O Transtorno de Humor Bipolar (THB) é uma doença psiquiátrica crônica e grave que tem sido relacionada com várias disfunções celulares, tais como uma resposta prejudicada ao estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta ao estresse do RE (Unfolded Protein Response - UPR) e a morte celular induzida por este processo celular em linfócitos de pacientes com THB e indivíduos saudáveis, avaliando sua relação com os estágios da doença. Linfócitos de 30 pacientes bipolares e 32 controles pareados por sexo e idade foram tratados com tunicamicina, um indutor do estresse do RE, por 12h ou 24h, com o objetivo de mensurar os níveis de proteínas relacionadas à UPR (GRP78, eIF2α-P e CHOP) por citometria de fluxo, e por 48h para analisar a morte celular induzida pelo estresse do RE. O efeito de lítio sobre estes parâmetros na cultura celular também foi avaliado. No grupo controle, observamos a indução de GRP78 e eIF2α-P pela tunicamicina após 12h e 24h e de CHOP após 24h. O aumento induzido por tunicamicina dos níveis de proteínas relacionadas com a UPR não foram encontrados no grupo de pacientes. Entre os pacientes eutímicos, aqueles em estágio inicial da doença tiveram uma melhor resposta ao estresse do RE quando comparados aos pacientes em estágios avançados, apresentando níveis de GRP78 e eIF2α-P semelhantes aos controles após 12h de tratamento com tunicamicina. A morte celular induzida por tunicamicina foi maior nos pacientes bipolares em relação aos controles. O lítio não induziu diferenças na expressão das proteínas avaliadas e não reverteu a morte celular induzida pelo estresse do RE, entretanto levou a uma diminuição pequena, mas estatisticamente significativa, neste último parâmetro. Este estudo em cultura primária de linfócitos de pacientes bipolares reforça os resultados anteriores sobre a disfunção na resposta ao estresse do RE no THB. Essa disfunção no RE pode estar associada com a diminuição da resiliência celular nos pacientes, contribuindo, em última análise, para a progressão da doença. / Bipolar disorder (BD) is a severe chronic psychiatric disorder that has been related to several cellular dysfunctions, such as an impaired endoplasmic reticulum (ER) stress response. We aimed to evaluate the unfolded protein response (UPR) and the outcome of this cellular process in cultured lymphocytes from patients with BD and healthy subjects, assessing its relationship to the stage of the disorder. Lymphocytes from 30 BD patients and 32 age- and sex-matched controls were treated with tunicamycin, an ER stressor, for 12h or 24h in order to measure levels of UPR-related proteins (GRP78, eIF2α-P and CHOP) by flow cytometry, and for 48h to analyze ER stress-induced cell death. The effect of lithium on these parameters in cultured lymphocytes was also evaluated. In the control group, inductions of GRP78 and eIF2α-P by tunicamycin after 12h and 24h and of CHOP after 24h were observed. Tunicamycin-induced increases in UPR-related proteins were not found in the BD group. Among euthymic patients, those at an early stage of disorder had a better response to ER stress when compared to patients in advanced stages, with GRP78 and eIF2α-P levels similar to controls after 12h of treatment with tunicamycin. Tunicamycin-induced cell death was higher in BD patients compared to controls. Lithium did not induce differences in the expression of the evaluated proteins and did not reverse tunicamicin-induced cell death, but led to a small yet statistically significant decrease in this parameter. This study extends earlier findings about impaired ER stress response in primary cultures of lymphocytes from BD patients. ER dysfunction may be associated with decreased cellular resilience in BD, ultimately contributing to the progression of the disorder.

