sinalização ativada pelo estresse do Retículo endoplasmático (ER). Anteriormente descrevemos um Paciente com Imunodeficiência Comum Variável (CVID) que apresenta um atraso na ativação da via UPR associado com o acumulo de imunoglobulinas dentro do ER e uma taxa de proliferação diminuída. Nossos resultados demonstram que a ativação crônica da UPR interrompe o ciclo celular de EBV-B através da quebra da natureza cíclica da ciclina A1. Essa parada é depende da linhagem EBV-B estudada e da droga utilizada. Além disso, a ativação crônica da UPR aumenta a apoptose através da ativação do braço da PERK da via UPR. Células ex-vivo e EBV-B do Paciente P apresentaram uma taxa metabólica muito baixa e numero aumentado de células em apoptose. A deficiência da resposta do paciente P frente a ativação da via UPR parece ser somente no reconhecimento de proteínas não dobradas. Nossos resultados sugerem que a proliferação deficiente observada em diversos paciente com CVID pode ser resultado de uma ativação deficiente da via UPR. / The unfolded protein response (UPR) is a signaling pathway activated by endoplasmic reticulum (ER) stress. Previously we described a patient (Patient P) with Common Variable Immunodeficiency (CVID) whose delayed activation of the UPR associates with accumulation of immunoglobulins and slower rate of proliferation. Our results showed that chronic UPR stress interrupted cell cycling of EBV-B cells through dysruption of the cyclic nature of cyclin A1. This interrption is depend of the cell type and drug. Furthermore, chronic ER stress triggered early apoptosis through activation of the PERK branch of the UPR. EBV-B and ex vivo cells from patient presented low metabolic rate and a high apoptosis rate even in the absence of ER stressors.. We noted that the deficiency of UPR pathway activation by Patient P apears to be on the recognition of unfolded proteins. Our results support the hypothesis that deficient proliferation observed in some CVID patients might be the result of deficient UPR activation.

Feeding high levels of distillers grains increases polyunsaturated fatty acid (PUFA) levels in beef. It is well stablished that beef with higher concentrations of PUFA is more likely to have increased lipid and myoglobin oxidation. This is important because lipid and myoglobin oxidation lead to off-flavor development and discoloration of retail-displayed beef, reducing display life. In the first study, the effects of feeding different dietary fat sources with modified distillers grains plus solubles (MDGS) on beef display life were evaluated. Results suggest that feeding MDGS to cattle reduces color and lipid stability in addition to increasing C18:2 and PUFA content of beef in comparison to the corn diet. Thus, feeding MDGS to cattle has the potential to reduce beef display life. Perhaps, MDGS in feedlot diets increases PUFA concentration in the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane, thereby altering membrane integrity, resulting in more rapid calcium leakage and improved tenderness. Therefore, the second study was dedicated to evaluate the effects of dietary fat source on the basic mechanism of beef tenderization. Feeding MDGS to cattle increased 18:2 and tended to increase PUFA concentration in the SR membrane, in addition to increase free calcium at d 2 postmortem in comparison to the corn diet. Beef from cattle finished on de-oiled MDGS and de-oiled MDGS plus oil had lower Warner-Bratzler shear force values than beef from cattle finished on corn at 2 d postmortem. No differences among dietary treatments were found for sarcomere length and troponin T degradation at 2 d postmortem. The results from this study suggest that feeding MDGS may increase tenderness, possibly by increasing free calcium in muscle early post-mortem. However, the true mechanism by which dietary fat source may accelerate the beef tenderization process is still unclear and should be further explored. / De acordo com a literatura, a adição de resíduo de destilaria com solúveis em dietas de terminação de bovinos de corte aumenta a quantidade de ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) na carne bovina. É sabido que quanto maior a concentração de PUFA na carne, maior será a probabilidade de ocorrência da oxidação lipídica e da mioglobina. Isso é importante porque o aumento da oxidação lipídica e da mioglobina acelera o desenvolvimento de odores indesejáveis e da descoloração da carne, reduzindo assim sua vida útil. O objetivo do primeiro estudo foi avaliar os efeitos do uso de diferentes resíduos de destilaria parcialmente desidratados com solúveis (MDGS) na vida útil da carne. Os resultados deste estudo sugerem que a inclusão de 40% de MDGS na dieta de terminação de bovinos pode reduzir a estabilidade lipídica e da cor, além de aumentar a quantidade de ácido linoléico (18:2) e PUFA da carne em comparação à carne de animais terminados com milho, reduzindo a vida útil da carne. No segundo estudo, nós trabalhamos com a hipótese de que a adição de elevadas quantidades de MDGS em dietas de terminação poderia aumentar a concentração de PUFA na membrana do retículo sarcoplasmático, e assim, alterar a integridade e permeabilidade dessa membrana, antecipando a liberação de cálcio postmortem. Com mais cálcio disponível, a proteólise muscular seria favorecida, aumentando a maciez da carne nos primeiros dias após o abate. Portanto, o objetivo do segundo estudo foi avaliar os efeitos da fonte de gordura dietética contida em diferentes tipos de MDGS na maciez da carne bovina. A inclusão de 40% de MDGS na dieta de terminação de novilhos aumentou a concentração de 18:2 e tendeu a aumentar a concentração de PUFA na membrana do retículo sarcoplasmático em comparação ao gado terminado com milho (sem inclusão de MDGS). Carne de animais terminados com MDGS apresentou maior quantidade de cálcio livre no sarcoplasma 48 horas após o abate. Carne de novilhos alimentados com MDGS desengordurado apresentou menor força de cisalhamento 48 horas após o abate quando comparada à carne de animais terminados com milho. Não houve diferença significativa entre nenhum dos tratamentos dietéticos 48 horas após o abate para comprimento de sarcômero e degradação de troponina T. Os resultados deste estudo sugerem que a inclusão de 40% de MDGS desengordurado na dieta de terminação de novilhos aumenta a maciez da carne 48 horas após o abate, possivelmente por aumentar a quantidade de cálcio livre no sarcoplasma. No entanto, o mecanismo pelo qual a fonte de gordura dietética acelerou a proteólise muscular ainda não está completamente elucidado.

