As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition

Objetivos: Avaliar a estatura final, mineralização e marcadores de mineralização óssea de adultos com síndrome nefrótica (SN) idiopática corticossensível na infância e adolescência e analisar a influência da doença, suas comorbidades e do alvo de estatura no crescimento e mineralização destes pacientes. Casuística: Avaliamos a estatura final de 60 pacientes (41 masculinos e 19 femininos) com idade mínima de dezenove anos ou desenvolvimento genital P4G4 nos masculinos e menarca nos femininos portadores de SN corticossensível na infância e adolescência. Realizamos a densitometria óssea (DMO=g/cm2) em 26 destes pacientes e em 35 controles, com análise concomitante dos níveis séricos de 25 OH vitamina D3 (25(OH)D), Paratormônio (PTH), telopéptido carboxiterminal do colágeno tipo 1( (CTx), Propeptídeo Aminoterminal do Colágeno Tipo I (P1NP) e Osteocalcina (OC) Resultados: A idade média inicial dos 60 pacientes foi de 5a3m e final de 20a5m, com acompanhamento médio de 15a2m. A dose média de prednisona utilizada foi de 1264 mg/kg. O Zscore médio da estatura inicial (-0,60; SD: 1,0) e final (0,64; SD: 0,92), não diferiu significativamente (Teste T: p=0,72) entre si. O Zscore estatura na idade adulta se correlacionou significativamente apenas com o Zscore estatura inicial e com o Zscore alvo de estatura. Seis pacientes atingiram Zscore estatura < -2 na idade adulta e este achado demonstrou forte correlação com o Zscore estatura inicial e com o Zscore alvo de estatura. A DMO e Zscore DMO de L1L4, Cabeça do fêmur e do Fêmur total dos pacientes e controles não diferiram significativamente. 6 pacientes e 2 controles apresentaram Zscore DMO < -2 (massa óssea reduzida) enquanto 2 pacientes e 1 controle demonstraram , Zscore DMO < -2,5 (osteoporose). Pacientes com massa óssea reduzida receberam 2189 mg/kg de prednisona durante 13 anos e aqueles com osteoporose, 2510 mg/kg durante 14 anos. Estes valores, comparados com aqueles de pacientes com massa óssea normal, mostraram significância estatística (p=0,01). Não houve correlação significativa entre as demais variáveis analisadas e a DMO. Os marcadores 25(OH)D, PTH, CTx, P1NP e OC dos pacientes e controles não diferiram significativamente. Quando analisados em relação à doença e suas comorbidades, DMO e estatura final não apresentaram significação estatística. Conclusões: 1. Os valores de Zscore estatura inicial e final se correlacionaram fortemente com o alvo de estatura. 2. Não houve associação entre as características clinicas da doença e a aquisição do alvo de estatura, neste grupo de pacientes. 3. A massa óssea e os marcadores de mineralização dos pacientes não diferiram quando comparados aos controles. 4. Os 6 pacientes com massa óssea reduzida (2 com osteoporose) utilizaram dose total e tempo de uso da prednisona significativamente maior que aqueles com massa óssea adequada 5. Não houve correlação entre os níveis séricos dos marcadores de mineralização óssea e a doença e suas comorbidades, a estatura final e a DMO dos pacientes adultos com SN na infância e adolescência / Objectives: The aim of the present study was to evaluate the final height, bone mineral density (BMD) and bone mineralization markers of adults with steroid responsive Idiopathic Nephrotic Syndrome (NS) in childhood and adolescence and to examine the influence of the disease, its co-morbidities and the patients\' target height in the final height and mineralization results. Patients and Methods: We have analyzed initial and final anthropometric data of 60 patients (41 male and 19 females) and / or their records, with a minimum age of nineteen years or fully developed pubertal status (P4G4 in males and menarche in females). BMD (g/cm2) was evaluated in 26 patients and in 35 controls, with a concomitant analysis, of serum levels of 25-OH Vitamin D (25(OH)D), Parathyroid Hormone (PTH); C-terminal telopeptide of type I collagen (CTx) and aminoterminal propeptide of type 1 procollagen (P1NP) and Osteocalcin (OC) Results: Mean age at first consultation was 5.3 years (SD: 2.4 yrs) and at last consultation was 20.4 yrs (SD: 3.0 yrs). The mean cumulative dose of prednisone was 1254 mg/kg (SD: 831.39 mg/kg). The mean initial height SDS was -0.60; (SD: 1.0) the final height SDS was -0.64; (SD: 0.92), (t-test: p=0.72). The final height SDS showed correlated significantly only with the initial height SDS and the target height SDS. Six patients achieved a final height SDS <-2 and this finding showed a strong correlation to the initial height SDS and to the target height SDS in the male patients. The patients\' and control subjects L1L4 head of the femur and the total femur BMD and BMD SDS did not differ significantly. 6 patients and 2 control subjects showed a BMD SDS <-2 (low bone mass) while 2 patients and 1 control subjects showed a BMD SDS <-2.5 (osteoporosis). Patients with BMD SDS <-2 received 2189 mg / kg of prednisone over 13 years while those with a BMD SDS <-2.5 received 2510 mg / kg prednisone for 14 years (p = 0.01 vs BMD SDS -2 ). No other studied variable correlated significantly with BMD. The studied bone biomarkers showed similar results in patients and control subjects without a significant correlation with disease activity, co-morbidities, and BMD or height parameters. Conclusion: 1. the initial and final height SDS were strongly correlated to the height target. 2. INS and its co-morbidities did not prevent the patients to reach their target height 3. The patients\' BMD and bone mineralization markers did not differ when compared to controls. 4. The 6 patients with low bone mass (2 with osteoporosis) used a total dose of prednisone for a longer period of time in relation to those with an adequate BMD 5. There was no correlation between bone mineralization markers, disease activity and its co-morbidities, final height and BMD of adult patients with INS in childhood and adolescence

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas do IGF-1 e 2 é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. Recentemente, a insensibilidade ao IGF-1 foi identificada como uma das causas de retardo de crescimento em crianças nascidas PIG que não apresentaram recuperação espontânea do crescimento na vida pós-natal. Crianças afetadas apresentavam níveis elevados de IGF-1, IGFBP-3 além de microcefalia. O papel de defeitos pósreceptor na sinalização do IGF-1 como causa de retardo de crescimento pré e pós-natal ainda não foi investigado. Objetivo: Analisar in vitro a ação do IGF-1 em fibroblastos de crianças nascidas PIG. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal, resposta insatisfatória ao tratamento com hGH apesar de níveis normais/elevados de IGF-1. Foi confirmado do ponto de vista molecular que um dos pacientes (SGA1) apresenta Síndrome de Sílver- Russell com perda da metilação do alelo paterno da região ICR1 (imprinting center region 1) importante para a expressão do IGF-2. Defeitos no gene do IGF1 e IGF1R foram afastados por sequenciamento direto. As ações do IGF- 1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da produção de IGFPB-3 em meio de cultura e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (AKT e ERK). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2 e SGA3 proliferaram respectivamente 31%, 60% e 78% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. Já a linhagem SGA4 apresentou comportamento semelhante ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, não foi observada diferença significativa na expressão do IGF1R nas diversas linhagens PIG em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Em relação á ativação da via MAPK, todas as linhagens dos pacientes PIGs apresentaram menor fosforilação ERK1/2 basal e após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles (p < 0.001) apesar do conteúdo total de ERK1/2 ser semelhante. Já em relação a ativação da via PI3K, as linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 não diferiram significantemente em relação aos fibroblastos controles quanto à ativação de AKT pelo IGF-1. O conteúdo total de AKT também foi semelhante em todas as linhagens estudadas. O estudo da expressão de IGFBP3 mostrou um aumento da expressão deste peptídeo na linhagem de fibroblastos do paciente SGA1 (14X). O conteúdo de IGFBP-3 intracelular não sofreu alteração, porém comprovamos que a linhagem SGA1 secretava 2x mais IGFBP-3 para o meio de cultura. Apesar de apresentarem estrutura, expressão e conteúdo de IGF1R normais, essas mesmas 3 linhagens celulares que apresentaram menor proliferação também apresentaram diminuição na fosforilação de ERK após tratamento com IGF-1. Mesmo sob o estímulo com desIGF-1 (um análogo do IGF-1 com baixa afinidade por IGFBPs mas que preserva sua capacidade de ativar o receptor IGF-1R) a ativação de ERK e a proliferação celular se manteve abaixo dos das linhagens controles. O estudo do conteúdo total de GRB10 foi semelhante em todas as linhagens celulares. Conclusão: Três dos 4 pacientes PIG estudados apresentaram insensibilidade pós-receptor ao IGF-1. A linhagem celular SGA1, obtida de um paciente com hipometilação do ICR1 11p15 causando SSR, demonstramos um aumento da expressão e secreção de IGFBP-3, o qual não se mostrou responsável por inibir a ação do IGF-1 nestes fibroblastos. Novos estudos devem ser desenvolvidos para identificar o defeito molecular responsável pela insensibilidade ao IGF-1 a nível pósreceptor observada nestes pacientes. / Introduction: Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of staying with short stature in adulthood. The insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factor determining fetal growth. Most of the known actions of IGFs are mediated by IGF-1R, a tyrosine kinase receptor. Recently, the IGF-1 insensitivity was identified causing growth retardation in children born SGA who who did not present spontaneous catch-up growth in postnatal life. Affected children had elevated IGF-1 and IGFBP-3 levels in addition to microcephaly. The role of post receptor defects in IGF-1 signaling on the deficit of growth is still unclear. Objective: To assess IGF-1 action and signaling in vitro in fibroblasts from SGA children. Methods: Fibroblasts cell cultures were developed from 2 controls (C1 and C2) and 4 patients with pre- and post-natal growth retardation (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4). IGF-1 insensitivity was demonstrated by severe pre and postnatal growth impairment without any evident cause, IGF1 SDS > 0 and poor growth response during high doses of hGH treatment. Three SGA patients presented microcephaly. Defects in the gene of the IGF1 and IGF1R were excluded by direct sequencing. One patient (SGA1) presents the Silver- Russell syndrome (SRS) with loss of methylation of the paternal allele in the ICR1 (imprinting center region 1) chromosome 11p15, important for IGF-2 expression. IGF-1 action was assessed by cell proliferation by colorimetric assay. IGF-1 signaling was assessed by AKT and ERK phosphorylation after IGF-1 stimulation through SDS-PAGE of intracellular extract followed by immunoblotting with specific antibodies. The expression of IGF1R and IGFBP3 gene was determined by Real-time quantitative PCR and the levels of the IGF-1R and IGBP-3 protein by direct immunoblotting. Results: The SGA1, SGA2 and SGA3 cell lines proliferated 31%, 60% and 78% less under IGF-1 stimulation in comparison of controls fibroblasts, respectively. The expression of IGF1R mRNA and the level of total amount of IGF-1R protein were similar in all SGA and control cell lines. Despite normal IGF-1R structure and quantity, the same 3 SGA cell lines that presented low proliferation response also had 50 to 85% lower ERK phosphorylation after IGF-1 treatment (p <0.001), although the similar total content of ERK1/2. In relation to PI3K pathway activation, all SGA cell cultures presented normal AKT phosphorilation. Fibroblasts from the SGA1 patient presented a 14x increase in IGFBP3 mRNA and 2x more IGFBP-3 secretion to culture serum medium. Treatment with desIGF-1, an IGF-1 analogue with low affinity for IGFBPs although retains its ability to activate the IGF-1R, did not recover cell proliferation or ERK phosphorylation. All cell lines presented similar amount of GRB10 protein Conclusion: Three of 4 SGA patients showed evidence of post-receptor IGF-1 insensitivity. The cell line SGA1, obtained from a SRS patient with ICR1 hypomethylation, showed increased expression and secretion of IGFBP-3, which was not directly responsible for inhibition in IGF- 1 action. Further studies should be developed to identify the molecular cause of IGF-1 post-receptor insensitivity observed in our patients.

Introdução: Polimorfismos na região promotora dos genes da insulina, IGF2 e IGF1 podem estar relacionados a uma diminuição da expressão desses genes na vida fetal que, por sua vez, pode causar restrição do crescimento intra-uterino e maior risco de hipospádia. Na vida pós-natal, perda completa ou parcial da expressão desses genes pode resultar em ausência de recuperação estatural e menores concentrações séricas de IGF1 na criança, além de um maior risco de diabetes melito tipo 2 e síndrome de resistência à insulina no adulto. Objetivos: Analisar em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG) com ou sem recuperação estatural (RE): 1) a freqüência alélica e genotípica dos polimorfismos VNTR-INS e das repetições CA do gene IGF1; 2) a região promotora P4 do gene IGF2; 3) a influência do VNTR INS e das repetições CA do gene IGF1 na sensibilidade à insulina e nas concentrações séricas de IGF1, respectivamente. Pacientes: Foram estudados 142 indivíduos nascidos PIG com (n= 66) e sem recuperação (n= 76) estatural selecionados de três diferentes centros (HC-FMUSP, Santa Casa de São Paulo e HC-UFPR) e um grupo controle constituído de 297 indivíduos nascidos adequados para idade gestacional (AIG). Métodos: Extração de DNA genômico; amplificação por PCR das regiões contendo os polimorfismos VNTR INS e repetições CA do IGF1 e da região promotora P4; digestão por enzima de restrição; software Genescan; seqüenciamento automático; avaliação bioquímica e hormonal da glicemia, insulina e IGF1, extração de RNA, PCR em tempo real e análise estatística com SPSS 13.0 (Statistical Package fo Social Sciences). Resultados: A média do Z-altura, Z-IMC (índice de massa corpórea), Z-altura paterno e ZEA (estatura alvo) foram maiores nas crianças PIG que tiveram recuperação estatural, com o Z-PC (perímetro cefálico) maior nas crianças sem recuperação estatural. O Z-IGF1 sérico foi significantemente mais elevado em crianças que apresentaram RE (p<0,05). A distribuição e genotipica das repetições CA do gene IGF1 e do VNTR INS foi semelhante estatisticamente entre os grupos AIG e PIG, e entre os PIG com e sem RE; não foi observada associação entre esse polimorfismo e as variáveis clínicas