A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia. Anteriormente identificou-se uma paciente com CVID que apresenta nível aumentado de estresse de retículo endoplasmático (ER), secundário a desregulação da via UPR. No presente trabalho, estendemos esta análise para outros pacientes e avaliamos o perfil de maturação de seus linfócitos B. Métodos: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Citometria de Fluxo e cultura de células B ex vivo e imortalizadas. Resultados: A análise de 16 pacientes com CVID e 9 indivíduos saudáveis revelou três pacientes com porcentagens aumentadas de linfócitos B imaturos no sangue periférico. A análise da expressão de RNAm para BiP e XBP-1 em linfócitos B destes pacientes, após estímulo com LPS in vitro, identificou que os linfócitos B de um deles apresenta estresse de RE. Conclusão: Identificamos um subgrupo de pacientes com CVID que apresentam linfócitos B imaturos no sangue periférico. Um membro deste subgrupo apresenta estresse aumentado de ER. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia. Previously a CVID patient was identified with increased levels of Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to dysregulation of the UPR. In the present study these analyses were performed in other patients and healthy donors. Maturation markers of B lymphocytes were also characterized in these individuals. Methods: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Flow cytometry and culturing of ex vivo and immortalized B cells. Results: The analysis of 16 CVID patients and 9 healthy donors revealed three patients that present higher percentage of immature B cells in peripheral blood. Analysis of expression of BiP and XBP1 induced by LPS treatment of B lymphocytes from these patients revealed that one patient present increased levels of ER stress.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Diversas condiciones pueden producir estrés en el retículo endoplásmico, tales como la acción de compuestos, como la tapsigargina (TG) y la tunicamicina (TU) o distintas situaciones patológicas como la hipoxia, daño oxidativo o reductor, infecciones virales e hipoglicemia. Todas ellas generan una acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico (RE), que conduce a la activación de una respuesta celular al estrés altamente conservada, evolutivamente conocida como respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), la cual puede ser adaptativa, de alarma o muerte dependiendo de la intensidad y cronicidad del estímulo. La respuesta adaptativa está diseñada especialmente para restablecer la homeostasis de RE y su normal funcionamiento por medio de la inducción de genes que codifican a chaperonas, a la vía de degradación de proteínas asociada al RE (ERAD) y la degradación proteoasomal de proteínas, así como también a proteínas que aumentan la capacidad plegadora del RE. Si estas respuestas adaptativas no logran recobrar el equilibrio en el RE, se activa el programa de muerte celular de tipo apoptótico, necrótico o autofágico. Las respuestas adaptativas mencionadas operan principalmente por medio de tres vías transduccionales: IRE1, PERK y ATF6, siendo las vías IRE1 y ATF6 las involucradas en las etapas iniciales de la UPR, para restablecer la homeostasis del RE. Sin embargo al mantenerse el estímulo de estrés las tres vías se activan en conjunto para inducir genes de muerte celular como lo es GADD153/CHOP. La insulina participa en la regulación de diversos procesos celulares, entre los que se encuentran el metabolismo de la glucosa en el tejido muscular y adiposo, el de los ácidos grasos en el hígado y células grasas. Estas acciones están mediadas por medio de la activación de su receptor de membrana, el receptor de insulina (IR), el El modelo experimental utilizado fue cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a dos tipos de estresores, TG y TU, por 24 hrs., e insulina por 15 minutos y 24 hrs. Los resultados obtenidos mostraron que, tanto TG como TU, indujeron estrés de RE en los cardiomiocitos y que activaron el programa de muerte celular de manera dosis-dependiente, esto determinado por la expresión de la proteína GADD153/CHOP. Sin embargo no se observaron cambios en los niveles de la chaperona Grp78/BIP. La inducción de estrés de RE afectó la viabilidad celular de manera dependiente de la concentración, esto determinado por los ensayos de exclusión de yoduro de propidio (IP) y azul de tripán. Además se observó que la muerte celular posee un componente importante de apoptosis. La insulina por sí sola no indujo estrés de RE en los cardiomiocitos, sin embargo disminuyó la expresión de GADD153/CHOP de los cardiomiocitos estimulados con TG y TU. Este efecto es parcial ya que la insulina no recuperó los niveles basales de GADD153/CHOP. La inducción del estrés de RE con TU o TG en los cardiomiocitos afectó la vía transduccional de la insulina, disminuyendo la activación del receptor de insulina y de PKB/Akt, sin afectar los niveles totales de Akt. Finalmente, los resultados permiten concluir que la insulina es un regulador negativo del estrés de RE en cardiomiocitos inducida por TG y TU / Conditions like thapsigargin (TG) and tunicamycin (TU), hypoxia, reductive and oxidative damage, viral infections and hypoglycemia may produce endoplasmic reticulum stress, leading to an accumulation of misfolded proteins in the ER, and the subsequent activation of a cell stress response knows as UPR. This response can leads