O transplante de ilhotas pancreáticas é uma terapia promissora para o tratamento da diabetes mellitus tipo 1 (DM1). No entanto, ilhotas transplantadas estão sujeitas à rejeição pelo sistema imune dos pacientes receptores, portanto faz-se necessário o desenvolvimento de mecanismos moleculares que protejam essas células. Estudos mostraram que o hormônio prolactina (PRL) é capaz de inibir a apoptose desencadeada por citocinas pró-inflamatórias sobre células beta pancreáticas e que este processo citoprotetor depende da presença da chaperona HSPB1. Foi observado que durante o desenvolvimento do DM1, as células beta pancreáticas sofrem estresse de retículo endoplasmático e que isso contribui para desencadear apoptose. O estresse de retículo endoplasmático é caracterizado pelo acúmulo de proteínas mal dobradas nessa organela resultando na ativação da resposta a proteínas mal dobradas (UPR) que tem como finalidade recuperar a homeostase celular. No presente estudo mostramos, pela primeira vez, que PRL foi capaz de proteger células beta pancreáticas contra estresse de retículo endoplasmático promovido tanto por citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IFNγ e IL1β) quanto pelos estressores de retículo endoplasmático: tunicamicina e tapsigargina; e que HSPB1 é essencial nesse mecanismo de citoproteção. No contexto do DM1, esse hormônio parece ter um efeito modulador da UPR aumentando os níveis de BiP, antecipando a ativação de ATF6 e PERK, mantendo a via de PERK ativa por mais tempo, inibindo a via de IRE1α, e diminuindo os níveis de CHOP em tempos maiores. Coletivamente, os resultados aqui apresentados aprofundam os conhecimentos sobre a função de HSPB1, conduzindo para o desenvolvimento de estratégias que visam à atenuação da morte de células beta por meio da modulação de uma via de proteção endógena, a qual é independente da modulação do sistema imunológico. / The islet transplantation is a promising therapy for the treatment of type 1 diabetes mellitus (T1DM). However, transplanted islets are subject to rejection by the immune system of the recipient patients, therefore the development of molecular mechanisms that protect these cells is necessary. Studies have shown that the hormone prolactin (PRL) is capable of inhibiting apoptosis triggered by pro-inflammatory cytokines on pancreatic beta cells and that this cytoprotective process depends on the presence of the chaperone HSPB1. It was observed that during the development of type 1 diabetes, pancreatic beta cells undergo endoplasmic reticulum stress and that this contributes to trigger apoptosis. The endoplasmic reticulum stress is characterized by accumulation of misfolded proteins in this organelle resulting in the activation of unfolded protein response (UPR) that aims to restore cellular homeostasis. In the present study, we show for the first time that PRL was able to protect pancreatic beta cells against endoplasmic reticulum stress promoted by both pro-inflammatory cytokines (TNFα, IFNγ and IL1β) as the endoplasmic reticulum stressors: tunicamycin and thapsigargin; and HSPB1 is essential that cytoprotective mechanism. In the context of T1DM, PRL appears to have a modulating effect of the UPR by increasing the levels of BiP, anticipating the activation of ATF6 and PERK, keeping the PERK pathway active for longer, inhibiting the pathway IRE1α, and decreasing the levels of CHOP for longer times. Collectively, the results presented here deepen the knowledge of the HSPB1 function, leading to the development of strategies inducing attenuation of beta cells death through modulation of endogenous protection means, which are independent of the modulation of the immune system.

Na gestação há aumento da proliferação e redução da apoptose das células b pancreáticas. Prolactina (PRL) desencadeia estas mudanças, que são revertidas após o parto mesmo na presença de PRL. In vitro, dexametasona (DEX) se contrapõe a PRL. Avaliamos se o estresse do retículo endoplasmático (ERE) está envolvido na apoptose do pós-parto e se os glicocorticóides (GC) participam deste mecanismo. A fragmentação do DNA aumenta no 3° dia pós-parto (L3), em paralelo com a diminuição de pAKT e aumento do TRB3, indutor da apoptose por ERE. BiP, ATF4, CHOP, e a ligação de CHOP e CHOP-ATF4 no promotor do TRB3 aumentam em L3. O inibidor do ERE PBA restaurou os níveis de pAKT e CHOP e inibiu a apoptose. Células RINm5F tratadas com DEX (24h) têm aumento de BiP e ATF4, de p-eIF2 e do XBP-1 ativo. DEX também induz TRB3, mas inibe a ligação de CHOP ao TRB3. O tratamento por 72h não altera p-eIF2a, diminui XBP-1 ativo e promove apoptose, único evento revertido pela PRL. Concluímos que a apoptose das ilhotas em L3 é desencadeada por ERE, mas os GC não induzem este mecanismo. / During gestation occurs increase on the proliferation and apoptosis reduction of pancreatic b cells. Prolactin (PRL) promotes these changes which are reverted after delivery. Dexametasone (DEX) in vitro opposed to PRL. We evaluate whether endoplasmatic reticulum stress (ERS) was involved on post-delivery apoptosis and glycocorticoids (GC) participate on this mechanism. DNA fragmentation increased on the 3rd day post-delivery (L3), in parallel with pAKT diminution and inductor of apoptosis-TRB3 augment by ERS. BiP, ATF4, CHOP along with binding of CHOP and CHOP-ATF4 to the TRB3 promoter increased in L3. ERS inhibitor-PBA restored pAKT, CHOP levels and inhibited apoptosis. RINm5F cells with DEX (24h) showed increase in BiP, ATF4, p-eIF2 and in active XBP-1. DEX induced TRB3, but inhibited the binding of CHOP to TRB3. The 72h treatment did not alter p-eIF2a, diminished active XBP-1 and promoted apoptosis; the unique event reverted by PRL. We concluded that apoptosis of islets in L3 is generated by ERS; nevertheless this mechanism is not induced by GC.

