Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Co-orientadora : Profa.Drª. Clarissa Cavarsan / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 29/10/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia celular / Resumo: A Doença de Parkinson (DP) é uma patologia neurodegenerativa, caracterizada pela morte progressiva dos neurônios dopaminérgicos da Substância Nigra pars compacta (SNpc), encontrando-se manifestações clinicas como tremor de repouso, rigidez e bradicinesia. Além da morte de neurônios dopaminérgicos, as alterações mais características da DP são presença de inclusões citoplasmáticas denominadas corpos de Lewy (formados principalmente por filamentos de proteínas como ?-sinucleína), reclutamento e ativação de micróglia e astróglia na SNpc e o subsequente desenvolvimento de um processo inflamatório. Por outro lado, o estresse de retículo endoplasmático (RE) apresenta um importante papel na progressão das doenças neurodegenerativas. No entanto, ainda não foi esclarecido se o estresse é uma causa ou uma consequência na gênese das enfermidades neurodegenerativas. No presente trabalho foi avaliado o papel do estresse de RE como único estímulo inicial na geração de um fenótipo Parkinsoniano, comparado com um modelo já estabelecido (6-OHDA) para o estudo da DP. Em nosso modelo animal para o estudo de Parkinson, a lesão gerada na SNpc é exclusivamente pelo efeito do estresse de RE. Após 7 dias de gerada a lesão, os animais injetados com Tunicamicina e 6-OHDA apresentaram aumento de marcadores prototípicos para avaliar estresse de RE, aumento na quantidade de células gliais ativadas, e morte celular inespecífica no sítio da lesão. Essas mudanças foram acompanhadas por um aumento na expressão de marcadores associados à ativação microglial e começo de um processo inflamatório. Por outro lado, não foram observadas diferenças nos níveis de sobrevida de neurônios dopaminérgicos, assim como nos níveis da síntese de TH. No entanto, conseguiu se observar diferenças no comportamento locomotor nos animais injetados com Tunicamicina e 6-OHDA. Todos esses dados sugerem que o estresse de RE poderia apresentar um papel muito importante no desencadeamento da DP. / Abstract: Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive death of dopaminergic neurons of Substance Nigra pars compacta, usualy are found clinical manifestations such as resting tremor, rigidity and bradykinesia. Besides the death of dopaminergic neurons, the changes most characteristic of PD are the presence of cytoplasmic inclusions called Lewy bodies (mainly formed by filament proteins as ?-synuclein), of microglia and astroglia recruitment in the SNpc and the subsequent development of an inflammatory process . On the other hand, the endoplasmic reticulum stress (ER-stress) has an important role in the progression of neurodegenerative diseases. However, it remains unclear whether ER-stress is cause or consequence in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. In this study we evaluated the role of ER stress as single stimulus in the generation of a Parkinsonian phenotype, compared to a model already established (6-OHDA) for the study of PD. In our animal model for the study of Parkinson's disease, the lesion is generated in the SNpc exclusively by the effect of ER-stress. Generated 7 days after injury, the animals injected with 6-OHDA and Tunicamycin exhibited increased prototypic marker to assess stress RE, increased in the amount of activated glial cells and nonspecific cell death at the site of injury. These changes were accompanied by an increase in microglial activation and early markers of an inflammatory process. Furthermore, no differences in the levels of survival of dopaminergic neurons in the levels of TH synthesis was observed. However, were able to observe differences in locomotor behavior in animals injected with 6-OHDA and Tunicamycin. All these data suggest that ER stress could present a very important role in the onset of PD.