to cell adaptation, alarm or cell death. The adaptive response is especially designed to reestablish ER homeostasis by the induction of genes that encode chaperones, the ERAD pathway and the proteoasomal proteins degradation, as well as proteins increasing the folding capacity of the ER. However, depending of the strength or exposure time, the cell death program can be activated leading to that apoptosis, necrosis and autophagy. The adaptive response above described, can signal three independent transductional pathways: IRE1, PERK and ATF6, being IRE1 and ATF6 pathway involved in the early stages of UPR, to reestablish ER homeostasis. However a chronic stress activates cell death signaling pathway, inducing genes like GADD153/CHOP. Insulin participates in different cell processes including the regulation of glucose metabolism in muscle and adipose tissue, fatty acids metabolism in the liver and adipocytes. These actions are mediated by the activation of its membrane receptor, insulin receptor (IR), wich has an intrinsic tyrosine kinase activity and allows the activation of the following signaling cascades PI3K/PKB/Akt and MAPK/ERK. Severeal evidences have shown that TG and TU induce ER stress. However the research made on the insulin activity in the regulation of the ER stress are only in neurons, in which the inhibition of PKB/Akt is capable of induce the GADD153/CHOP expression, but the mechanism involved in this process is not fully understood. Our working hypothesis state that “Insulin attenuates the endoplasmic reticulum stress in cultured cardiomyocytes”. The experimental model was primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes exposed to the stressors, TG and TU, for 24 h and insulin for 15 minutes and 24 h. Our results showed that both, TG and TU, induced ER stress in cardiomyocytes activating the cell death program in concentration-dependent manner. This event was characterized by the expression of GADD153/CHOP. However any effect was observed in Grp78/BIP levels. ER stress induction affected the cell viability in concentration-dependent manner, was assessed by IP and tripán blue exclusion tests. We also observed that apoptosis was the type of cell death activated in our model of ER stress. Insulin itself did not induce ER strees in cultured cardiomyocytes, however decreased GADD153/CHOP expression triggered by TG and TU. This effect is partial because the insulin did not recover GADD153/CHOP basal levels. ER stress induction in cultured cardiomyocytes affected insulin signaling pathway characterized by decreased insulin receptor activation and phosphorylated PKB/Akt levels without any effect in total PKB/Akt levels. This effect was seen both with TG and TU. In summary, these results suggest that insulin receptor signaling pathway is negatively regulated by ER stressors in cultured cardiomyocytes

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-12T16:21:21Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 175674 bytes, checksum: 1fb40fb45ee23b9fbf635160375e913f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T16:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 175674 bytes, checksum: 1fb40fb45ee23b9fbf635160375e913f (MD5) Previous issue date: 2004-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Foram utilizados, quatro novilhos, Holandês-Zebu, castrados, fistulados no rúmen e abomaso, com peso vivo médio inicial de 279,0 kg distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado. Determinaram-se os consumos e as digestibilidades aparentes totais e parciais de matéria seca (MS), matéria orgânica (MO), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE), carboidratos totais (CHOT), fibra em detergente neutro (FDN) e carboidratos não fibrosos (CNF). Foram avaliados três tratamentos constituídos pelos volumosos: capim-elefante picado (CE), feno de capim-tifton 85 (FT) e silagem pré-secada de capim-tifton 85. Foram usados três períodos experimentais com duração de 17 dias cada, sendo sete dias para adaptação dos animais, dez dias para coletas. Os fluxos de digesta abomasal e a excreção fecal foram estimados com óxido crômico. O capim elefante proporcionou menores consumos de MS, PB, FDN e NDT. As digestibilidades aparentes totais da MS e MO não foram influenciadas pelos diferentes volumosos. Contudo, registrou-se menor digestibilidade aparente total para o pré-secado. O valor da FDN encontrado foi maior para o feno e o pré-secado, que não diferiram entre si. Quanto a digestibilidade aparente ruminal dos nutrientes apenas a da MO foi influenciada pelos volumosos. As digestibilidades aparentes intestinal da MS, CHO e FDN não foram afetadas pelos volumosos. Contudo, detectou-se efeito de volumoso para a digestibilidade intestinal dos demais nutrientes. Foram utilizados, na presente pesquisa, quatro novilhos, Holandês-Zebu, castrados, fistulados no rúmen e abomaso, com peso vivo médio inicial de 279,0 kg distribuídos em delineamento inteiramente casualizado, em três tratamentos: o capim-elefante (Pennisetum purpureum, Schum.) picado (CE), feno de capim-tifton 85 (Cynodon spp.) no (FT) e silagem pré-secada de capim tifton-85 (Cynodon spp.) (PS). Os objetivos foram avaliar a produção de proteína microbiana, utilizando-se as bases purinas no abomaso e a excreção urinária de derivados de purinas em amostras spot; a excreção de uréia, a concentração plasmática de N-uréia, o pH e as concentrações de amônia ruminais. Cada alimento (tratamento) foi