O fator 2 derivado de células estromais, SDF2 (do inglês Stromal cell derived fator 2) é um gene de função ainda desconhecida, conservado em mamíferos e descrito primeiramente por Hamada et al. (1996). Neste estudo, observamos que a proteína Sdf2 de camundongo possui a alta similaridade de sequência em relação ao SDF2-like(L)1 humano e murino e de estrutura preditiva também similar em relação ao SDF2-like de Arabidopsis thaliana. A proteína mostrou-se sublocalizada no retículo endoplasmático e apresentou ampla distribuição nos tecidos e órgãos de camundongos. O mapeamento da expressão de Sdf2 ao longo da gestação humana e de camundongo nos mostrou que a proteína está presente em todas as etapas e compartimentos da placenta, com expressão em diversos tipos celulares. Nossos resultados sugerem que o SDF2 participa dos processos de diferenciação de células trofoblásticas humanas e murinas de maneira oposta. Em humanos, onde o processo é dependente da ativação de caspase-8 observou-se um aumento da expressão de SDF2. Em camundongos, onde o processo é por endoreduplicação, houve diminuição da expressão da proteína. A participação do SDF2 na via de estresse de retículo endoplasmático (RE) nas células trofoblásticas também foi analisada. Fatores adversos que podem levar à perda da homeostase do RE e levar a um acúmulo de proteínas mal enoveladas geram o fenômeno conhecido como Estresse de RE. O estresse de RE ativa a via de Resposta a Proteínas Mal Enoveladas (UPR, em inglês Unfolded Protein Response), que atua em diferentes vias de sinalização para aumentar a produção de chaperonas, a degradação das proteínas mal enoveladas e a diminuição da produção de novas proteínas. Estas respostas aumentam as chances de sobrevivência celular. Se, no entanto, a célula não recuperar sua homeostase, vias que levam à apoptose serão ativadas. A geração de estresse de RE pelo agente tunicamicina alterou significativamente a expressão de SDF2. Além disso, o silenciamento do gene SDF2 alterou a expressão dos principais fatores de controle de sobrevivência e apoptose da UPR. Desta forma, estes achados sugerem que o SDF2 desempenha um papel na regulação de sobrevivência/apoptose das células trofoblásticas pela via UPR. / The stromal cell derived factor 2 (SDF2) was first described by Hamada et al.(1996), is well conserved in mammals but its function is still unknown. In this study, we observed the predicted aminoacid sequence os Sdf2 is similar to human and mouse SDF2L1 sequence and the predicted Sdf2 structure is similar to SDF2-like from Arabidopsis thaliana. The protein is sublocalizes in the ER and it is widely expressed in mouse tissue and organs. The expression of Sdf2 throughout human and mouse gestation showed the protein is present in all gestational phases and compartments analysed and it is expressed by several cell types in the placenta. In trophoblast functional assays, SDF2 showed opposite expression patterns in human and mouse differentiation processes. In humans, where the process is dependent of caspase-8 activation, the protein is upregulated. Im mouse, the process is dependent of endoreduplication, the protein is downregulated. The participation of SDF2 in Endoplasmic Reticulum (ER) stress in trophoblastic cells was also evaluated. Adverse environmental conditions may lead to disruption of ER homeostasis causing accumulation of unfolded/misfolded proteins in ER, a phenomenon known as ER stress. ER stress activates the Unfolded Protein Response (UPR) that acts in several signaling cascades to improve chaperone production, misfolded protein degradation and to downregulate new protein production. These responses increase the capacity of cells to maintain alive even in stress conditions. Whether cells fail on restore homeostasis, the UPR activates apoptosis. We were able to observed that when gene silencing assays was used for SDF2, modifications in UPR cell survival/apoptosis markers were observed. In conclusion, we propose that SDF2 is playing a role in ER stress cell survival/apoptosis control in trophoblast cells.

