Die gegenwärtige Vorstellung von Genexpression in Plastiden leitet sich von der Analyse weniger, individueller Gene ab und ist deshalb noch relativ lückenhaft. In dieser Arbeit sollte daher differenzierende RNA Sequenzierung- eine neue Methode, die zwischen prozessierten und Primärtranskripten unterscheiden kann, verwendet werden, um ein vollständigeres Bild des Transkriptionsprozesses und der RNA Prozessierung von Hordeum vulgare L. (Gerste) Chloroplasten zu erhalten. Plastidengene in höheren Pflanzen können sowohl von einer plastidenkodierten, bakterienähnlichen RNA-Polymerase (PEP), als auch von einer kernkodierten, phagenähnlichen RNA-Polymerase (NEP), die beide unterschiedliche Promotoren erkennen, abgelesen werden. In dieser Arbeit wurde die Verteilung von Transkriptionsstartstellen innerhalb des Plastidengenoms von grünen (reife Chloroplasten; Transkriptionsaktivität von PEP und NEP) und weißen Plastiden (Transkriptionsaktivität von NEP) der Gerstenmutantenlinie albostrians analysiert. Dies führte zu neuen Erkenntnissen bezüglich polymerasenspezifischer Genexpression in Plastiden. Auf Grundlage neuerer Arbeiten wird angenommen, daß nicht kodierende RNAs (ncRNAs) in Chloroplasten vorkommen. Die bisher verwendeten Methoden waren jedoch nicht geeignet, ncRNAs als Primärtranskripte zu identifizieren, die zumindest in Prokaryoten die häufigste Klasse von ncRNAs darstellen. In dieser Arbeit konnte durch dRNA-seq gezeigt werden, daß auch in Plastiden zahlreiche ncRNAs als Primärtranskripte generiert werden. Die wichtigsten Schritte im Prozess der mRNA Reifung in Plastiden sind 5´und 3´ Endformation und intercistronische Prozessierung. Vor Kurzem wurde gezeigt, daß ein PPR (Pentatricopeptide repeat) Protein zur Bildung der Ende von einigen prozessierten Plastiden mRNAs beiträgt, indem es als Hindernis für Exonukleasen wirkt. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß dies ein genereller Mechanismus zur Bildung prozessierter mRNA-Enden in Chloroplasten ist. / The current view on plastid gene expression is mainly based on the analysis of a few individual genes, and thus it is lacking in comprehensiveness. Here, a novel differential RNA-seq approach, designed to discriminate between primary and processed transcripts, was used to obtain a deeper insight into the plastid transcription and RNA maturation of mature barley (Hordeum vulgare L.) chloroplasts. Transcription in plastids of higher plants is dependent on two different transcription machineries, a plastid-encoded bacterial-type RNA polymerase (PEP) and a nuclear-encoded phage-type RNA polymerase (NEP), which recognize distinct types of promoters. This study provided a thorough investigation into the distribution of transcription start sites within the plastid genome of green (mature chloroplasts; transcription by both PEP and NEP) and white (PEP-deficient plastids; transcription by NEP) plastids of the barley line albostrians. This analysis led to new insights on polymerase specific gene expression in plastids. Recent studies have suggested that non-coding RNAs (ncRNAs) are common in chloroplasts. However, they did not directly detect ncRNAs generated via transcription, the so far most abundant class of known regulatory ncRNAs in bacteria. Here, dRNA-seq analysis of the transcriptome of barley chloroplasts demonstrated the existence of numerous ncRNA generated via transcription of free-standing genes. Major events in plastid mRNA maturation include 5’ and 3’ processed end formation and intercistronic processing. Recently, a PPR (pentatricopeptide repeat) protein was shown to participate in the generation of several plastid mRNA processed ends by serving as a barrier to exonucleases. This study provided evidence for the global impact of this mechanism on processed termini formation in chloroplasts.