fornecido em um período experimental aos quatro animais. Cada período experimental teve duração de 17 dias, sendo sete de adaptação e 10 para coletas. Houve interação entre tratamento e tempo de coletas tanto para a N-NH 3 (P<0,05) quanto para o pH (P<0,01) ruminal. Estimaram-se concentrações máximas de N-NH 3 de 26,11, 13,36 e 9,69 mg/dl nos tempos de 3,07, 2,78 e 2,23 h após a alimentação, respectivamente, para a silagem pré- secada de capim tifton-85, o capim-elefante e feno de capim-tifton 85. Foram estimados valores mínimos de pH de 6,55 às 6,89h após a alimentação para o capim-elefante e de 6,61 às 1,44h após a alimentação, para o feno de capim- tifton 85. Já para a silagem, o pH diminuiu linearmente com o tempo após a alimentação. Não houve diferença significativa (P<0,05) para excreção de uréia na urina, sendo os menores (P<0,05) consumos de N, fluxo de N abomasal e valores de MODR e CHODR obtidos para o capim-elefante. Não houve diferenças (P<0,05) entre os tratamentos para a eficiência microbiana. A produção microbiana estimada pelos derivados de purina na urina não diferiu (P<0,05) da obtidas pelas bases purinas no abomaso. / Four castrated Zebu-Holstein, which were fistulated in the rumen and abomasum, from which the average initial alive weight was 279.0 kg were used. The animals were distributed into an entirely randomized experimental design with 3 stages. The evaluations were performed for the intakes and the total and partial apparent digestibilities of the dry matter (DM), organic matter (OM), crude protein (CP), ethereal extract (EE), total carbohydrates (CHO), neutral detergent fiber (NDF), non-fibrous carbohydrates (NFC).The animals’ diet was exclusively composed by feedstuff and mineral mixture ad libitum. The following feedstuff were used: chopped elephant-grass, hay of tifton-85 grass and pre- dried silage of tifton-85 grass. The experiment consisted of three periods that lasted 17 days each one, from which seven days were addressed to the animals’ adaptation and the other ten days for data collection. The abomasum digesta flows and the fecal excretion were estimated with chromic oxide. The elephant-grass provided lower intakes of DM, CB, NFC and TDN. The total apparent digestibilities of DM and OM were not affected by the different feedstuffs. However, a lower total apparent digestibility of CP was found for the haylage. Concerning to NDF a higher value was observed for the hay and ixhaylage, what did not differ from each others. In relation to the rumen apparent digestibility of the nutrients, only the OM’s was affected by the feedstuffs. The intestinal apparent digestibility of DM, CHO and NDF were not affected by the feedstuffs. However, the feedstuffs affected the intestinal digestibility of the other nutrients. The pH and the rumen ammonia concentration were affected by the foods, collection times and the interaction among these factors. The highest values of the ammonia concentrations were 26.11, 11.36 and 9.69 mg/dl at the times 3.07, 2.78, and 2.23h after feeding for the pre-dried silage of the tifton-85 grass, elephant-grass and the hay of tifton-85 grass, respectively. Concerning to the rumen pH, some lowest values of 6.55 and 6.61 were estimated at 6.89h and 1.44h after feeding for the elephant-grass and hay, respectively. However, the pH was linearly decreased with the collection time, for the haylage. In relation to the plasmatic urea concentration, no effects of the feedstuff were observed, since an average value of 14.6 mg/dl was found. Concerning to the bacteria isolated from the rumen, a lower value of TN was observed for the elephant-grass. However, no effects of the feedstuffs upon N-RNA and NRNA:NT relationship, neither on the urea excretion through urine were observed. The elephant-grass provided lower contents of RDOM and RDCHO. No influence of the feedstuffs upon the microbial efficiency independently of the expression was found. Similar values were found in estimating the microbial production obtained by the derivatives from purine in the urine, as well as by the purine bases in the abomasum.

Doctor en Bioquímica / Herp es una proteína residente de la membrana del retículo endoplásmico que regula la degradación de proteínas a través del proteosoma. Este efecto lo ejerce principalmente regulando la formación del complejo de degradación de proteínas asociado al retículo endoplásmico (ERAD). Además, Herp se ha vinculado con la regulación del Ca2+ intracelular y citoprotección frente al estrés de retículo. Se desconoce si Herp tiene un efecto citoprotector frente al estrés oxidativo y los mecanismos por los cuales podría ejercer esta función. En esta tesis se planteó como hipótesis de trabajo que “Herp es una proteína inducida por H2O2 que regula la sobrevida celular, modulando la degradación del receptor de IP3 y la transferencia de Ca2+ a la mitocondria”. Para probar esta hipótesis se establecieron los siguientes objetivos específicos: -Establecer si el H2O2 estimula la expresión de Herp en células Hela. -Determinar si Herp regula los niveles intracelulares de Ca2+ dependientes de H2O2 -Determinar si Herp regula el traspaso de Ca+2 del retículo endoplásmico a la mitocondria por modulación del IP3R, en células Hela expuestas a H2O2. -Establecer si Herp tiene un papel citoprotector frente al H2O2 por regulación del Ca2+ intracelular. Los resultados mostraron que Herp aumenta sus niveles frente a el tratamiento con H2O2 en forma