Diante da ausência de dados prévios, foi pretendido estabelecer uma correlação entre as possíveis modificações metabólicas e moleculares na resistência insulínica e inflamação em modelos animais de obesidade, induzida pela dieta, recebendo a suplementação de ômega 3/ALA. Além disto, pretendeu-se obter dados que permitam uma melhor elucidação dos mecanismos envolvidos na resistência insulínica neste modelo e um possível efeito preventivo da administração de ALA sobre este processo, podendo, desta forma, auxiliar no desenvolvimento de novas terapias. O objetivo do estudo foi demonstrar que a suplementação ALA reduz a resistência à insulina e a inflamação em modelo animal de obesidade. Foram divididos 40 camundongos machos (C57/BL6) em 4 grupos: controle (C), controle + ômega 3/ALA (CW), obesos (O) e obesas + ômega 3/ALA (OW). Por um período de oito semanas, os grupos O e OW receberam uma dieta hiperlipídica com 60% de lipídeos, enquanto o C e CW receberam ração padrão. Depois, os grupos CW e OW receberam suplementação de 10% de ômega 3/ALA liofilizado, extraído de semente de linhaça, diariamente, por mais 8 semanas. Observando os resultados, todos os grupos de animais tiveram o mesmo ganho de peso, assim como consumo alimentar, eficiência enérgica e eficiência alimentar. O uso do ALA diminuiu o peso da gordura subcutânea no grupo OW comparado ao O e manteve os valores semelhantes entre os outros grupos, no entanto, as comparações do peso do fígado, gordura epididimal, pâncreas e músculo gastrocnemio, foram semelhantes entre todos os grupos. Observou-se uma diminuição na resistência insulínica nos animais OW comparado ao O pelo teste de IPGTT, sendo a área sob a curva de glicose similar entre C e CW. Além disso, os níveis totais de gordura no fígado foram significativamente menores no CW e OW, em comparação com C e O, estes resultados são reforçados pela análise dos tecidos em avaliação histopatológica. Os níveis séricos de glicemia e insulina, ao final do estudo, mostraram uma redução importante em OW comparado a CW, porém, não foi observado diferenças entre os animais obesos suplementados ou não com ômega-3/ALA. Entretanto, quanto à avaliação de resistência insulínica pelo cálculo do HOMA IR, este mostrou-se menor comprando-se OW com O. Os níveis séricos de colesterol total e HDL foram maiores no grupo CW comparados ao C, sendo que os níveis de colesterol total foram menores, também, no grupo OW comparados ao O. No entanto, os valores de triglicérides séricos foram semelhantes entre todos os grupos, assim como valores de triglicérides hepáticos. Colesterol total hepático teve um aumento significativo entre OW e O. As dosagens séricas de IL1, IL6 e MCP1 mostraram uma redução importante em O comparadas com OW. Já quanto a IL17 e TNF, ambas foram equivalentes, nas comparações entre diferentes grupos. A avaliação da ativação do estresse do retículo endoplasmático mostrou que a proteína BIP teve um aumento importante tanto na comparação entre C e CW e também entre O e OW. A também chaperona HSP70 mostrou aumento significativo em ambas as comparações entre grupos, tanto em C e CW quanto em O e OW. GRP94 e IRE1 tiveram resultados semelhantes, sem diferenças entre os grupos, assim como a DAPK1. CHOP teve diminuição importante comparando-se C e CW, e O e OW. Em contrapartida, XBP1 teve diminuição importante na comparação entre os grupos C e CW. Por fim, a suplementação de ômega 3/ALA mostrou ser eficaz na prevenção de esteatose hepática, redução de resistência insulínica, diminuição do processo inflamatório, e redução da ativação do estresse do retículo endoplasmático em tecido hepático. / Given the absence of previous data, it is intended to establish a possible correlation between metabolic and molecular changes in insulin resistance and inflammation in animals receiving supplementation of -linoleic acid (ALA) found in flaxseeds oil. Furthermore, we intend to obtain data for an elucidation of the mechanisms involved in insulin resistance and preventive effect of administration of ALA on this process and may thus aid the development of new therapies. The aim of study was prove the ALA supplementation reduces insulin resistance and inflammation in an obesity animal model. 40 male mice (C57/BL6) were divided into 4 groups: control (C), control + omega 3/ALA (CW), obese (O) + omega 3/ALA and obese (OW). For a period of eight weeks, the groups O and OW received a high-fat diet with 60% fat, while the C and CW received regular chow. Then, the CW and OW groups were supplemented with 10% omega 3/ALA lyophilized, extracted from flaxseed daily, for another 8 weeks. Analyzing the results, all groups of animals had the same weight gain, and food consumption, food efficiency and energetic efficiency. The use of ALA decreased subcutaneous fat weight in group OW compared to O and remained similar values between the other groups, however, comparisons of the size of liver tissue, epididymal fat, pancreas and gastrocnemius muscle were similar among all groups. There was a decrease in insulin resistance in animals OW compared to O by GTT test, with an area under the curve of glucose similar between C and CW. Moreover, the total liver fat levels were significantly lower in CW and OW compared to C and O, these results are reinforced by histopathological tissues analysis. Serum glucose and insulin levels, at the end of the study, showed a significant reduction in OW compared to CW, however, no differences were observed between the obese animals supplemented or not with omega 3/ALA. Meanwhile, about the valuation of insulin resistance calculating by HOMA IR, this was lower in OW compared with O. Serum total cholesterol and HDL levels were higher in CW compared to the group C, and total cholesterol levels were also lower in the OW group compared to O. However, the serum levels of triglyceride were similar among all groups as well as hepatic triglycerides values. Hepatic total cholesterol increased significantly between OW and O. Serum levels of IL1, IL6 and MCP1 showed a significant reduction in O compared to OW. As for IL17 and TNF were similar for both comparisons between different groups. The evaluation of endoplasmic reticulum stress activation showed the BIP protein had a significant increase in the comparison between CW and C and also between OW and O. The also chaperone HSP70 showed a significant increase in both comparisons between groups, both in C and CW as for O and OW. GRP94 and IRE1 had similar results, with no differences between groups, as well as DAPK1. CHOP had significant decrease comparing CW and C, and O and OW. In contrast, XBP1 had significant reduction in the comparison between groups C and CW. Finally, omega 3/ALA supplementation showed to be effective in preventing hepatic esteatose, the reduction of insulin resistance, inflammation decrease, and reduction of activation of endoplasmic reticulum stress in liver tissue.