O câncer de mama é o carcinoma que mais acomete mulheres no Brasil. Os tratamentos disponíveis são recomendados a partir da análise de fatores de prognóstico como a classificação pelo sistema TNM, tipo histológico, status de receptores hormonais e marcadores de proliferação tumoral. No entanto, a classificação dos tumores de mama é muito variável e o poder prognóstico dos marcadores tumorais atuais ainda é limitado, levando muitas pacientes à terapia adjuvante desnecessária. Portanto, novos métodos de prognóstico mais sensíveis são necessários para melhorar a tomada de decisão na clínica oncológica de pacientes com câncer de mama. Do ponto de vista de ciência básica, as modificações transcricionais associadas à oncogênese e progressão do câncer de mama ainda são pouco conhecidas. Além da alteração na expressão de genes codificadores para proteínas, evidências recentes sugerem que RNAs não-codificadores (ncRNAs) podem ter um papel importante na transformação maligna. Este projeto teve como principais objetivos: i) investigar a expressão de ncRNAs intrônicos em amostras de adenocarcinoma de mama e ii) identificar assinaturas de expressão gênica associadas a características anatomo-patológicas e clínicas de tumores de mama com potencial aplicação clínica. Para isso, foram comparados os perfis de expressão gênica de 58 amostras de tecido tumoral de mama, com seguimento clínico conhecido, utilizando uma plataforma de microarranjos de cDNA, enriquecida em ncRNAs provenientes de regiões intrônicas de genes humanos conhecidos. 9 Durante o projeto foram testadas diferentes metodologias para análise da expressão gênica utilizando microarranjos de cDNA com uma ou duas cores. O desenho experimental das hibridizações incluiu a co-hibridização de cada microarranjo com alvos fluorescentes representando o transcritoma da amostra de tumor juntamente com um oligonucleotídeo referência complementar a uma região presente em todas as sondas de cDNA (RefOligo). Este desenho experimental permitiu a avaliação de duas abordagens de análise da expressão gênica: a primeira baseada nas intensidades diretas de cada transcrito (One-Color) e a segunda baseada em razões de expressão onde a intensidade de cada transcrito foi normalizada pelo oligonucleotídeo referência (RefOligo). A utilização direta das intensidades se mostrou mais reprodutível e sensível para a detecção de assinaturas de expressão correlacionadas com características das amostras de mama, e essa abordagem foi escolhida para as análises subseqüentes. Os dados provenientes dos experimentos de microarranjos revelaram níveis de expressão ubíqüos dos transcritos intrônicos nas amostras analisadas, extendendo para o câncer de mama a relevância do estudo desta classe de ncRNAs. Além disso, foi identificada uma assinatura contendo 95 transcritos, correlacionada com o status de expressão do receptor de estrogênio (REr), dos quais cerca de 15% correspondem a ncRNAs. Utilizando apenas amostras com seguimento clínico superior a 4 anos, foi identificada uma assinatura com 113 transcritos, dos quais cerca de 30% são ncRNAs intrônicos, capaz de distinguir com 100% de acurácia pacientes que desenvolveram metástase daqueles que permaneceram livres da doença. Além de contribuir com novos candidatos a marcadores de prognóstico no câncer de mama, este estudo aponta para a participação de ncRNAs intrônicos em complexas redes transcricionais, possivelmente modulando a expressão de genes codificadores para proteínas. A caracterização detalhada da função de ncRNAs com expressão correlacionada a características fenotípicas e clínicas dos tumores de mama deverá fornecer novas informações sobre as bases moleculares da tumorigênese e progressão desta neoplasia. / Breast carcinoma is the most frequently occurring cancer amongst women in Brazil. The treatments available for breast cancer are prescribed based on the results of prognostic factors, such as the TNM classification system, histological type, hormonal receptor status and tumoral markers for cell proliferation. Nevertheless, breast cancer classification can be variable and inconsistent, and the prognosis power of tumoral markers is still limited, resulting in many patients unnecessarily undergoing adjuvant therapy. Therefore, there is an urge for new prognosis methods that are more sensitive, as well as accurate, in order to improve treatment decisions for breast cancer patients. From a basic science perspective, transcriptional modifications associated with oncogenesis and breast cancer progression are still poorly understood. Beyond alterations of the expression of protein-coding genes, recent evidences