rápida, antes de los 30 min post estimulo, por un mecanismo transcripcional y traduccional. Esta respuesta es importante para la sobrevida celular frente a agentes que producen estrés oxidativo. Las células que poseen bajos niveles de la proteína Herp son más sensibles a la muerte producida por H2O2 que las células controles. También las células con menores niveles de Herp presentaron cinéticas de Ca2+ intracelular y mitocondrial diferentes en respuesta al H2O2, comparado con los controles. Estos cambios se debieron a una desregulación en los niveles del IP3R dado que Herp reguló su degradación a través de la vía proteosomal. Nuestros resultados sugieren que Herp mantiene los niveles normales de IP3R, regulando así la entrada de Ca2+ a la mitocondria. De este modo, Herp evita la sobrecarga de Ca2+ mitocondrial, apertura del poro de transición mitocondrial y posterior apoptosis en respuesta a estímulos nocivos como el H2O2. Junto con lo anterior, nuestros estudios mostraron que Herp regula el metabolismo mitocondrial, lo cual tienen repercusiones en la proliferación celular y la sensibilidad de las células a antineoplásicos. Las células HeLa con bajos niveles de Herp mostraron un metabolismo mitocondrial aumentado por un mayor influjo de Ca2+ mitocondrial vía IP3R. Estas células basalmente presentaron mayores niveles del IP3R. Tanto células Hela como células U2OS con bajos niveles de la proteína Herp presentaron una mayor sensibilidad a la muerte frente a una batería de antineoplásicos, probablemente producto de los cambios metabólicos anteriormente mencionados. Estos resultados sugieren que la proteína Herp podría ser un posible blanco terapéutico contra el cáncer. En resumen, Herp regula los niveles del IP3R de forma basal en las células Hela, de esta manera mantiene la homeostasis del Ca2+ mitocondrial, regulando la apertura del poro de transición mitocondrial y la función mitocondrial. En ausencia de la proteína ocurre una desregulación en la homeostasis del Ca2+ intracelular y mitocondrial, lo que produce aumentos de la actividad mitocondrial y mayor sensibilidad de las células a agentes nocivos como el H2O2 y quimioterapéuticos / Herp is a resident membrane protein of the endoplasmic reticulum (ER) that regulates protein degradation via proteasome. This effect is primarily done by regulating the formation of the ER-associated protein degradation (ERAD) complex. In addition, Herp regulates intracellular Ca2+ levels and stimulates cytoprotection against ER stress. It is unknown whether Herp protects against oxidative stress and the molecular mechanisms involved in this action. Our working hypothesis was "Herp is a H2O2-inducible protein that regulates cell survival by modulating IP3 receptor degradation and transfer of Ca2+ into mitochondria". To test this, the following specific objectives were established: -To assess whether H2O2 stimulates Herp expression in Hela cells. -To determine if Herp regulates H2O2-dependent intracellular Ca2+ levels. -To evaluate whether Herp regulates Ca2+ transfer from the ER to mitochondria by modulating IP3R in Hela cells exposed to H2O2. -To assess if Herp has a cytoprotective role against H2O2 by regulating intracellular Ca2+ levels. The results showed that the Herp levels rapidly increase in response to exogenous H2O2 by a mechanism involving transcriptional and translational regulation. This response was important for cell survival against agents producing oxidative stress. Cells with low levels of protein Herp exposed to H2O2 were more sensitive to die than controls, showing a different intracellular and mitochondrial Ca2+ kinetics and desregulation of IP3 receptor levels. Our results suggest that Herp maintains normal levels of IP3R, thus regulating Ca2+ entry to the mitochondria. Thus Herp seems to prevent mitochondrial Ca2+ overload, mitochondrial transition pore opening and apoptosis in response to H2O2. HeLa cells with low mitochondrial metabolism Herp depicted increased mitochondrial Ca2+ influx via IP3 receptors. These cells had higher baseline levels of IP3R. Both Hela and U2OS cells with low Herp levels depicted a higher sensitivity to antineoplasic drugs due to the aforementioned metabolic changes. These results suggest that the Herp protein could be a potential therapeutic target for cancer. In summary, Herp regulates IP3 receptor basal levels in HeLa cells maintaining mitochondrial Ca2+ homeostasis and thereby regulating mitochondrial transition pore opening and cell survival / Conicyt; Fondap

A fecundação resulta no aumento intracelular de cálcio que é necessário para a transição do oócito até o estádio de zigoto. Os eventos que ocorrem durante esta transição são caracterizados como ativação, sendo estes dependentes de cálcio. Entretanto, os eventos bioquímicos que ocorrem durante a ativação ainda não estão completamente elucidados. A proteína quinase C (PKC) e a proteína quinase dependente de cálcio/calmodulina (CaMKII), por apresentarem atividade durante a fecundação e por serem ativadas por cálcio são implicadas na regulação dos eventos da ativação. Entretanto, existem muitas dúvidas sobre o real papel destas proteínas na ativação do oócito. Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o papel da PKC e da CaMKII na ativação de oócitos bovinos. Para tal, oócitos bovinos maturados in vitro foram ativados partenogeneticamente (AP) com cálcio ionóforo A23187 (5&mu;M) por 5 minutos, sendo a retomada da meiose, a organização do citoesqueleto e do retículo endoplasmático (RE) avaliada 1 hora após a ativação. No experimento 1 foi avaliado o papel da CaMKII nestes eventos. Os oócitos foram AP na presença ou ausência de 100M do inibidor de CaMKII (Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated). A inibição da CaMKII não afetou a retomada da meiose e nem a distribuição dos RE, após a AP. Entretanto, não ocorreu a rotação do fuso meiótico no estádio de telófase II quando a CaMKII foi inibidada. Estes resultados demonstram que embora a CaMKII não tenha efeito na retomada da meiose, esta proteína participa na progressão do ciclo celular de oócitos bovinos, após a AP. No experimento 2 foi avaliado o papel da PKC em oócitos bovinos AP. Os oócitos foram ativados partenogeneticamente na presença ou ausência de 10&mu;M do inibidor de PKC (Bisindolymaleimide I). A inibição da PKC não afetou a retomada da meiose e nem a progressão pelo ciclo celular até o estádio de telófase II. Entretanto, a organização do RE foi afetada pela inibição da PKC. Resultado semelhante foi obtido quando os oócitos foram ativados na presença de citocalasina C, um despolimerizador de filamentos de actina. O presente experimento demonstra a participação da via PKC-actina na organização do RE na ativação de oócitos bovinos. / The intracellular calcium increase resulting from fertilization is necessary for oocyte transition to zygote. The events that occur during this transition are characterized as activation, which are dependent on calcium. However the biochemical events that occur during this activation are still not fully elucidated. The protein kinase C (PKC) and the calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), are involved in regulating the events of activation, since these proteins have activity during fertilization and are activated by calcium. However there are many doubts about the real role of these proteins in the oocyte activation. Thus, the objective of this study was to evaluate the role of PKC and CaMKII in bovine oocyte activation. For this purpose, in vitro matured bovines oocytes were parthenogenetically activated (PA) by using calcium ionophore A23187 (5&mu;M) for five minutes, and the resumption of meiosis, the cytoskeleton organization and the endoplasmic reticulum (ER) organization were evaluated 1 hour post-activation. In experiment 1, were evaluated the role of CaMKII in these events. The oocytes were PA in the presence or absence of 100M of CaMKII inhibitor (Autocamtide-2 Related Inhibitory Peptide, Myristoylated). The inhibition of CaMKII did not affect the meiosis resumption and the ER after the PA. However, there was no spindle rotation at telophase II stage when the CaMKII was inhibited. These results showed that although the CamKII has no effect on resumption of meiosis, it participates in the regulation of cell cycle progression after PA of bovine oocytes. In experiment 2, was evaluated the role of PKC on PA bovine oocytes. The oocytes were parthenogenetically activated in the presence or absence of 10&mu;M of PKC inhibitor (Bisindolymaleimide I). The PKC inhibition did not affected the resumption of meiosis and the progression through the cell cycle until the stage of telophase II. However, the ER organization was affected by PKC inhibition. A similar result was obtained when the oocytes were activated in the presence of cytochalasin C, which promotes the depolymerization of the actin filaments. The current experiment showed the participation of the PKC-actin pathway at the ER organization in the bovine oocytes activation.

A lesão de isquemia e reperfusão (IRI) continua a ser um problema clínico e o estresse do retículo endoplasmático (ERS) parece ser um importante mediador desse processo. A presença da heme oxigenase-1 (HO-1) ou do monóxido de carbono (CO), parece proteger da IRI. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar a papel da HO-1 e CO na IRI renal. A indução da HO-1 em camundongos promoveu uma proteção na IRI renal, com melhora da função renal, menos inflamação e atenuação do ERS. Ao avaliarmos o papel do CO, verificamos que há também uma proteção, mediada por p38, vias purinérgicas, estabilização de HIF-1a e eritropoietina. Há ainda uma melhora do metabolismo energético celular após o tratamento com CO. Enfim, podemos concluir que, na presença da HO-1 ou do CO, há uma melhora da lesão isquêmica, através de uma maior ativação de vias citoprotetoras, com atenuação do ERS, redução da inflamação e consequente melhora da função renal. / Ischemia-reperfusion injury (IRI) remains a clinical problem and endoplasmic reticulum stress (ERS) seems to be an important mediator of this process. The presence of heme oxygenase-1 (HO-1) or carbon monoxide (CO) appears to protect from IRI. The aim of our study was to evaluate the role of HO-1 and CO in renal IRI. The induction of HO-1 in mice promoted protection in renal IRI with improved renal function, less inflammation and attenuation of ERS. When evaluating the role of CO, we found that there is also a protection mediated by p38, purinergic signaling, HIF-1a stabilization and erythropoietin. There is still an improvement of cellular energy metabolism after treatment with CO. Finally, we conclude that, in the presence of HO-1 or CO, there is an improvement of the ischemic lesion, through greater activation of cytoprotective pathways, with reduced ERS, reducing inflammation and consequent improvement in renal function.