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-17T18:21:20Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2822554 bytes, checksum: 7bef13d6e29446a21866e18f47787668 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T18:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2822554 bytes, checksum: 7bef13d6e29446a21866e18f47787668 (MD5) Previous issue date: 2005-02-23 / A proteína BiP ("binding protein") de plantas tem sido descrita como um importante mediador de translocação, dobramento e montagem de proteínas recém-sintetizadas no lúmem do retículo endoplasmático, exibindo uma forte indução em resposta a uma variedade de estresses bióticos e abióticos. Apesar de sua relevância funcional, muito pouco se sabe com relação aos mecanismos de regulação da expressão dos genes BiP de plantas e da estrutura de seus promotores. Nesta investigação, dois promotores de BiP de soja, designados gsBiP6 e gsBiP9, bem como diferentes extensões de suas extremidades 5' foram fusionados ao gene repórter beta-glucuronidase (GUS) e introduzidas em Nicotiana tabacum via transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Os promotores de gsBiP6 e gsBiP9 possuem cis-elementos gerais, característicos de promotores de genes de plantas, como as seqüências de transcrição CAAT e TATA, e cis-elementos que respondem a estresses do retículo endoplasmático (ERSE), além de seqüências relacionadas com o G-box. Ensaios de atividade de GUS em discos foliares transformados com os genes quiméricos BiP6-GUS e BiP9-GUS demonstraram que o promotor de gsBiP6 é induzido por uma variedade de estresses, enquanto gsBiP9 é induzido apenas por tunicamicina, um potente ativador da via de resposta a proteínas mal-dobradas (UPR). Além disso, análises histoquímicas de plantas transformadas com as construções -358pbip6-gus (BiP6) e -2200pbip9-gus (BiP9) revelaram que os promotores de BiP produziram um padrão intenso e uniforme de expressão de GUS em folhas, caules, raízes e meristemas apicais. Este padrão de distribuição espacial da atividade de GUS está correlacionado com uma expressão desses genes em tecidos que apresentam alta atividade celular secretória e alta proporção de células em um processo ativo de divisão celular. Análises de deleções do promotor de gsBiP9 em plantas transformadas identificaram dois domínios regulatórios cis-atuantes, denominados CRD-1 (-1090 a -670) e CRD-2 (-670 a +1), que são importantes para regulação espacial dos promotores de BiP em condições normais de desenvolvimento. A região de CRD-1 é caracterizada pela predominância quase absoluta de adenina e timina exibindo uma alta atividade do gene repórter GUS. Este domínio funcional possui uma atividade similar à de “enhancer”, já que é capaz de restaurar altos níveis de expressão quando fusionado diretamente à extremidade 5’ do promotor de BiP9. De fato, a atividade do gene repórter -glucuronidase (GUS) nas plantas contendo esse domínio regulatório cis-atuante foi praticamente idêntica àquela exibida pelo promotor inteiro. Além disso, a análise histoquímica e fluorimétrica de plantas contendo tais seqüências mostraram um aumento significativo na atividade do gene repórter GUS. A região de CDR-2 é caracterizada por conter elementos regulatórios positivos, que coordenam a expressão tecido-específica do promotor de gsBiP9, sendo capaz de restaurar em parte, os níveis de expressão basal do gene repórter GUS, uma vez que se detectou atividade do promotor em raízes e caule, entretanto, os níveis de expressão em folhas, principalmente na região dos feixes vasculares, não foram suficientemente altos e nem tão pouco de forma generalizada como visto nas construções contendo o promotor completo de BiP, sendo necessário seqüências adicionais delimitadas até a posição -1090 para uma alta atividade. Estes resultados sugerem que o controle da expressão dos genes BiP de plantas envolve múltiplos e complexos mecanismos e depende de uma complexa integração de múltiplos cis-elementos regulatórios no promotor. / Plant BiP (binding protein) has been described as an important mediator of translocation, folding and assembly of nascent secretory proteins in the endoplasmic reticulum lumen and it responds to a variety of biotic and abiotic stresses. Despite its functional relevance, little is known about the regulation mechanisms of plant BiP gene expression and the structure of their promoters. Here, we have fused two BiP promoters, designated gsBiP6 and gsBiP9, as well as different extensions of their 5'-flanking sequences to beta-glucuronidase (GUS) reporter gene and introduced into Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. The gsBiP6 and gsBiP9 promoters possess cis-regulatory elements of most plant promoters, such as CAAT e TATA boxes, in addition to potential regulatory cis-elements, such as endoplasmic reticulum stress elements (ERSE) and G-box-related sequences. GUS activity assays from leaf discs expressing BiP6- GUS e BiP9-GUS demonstrated that gsBiP6 promoter is induced by a variety of stress conditions, whereas the induction of gsBiP9 is restricted to tunicamycin treatment, a potent activator of the unfolded protein response (UPR) pathway. Furthermore, histochemical analysis of transgenic lines harbouring -358pbip6-gus (BiP6) and -2200pbip9-gus (BiP9) revealed that BiP promoters drove an intense and uniform pattern of GUS