A neurodegeneração é o resultado da destruição progressiva e irreversível dos neurônios no sistema nervoso central, apresentando causas desconhecidas e mecanismos patológicos não totalmente elucidados. Fatores como a idade, o aumento da formação de radicais livres e/ou estresse oxidativo, defeito no metabolismo energético, a inflamação e acúmulo de elementos neurotóxicos e de proteínas malformadas no lúmen do retículo endoplasmático (RE) contribuem para o desenvolvimento dos processos neurodegenerativos. O sistema canabinoide tem sido proposto como neuroprotetor em diversos modelos de neurodegeneração como hipóxia aguda e epilepsia, isquemia cerebral, lesão cerebral e modelos de estresse oxidativo. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar o papel do sistema canabinoide em uma linhagem de neuroblastoma (Neuro 2a) submetida a condições de estresse oxidativo (H2O2), inflamação (LPS) e estresse do RE (tunicamicina), avaliando parâmetros de viabilidade celular e vias de sinalização envolvidas. Nossos resultados mostram que o agonista canabinoide ACEA foi capaz de proteger as células da morte celular causada pela inflamação e pelo estresse de retículo endoplasmático, mas não pelo estresse oxidativo. Esse efeito neuroprotetor exercido pelo ACEA parece pelo menos em parte ocorrer via receptor CB1 no modelo de inflamação e ser independente deste receptor no modelo de estresse de RE. Os efeitos neuroprotetores observados envolveram a modulação dos níveis de proteínas pré-apoptóticas, CHOP e Caspase 12, e da proteína relacionada à sobrevivência celular ERK 1/2. Nossos dados sugerem um papel neuroprotetor do sistema canabinoide em mecanismos relacionados aos processos neurodegenerativos e propõem a manipulação desse sistema como possível alvo terapêutico. / Neurodegeneration is the result of progressive and irreversible destruction of neurons in the central nervous system, with unknown causes and pathological mechanisms not fully elucidated. Factors such as age, increased formation of free radicals and/or oxidative stress, defects in energetic metabolism, inflammation and accumulation of neurotoxic factors and misfolded proteins in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) contribute to the development of neurodegenerative processes. The cannabinoid system has been proposed as neuroprotector in several models of neurodegeneration such as acute hypoxia and epilepsy, cerebral ischaemia, brain injury and oxidative stress models. This work aimed to investigate the role of the cannabinoid system in a neuroblastoma line (Neuro 2a) submitted to oxidative stress (H2O2), inflammation (LPS) and ER stress (tunicamycin) conditions, assessing cell viability parameters and signaling pathways involved. Our results show that the ACEA cannabinoid agonist was able to protect cells from cell death caused by inflammation and ER stress, but not from oxidative stress. This neuroprotective effect exerted by ACEA appears to occur at least in part via the CB1 receptor in inflammation model and it seems to be independent of this receptor in the ER stress model. The neuroprotective effects observed involved the modulation of the levels of pre-apoptotic proteins CHOP and Caspase 12 and the cell survival related protein ERK 1/2. Our data suggest a neuroprotective role of the cannabinoid system in mechanisms related to neurodegenerative processes and propose it as possible therapeutic target.

O retículo endoplasmático (RE) vem ganhando evidência quando se trata de morte celular. O acúmulo de proteínas mal formadas inicia a ativação da Unfolded Protein Response (UPR), com a finalidade de manter a homeostasia do RE. Porém, quando o estímulo do estresse perdura por muito tempo e não é resolvido, a UPR pode ativar genes que conduzem à morte celular. Hiperglicemia, presente no diabetes mellitus, induz estresse de RE em vários tipos celulares. Assim, este estudo teve como objetivo investigar o possível envolvimento do estresse do retículo no processo de morte celular em neutrófilos de ratos diabéticos. Nosso estudo revelou que os neutrófilos de ratos diabéticos quando estimulados com PMA apresentam uma maior suscetibilidade à morte devido à ativação de IRE1a e subsequente fosforilação de JNK, redução na interação mitocôndria-RE na MAM e aumento da atividade da caspase-3. Dentre os resultados apresentados, neutrófilos provenientes de animais controle parecem estar protegidos do estresse de RE por apresentar maior expressão de GRP78 e das proteínas da MAM. / Endoplasmic reticulum (ER) has been gaining evidence when it comes to cell death. The accumulation of unfolded proteins initiates the activation of the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR may resolve the ER stress by upregulating genes responsible to maintain the ER homeostasis; or it can activate genes that lead to the cell death when the ER disbalance is not solved. Hyperglycemia, one of many symptoms observed is Diabetes, may cause ER stress in various types of cells. Thus, this study aims to investigate the possible involvement of the ER stress in the process of cell death in neutrophils from diabetic rats. In summary, our study found that neutrophils from diabetic rats when stimulated with PMA exhibit greater susceptibility to death due to activation of IRE1a and subsequent phosphorylation of JNK, reduced safety in mitochondria-ER interaction in the MAM compartment and increased caspase-3 activation. Control group seems to be protect against the ER stress by ROS production by higher expression of GRP78 and MAM proteins.