A neurodegeneração é o resultado da destruição progressiva e irreversível dos neurônios no sistema nervoso central, apresentando causas desconhecidas e mecanismos patológicos não totalmente elucidados. Fatores como a idade, o aumento da formação de radicais livres e/ou estresse oxidativo, defeito no metabolismo energético, a inflamação e acúmulo de elementos neurotóxicos e de proteínas malformadas no lúmen do retículo endoplasmático (RE) contribuem para o desenvolvimento dos processos neurodegenerativos. O sistema canabinoide tem sido proposto como neuroprotetor em diversos modelos de neurodegeneração como hipóxia aguda e epilepsia, isquemia cerebral, lesão cerebral e modelos de estresse oxidativo. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar o papel do sistema canabinoide em uma linhagem de neuroblastoma (Neuro 2a) submetida a condições de estresse oxidativo (H2O2), inflamação (LPS) e estresse do RE (tunicamicina), avaliando parâmetros de viabilidade celular e vias de sinalização envolvidas. Nossos resultados mostram que o agonista canabinoide ACEA foi capaz de proteger as células da morte celular causada pela inflamação e pelo estresse de retículo endoplasmático, mas não pelo estresse oxidativo. Esse efeito neuroprotetor exercido pelo ACEA parece pelo menos em parte ocorrer via receptor CB1 no modelo de inflamação e ser independente deste receptor no modelo de estresse de RE. Os efeitos neuroprotetores observados envolveram a modulação dos níveis de proteínas pré-apoptóticas, CHOP e Caspase 12, e da proteína relacionada à sobrevivência celular ERK 1/2. Nossos dados sugerem um papel neuroprotetor do sistema canabinoide em mecanismos relacionados aos processos neurodegenerativos e propõem a manipulação desse sistema como possível alvo terapêutico. / Neurodegeneration is the result of progressive and irreversible destruction of neurons in the central nervous system, with unknown causes and pathological mechanisms not fully elucidated. Factors such as age, increased formation of free radicals and/or oxidative stress, defects in energetic metabolism, inflammation and accumulation of neurotoxic factors and misfolded proteins in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) contribute to the development of neurodegenerative processes. The cannabinoid system has been proposed as neuroprotector in several models of neurodegeneration such as acute hypoxia and epilepsy, cerebral ischaemia, brain injury and oxidative stress models. This work aimed to investigate the role of the cannabinoid system in a neuroblastoma line (Neuro 2a) submitted to oxidative stress (H2O2), inflammation (LPS) and ER stress (tunicamycin) conditions, assessing cell viability parameters and signaling pathways involved. Our results show that the ACEA cannabinoid agonist was able to protect cells from cell death caused by inflammation and ER stress, but not from oxidative stress. This neuroprotective effect exerted by ACEA appears to occur at least in part via the CB1 receptor in inflammation model and it seems to be independent of this receptor in the ER stress model. The neuroprotective effects observed involved the modulation of the levels of pre-apoptotic proteins CHOP and Caspase 12 and the cell survival related protein ERK 1/2. Our data suggest a neuroprotective role of the cannabinoid system in mechanisms related to neurodegenerative processes and propose it as possible therapeutic target.

A doença renal crônica (DRC) é um problema de saúde pública caracterizado por alta morbidade e mortalidade e com enorme impacto social e econômico no sistema de saúde. Uma das consequências mais graves da progressão da DRC é a albuminúria, que se deve principalmente a lesões no epitélio tubular proximal e na membrana basal glomerular. O aumento da permeabilidade da barreira de ultrafiltração glomerular à albumina está diretamente relacionado à lesão podocitária, principalmente devido à perda de processos podais, estresse oxidativo, estresse de reticulo endoplasmático e eventos apoptóticos. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos em tais processos ainda não foram elucidados. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os mecanismos pelos quais a albumina participa na lesão de podócitos, considerando a contribuição da caveolina-1, IRE-1 fosforilado, PKC fosforilada, p38 MAPK fosforilada e caspase-12 clivada. Para isso, utilizamos podócitos de camundongos diferenciados, os quais foram distribuídos em quatro grupos experimentais: controle e tratados com albumina nas concentrações de 1, 5 e 10 mg/mL, em RPMI 1640 sem soro, durante 24 horas. Após o tratamento, a apoptose foi avaliada por citometria de fluxo. Para os experimentos de imunofluorescência, as células foram tratadas com albumina fluorescente conjugada à isotiocianato de fluoresceína (FITC) 1 mg/mL durante 30 min, 1h, 3h e 24h. As imagens foram obtidas por microscopia confocal, objetivo de 63x. A expressão de proteínas foi analisada por western blotting; GRP78, PKC , p38 MAPK e caspase-12 clivada foram avaliados 30 min, 1h, 3h e 24h após o tratamento das células com albumina 1 mg/mL. GAPDH foi usado como controle endógeno. A análise estatística foi avaliada pela ANOVA one-way seguida do pós teste de Bonferroni. Valores de p<0,05 foram considerados significativos. Nossos resultados mostram que o tratamento das culturas celulares de podócitos com albumina, na concentração de 1 mg/mL, durante 24h resultou em um aumento significativo na taxa de apoptose total em comparação com o controle. Com relação à imunofluorescência, colocalizações entre albumina FITC e caveolina-1 foram observadas no período de 30 min, 1h, 3h e 24h. Em relação à expressão proteica, observou-se um aumento significativo na expressão da proteína GRP78 no período