expression in leaves and stems, with the expression of BiP genes in tissues with high secretory activity and in regions of intense cell division. Promoter deletion analyses allowed to identify two cis-regulatory functional domains, designated CRD-1 (-1090 to -670) and CRD-2 (-670 to +1), that are important for the spatially-regulated activation of BiP expression under normal plant development. CRD-1 corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. CDR-2 is able to maintain a basal expression of the reporter gene in root, stem and leaves and, most likely, it contains all the required elements of a eukaryotic promoter. In spite of that, the gene reporter expression levels driven by CRD-2 domain were not sufficiently high in these organs, and GUS activity were not detected in apical meristems. In fact, the BiP promoter activity in meristematic tissues requires the presence of a second activating domain CRD-1 (-1090 to -670), that corresponds to an AT-rich enhancer-like region, capable of promoting a significant increase in GUS activity in all analysed tissues. These results suggest that the tissue-specific control of BiP gene expression requires a complex integration of multiple cis- acting regulatory elements on the promoter. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-12-01T14:42:08Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3030242 bytes, checksum: d145bff94d511f6d8353fbb00470328b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-01T14:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3030242 bytes, checksum: d145bff94d511f6d8353fbb00470328b (MD5) Previous issue date: 2015-05-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O silenciamento de RNA pode ser induzido em plantas como resultado da infecção por vírus, um processo denominado “silenciamento gênico induzido por vírus” (virus induced gene silencing) – VIGS. Vetores VIGS permitem de uma forma rápida e eficiente a análise funcional de genes de soja por genética reversa. A construção de um vetor de silenciamento viral para inativação de genes de soja foi baseado na modificação do genoma do DNA-A de SoCSV (Soybean chlorotic spot virus) de forma a deletar o gene da proteína do capsídeo, e incorporar sítios de enzimas de clonagem chaves que permitam a inserção de sequências para silenciamento específico de genes alvos. O vetor de silenciamento derivado do genoma de SoCSV poderá ser usado para permitir o entendimento entre as possíveis comunicações cruzadas entre a via UPR e a via de morte celular mediada por NRPs (DCD/NRP), já que a falta de conhecimento com relação aos transdutores de sinais da referida via UPR em soja tem limitado seu estudo. A via UPR (Unfolded Protein Response) é desencadeada pelo acúmulo de proteínas mal dobradas e, por sua vez, é induzida para garantir o dobramento adequado das proteínas atenuando o estresse no RE. Nos mamíferos, a via UPR muito bem caracterizada é regulada pelo chaperone molecular, BiP, e ativada por três receptores: PERK, IRE1 e ATF6. A caracterização da via UPR em Arabidopsis foi baseada em mamífero e é ativada por duas classes de receptores transmembranas do RE: bZIP28 e bZIP17 (homólogos de ATF6) e IRE homólogos, IRE1a e IRE1b. Apesar da importância do RE como uma organela chave envolvida em respostas adaptativas a estresse, a resposta ao estresse RE não tem sido caracterizada no genoma da soja. Portanto, por análise in silico, em comparação com Arabidopsis, e estudos funcionais foi gerado um painel com um completo cenário de resposta ao estresse no RE em soja. No genoma da soja foram também identificados fatores de transcrição induzidos por estresse no RE, um associado à membrana, ortólogo de AtNAC062 e um fator de transcrição ortólogo de AtNAC103. Além de genes envolvidos na via UPR, foi identificado um fator de transcrição associado à membrana do RE, ortólogo de AtNAC89, que contém um domínio NAC e up-regula vii genes associados a morte celular. Em soja foi demonstrado que o sinal de estresse no RE e estresse osmótico integra com outras repostas adaptativas, como a via de sinalização de morte celular programada mediada por DCD/NPRs, específica de planta e iniciada por GmERD15 que ativa o promotor alvo NRP. A expressão aumentada de NRP leva à indução de GmNAC81 e GmNAC30 que cooperam para ativação da expressão do gene VPE (vacuolar processing enzyme), que, por sua vez, executa o processo de morte celular programada. Ao contrário, por análise in silico mostramos que esta via de morte celular mediada por DCD/NRP também é conservada em Arabidopsis, com exceção para GmERD15, que aparententemente não possui ortólogo em Arabidopsis. Em nossa pesquisa fornecemos evidências que as respostas de estresse no RE funcionam de forma semelhante. Primeiramente uma alta conservação de estruturas primárias de soja com preditos ortólogos de Arabidopsis possuem domínios de localização e funcional comuns que podem ser associados com atividade bioquímica correta e localização subcelular. Em segundo, os dois ramos da UPR em soja foram analisados funcionalmente. Ortólogos bZIP17/28 (GmbZIP37 e GmbZIP38) e ortólogo ZIP60 (GmbZIP68) de soja possuem organização estrutural similar e assim como em Arabidopsis são induzidos por estresse no RE e o putativo substrato de GmIREs, transcrito GmbZIP68, possui sítio canônico para atividade endonuclease de IRE1 e sofre splicing sob condições de estresse no RE. A expressão de bZIP38, bZIP37 e bZIP68 suporta que a via UPR em plantas é funcionalmente conservada em soja. O amplo painel compreensivo de resposta a estresse do RE em soja gerado permite predições funcionais da sinalização de componentes de estresse no RE. Portanto, o vetor VIGS desenvolvido possibilitará um avanço na caracterização funcional dos componentes da via e possibilidade de conecções com respostas a múltiplos estresses em plantas. / The RNA silencing can be induced in plants as a result of virus infection, this process is called virus induced gene silencing – VIGS. VIGS vectors allow a fast and efficient functional analysis of soybean genes by reverse genetics. The construction of a VIGS vector for the soybean genes inactivation