e laboratoriais do estudo. O estudo da região promotora P4 do gene IGF2 identificou um novo polimorfismo de 9-12 repetições C na posição -1982, antes do sítio de início de transcrição do exon 2, e este apresentou distribuição semelhante entre os grupos PIG e AIG. Foi identificada também uma troca C/T em heterozigose no nono nucleotídeo do alelo 11C em quatro crianças nascidas PIG. Contudo, a quantificação da expressão do gene IGF2 em duas dessas crianças não demonstrou perda da expressão desse gene. Conclusões: Não observamos influência dos polimorfismos acima descritos no crescimento pré e pós-natal, na presença de resistência à insulina, nem em concentrações séricas de IGF1 dos indivíduos nascidos PIG. Identificamos uma nova variante na região promotora P4 do gene IGF2, contudo estudos preliminares não demonstraram influência desse polimorfismo sobre o crescimento intra-uterino. / Introduction: Polymorphisms in the promoter region of insulin (INS), IGF2 and IGF1 genes may decrease their expression during fetal life and afterward could be related to intra-uterine fetal growth retardation and greater risk of hypospadia development. In post-natal life, decreased expression of these genes can result in lack of stature recovery and in lower IGF1 serum levels in children, as well as in higher risk for type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome in adults. Objectives: The aims of the present study were: (1) to analyze the allelic and the genotypic frequency of the insulin (INS) gene variable number of tandem repeats (VNTR) and the IGF1 gene CA repeats; (2) to analyze the P4 promoter region of IGF2 gene (3) to test the contribution of INS VNTR, IGF1 gene CA repeats on insulin sensitivity and IGF1 serum levels in children born SGA with and without catch up, respectively. Patients: We studied 142 individuals born SGA with catch up (n = 66) and without catch up (n = 76) selected from three different centers (HCFMUSP, Santa Casa de Sao Paulo and HC-UFPR). The control group consisted of 297 children born appropriate for gestational age (AGA). Methods: Extraction of genomic DNA, PCR-amplification of the VNTR of insulin gene, CA repeats of IGF1 and IGF2 gene P4 promoter region; restriction analysis; Genescan software; automatic sequencing. Blood measurements of serum level of glucose, insulin and IGF1. Statistical analysis (Statistical Package for Social Sciences software). Results: Regarding birth parameters, the average of Z-height, Z-BMI (body mass index) and Z-height paternal and Z- EA (target height) were higher in children born SGA who had catch up. Interestingly, we observed that the Z-PC was higher in children born SGA without catch up. In addition, the Z-IGF1 serum levels were significantly higher in children who had catch up (p <0.05). The molecular analysis of IGF1 gene CA repeats and of INS gene VNTR locus did not show a statistically significant difference in the allelic and genotypic distribution of these polymorphisms between adequate for gestational age (AGA) and SGA groups nor between SGA with and without catch up. Similarly, we have not found an association of these polymorphisms with clinical or laboratory variables of this study. A novel polymorphism in the P4 promoter region of the IGF2 gene was identified. It was characterized by cytosine repeats (9-12) at position -1982 before transcription initiation site of exon 2 of IGF2 gene. Yet, we have identified a heterozygous substitution of cytosine for thymine at the nucleotide position 9 in the allele 11C in four children born SGA. This change was also absent in the control population. Quantization of IGF2 gene expression in two of these children did show loss of expression of this gene in patients carrying the variant 9C/T. Conclusions: We have not observed an association of the above described polymorphisms with pre and post natal growth, or with the occurrence of insulin resistance in individuals born SGA. IGF-1 levels did not seem to be associated with the polymorphisms either. A new variant in the P4 promoter region of IGF2 gene was identified, however preliminary studies showed no influence on intra-uterine growth.

Introdução: Crianças nascidas pequenas para a idade gestacional (PIG) apresentam maior risco de permanecerem com baixa estatura na vida adulta. Os fatores de crescimento insulino-símile tipo 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2) são os principais fatores endócrinos determinantes do crescimento fetal. A maioria das ações conhecidas do IGF-1 e 2 é mediada via um receptor tirosina quinase, conhecido como IGF-1R. Recentemente, a insensibilidade ao IGF-1 foi identificada como uma das causas de retardo de crescimento em crianças nascidas PIG que não apresentaram recuperação espontânea do crescimento na vida pós-natal. Crianças afetadas apresentavam níveis elevados de IGF-1, IGFBP-3 além de microcefalia. O papel de defeitos pósreceptor na sinalização do IGF-1 como causa de retardo de crescimento pré e pós-natal ainda não foi investigado. Objetivo: Analisar in vitro a ação do IGF-1 em fibroblastos de crianças nascidas PIG. Material e métodos: Desenvolvemos cultura de fibroblastos de 2 controles (C1 e C2) e de 4 pacientes nascidos PIG (SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4) com suspeita de insensibilidade ao IGF-1 por ausência de recuperação do crescimento na vida pós natal, resposta insatisfatória ao tratamento com hGH apesar de níveis normais/elevados de IGF-1. Foi confirmado do ponto de vista molecular que um dos pacientes (SGA1) apresenta Síndrome de Sílver- Russell com perda da metilação do alelo paterno da região ICR1 (imprinting center region 1) importante para a expressão do IGF-2. Defeitos no gene do IGF1 e IGF1R foram afastados por sequenciamento direto. As ações do IGF- 1 foram determinadas por ensaios de proliferação, análise da produção de IGFPB-3 em meio de cultura e estudos de fosforilação de proteínas da via de sinalização do IGF-1 em fibroblastos (AKT e ERK). Resultados: As linhagens SGA1, SGA2 e SGA3 proliferaram respectivamente 31%, 60% e 78% a menos sob estímulo de IGF-1 em relação ás linhagens controles. Já a linhagem SGA4 apresentou comportamento semelhante ás linhagens controles. No estudo da expressão do RNAm do IGF1R por PCR em tempo real, não foi observada diferença significativa na expressão do IGF1R nas diversas linhagens PIG em relação aos controles, assim como o conteúdo total da proteína IGF-1R. Em relação á ativação da via MAPK, todas as linhagens dos pacientes PIGs apresentaram menor fosforilação ERK1/2 basal e após estímulo com IGF-1, quando comparadas com as linhagens controles (p < 0.001) apesar do conteúdo total de ERK1/2 ser semelhante. Já em relação a ativação da via PI3K, as linhagens SGA1, SGA2, SGA3 e SGA4 não diferiram significantemente em relação aos fibroblastos controles quanto à ativação de AKT pelo IGF-1. O conteúdo total de AKT também foi semelhante em todas as linhagens estudadas. O estudo da expressão de IGFBP3 mostrou um aumento da expressão deste peptídeo na linhagem de fibroblastos do paciente SGA1 (14X). O conteúdo de IGFBP-3 intracelular não sofreu alteração, porém comprovamos que a linhagem SGA1 secretava 2x mais IGFBP-3 para o meio de cultura. Apesar de apresentarem estrutura, expressão e conteúdo de IGF1R normais, essas mesmas 3 linhagens celulares que apresentaram menor proliferação também apresentaram diminuição na fosforilação de ERK após tratamento com