Recentemente, verificou-se que diferentes protocolos de overtraining (OT) com mesma carga externa, mas realizados em declive (OTR/down), aclive (OTR/up) e sem inclinação (OTR) levaram ao acúmulo de gordura hepática. Sabe-se que perturbando a homeostase do retículo endoplasmático (ER) ocorre o estresse do RE que também está associada com presença de gordura hepática em modelos animais. Com isso, verificamos os efeitos desses modelos de OT nas proteinas relacionadas ao estresse do RE (BiP, IRE1, PERK, eIF2alpha, ATF6beta, and GRP94), apoptose (CHOP, Caspase-3, 4 and 12, Bax and TRAF2) e inflamação (SAPKJNK and IKK) no fígado de camundongos C57BL/6. Uma vez que o treinamento aeróbio pode diminuir o estresse do RE cardíaco e aumentar a capacidade do exercício, também verificou se a queda de desempenho induzida pelos protocolos de OT estaria relacionada com o estresse do RE e apoptose no coração dos animais. Os animais foram divididos em naive (N, animais sedentários), controle (CT, animais sedentários submetidos as avaliações de desempenho), treinado (TR), OTR/down, OTR/up and OTR. Os testes de rotarod, incremental, exaustivo e força de preensão foram usados para avaliar o desempenho. Trinta e seis horas após o teste de força de preensão, os fígados e corações (ventrículo esquerdo) foram removidos e usados para técnica de immunoblotting. Todos os protocolos de OT levaram a respostas similares em relação aos parâmetros de desempenho e mostraram valores significativamente menores de ATF6beta hepática quando comparados com o grupo N. O grupo OTR/down exibiu valores inferiores de caspase-3 clivada no fígado quando comparado com o grupo CT. As proteínas cardíacas relacionadas ao estresse do RE, apoptose e inflamação não foram moduladas nos grupos experimentais. / Newly, we verified that different running overtraining (OT) protocols with same external load but performed in downhill (OTR/down), uphill (OTR/up) and without inclination (OTR), directed to hepatic fat accumulation. Knowing the disruption of endoplasmic reticulum (ER) homeostasis is linked to animal models of fatty liver, we explored the effects of these OT models on the proteins related to ER stress (i.e., BiP, IRE1, PERK, eIF2alpha, ATF6beta, and GRP94), apoptosis (CHOP, Caspase-3, 4 and 12, Bax and TRAF2) and inflammation (SAPKJNK and IKK) in livers of C57BL/6 mice. Because aerobic training can diminish cardiac ER stress and increase exercise capacity, we also verified whether the performance decrease induced by our OT protocols is linked to ER stress and apoptosis in mouse hearts. Rodents were divided into naive (N. sedentary mice), control (CT, sedentary mice submitted to the performance evaluations), trained (TR), OTR/down, OTR/up and OTR groups. Rotarod, incremental load, exhaustive and grip force tests were used to estimate performance. Thirteen six hours after the grip force test, the livers and cardiac muscles (i.e., left ventricle) were removed and used for immunoblotting. All OT protocols led to similar responses of the performance parameters and showed significantly lower values of hepatic ATF6beta compared to the N group. The OTR/down group exhibited inferior values of liver cleaved caspase-3 compared to the CT group. The cardiac proteins related to ER stress and apoptosis were not modulated in the experimental groups.

A lesão de isquemia e reperfusão (IRI) continua a ser um problema clínico e o estresse do retículo endoplasmático (ERS) parece ser um importante mediador desse processo. A presença da heme oxigenase-1 (HO-1) ou do monóxido de carbono (CO), parece proteger da IRI. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar a papel da HO-1 e CO na IRI renal. A indução da HO-1 em camundongos promoveu uma proteção na IRI renal, com melhora da função renal, menos inflamação e atenuação do ERS. Ao avaliarmos o papel do CO, verificamos que há também uma proteção, mediada por p38, vias purinérgicas, estabilização de HIF-1a e eritropoietina. Há ainda uma melhora do metabolismo energético celular após o tratamento com CO. Enfim, podemos concluir que, na presença da HO-1 ou do CO, há uma melhora da lesão isquêmica, através de uma maior ativação de vias citoprotetoras, com atenuação do ERS, redução da inflamação e consequente melhora da função renal. / Ischemia-reperfusion injury (IRI) remains a clinical problem and endoplasmic reticulum stress (ERS) seems to be an important mediator of this process. The presence of heme oxygenase-1 (HO-1) or carbon monoxide (CO) appears to protect from IRI. The aim of our study was to evaluate the role of HO-1 and CO in renal IRI. The induction of HO-1 in mice promoted protection in renal IRI with improved renal function, less inflammation and attenuation of ERS. When evaluating the role of CO, we found that there is also a protection mediated by p38, purinergic signaling, HIF-1a stabilization and erythropoietin. There is still an improvement of cellular energy metabolism after treatment with CO. Finally, we conclude that, in the presence of HO-1 or CO, there is an improvement of the ischemic lesion, through greater activation of cytoprotective pathways, with reduced ERS, reducing inflammation and consequent improvement in renal function.

Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:02:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramalho_VanessaDomingues_D.pdf: 1441004 bytes, checksum: a45d3f4f8825288e2959115ef25fc13a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A agamaglobulinemia ligada ao X (XLA; OMIM#300755) é caracterizada por um bloqueio na diferenciação dos linfócitos B na medula óssea, levando à profunda hipogamaglobulinemia e reduzido número ou ausência de linfócitos B periféricos. Os pacientes são susceptíveis a infecções recorrentes por bactérias encapsuladas e enterovírus. XLA é causada por mutações no gene da tirosina quinase de Bruton (BTK). Contudo, não há estudos de relação entre expressão protéica e o tipo de mutação, nem sobre as conseqüências da retenção intracelular do excesso de proteínas mal formadas. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão de BTK e sua relação com o tipo de mutação em pacientes com XLA, assim como verificar suas conseqüências nos sensores de estresse do retículo endoplasmático. O diagnóstico de XLA foi baseado em infecções recorrentes, níveis significativamente reduzidos de IgM, IgG e IgA, linfócitos B circulantes <2% e mutação identificada no gene BTK. A expressão dos transcritos de BTK foi avaliada por PCR quantitativo em tempo real em oito pacientes XLA e oito controles. Pela mesma técnica, foi avaliada a expressão de 10 genes do estresse do retículo endoplasmático em seis pacientes e seis controles. Foram caracterizadas quatro mutações missense, uma mutação nonsense, dois frameshifts e um defeito em sítio de splicing. As mutações do tipo nonsense, frameshift e defeito em sítio de splicing levaram à formação de stop codon prematuro. Foi detectado um perfil de expressão de BTK diferenciado nos pacientes com mutações com stop codon prematuro em comparação aos pacientes com mutações missense e controles saudáveis. Especificamente, os pacientes com mutações com stop codon prematuro apresentaram redução da expressão de BTK (P = 0,004). No entanto, verificamos que as mutações missense não afetaram a expressão de BTK. Por meio de imunocitoquímica, encontramos que as mutações com stop codon prematuro levaram à deficiência da expressão da proteína BTK e as do tipo missense resultaram na localização anormal da proteína no citoplasma celular, o que evidencia a síntese de proteína não funcional. Os pacientes com XLA apresentaram expressão aumentada do marcador de estresse do retículo endoplasmático XBP1 (P = 0,002). Em conclusão, a quantificação da expressão de mRNA para BTK é uma ferramenta para diferenciar as conseqüências mutacionais em pacientes com XLA. Ela também pode contribuir para o estudo de transcritos em outras doenças genéticas com diferentes tipos de mutação. Este é o primeiro relato de estresse do retículo endoplasmático na agamaglobulinemia ligada ao X / Abstract: X-linked agammaglobulinemia (XLA, OMIM # 300755) is characterized by a block in differentiation of B lymphocytes in the bone marrow, leading to profound hypogammaglobulinemia and few or no peripheral B lymphocytes. Patients are susceptible to recurrent infections by encapsulated bacteria and enteroviruses. XLA is caused by mutations in the Bruton tyrosine kinase gene (BTK). However, there have been no studies on the relationship between protein expression and the type of mutation, nor on the consequences of the disruption of protein folding that results in intracellular retention. The objectives of this study were to evaluate BTK expression and its mutation type in patients with XLA, as well as to verify their consequences on the endoplasmic reticulum stress sensors. The XLA diagnosis was based on recurrent infections, significantly reduced levels of IgM, IgG and IgA, circulating B lymphocytes <2% and BTK gene mutation identified. The expression of BTK transcripts was assessed by quantitative real-time PCR in eight XLA patients and eight control subjects. By the same technique, the expression of 10 endoplasmic reticulum stress genes was measured in six patients and six controls. Four missense mutations, one nonsense mutation, two frameshifts and a splice site defect were characterized. Mutations of the nonsense type, frameshift and splice site defect led to a premature stop codon formation. A differential profile of expression of BTK was detected in patients with mutations that led to a premature stop codon compared to patients with missense mutations and healthy controls. Specifically, patients with mutations resulting in a premature stop codon exhibited reduced expression of BTK gene (P = 0.004). However, it was found that missense mutations did not affect BTK expression. By immunocytochemistry, we found that mutations with a premature stop codon impaired expression of BTK protein and that missense mutations led to an abnormal localization of the protein in the cell cytoplasm, showing the synthesis of a non-functional protein. Patients with XLA showed increased expression of the endoplasmic reticulum stress marker XBP1 (P = 0.002). In conclusion, the quantification of mRNA expression for BTK is a tool to differentiate mutational consequences in patients with XLA. It can also contribute to the study of transcripts in other genetic diseases with different types of mutation. This is the first report on endoplasmic reticulum stress in X-linked agammaglobulinemia / Doutorado / Saude da Criança e do Adolescente / Doutora em Ciências