was based in the modification of the DNA-A of SoCSV (Soybean chlorotic spot virus) genome aiming to delete the protein gene of the capsid, and to incorporate enzyme sites of cloning keys that allow the insertion of sequences to the silencing of specific target genes. The silencing vector derived from the SoCSV genome can be used to enable a better understanding between the possible cross-communication between the UPR pathway and the pathway of cell death mediated by NRPs (DCD/NRP), since the lack of knowledge about transducers signals of the UPR via has limited its study. The UPR (Unfolded Protein Response) is triggers by the accumulation of unfolded proteins, and it is induced to guarantee the proper protein folding attenuating the stress on ER (endoplasmic reticulum). In mammals, a very well characterized UPR pathway is regulated by the molecular chaperone BiP, and it is activated by three receptors: PERK, IRE1 e ATF6. The UPR pathway characterization in Arabidopsis was based on mammals and it is activated by two classes of transmembrane receptors of ER: bZIP28 e bZIP17 (homologs of ATF6) and IRE homologs, IRE1a and IRE1b. Despite the importance of the RE as a key organelle involved in adaptative responses to stress, the ER stress response has not been characterized in the soybean genome. Therefore, by in silico analysis, in comparison with Arabidopsis and functional studies, a panel was created with a complete scenario of ER stress response in soybean. In the soybean genome were also identified transcription factors induced by stress in the ER, one of them associated to the membrane, orthologs of AtNAC062, and a transcription factor ortholog of AtNAC103. Besides the genes involved on the UPR pathway, a transcription factor associated with the ER membrane, orthologs of AtNAC89, that contains a NAC domain and up regulates genes associated to the cell death was identified. In soybean, it was demonstrated that the ER stress and osmotic ix stress-signal integrates with other adaptive responses, as the plant-specific cell death signaling pathways mediated by DCD/NPRs and initiated by GmERD15, that activates the target promoter NPR. The increased expression of NPR leads to the induction of GmNAC81 and GmNAC30 that cooperate to the activation of the expression of the VPE gene (vacuolar processing enzyme), that executes the process of programmed cell death. In a reverse approach, by in silico analysis we also examined the Arabidopsis genome for components of a previously characterized ER stress-induced cell death signaling response in soybean. With the exception of GmERD15, which apparently does not possess an Arabidopsis ortholog, the Arabidopsis genome harbors conserved GmNRP, GmNAC81, GmNAC30 and GmVPE sequences that share significant structural and sequence similarities with their soybean counterparts. In our research we showed evidences that the stress response in the ER operates in a similar fashion in both soybean and Arabidopsis. Firstly, a high conservation of primary structures of soybean with predicted Arabidopsis orthologs have functional common domains that can be associated to the biochemistral activity and subcellular localization. Secondly, both branches of UPR in soybean were analysed functionally. The bZIP17/bZI28 orthologs (GmbZIP37 and GmbZIP38) and ZIP60 ortholog (GmbZIP68) from soybean have a similar structural organization and as in Arabidopsis they are induced by stress in ER and the putative substrate of GmIREs, transcript GmbZIP68, have canonical site to endonuclease activity of IRE1 and undergoes alternatively spliced under stress conditions in ER. The expression of bZIP38, bZIP37 and bZIP68 supports that the UPR pathway in plants is functionally conserved in soybean. Our in silico analyses, along with functional data, have generated a comprehensive overview of the ER stress response in soybean as a framework for functional prediction of ER stress signaling components. Therefore, the development of VIGS vector enables an advance in the functional characterization of the pathway components and the possible connections with multiple stress responses in plants.

Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. / O câncer é uma das principais causas de morte da população mundial, sendo considerado um problema de saúde pública. As células tumorais adquirem diversas características que as permitem se proliferar desordenadamente e invadir outros tecidos, como a resistência à morte celular. As fenotiazinas são fármacos utilizados há muito tempo para o tratamento de desordens psiquiátricas. Dados da literatura demonstram que estes compostos apresentam diversos efeitos biológicos relevantes, como a atividade antitumoral. Estudos do nosso grupo têm evidenciado efeitos extremamente importantes das fenotiazinas e análogos sobre mitocôndrias, como aumento das concentrações de cálcio no citosol. Em nosso estudo prévio com mitocôndrias isoladas, foi demonstrado que estes compostos promovem a permabilização da membrana mitocondrial pela abertura do poro de transição de permeabilidade com consequente dissipação do potencial de membrana mitocondrial, efluxo de cálcio e liberação de citocromo c. Posteriormente, em um estudo recente, demonstramos a citotoxicidade destes compostos em células de hepatoma, acompanhada de alterações na morfologia celular, permeabilização da membrana plasmática e imediata dissipação do potencial de membrana mitocondrial. Dentre as fenotiazinas estudadas por nosso grupo, a que apresentou maior potência foi a tioridazina (TR), sendo assim a droga escolhida para este estudo, cujo objetivo foi estudar os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular induzida pela tioridazina em células leucêmicas, investigando o papel das proteínas da família BCL-­2 neste processo, bem como as alterações nas vias de sinalização associadas à morte celular, como estresse do retículo endoplasmático (RE). A TR foi capaz de induzir a apoptose de maneira concentração e tempo­dependente, além de inibir a progressão do ciclo celular nas células leucêmicas K562. Além disso, a morte celular induzida pela tioridazina foi