IGF-1. Mesmo sob o estímulo com desIGF-1 (um análogo do IGF-1 com baixa afinidade por IGFBPs mas que preserva sua capacidade de ativar o receptor IGF-1R) a ativação de ERK e a proliferação celular se manteve abaixo dos das linhagens controles. O estudo do conteúdo total de GRB10 foi semelhante em todas as linhagens celulares. Conclusão: Três dos 4 pacientes PIG estudados apresentaram insensibilidade pós-receptor ao IGF-1. A linhagem celular SGA1, obtida de um paciente com hipometilação do ICR1 11p15 causando SSR, demonstramos um aumento da expressão e secreção de IGFBP-3, o qual não se mostrou responsável por inibir a ação do IGF-1 nestes fibroblastos. Novos estudos devem ser desenvolvidos para identificar o defeito molecular responsável pela insensibilidade ao IGF-1 a nível pósreceptor observada nestes pacientes. / Introduction: Children born small for gestational age (SGA) have a higher risk of staying with short stature in adulthood. The insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) are the main endocrine factor determining fetal growth. Most of the known actions of IGFs are mediated by IGF-1R, a tyrosine kinase receptor. Recently, the IGF-1 insensitivity was identified causing growth retardation in children born SGA who who did not present spontaneous catch-up growth in postnatal life. Affected children had elevated IGF-1 and IGFBP-3 levels in addition to microcephaly. The role of post receptor defects in IGF-1 signaling on the deficit of growth is still unclear. Objective: To assess IGF-1 action and signaling in vitro in fibroblasts from SGA children. Methods: Fibroblasts cell cultures were developed from 2 controls (C1 and C2) and 4 patients with pre- and post-natal growth retardation (SGA1, SGA2, SGA3 and SGA4). IGF-1 insensitivity was demonstrated by severe pre and postnatal growth impairment without any evident cause, IGF1 SDS > 0 and poor growth response during high doses of hGH treatment. Three SGA patients presented microcephaly. Defects in the gene of the IGF1 and IGF1R were excluded by direct sequencing. One patient (SGA1) presents the Silver- Russell syndrome (SRS) with loss of methylation of the paternal allele in the ICR1 (imprinting center region 1) chromosome 11p15, important for IGF-2 expression. IGF-1 action was assessed by cell proliferation by colorimetric assay. IGF-1 signaling was assessed by AKT and ERK phosphorylation after IGF-1 stimulation through SDS-PAGE of intracellular extract followed by immunoblotting with specific antibodies. The expression of IGF1R and IGFBP3 gene was determined by Real-time quantitative PCR and the levels of the IGF-1R and IGBP-3 protein by direct immunoblotting. Results: The SGA1, SGA2 and SGA3 cell lines proliferated 31%, 60% and 78% less under IGF-1 stimulation in comparison of controls fibroblasts, respectively. The expression of IGF1R mRNA and the level of total amount of IGF-1R protein were similar in all SGA and control cell lines. Despite normal IGF-1R structure and quantity, the same 3 SGA cell lines that presented low proliferation response also had 50 to 85% lower ERK phosphorylation after IGF-1 treatment (p <0.001), although the similar total content of ERK1/2. In relation to PI3K pathway activation, all SGA cell cultures presented normal AKT phosphorilation. Fibroblasts from the SGA1 patient presented a 14x increase in IGFBP3 mRNA and 2x more IGFBP-3 secretion to culture serum medium. Treatment with desIGF-1, an IGF-1 analogue with low affinity for IGFBPs although retains its ability to activate the IGF-1R, did not recover cell proliferation or ERK phosphorylation. All cell lines presented similar amount of GRB10 protein Conclusion: Three of 4 SGA patients showed evidence of post-receptor IGF-1 insensitivity. The cell line SGA1, obtained from a SRS patient with ICR1 hypomethylation, showed increased expression and secretion of IGFBP-3, which was not directly responsible for inhibition in IGF- 1 action. Further studies should be developed to identify the molecular cause of IGF-1 post-receptor insensitivity observed in our patients.

As doenças que comprometem o crescimento humano apresentam uma forte influência genética. O objetivo geral do projeto atual é desenvolver e aplicar a tecnologia de sequenciamento paralelo em larga escala para compreensão desses distúrbios de crescimento, com foco principal em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG), definida como criança com Escore-Z de comprimento e/ou peso ao nascimento menor ou igual a -2. PIG é uma condição heterogênea, que inclui como causa fatores maternos, placentários e fetal, dentre o qual, destacam-se as alterações genéticas. Crianças nascidas PIG e que não recuperaram seu déficit estatural espontaneamente nos primeiros anos de vida apresentam uma alta probabilidade de serem adultos baixos e costumam evoluir com quadros clínicos complexos, envolvendo retardo de crescimento persistente na vida pós-natal, dismorfismos, anomalias congênitas e distúrbios de desenvolvimento neuropsicomotor. Foi utilizada a tecnologia de sequenciamento Sure Select (Agilent Technologies, CA, USA) para estudar aproximadamente 390 genes escolhidos por pertencerem à via IGFs/IGF1R, principal eixo regulador hormonal do crescimento, genes sabidamente envolvidos em doenças associadas com distúrbio de crescimento, além de genes candidatos identificados em estudos prévios do laboratório, associados à regulação do crescimento, em um grande número de pacientes. Foram sequenciados 80 pacientes, obtendo uma cobertura média de 354 vezes e com mais de 99% da região alvo com cobertura > 10 reads. Nestas amostras foram identificadas 58 variantes, 18 consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas em 19 pacientes, 32 de significado incerto, 7 provavelmente benigna e 1 provavelmente patogênica para condição não associada a distúrbio de crescimento (\"achado acidental\"). Dentre as variantes consideradas patogênicas ou provavelmente patogênicas houve uma grande heterogeneidade entre os genes, sendo identificadas variantes nos genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL e deleção 22q11. Podemos concluir que a técnica de sequenciamento paralelo em larga escala de genes alvo é eficiente em estabelecer o diagnóstico molecular de crianças nascidas PIG. Foi possível identificar a etiologia genética em 23,75% da casuística estudada, em sua maior parte, de pacientes com síndromes reconhecidas clinicamente. Contudo, defeitos no sistema IGFs/IGF1R não foram frequentes nesta condição / Diseases affecting human growth are most likely caused by genetic factors. The main goal of this project is to apply the technology of massive parallel sequencing to comprehend growth disturbs in children born small for gestational age (SGA), known as the children with Z-score of height and/or weight at birth less or equal -2. SGA is a heterogeneous condition, and as its causes we can find maternal, placental and fetal factors, of which, the most important are the genetic alterations. Children born SGA that do not have catch-up growth spontaneously up to the second year of life may remain with short stature when adults and they usually present other clinical features, such as dimorphisms, congenital anomalies and neuropsychomotor developmental delay. We used the Sure Select technology (Agilent Technologies, CA, USA) to study approximately 390 genes chosen by participate of the IGFs/IGF1R system, or genes already associated with growth disorders, or candidate genes found in previous studies of aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization) or exome sequencing. We sequenced 80 patients, and had a mean coverage of 354x, with more than 99% of the target region with > 10 reads. We found 58 variants, 18 classified as pathogenic or probably pathogenic in 19 patients, 32 variants of unknown significance and 7 probably benign and 1 probably pathogenic for a condition non associated to short stature (``incidental finding``) Among the probably pathogenic and pathogenic we found a great heterogeneity in genes, with variants identified in 10 different genes PTPN11 (x3), BLM (x3), NPR2 (x2), ANKRD11 (x2), SRCAP (x2), FGFR3 (x2), IGF1R, SHOC2, SHOX, NIPBL and a 22q11 deletion. In conclusion, the technique of targeted gene panel sequencing is a useful tool to establish the molecular diagnose in children SGA. We could identify the molecular cause in 23.75% of the casuistic, mostly patients with clinically recognized syndromes. However, variants at IGFs/IGF1R system are not frequently associated with the studied condition