Orientador: Patrícia de Oliveira Prada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas / Made available in DSpace on 2018-08-23T21:18:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castro_Giselede_M.pdf: 1355339 bytes, checksum: 9e121a8d79b7d1be25b7e55dcea89b10 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A obesidade é uma doença caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura corporal, acarretando diversas alterações metabólicas. Estas alterações influenciam o controle do balanço energético. O hipotálamo é considerado o órgão chave para o controle do balanço energético. Recebe informações da periferia por meio de nutrientes, sinais neurais e hormônios. Dentre estes hormônios, a insulina participa do controle da ingestão alimentar, tendo efeitos anorexigênicos. Esta regulação ocorre pela ativação de sua via de sinalização IR/PI3q/Akt. Em animais obesos ocorre uma menor ativação desta via como consequência ao estresse do retículo endoplasmático e ativação de proteínas da via inflamatória. No presente estudo destacamos a amígdala como uma importante região do sistema nervoso central envolvida na regulação da ingestão alimentar em resposta à insulina. Essa regulação foi dependente da ativação da via PI3q, pois a injeção de LY aboliu os efeitos da insulina no controle da ingestão. A insulina diminuiu os níveis de RNAm do neuropeptídeo orexigênico NPY e aumentou os níveis do RNAm do neuropeptídeo anorexigênico ocitocina na amígdala de animais controles via PI3q, o que pode ter contribuído para a hipofagia. Além disso, em animais obesos não houve redução na ingestão alimentar em resposta a insulina e a fosforilação da Akt foi diminuída na amígdala, sugerindo resistência à insulina nessa região do sistema nervoso central. A resistência à insulina foi associada com o estresse do retículo endoplasmático e inflamação na região da amígdala. A inibição do estresse do retículo endoplasmático com PBA (ácido fenil butírico), inibidor do estresse de retículo, reverteu a ação e sinalização da insulina, diminuindo a expressão do RNAm do NPY e aumentando a expressão do RNAm da ocitocina na amígdala de animais obesos. Em conjunto, os resultados sugerem que a amígdala é sensível a ação anorexigênica da insulina, sendo este efeito dependente da via PI3q. A ação da insulina na amígdala provavelmente modula a ingestão por alterar os níveis de neuropeptídeos como NPY e ocitocina. Animais obesos apresentam resistência à ação e sinalização da insulina em amígdala. O mecanismo molecular pelo qual ocorre resistência à insulina parece estar relacionado à ativação da via inflamatória e ao estresse de retículo endoplasmático / Abstract: Insulin acts in hypothalamus decreasing food intake (FI) by IR/PI3K/Akt pathway. This pathway is impaired in obese animals and endoplasmic reticulum (ER) stress and low grade inflammation are possible mechanisms involved in this impairment. Here, we highlighted amygdala as an important brain site of FI regulation in response to insulin. This regulation was dependent on PI3K/AKT pathway similar to the hypothalamus. Insulin was able to decrease NPY and increase oxytocin mRNA levels in the amygdala via PI3K, which may contribute to hypophagia. Additionally, obese rats did not reduce FI in response to insulin and AKT phosphorylation was decreased in the amygdala, suggesting insulin resistance. Insulin resistance was associated with ER stress and low grade inflammation in this brain region. The inhibition of ER stress with PBA reverses insulin action/signaling, decreases NPY and increases oxytocin mRNA levels in the amygdala from obese rats, suggesting that ER stress is probably one of the mechanisms that induce insulin resistance in the amygdala / Mestrado / Metabolismo e Biologia Molecular / Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

Orientador: Patrícia de Oliveira Prada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T18:26:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Areias_MariaFernandaCondes_D.pdf: 914463 bytes, checksum: a03d2c15dfaa827247604af7078cc199 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A insulina tem efeitos anorexigênicos, reduzindo o peso corporal. Entretanto, a maior parte dos estudos teve como foco a ação e sinalização de insulina no hipotálamo. Assim, o primeiro objetivo do trabalho foi investigar a expressão e grau de fosforilação das proteínas da via de sinalização de insulina (IR/Akt), assim como a modulação da ingestão alimentar após estímulo com insulina na região da amígdala em animais controles. No segundo objetivo, investigamos se o bloqueio farmacológico da via da insulina com LY24002 na amígdala alterou a ingestão alimentar em resposta à insulina. O consumo de dieta hiperlipídica tem sido associado à resistência à insulina no hipotálamo. Assim, o terceiro objetivo foi investigar se a obesidade induz resistência à insulina nessa região e em adição investigar se a via inflamatória IKK/NFkB e o ER stress estavam alterados em amígdala de animais obesos. Obervou-se que após a injeção de insulina na amígdala, não houve diferença no peso corpóreo após 24 horas em animais controles. Em relação à ingestão alimentar, quatro horas após a injeção de insulina na amígdala, não houve diferença, entretanto, após 8, 12 e 24 horas houve uma diminuição na ingestão alimentar em animais controles. Após o bloqueio da PI3q com o inibidor farmacológico