acompanhada de dissipação do potencial de membrana mitocondrial e alterações na expressão das proteínas da família BCL-­2 e ativação das proteínas quinases JNK, ERK1/2 e p38. Nossos resultados também demonstraram que TR é capaz de promover a ativação da proteína pró-­apoptótica BAX e liberação da proteína mitocondrial Omi, eventos característicos da permeabilização da membrana mitocondrial externa. Adicionalmente, observamos que TR foi capaz de promover severo estresse do RE, acompanhado de aumento na expressão das principais proteínas envolvidas na sinalização em resposta a este evento e consequente morte celular. Neste trabalho podemos concluir que a tanto a via mitocondrial como o estresse do retículo endoplasmático contribuem para a morte celular induzida pela TR nas células K562. Estes resultados demonstraram o potente efeito citotóxico da tioridazina nas células leucêmicas e evidenciaram o promissor potencial terapêutico dessa classe de drogas como antitumorais. / Cancer is the leading cause of death worldwide and it is considered a public health problem. Tumor cells exhibit a variety of features that enable tumor growth and dissemination, like resistance to cell death mechanisms. Phenothiazines is a group of drugs that have been used in the treatment of psychiatric disorders for a long time. Literature data demonstrate that these compounds exhibit relevant biological effects including antitumor activity. Publications from our group have evidenced extremely important effects of phenotiazines and analogues on mitochondria related to the increase of calcium cytosolic concentration promoted by this drug. In our earlier work with isolated mitochondria, it was demonstrated that these drugs promote the mitochondrial membrane permeability due to the opening of permeability transition pore complex with consequent dissipation of mitochondrial transmembrane potential, calcium efflux and cytochrome c release. Additionally, in our latest publication, we demonstrated the cytotoxicity of phenothiazines in hepatoma cells, accompanied by cellular morphological alterations, plasma membrane permeability and immediate dissipation of mitochondrial transmembrane potential. Among the studied phenothiazines, the most potent was thioridazine, which was chosen for the present work. The goal of this work was to underlie the molecular mechanisms of thioridazine-­induced cell death in leukemic cells, evaluating the role of BCL-­2 family proteins, as well as changes in signaling pathways associated to cell death, including endoplasmic reticulum (ER) stress. This compound was able to induce apoptosis in a concentration and time-­dependent manner, and also inhibit the cell cycle progression in K562 cells. Furthermore, tioridazine-­induced cell death was accompanied by dissipation of mitochondrial transmembrane potential, alterations in BCL-­2 proteins expression as well as activation of the kinases JNK, ERK1/2 and p38. Our results also demonstrated that thioridazine was able to activate the pro ­apoptotic protein BAX and the release of the mitochondrial protein Omi, resulting in mitochondrial outer membrane permeabilization. In addition, we observed that thioridazine was able to induce a severe ER stress, promoting an increase in the expression of the major sensor proteins in this signaling pathway, leading to cell death. We can conclude that both mitochondrial and ER stress contributes to thioridazine-­induced cell death in K562 cells. Besides the importance of our results to the elucidation of phenothiazines-­induced tumor cells death, it also confirms the promising therapeutic potential of this class of drugs as antitumor agents.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A obesidade está relacionada com o desenvolvimento de processos inflamatórios os quais interferem sobre a via de sinalização da insulina levando à resistência à ação deste hormônio e ao desenvolvimento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Além disso, o estado de inflamação subclínica pode comprometer a função do retículo endoplasmático, um processo conhecido como estresse de retículo endoplasmático. Diante disso, e ciente das determinantes inflamatórias para o surgimento do DM2; torna-se de grande valia explorar os efeitos dos ácidos graxos poli-insaturados ômega 3 sobre estas vias. Dessa forma, o presente estudo avaliou os efeitos da suplementação com óleo de peixe em pacientes com sobrepeso/obesos e DM2, sobre os níveis proteicos de moléculas marcadoras de inflamação e de estresse de retículo endoplásmático. Para isso, foram recrutados 32 pacientes com sobrepeso ou obesos e diagnosticados com diabetes mellitus tipo 2 há mais de um ano. Esses pacientes foram suplementados por oito semanas com óleo de peixe (2,4g/dia), ingerindo duas cápsulas pela manhã e duas à noite. Não foi orientado nenhuma modificação na alimentação durante o período de estudo, apenas a ingestão das cápsulas de óleo de peixe diariamente. Os pacientes tiveram amostras de sangue periférico coletado antes e após a intervenção. As coletas foram feitas mediante jejum de 12 horas e o não consumo de álcool nas 48 horas anteriores. Células mononucleares do sangue periférico foram isoladas por centrifugção em ficol seguida das preparação de seus extratos protéicos. Os extratos foram submetidos à eletrofosere em gel de poliacrilamida e transferência Western blot. Em seguida, foram determinados seus níveis de fosforilação por meio dos anticorpos anti NFB, JNK fosforilados, XBP1, pPERK e pEIF2. Observou-se que a suplementação com ácidos graxos poli-insaturados ômega-3, durante oito semanas, reduziu, de modo significativo, os níveis protéicos de NFB e JNK fosforilados indicando menor interferencia de sinais inflamatórios sobre a via de sinalização da insulina. O mesmo foi observado para os marcadores de estressse de retículo XBP1, pPERK e pEIF2. Em conclusão, a suplementação com ácidos graxos poli-insaturados ômega 3, na dosagem de 2,4 gramas por dia, foi eficaz para reduzir os níveis proteicos de moléculas marcadoras de inflamação e de estresse de retículo endoplasmático em pacientes com sobrepeso/obesos e DM2.