Introdução: Polimorfismos na região promotora dos genes da insulina, IGF2 e IGF1 podem estar relacionados a uma diminuição da expressão desses genes na vida fetal que, por sua vez, pode causar restrição do crescimento intra-uterino e maior risco de hipospádia. Na vida pós-natal, perda completa ou parcial da expressão desses genes pode resultar em ausência de recuperação estatural e menores concentrações séricas de IGF1 na criança, além de um maior risco de diabetes melito tipo 2 e síndrome de resistência à insulina no adulto. Objetivos: Analisar em crianças nascidas pequenas para idade gestacional (PIG) com ou sem recuperação estatural (RE): 1) a freqüência alélica e genotípica dos polimorfismos VNTR-INS e das repetições CA do gene IGF1; 2) a região promotora P4 do gene IGF2; 3) a influência do VNTR INS e das repetições CA do gene IGF1 na sensibilidade à insulina e nas concentrações séricas de IGF1, respectivamente. Pacientes: Foram estudados 142 indivíduos nascidos PIG com (n= 66) e sem recuperação (n= 76) estatural selecionados de três diferentes centros (HC-FMUSP, Santa Casa de São Paulo e HC-UFPR) e um grupo controle constituído de 297 indivíduos nascidos adequados para idade gestacional (AIG). Métodos: Extração de DNA genômico; amplificação por PCR das regiões contendo os polimorfismos VNTR INS e repetições CA do IGF1 e da região promotora P4; digestão por enzima de restrição; software Genescan; seqüenciamento automático; avaliação bioquímica e hormonal da glicemia, insulina e IGF1, extração de RNA, PCR em tempo real e análise estatística com SPSS 13.0 (Statistical Package fo Social Sciences). Resultados: A média do Z-altura, Z-IMC (índice de massa corpórea), Z-altura paterno e ZEA (estatura alvo) foram maiores nas crianças PIG que tiveram recuperação estatural, com o Z-PC (perímetro cefálico) maior nas crianças sem recuperação estatural. O Z-IGF1 sérico foi significantemente mais elevado em crianças que apresentaram RE (p<0,05). A distribuição e genotipica das repetições CA do gene IGF1 e do VNTR INS foi semelhante estatisticamente entre os grupos AIG e PIG, e entre os PIG com e sem RE; não foi observada associação entre esse polimorfismo e as variáveis clínicas e laboratoriais do estudo. O estudo da região promotora P4 do gene IGF2 identificou um novo polimorfismo de 9-12 repetições C na posição -1982, antes do sítio de início de transcrição do exon 2, e este apresentou distribuição semelhante entre os grupos PIG e AIG. Foi identificada também uma troca C/T em heterozigose no nono nucleotídeo do alelo 11C em quatro crianças nascidas PIG. Contudo, a quantificação da expressão do gene IGF2 em duas dessas crianças não demonstrou perda da expressão desse gene. Conclusões: Não observamos influência dos polimorfismos acima descritos no crescimento pré e pós-natal, na presença de resistência à insulina, nem em concentrações séricas de IGF1 dos indivíduos nascidos PIG. Identificamos uma nova variante na região promotora P4 do gene IGF2, contudo estudos preliminares não demonstraram influência desse polimorfismo sobre o crescimento intra-uterino. / Introduction: Polymorphisms in the promoter region of insulin (INS), IGF2 and IGF1 genes may decrease their expression during fetal life and afterward could be related to intra-uterine fetal growth retardation and greater risk of hypospadia development. In post-natal life, decreased expression of these genes can result in lack of stature recovery and in lower IGF1 serum levels in children, as well as in higher risk for type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome in adults. Objectives: The aims of the present study were: (1) to analyze the allelic and the genotypic frequency of the insulin (INS) gene variable number of tandem repeats (VNTR) and the IGF1 gene CA repeats; (2) to analyze the P4 promoter region of IGF2 gene (3) to test the contribution of INS VNTR, IGF1 gene CA repeats on insulin sensitivity and IGF1 serum levels in children born SGA with and without catch up, respectively. Patients: We studied 142 individuals born SGA with catch up (n = 66) and without catch up (n = 76) selected from three different centers (HCFMUSP, Santa Casa de Sao Paulo and HC-UFPR). The control group consisted of 297 children born appropriate for gestational age (AGA). Methods: Extraction of genomic DNA, PCR-amplification of the VNTR of insulin gene, CA repeats of IGF1 and IGF2 gene P4 promoter region; restriction analysis; Genescan software; automatic sequencing. Blood measurements of serum level of glucose, insulin and IGF1. Statistical analysis (Statistical Package for Social Sciences software). Results: Regarding birth parameters, the average of Z-height, Z-BMI (body mass index) and Z-height paternal and Z- EA (target height) were higher in children born SGA who had catch up. Interestingly, we observed that the Z-PC was higher in children born SGA without catch up. In addition, the Z-IGF1 serum levels were significantly higher in children who had catch up (p <0.05). The molecular analysis of IGF1 gene CA repeats and of INS gene VNTR locus did not show a statistically significant difference in the allelic and genotypic distribution of these polymorphisms between adequate for gestational age (AGA) and SGA groups nor between SGA with and without catch up. Similarly, we have not found an association of these polymorphisms with clinical or laboratory variables of this study. A novel polymorphism in the P4 promoter region of the IGF2 gene was identified. It was characterized by cytosine repeats (9-12) at position -1982 before transcription initiation site of exon 2 of IGF2 gene. Yet, we have identified a heterozygous substitution of cytosine for thymine at the nucleotide position 9 in the allele 11C in four children born SGA. This change was also absent in the control population. Quantization of IGF2 gene expression in two of these children did show loss of expression of this gene in patients carrying the variant 9C/T. Conclusions: We have not observed an association of the above described polymorphisms with pre and post natal growth, or with the occurrence of insulin resistance in individuals born SGA. IGF-1 levels did not seem to be associated with the polymorphisms either. A new variant in the P4 promoter region of IGF2 gene was identified, however preliminary studies showed no influence on intra-uterine growth.