de 1 hora após o tratamento com albumina, o que indica um possível estresse de retículo endoplasmático. No caso da proteína IRE-1 fosforilada houve aumento da expressão em 30 min, 1h, 3h e 24h em relação ao grupo controle. Além disso, um aumento significativo na expressão das proteínas PKC fosforilada, p38 MAPK fosforilada e caspase-12 clivada foi observado nos períodos de 1h, 3h e 24h após o tratamento com albumina. Estes dois últimos parâmetros foram reduzidos pelo co-tratamento das células com SB203580 (10-6 M), um inibidor específico da p38 MAPK. Estes resultados sugerem que a proteína caveolina-1 tem um papel importante na internalização da albumina nos podócitos. Além disso, a albumina induz a apoptose por ativação do estresse de retículo nessas células, principalmente através da via PKC /p38MAPK/caspase-12 clivada. / Chronic kidney disease (CKD) is a public health problem characterized by high morbidity and mortality and with enormous social and economic impact on the health system. One of the most serious consequences of CKD progression is albuminuria, which is mainly due to lesions in the proximal tubular epithelium and the glomerular basement membrane. Increased permeability of the glomerular ultrafiltration barrier to albumin is directly related to podocyte lesion, mainly due to loss of foot processes, oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptotic events. However, the cellular mechanisms involved in such processes have not yet been elucidated. Thus, the objective of this study was to investigate the mechanisms by which albumin participates in podocyte injury, considering the contribution of caveolin-1, phosphorylated IRE-1, phosphorylated PKC, phosphorylated p38 MAPK, and cleaved caspase-12. For this, we used mice differentiated podocytes, which were distributed in four experimental groups: control and treated with serum concentrations of 1, 5 and 10 mg/mL in serum-free RPMI 1640 for 24 hours. After treatment, apoptosis was assessed by flow cytometry. For the immunofluorescence experiments, the cells were treated with 1 mg/mL fluorescein isothiocyanate-conjugated (FITC) albumin for 30 min, 1h, 3h, and 24h. The images were obtained by confocal microscopy, 63x objective. Protein expression was analyzed by western blotting; GRP78, PKC , p38 MAPK and cleaved caspase-12 were evaluated 30 min, 1h, 3h and 24h after treatment of the cells with 1 mg/mL albumin. GAPDH was used as an endogenous control. Statistical analysis was assessed by one-way ANOVA followed by Bonferroni post-test. Values of p<0.05 were considered significant. Our results show that the treatment of cell cultures of podocytes with albumin at a concentration of 1 mg/mL for 24h resulted in a significant increase in the total apoptosis rate compared to the control. Regarding immunofluorescence, colocalizations between FITC albumin and caveolin-1 were observed in the period of 30 min, 1h, 3h and 24h. Regarding protein expression, a significant increase in GRP78 protein expression was observed within 1 hour of albumin treatment, indicating potential endoplasmic reticulum stress. In the case of the phosphorylated IRE-1 protein, expression increased in 30 min, 1h, 3h and 24h in relation to the control group. In addition, a significant increase in the expression of phosphorylated PKC, phosphorylated p38 MAPK and cleaved caspase-12 proteins was observed at 1h, 3h and 24h after albumin treatment. These latter two parameters were reduced by co-treatment of the cells with SB203580 (10-6 M), a specific inhibitor of p38 MAPK. These results suggest that caveolin-1 protein plays an important role in the internalization of albumin in podocytes. In addition, albumin induces apoptosis by activating the reticulum stress in these cells, mainly through the PKC / p38MAPK / caspase-12 pathway.

Os receptores toll-like (TLR) reconhecem agentes invasores ou moléculas indicativas de injúria tecidual. Neutrófilos expressam a maioria dos receptores TLR e quando ativados desencadeiam a produção de citocinas e inicia-se o processo inflamatório. A ativação da via de TLR4 promove um aumento do estresse de retículo endoplasmático devido a alta demanda na produção de proteínas, principalmente citocinas e quimiocinas. O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta neutrofílica ao LPS e a interação das vias de TLR4 e UPR frente a duas condições: a obesidade e o diabetes tipo 2 (GK). Wistar alimentados com dieta hiperlipídica apresentaram um quadro de obesidade com diminuição da sensibilidade a insulina, enquanto animais GK apresentaram todo o fenótipo diabético tipo 2. Neutrófilos de animais GK e HFD produziram menos citocinas e migraram menos para o sítio de inflamação por mecanismos distintos. Por fim, neutrófilos dos grupos GK e HFD mostraram-se resistentes ao LPS por deficiência na via do TLR4. / Toll-like receptors (TLRs) recognize invading agents or molecules indicative of tissue injury. Neutrophils express most TLR receptors and when activated trigger the production of cytokines and initiate the inflammatory process. Activation of the TLR4 pathway promotes an increase in endoplasmic reticulum stress due to high demand in the production of proteins, mainly cytokines and chemokines. The aim of this study was to evaluate the neutrophilic response to LPS and the interaction of the TLR4 and UPR pathways in two different conditions: obesity and type 2 diabetes (GK). HFD fed Wistar rats had a decrease in insulin sensitivity, whereas GK animals had the full type 2 diabetic phenotype. Neutrophils from GK and HFD produced lower cytokines and migrated less to the site of inflammation by different mechanisms. Finally, neutrophils from the GK and HFD groups were resistant to LPS because of deficiency in the TLR4 pathway.