LY (240002), trinta minutos antes da injeção de insulina, observou se que a insulina não foi capaz de reduzir a ingestão alimentar. Verificou-se, após a injeção de insulina na região da amígdala, um aumento da fosforilação do receptor de insulina (IR) e da AKT em animais controles. Para confirmação da dissecção da amígdala, testou-se a expressão protéica FKBP5, que é expressa especificamente na região da amígdala. Os animais foram submetidos à dieta hiperlipídica e padrão por 3 meses e realizou-se um ITT (Teste Tolerância Insulina) para verificar a resistência à insulina dos animais. Observou-se que os animais obesos ficaram resistentes à insulina. Em relação ao peso corpóreo, houve um aumento de peso entre os obesos. Já em relação à ingestão alimentar, não houve diferença na ingestão após 4, 8, 12 e 24 horas entre os animais obesos. Após a injeção de insulina na região da amígdala, não se observou diferença na fosforilação da AKT de animais obesos quando comparada ao controle. Observou-se um aumento da fosforilação da JNK, da IKK alfa e beta, além da PERK e IRE1 no grupo submetido à dieta hiperlipídica quando comparada ao controle. Sendo assim, concluí-se que: o controle da ingestão alimentar é realizado, pelo menos em parte, pela ação da insulina na amígdala; e que o efeito da insulina na amígdala é via IR/PI3q/Akt. Os animais obesos apresentam resistência à ação da insulina na amígdala e esta é associada à redução da ativação da via IR/Akt. Acredita-se também que a dieta hiperlipídica aumenta a ativação, na amígdala, de serinas quinases que participam da via inflamatória e do stress do retículo endoplasmático, o que pode justificar a resistência à insulina / Abstract: Insulin has anorexigenic effects, reducing body weight. However most part of the studies has focused on hypothalamic insulin signaling. Thus the aim of the study was too investigated if insulin activates IR/Akt pathway in the amygdale and if this activation controls feeding. Besides this, it was investigated if the inhibition of PI3K by LY294002 alters food intake. In obese animals models insulin induces IR/PI3K/Akt pathway is impaired in the hypothalamus. Low grade inflammation characterized at cellular level by an activation of IKK/IKB/NF-KB pathway and JNK activation, and also induce of endoplasmatic reticulum (ER) stress are molecular mechanisms involved in insulin resistance in the hypothalamus of obese roedents. So, it was investigated if high fat diet impairs insulin signaling and action in the amygdale and if low grade inflammation and ER stress were present in this brain region. Food intake is decreased and IR and Akt phosphorylation were increased in response to insulin in the amygdale of control rats. In order to confirm whether the dissections of amygdale were corrected, the membranes with anti-co-chaperone FK506 binding protein 51 (FKBP5) antibody were re-blotted. FKBP51 is expressed in the amygdale region but not in striatum. It was observed the presence of FKBP5 in their membranes, indicating that the dissections of amygdale were appropriated. The administration of LY prior to insulin in the amygdale abolished this effect and also impaired Akt not IR phosphorylation in response to insulin. Body weight was increased in rats fed with HFD compared to control rats. Insulin tolerance test showed that obese rats were insulin resistant in comparison to control rats. Insulin injected in the amygdale did not decrease food intake after 4, 8, 12, 24 h. The IR and Akt phosphorylation were blunted in rats on HFD. The IKK and JNK phosphorylation were also increased in the amygdale of obese rats. In order to evaluate ER stress, it was investigated whether high fat feeding alters the protein expression of RNA-activated protein kinase-like ER resident kinase (PERK) and inositol-requiring kinase (IRE1). PERK and IRE1 protein expression were increased in the amygdale of rats fed a HFD compared to control rats, suggesting increased ER stress in the amygdale of obese rats Summing up, it was suggested that amygdale is an important region for food intake regulation in response to insulin and this regulation is disrupted in obese rats. It was also shown that food intake is regulated in a PI3K/Akt manner in the amygdale similarly to what occurs in the hypothalamus. Besides, data were provided suggesting that obese rats may have low grade inflammation and ER stress in parallel to insulin resistance in the amygdale / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Ciências

Orientador: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Resumo: Embora estágios iniciais de embriões de mamíferos tenham aparentemente uma grande plasticidade, eles, assim como o oócito em maturação, são bastante sensíveis a estresses exógenos. Responder a esses estresses é uma parte vital da fisiologia celular. Cada vez mais é aparente que um dos principais mecanismos, para iniciar a resposta celular a uma variedade de estressores exógenos, reside no retículo endoplasmático (RE). O RE é uma importante organela responsável pela síntese, processamento e transporte de proteínas e lipídeos. No entanto e in vitro, a perturbação do microambiente do RE pode causar alterações na estrutura das proteínas levando ao acúmulo de proteínas com o incorreto dobramento, uma condição denominada estresse do RE. Dependendo da intensidade do estresse, o RE pode desencadear a apoptose pela Unfolded Protein Response. Em várias espécies, estudos observaram uma melhoria da competência do oócito e no desenvolvimento do embrião quando foram adicionados inibidores do estresse do RE no meio de maturação e/ou meio de cultivo in vitro (CIV). Dentre os inibidores do estresse do RE, o ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) se mostrou benéfico na produção in vitro de embriões. Entretanto, pouco é conhecido sobre o seu efeito na maturação oocitária e no desenvolvimento do embrião bovino in vitro. Portanto, os objetivos gerais desta Tese foram: Capítulo 1 - investigar o efeito da adição de TUDCA durante a maturação in vitro (MIV) sobre a competência do oócito e do embrião [ma... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Although early stages of mammalian embryos appear to retain great plasticity, they and maturing oocytes are quite sensitive to exogenous stresses. Responding to those stresses is a vital part of cellular physiology, and it is increasingly apparent that one of the main mechanisms for initiating that response is based on the endoplasmic reticulum (ER). ER is an important organelle responsible for the synthesis, processing, folding and transport of proteins and lipids. However, in vitro, the disturbance of the ER microenvironment can cause changes in the structure and folding of proteins leading to the accumulation of misfolding proteins, a condition called ER stress. Depending on the intensity of the stress, the ER can trigger apoptosis by Unfolded Protein Response. In several species, studies have reported an improvement in oocyte and embryo competence when ER stress inhibitors have been added to the in vitro maturation (IVM) medium and/or in vitro culture (IVC) medium. Among the ER stress inhibitors, tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) has been shown to be beneficial in in vitro embryo production. However, little is known about TUDCA’s effect on oocyte maturation and the development of bovine embryo in vitro. Therefore, the main objectives of this Thesis were: Chapter 1 - to investigate the effect of adding different TUDCA concentrations during IVM on the oocyte and embryo competence [nuclear maturation, mitochondrial activity, reactive oxygen species (ROS) production, pronucle... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

[EN] Heart failure is a multifactorial syndrome characterized by alterations in ventricular function and cardiac chambers dilation, being a cause of increase of morbidity, mortality and health costs. Dilated and ischemic cardiomyopathies are frequent causes of this syndrome. Despite the progress in treatment of heart failure, the prognosis has not improved significantly in the last years, because of that, we need a development of novel treatment strategies, given the limited efficacy of current therapies. This syndrome can be associated to alterations in heart contraction. Endoplasmic reticulum is the major intracellular calcium storage necessary for heart contraction onset. On the other hand, ion channels regulate heart contraction and are responsible for the ion currents that determine and influence the action potential of heart muscle. In this Thesis we aimed to study, in a group of patients with heart failure, the changes existing in the structural and stress response proteins of the endoplasmic reticulum, as well as the gene expression of cardiac ion channels, relating these alterations with ventricular dysfunction of these patients. Our results showed the presence of alterations in the majority of structural and stress proteins of the endoplasmic reticulum, being the structural protein RRBP1 related to ventricular dysfunction and also to the stress protein XBP1. This evidences a specific dependency between stress and structure in this organelle and an influence of structural changes in ventricular function of patients. Additionally, we showed different expression changes of a large number of cardiac ion channels through microarrays and RNA sequencing techniques. Of these channels, down-regulation of CACNG8 related to ventricular function improvement and increased levels of KCNJ2 and KCNN3 with ventricular dysfunction in dilated cardiomyopathy. In ischemic cardiomyopathy, reduced levels of TRPM7 channel were related to a better ventricular function. Differential gene expression of this category in both cardiomyopathies, could explain the changes in the different ion currents that affect the myocardial contraction process in heart failure. In conclusion, we show alterations in the expression of two key components of cardiac muscle contraction that could provide novel basis for their study and regulation as possible therapeutic targets for the improvement of cardiac contractility in patients with heart failure. / [ES] La insuficiencia cardíaca es un síndrome multifactorial que se acompaña de alteraciones en la función ventricular y dilatación de las cámaras cardíacas, siendo causa de aumento de morbilidad, mortalidad y gasto sanitario. Las miocardiopatías dilatada e isquémica son causas muy frecuentes de este síndrome. A pesar de los avances que se han producido en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, el pronóstico no ha mejorado significativamente en los últimos años. Es por ello, que existe una necesidad de desarrollar nuevas estrategias para su tratamiento, dada la eficacia limitada de las terapias actuales. Este síndrome puede estar