Estudamos a Eletrodinâmica de Wheeler-Feynman usando um princípio variacional para um funcional de ação finito acoplado a um problema de valor na fronteira. Para trajetórias C2 por trechos, a condição de ponto crítico desse funcional fornece as equações de movimento de Wheeler-Feynman mais uma condição de continuidade dos momentos parciais e energias parciais, conhecida como condição de quina de Weierstrass-Erdmann. Estudamos em detalhe um sub-caso mais simples, onde os dados de fronteira têm um comprimento mínimo. Nesse caso, mostramos que a condição de extremo se reduz a um problema de valor na chegada para uma equação diferencial com retardo misto dependente do estado e do tipo neutro. Resolvemos numericamente esse problema usando um método de shooting e um método de Runge-Kutta de quarta ordem. Para os casos em que as fronteiras mínimas têm velocidades descontínuas, elaboramos uma técnica para resolver as condições de quina de Weierstrass-Erdmann junto com o problema de valor na chegada. As trajetórias com velocidades descontínuas previstas pelo método variacional foram verificadas por experimentos numéricos. Em um segundo desenvolvimento, para o caso mais difícil de fronteiras de comprimento arbitrário, implementamos um método de minimização com gradiente fraco para o princípio variacional e problema de fronteira acima citado. Elaboramos dois métodos numéricos, ambos implementados em MATLAB, para encontrar soluções do problema eletromagnético de dois corpos. O primeiro combina o método de elementos finitos com o método de Newton para encontrar as soluções que anulam o gradiente fraco do funcional para fronteiras genéricas. O segundo usa o método do declive máximo para encontrar as soluções que minimizam a ação. Nesses dois métodos as trajetórias são aproximadas dentro de um espaço de dimensão finita gerado por uma Galerkiana que suporta velocidades descontínuas. Foram realizados diversos testes e experimentos numéricos para verificar a convergência das trajetórias calculada numericamente; também comparamos os valores do funcional calculados numericamente com alguns resultados analíticos sobre órbitas circulares. / We study the Wheeler-Feynman electrodynamics using a variational principle for an action functional coupled to a finite boundary value problem. For piecewise C2 trajectories, the critical point condition for this functional gives the Wheeler-Feynman equations of motion in addition to a continuity condition of partial moments and partial energies, known as the Weierstrass-Erdmann corner conditions. In the simplest case, for the boundary value problem of shortest length, we show that the critical point condition reduces to a two-point boundary value problem for a state-dependent mixed-type neutral differential-delay equation. We solve this special problem numerically using a shooting method and a fourth order Runge-Kutta. For the cases where the boundary segment has discontinuous velocities we developed a technique to solve the Weierstrass-Erdmann corner conditions and the two-point boundary value problem together. The trajectories with discontinuous velocities presupposed by the variational method were verified by numerical experiments. In a second development, for the harder case with boundaries of arbitrary length, we implemented a method of minimization with weak gradient for the variational principle quoted above. Two numerical methods were implemented in MATLAB to find solutions of the two-body electromagnetic problem. The first combines the finite element method with Newtons method to find the solutions that vanish the weak gradient. The second uses the method of steepest descent to find the solutions that minimize the action. In both methods the trajectories are approximated within a finite-dimensional space generated by a Galerkian that supports discontinuous velocities. Many tests and numerical experiments were performed to verify the convergence of the numerically calculated trajectories; also were compared the values of the functional computed numerically with some known analytical results on circular orbits.

[ES] La disponibilidad y el rendimiento de las actuales tecnologías inalámbricas como WiFi o 4G, pueden tener serios problemas de congestión y propagación, especialmente en espacios muy concurridos, o bien ser inaccesibles en sitios remotos o con baja densidad de personas. La utilización de las Redes Oportunistas en este tipo de escenarios puede ser la solución a estos problemas. Estas redes se basan en la oportunidad de intercambiar mensajes utilizando algún tipo de tecnología de comunicación directa entre dispositivos móviles como son Bluetooth o WiFi. El rendimiento de las Redes Oportunistas depende principalmente de la movilidad de los nodos y los protocolos de enrutamiento utilizados, siendo estos últimos los encargados de decidir como son intercambiados los mensajes cuando un contacto ocurre, intentando encontrar la mejor ruta para que un mensaje alcance su destino. Por otra parte, la eficiencia de la difusión en estas redes está ligada especialmente a la movilidad de los usuarios y al comportamiento humano. Entonces, para el análisis y la evaluación del rendimiento de las Redes Oportunistas es necesario considerar tanto los aspectos técnicos relacionados con los protocolos de encaminamiento, como los aspectos de la movilidad humana. Esta tesis doctoral se centra principalmente en evaluar la diseminación de la información usando redes oportunistas en escenarios urbanos, en los que existen diferentes densidades y tasas de renovación de personas, es decir, con usuarios que puedan entrar y salir del escenario evaluado. Dado que la existencia de este tipo de trazas reales es muy limitada, en esta tesis se plantea la generación de este tipo de trazas de forma sintética. Para ello, mediante el uso de un simulador de movilidad peatonal, se han generado trazas realistas de movilidad con diferentes grados de densidad y tasas de renovación de usuarios con el objeto de evaluar diferentes aspectos de la difusión de mensajes en las Redes Oportunistas. El análisis de las características temporales y espaciales de estas trazas generadas refleja el realismo de los escenarios que se han considerado. Además, los experimentos relativos a la difusión de mensajes realizados con estas trazas, confirman que la tasa de renovación tiene un gran impacto en el rendimiento de los protocolos, lo que es particularmente evidente cuando el tamaño de los mensajes es mayor. Por otra parte, también se ha realizado el estudio, utilizando en este caso trazas reales, de la difusión de información a través de las Redes Oportunistas Vehiculares. Ya que de la misma manera la movilidad de estos vehículos está ligada al comportamiento humano, nos hemos centrado en la diseminación de la información en determinadas horas del día dependiendo del número de vehículos en circulación, debido a que este aspecto tiene un gran impacto en el reenvío de datos. Los resultados de estos experimentos confirman que los dos principales factores que afectan a la difusión de información son el grado de movilidad y el tamaño de mensaje. Aunque es bien sabido que al aumentar la densidad de nodos aumenta la velocidad de difusión, mostramos que, al mantener la densidad de nodos fija, las tasas de renovación más altas hacen que la relación de entrega disminuya. Además, descubrimos que la relación entre el tamaño del mensaje y la duración del contacto también es un factor clave, lo que demuestra que la transmisión de los mensajes grandes puede llevar a un rendimiento general muy bajo. Basándonos en todo lo expuesto anteriormente, se ha propuesto una mejora al protocolo Epidemic, a la que hemos denominado EpidemicX2, que se basa en la fragmentación de los datos a ser enviados con el fin de aprovechar la corta duración de los contactos para aumentar así la posibilidad de su entrega. Este protocolo es particularmente efectivo para la difusión de los mensajes grandes. Los resultados muestran que la tasa de entrega se increment / [CA] La disponibilitat i el rendiment de les actuals tecnologies sense fil com WiFi o 4G, poden tindre seriosos problemes de congestió i propagació, especialment en espais molt concorreguts, o bé ser inaccessibles en llocs remots o amb baixa densitat de persones. La utilització de les Xarxes Oportunistes en este tipus d'escenaris pot ser la solució a estos problemes. Estes xarxes es basen en l'oportunitat d'intercanviar missatges utilitzant algun tipus de tecnologia de comunicació directa entre dispositius mòbils com són Bluetooth o WiFi. El rendiment de les Xarxes Oportunistes depén principalment de la mobilitat dels nodes i els protocols d'enrutamiento utilitzats, sent estos últims els encarregats de decidir com són intercanviats els missatges quan un contacte ocorre, intentant trobar la millor ruta perquè un missatge abast el seu destí. D'altra banda, l'eficiència de la difusió en estes xarxes està lligada especialment a la mobilitat dels usuaris i al comportament humà. Llavors, per a l'anàlisi i l'avaluació del rendiment de les Xarxes Oportunistes és necessari considerar tant els aspectes tècnics relacionats amb els protocols d'acarrerament, com els aspectes de la mobilitat humana. Esta tesi doctoral se centra principalment a avaluar la disseminació de la informació usant xarxes oportunistes en escenaris urbans, en els que hi ha diferents densitats i taxes de renovació de persones, és a dir, amb usuaris que puguen entrar i eixir de l'escenari avaluat. Atés que l'existència d'este tipus de traces reals és molt limitada, en esta tesi es planteja la generació d'este tipus de traces de forma sintètica. Per a això, per mitjà de l'ús d'un simulador de mobilitat de vianants, s'han generat traces realistes de mobilitat amb diferents graus de densitat i taxes de renovació d'usuaris amb l'objecte d'avaluar diferents aspectes de la difusió de missatges en les Xarxes Oportunistes. L'anàlisi de les característiques temporals i espacials d'estes traces generades reflectix el realisme dels escenaris que s'han considerat. A més, els experiments relatius a la difusió de missatges realitzats amb estes traces, confirmen que la taxa de renovació té un gran impacte en el rendiment dels protocols, la qual cosa és particularment evident quan la grandària dels missatges és major. D'altra banda, també s'ha realitzat l'estudi, utilitzant en este cas traces reals, de la difusió d'informació a través de les Xarxes Oportunistes Vehiculares. Ja que de la mateixa manera la mobilitat d'estos vehicles està lligada al comportament humà, ens hem centrat en la disseminació de la informació en determinades hores del dia depenent del nombre de vehicles en circulació, pel fet que este aspecte té un gran impacte en el reexpedició de dades. Els resultats d'estos experiments confirmen que els dos principals factors que afecten la difusió d'informació són el grau de mobilitat i la grandària de missatge. Encara que és ben sabut que a l'augmentar la densitat de nodes augmenta la velocitat de difusió, mostrem que, al mantindre la densitat de nodes fixa, les taxes de renovació més altes fan que la relació d'entrega disminuïsca. A més, descobrim que la relació entre la grandària del missatge i la duració del contacte també és un factor clau, la qual cosa demostra que la transmissió dels missatges grans pot portar a un rendiment general molt davall. Basant-nos en tot el que exposa anteriorment, s'ha proposat una millora al protocol Epidemic, a la que hem denominat EpidemicX2, que es basa en la fragmentació de les dades a ser enviats a fi d'aprofitar la curta duració dels contactes per a augmentar així la possibilitat del seu entrega. Este protocol és particularment efectiu per a la difusió dels missatges grans. Els resultats mostren que la taxa d'entrega s'incrementa, el temps mitjana en l'entrega es reduïx, sense un substancial increment en termes de sobrecàrrega. / [EN] The availability and performance of current wireless technologies such as WiFi or 4G, can have severe problems of congestion and information diffusion, especially in crowded spaces, or, on the other side, be inaccessible in places with a low density of people. The use of Opportunistic Networks in these types of scenarios can be a solution to these problems. These networks are based on the opportunity to exchange messages using some type of direct communication technology between nearby mobile devices such as Bluetooth or WiFi. The performance of these networks depends mainly on the mobility of the nodes and the routing protocols used. The goal of these protocols is to decide how messages are exchanged when a pair of nodes are in contact, trying to find the best route for a message to reach its destination. The efficiency of the diffusion in these networks is related mainly to the mobility of users and human behaviour. Therefore, for the analysis and evaluation of the performance of the Opportunistic Networks, it is necessary to consider both the technical aspects related to the routing protocols, as well as the aspects of human mobility. This thesis mainly focuses on evaluating the dissemination of information using Opportunistic Networks in urban scenarios, in which there are different densities and renewal rates of people, that is, with users who can enter and leave the evaluated scenario. Given that the existence of this type of real traces is very limited, this thesis proposes the generation of realistic traces. For this, through the use of a pedestrian mobility simulator, realistic traces of mobility have been defined with different degrees of density and renewal rates of users to evaluate different aspects of the Opportunistic Network with this approach. The analysis of the temporal and spatial characteristics of these generated traces reflects the realism of the scenarios that have been considered. The experiments related to the diffusion of messages made with these traces, confirm that the renewal rate has a high impact on the performance of the protocols, which is particularly evident when the message size is longer. Furthermore, considering vehicular scenarios, a study has also been carried out using real traces, following the same methodology to evaluate the dissemination of information. Since in the same way the mobility of these vehicles is linked to human behaviour, we have focused on the dissemination of information at certain times of the day depending on the number of vehicles in circulation, since this aspect has a significant impact on data diffusion. The results of all these experiments show that the diffusion of contents is affected mainly by two factors: degree of mobility and message size. Although it is well known that increasing the density of nodes increases the speed of diffusion, we show that, by maintaining the density of fixed nodes, the higher renewal rates cause the delivery ratio to decrease. In addition, we discovered that the relationship between message size and contact duration is also a key factor, showing that large messages can lead to very reduced overall performance. Based on these results, an improvement to the Epidemic protocol has been proposed, called EpidemicX2, which is based on the fragmentation of the data to be sent in order to take advantage of the short duration of the contacts. This protocol is particularly effective for the dissemination of large messages. The results show that the delivery rate increases, the average time in the delivery is reduced, without a substantial increase in terms of overload. / Finalmente, quiero agradecer a la República del Ecuador junto con la “Secretaría de Educación Superior, Ciencia y Tecnología e Innovación” - SENESCYT, por su programa de apoyo y financiar mis estudios. / Chancay Garcia, LJ. (2019). Evaluación y Modelado de Redes Oportunistas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/124339

[ES] Una de las principales preocupaciones de los centros de datos actuales es maximizar la utilización de los servidores. En cada servidor se ejecutan simultáneamente varias aplicaciones para aumentar la eficiencia de los recursos. Sin embargo, las prestaciones dependen en gran medida de la proporción de recursos que recibe cada aplicación. El mayor número de núcleos (y de aplicaciones ejecutándose) con cada nueva generación de procesadores hace que crezca la preocupación por la interferencia en los recursos compartidos. Esta tesis se centra en mitigar la interferencia cuando diferentes aplicaciones se consolidan en un mismo procesador desde dos perspectivas: computación de alto rendimiento (HPC) y computación en la nube. En el contexto de HPC, esta tesis propone políticas de gestión para dos de los recursos más críticos: la caché de último nivel (LLC) y los núcleos del procesador. La LLC desempeña un papel clave en las prestaciones de los procesadores actuales al reducir considerablemente el número de accesos de alta latencia a memoria principal. Se proponen estrategias de particionado de la LLC tanto para cachés inclusivas como no inclusivas, ambos diseños presentes en los procesadores para servidores actuales. Para los esquemas, se detectan nuevos comportamientos problemáticos y se asigna un mayor espacio de caché a las aplicaciones que hacen mejor uso de este. En cuanto a los núcleos del procesador, muchas aplicaciones paralelas (como aplicaciones de grafos) no escalan bien con un mayor número de núcleos. Además, el planificador de Linux aplica una estrategia de tiempo compartido que no ofrece buenas prestaciones cuando se ejecutan aplicaciones de grafo. Para maximizar la utilización del sistema, esta tesis propone ejecutar múltiples aplicaciones de grafo en el mismo procesador, asignando a cada una el número óptimo de núcleos (y adaptando el número de hilos creados) dinámicamente. En cuanto a la computación en la nube, esta tesis aborda tres grandes retos: la compleja infraestructura de estos sistemas, las características de sus aplicaciones y el impacto de la interferencia entre máquinas virtuales (MV). Primero, esta tesis presenta la plataforma experimental desarrollada con los principales componentes de un sistema en la nube. Luego, se presenta un amplio estudio de caracterización sobre un conjunto de aplicaciones de latencia crítica representativas con el fin de identificar los puntos que los proveedores de servicios en la nube deben tener en cuenta para mejorar el rendimiento y la utilización de los recursos. Por último, se realiza una propuesta que permite detectar y estimar dinámicamente la interferencia entre MV. El enfoque usa métricas que pueden monitorizarse fácilmente en la nube pública, ya que las MV deben tratarse como "cajas