asociado a alteraciones en la contracción del corazón. El retículo endoplásmico es el principal almacén de calcio intracelular necesario para el inicio del proceso de contracción del corazón. Por otro lado, los canales iónicos regulan la contracción del músculo cardíaco y son responsables de las corrientes de iones que determinan e influyen sobre el potencial de acción cardíaco. En esta Tesis nos planteamos estudiar, en un grupo de pacientes con insuficiencia cardíaca, los cambios existentes en las proteínas que conforman la estructura y participan en la respuesta a estrés del retículo endoplásmico, así como analizar la expresión génica de canales iónicos cardíacos y relacionar estas alteraciones con la disfunción ventricular de estos pacientes. Nuestros resultados muestran la presencia de alteraciones en la mayoría de proteínas estructurales y de respuesta a estrés del retículo endoplásmico, siendo RRBP1 la que presenta relaciones significativas con la disfunción cardíaca de los pacientes y también con la proteína de estrés XBP1. Ello evidencia una dependencia específica entre estructura y estrés de este orgánulo y una influencia de estas alteraciones estructurales sobre la función ventricular de los pacientes. Además, mostramos diferentes cambios de expresión en un gran número de canales iónicos cardíacos mediante microarrays y secuenciación de ARN. De estos canales, en la miocardiopatía dilatada encontramos que los niveles reducidos de CACNG8 se relacionan con una mejora en la función y los niveles aumentados de KCNJ2 y KCNN3 se relacionan con una mayor disfunción ventricular. En el caso de estas alteraciones en la miocardiopatía isquémica, los niveles reducidos del canal TRPM7 favorecen una mejora de la función del ventrículo izquierdo. La expresión génica diferencial de esta categoría en ambas miocardiopatías, podría explicar las alteraciones en las diferentes corrientes iónicas que afectan al proceso de contracción del miocardio en la insuficiencia cardíaca. En conclusión, demostramos la presencia de alteraciones en dos componentes clave para la contracción del miocardio que pueden proporcionar nuevas bases para su estudio y regulación como diana de posibles tratamientos para la mejora de la alteración en la contractilidad del corazón en pacientes con insuficiencia cardíaca. / [CA] La insuficiència cardíaca és una síndrome multifactorial que s'acompanya d'alteracions en la funció ventricular i dilatació de les cambres cardíaques, a més de ser causa d'augment de morbiditat, mortalitat i cost sanitari. Les miocardiopatíes dilatada i isquèmica són causes molt freqüents d'esta síndrome. A pesar dels avanços que s'han produït en el tractament de la insuficiència cardíaca, el pronòstic no ha millorat significativament en els últims anys. És per això que hi ha una necessitat de desenvolupar noves estratègies per al seu tractament, donada l'eficàcia limitada de les teràpies actuals. Esta síndrome s'associa amb alteracions en la contracció del cor. El reticle endoplàsmic és el principal magatzem de calci intracel·lular necessari per a l'inici del procés de contracció del cor. D'altra banda, els canals iònics regulen la contracció del múscul cardíac i són responsables dels corrents d'ions que determinen i influïxen sobre el potencial d'acció cardíac. En esta Tesi ens plantegarem estudiar, en un grup de pacients amb insuficiència cardíaca, els canvis existents en les proteïnes que conformen l'estructura i participen en la resposta a estrés del reticle endoplàsmic, així com analitzar l'expressió gènica de canals iònics cardíacs i relacionar estes alteracions amb la disfunció ventricular dels pacients. Els nostres resultats mostren la presència d'alteracions en la majoria de proteïnes estructurals i de resposta a estrés del reticle endoplàsmic, sent la proteína estructural RRBP1 la que presenta relacions significatives amb la disfunció cardíaca dels pacients i també amb la proteïna d'estrés XBP1. Aixó evidencia una dependència específica entre estructura i estrés d'este orgànul i una influència d'estes alteracions estructurals sobre la funció ventricular dels pacients. A més, mostrem diferents canvis d'expressió en un gran nombre de canals iònics cardíacs per mitjà de microarrays i sequenciació d'ARN. D'estos canals, trobem que els nivells reduïts de CACNG8 es relacionen amb una millora en la funció i els nivells augmentats de KCNJ2 i KCNN3 es relacionen amb una major disfunció ventricular en la miocardiopatía dilatada. En el cas d'estes alteracions en la miocardiopatía isquèmica, els nivells reduïts del canal TRPM7 afavorixen una millora de la funció del ventricle esquerre. L'expressió gènica diferencial d'esta categoria en ambdós miocardiopatíes, podria explicar les alteracions en els diferents corrents iònics que afecten el procés de contracció del miocardi en la insuficiència cardíaca. En conclusió, demostrem la presència d'alteracions en dos components clau per a la contracció del miocardi que poden proporcionar noves bases per al seu estudi i regulació com a diana de possibles tractaments per a la millora de l'alteració en la contractilitat del cor en pacients amb insuficiència cardíaca. / Ortega Gutiérrez, A. (2016). Bases genómicas y celulares de la contracción ventricular. Papel del retículo endoplásmico y los canales iónicos en la insuficiencia cardiaca humana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/68491 / TESIS