negras". Toda la investigación descrita se lleva a cabo respetando las restricciones y cumpliendo los requisitos para ser aplicable en entornos de producción de nube pública. En resumen, esta tesis aborda la contención en los principales recursos compartidos del sistema en el contexto de la consolidación de servidores. Los resultados experimentales muestran importantes ganancias sobre Linux. En los procesadores con LLC inclusiva, el tiempo de ejecución (TT) se reduce en más de un 40%, mientras que se mejora el IPC más de un 3%. Con una LLC no inclusiva, la equidad y el TT mejoran en un 44% y un 24%, respectivamente, al mismo tiempo que se mejora el rendimiento hasta un 3,5%. Al distribuir los núcleos del procesador de forma eficiente, se alcanza una equidad casi perfecta (94%), y el TT se reduce hasta un 80%. En entornos de computación en la nube, la degradación del rendimiento puede estimarse con un error de un 5% en la predicción global. Todas las propuestas presentadas han sido diseñadas para ser aplicadas en procesadores comerciales sin requerir ninguna información previa, tomando las decisiones dinámicamente con datos recogidos de los contadores de prestaciones. / [CAT] Una de les principals preocupacions dels centres de dades actuals és maximitzar la utilització dels servidors. A cada servidor s'executen simultàniament diverses aplicacions per augmentar l'eficiència dels recursos. Tot i això, el rendiment depèn en gran mesura de la proporció de recursos que rep cada aplicació. El nombre creixent de nuclis (i aplicacions executant-se) amb cada nova generació de processadors fa que creixca la preocupació per l'efecte causat per les interferències en els recursos compartits. Aquesta tesi se centra a mitigar la interferència en els recursos compartits quan diferents aplicacions es consoliden en un mateix processador des de dues perspectives: computació d'alt rendiment (HPC) i computació al núvol. En el context d'HPC, aquesta tesi proposa polítiques de gestió per a dos dels recursos més crítics: la memòria cau d'últim nivell (LLC) i els nuclis del processador. La LLC exerceix un paper clau a les prestacions del sistema en els processadors actuals reduint considerablement el nombre d'accessos d'alta latència a la memòria principal. Es proposen estratègies de particionament de la LLC tant per a caus inclusives com no inclusives, ambdós dissenys presents en els processadors actuals. Per als dos esquemes, se detecten nous comportaments problemàtics i s'assigna un major espai de memòria cau a les aplicacions que en fan un millor ús. Pel que fa als nuclis del processador, moltes aplicacions paral·leles (com les aplicacions de graf) no escalen bé a mesura que s'incrementa el nombre de nuclis. A més, el planificador de Linux aplica una estratègia de temps compartit que no ofereix bones prestacions quan s'executen aplicacions de graf. Per maximitzar la utilització del sistema, aquesta tesi proposa executar múltiples aplicacions de grafs al mateix processador, assignant a cadascuna el nombre òptim de nuclis (i adaptant el nombre de fils creats) dinàmicament. Pel que fa a la computació al núvol, aquesta tesi aborda tres grans reptes: la complexa infraestructura d'aquests sistemes, les característiques de les seues aplicacions i l'impacte de la interferència entre màquines virtuals (MV). En primer lloc, aquesta tesi presenta la plataforma experimental desenvolupada amb els principals components d'un sistema al núvol. Després, es presenta un ampli estudi de caracterització sobre un conjunt d'aplicacions de latència crítica representatives per identificar els punts que els proveïdors de serveis al núvol han de tenir en compte per millorar el rendiment i la utilització dels recursos. Finalment, es fa una proposta que de manera dinàmica permet detectar i estimar la interferència entre MV. L'enfocament es basa en mètriques que es poden monitoritzar fàcilment al núvol públic, ja que les MV han de tractar-se com a "caixes negres". Tota la investigació descrita es duu a terme respectant les restriccions i complint els requisits per ser aplicable en entorns de producció al núvol públic. En resum, aquesta tesi aborda la contenció en els principals recursos compartits del sistema en el context de la consolidació de servidors. Els resultats experimentals mostren que s'obtenen importants guanys sobre Linux. En els processadors amb una LLC inclusiva, el temps d'execució (TT) es redueix en més d'un 40%, mentres que es millora l'IPC en més d'un 3%. En una LLC no inclusiva, l'equitat i el TT es milloren en un 44% i un 24%, respectivament, al mateix temps que s'obté una millora del rendiment de fins a un 3,5%. Distribuint els nuclis del processador de manera eficient es pot obtindre una equitat quasi perfecta (94%), i el TT pot reduir-se fins a un 80%. En entorns de computació al núvol, la degradació del rendiment pot estimar-se amb un error de predicció global d'un 5%. Totes les propostes presentades en aquesta tesi han sigut dissenyades per a ser aplicades en processadors de servidors comercials sense requerir cap informació prèvia, prenent decisions dinàmicament amb dades recollides dels comptadors de prestacions. / [EN] One of the main concerns of today's data centers is to maximize server utilization. In each server processor, multiple applications are executed concurrently, increasing resource efficiency. However, performance and fairness highly depend on the share of resources that each application receives, leading to performance unpredictability. The rising number of cores (and running applications) with every new generation of processors is leading to a growing concern for interference at the shared resources. This thesis focuses on addressing resource interference when different applications are consolidated on the same server processor from two main perspectives: high-performance computing (HPC) and cloud computing. In the context of HPC, resource management approaches are proposed to reduce inter-application interference at two major critical resources: the last level cache (LLC) and the processor cores. The LLC plays a key role in the system performance of current multi-cores by reducing the number of long-latency main memory accesses. LLC partitioning approaches are proposed for both inclusive and non-inclusive LLCs, as both designs are present in current server processors. In both cases, newly problematic LLC behaviors are identified and efficiently detected, granting a larger cache share to those applications that use best the LLC space. As for processor cores, many parallel applications, like graph applications, do not scale well with an increasing number of cores. Moreover, the default Linux time-sharing scheduler performs poorly when running graph applications, which process vast amounts of data. To maximize system utilization, this thesis proposes to co-locate multiple graph applications on the same server processor by assigning the optimal number of cores to each one, dynamically adapting the number of threads spawned by the running applications. When studying the impact of system-shared resources on cloud computing, this thesis addresses three major challenges: the complex infrastructure of cloud systems, the nature of cloud applications, and the impact of inter-VM interference. Firstly, this thesis presents the experimental platform developed to perform representative cloud studies with the main cloud system components (hardware and software). Secondly, an extensive characterization study is presented on a set of representative latency-critical workloads which must meet strict quality of service (QoS) requirements. The aim of the studies is to outline issues cloud providers should consider to improve performance and resource utilization. Finally, we propose an online approach that detects and accurately estimates inter-VM interference when co-locating multiple latency-critical VMs. The approach relies on metrics that can be easily monitored in the public cloud as VMs are handled as ``black boxes''. The research described above is carried out following the restrictions and requirements to be applicable to public cloud production systems. In summary, this thesis addresses contention in the main system shared resources in the context of server consolidation, both in HPC and cloud computing. Experimental results show that important gains are obtained over the Linux OS scheduler by reducing interference. In inclusive LLCs, turnaround time (TT) is reduced by over 40% while improving IPC by more than 3%. In non-inclusive LLCs, fairness and TT are improved by 44% and 24%, respectively, while improving performance by up to 3.5%. By distributing core resources efficiently, almost perfect fairness can be obtained (94%), and TT can be reduced by up to 80%. In cloud computing, performance degradation due to resource contention can be estimated with an overall prediction error of 5%. All the approaches proposed in this thesis have been designed to be applied in commercial server processors without requiring any prior information, making decisions dynamically with data collected from hardware performance counters. / Pons Escat, L. (2023). Interference Analysis and Resource Management in Server Processors: from HPC to Cloud Computing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/195840