suggest that non-coding RNAs (ncRNAs) might have an important role in malignant transformation. The main goals of this project are: i) to investigate the expression of intronic ncRNAs in breast cancer tissue and ii) to identify gene expression signatures correlated to anatomo-pathological and clinical characteristics of human breast tumors, with a potential clinical aplication. To achieve this, gene expression profiles of 58 breast tumor samples with clinical follow-up were compared using a microarray platform enriched in non-coding RNAs (ncRNAs) derived from intronic regions of known human genes. During this project different gene expression methodologies were tested for the analysis of one- or two-color cDNA microarrays. The experimental design included the co-hybridization of the microarrays with fluorescent targets representing the tumor sample transcriptome with a reference oligonucleotide that is complementary to a 12 common region present in all cDNA probes (RefOligo). This experimental design permited the evaluation of two gene expression analysis approaches: the first based on direct intensities of each transcript (One-Color) and the second based in expression ratios where the intensity of each transcript is normalized by the reference oligonucleotide (RefOligo). One-Color methodology has shown to provide a more reproducible and sensitive gene expression signatures correlated to the breast samples characteristics and, therefore, this approach was chosen for subsequent analysis. The data provided by the microarray experiments revealed that ubiquitous expression of intronic ncRNAs was observed, confirming the relevance of investigating the role of this class of ncRNAs in breast cancer. Furthermore, a gene expression signature comprising 95 transcripts and correlated to the estrogen receptor status of breast tumor samples was identified, from which approximately 15% are ncRNAs. Using only samples from patients with known follow-up, a signature of 113 transcripts was identified, of which 30% are ncRNAs. This gene expression signature was able to distinguish with 100% accuracy patients that developed metastasis from those that remained disease-free up to 4 years after surgery. Besides the contribution of new molecular prognostic markers for breast cancer, the present study indicates that intronic ncRNAs might play a role in complex transcriptional networks, possibly regulating the expression of protein-coding genes. The detailed caracterization of the functional roles of ncRNAs, whose expression levels are correlated to fenotypical and clinical characteristics of breast tumors, is likely to provide new insigths on the molecular basis of tumorigenesis and progression of this neoplasia.

Introdução: A hiperplasia prostática benigna (HPB) é apontada como um dos mais comuns problemas de saúde associado ao envelhecimento dos homens. A incidência da doença começa a aumentar a partir dos 40 anos de idade, e se torna frequente em cerca de 50% dos homens com 50 anos e em quase 90% dos homens após a oitava década. A etiopatogenia da HPB ainda não foi totalmente elucidada, mas sabe-se que alguns fatores aumentam os riscos de aparecimento do problema. Seu melhor entendimento contribuiria substancialmente para o estabelecimento de um consenso terapêutico para a doença. Nesse sentido, os marcadores moleculares têm sido pesquisados na tentativa de auxiliar ou mesmo suplantar a eficiência dos métodos tradicionais. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNA regulatórios (19-25 nucleotídeos), não codificadores que possuem um papel fundamental no controle da expressão gênica. Essas pequenas moléculas estão envolvidas em vários processos celulares fisiológicos e patológicos. Alguns estudos demonstraram que os miRNAs 143 e 145 têm papel fundamental na diferenciação e proliferação celular da musculatura lisa. A ação de miRNAs na HPB ainda foi pouco explorada. Objetivos: Analisar a expressão do miR-143 e de seus genes e proteínas alvo ERK5 e KRAS e do miR-145 e dos seus genes e proteínas alvo MAP3K3 e MAP4K4, em pacientes portadores de HPB e comparar os perfis de expressão destes com parâmetros clínicos dos pacientes. Material e Métodos: Para análise dos miRNAs e dos seus genes alvo, foram estudados 44 pacientes diagnosticados com HPB submetidos à ressecção transuretral da próstata ou prostatectomia aberta. A análise da expressão foi realizada pela técnica de RT-PCR quantitativo. O grupo controle foi composto de tecido prostático normal de dois pacientes jovens doadores de órgãos. A análise proteica foi feita a partir de 38 pacientes, pela técnica de Western Blotting. Resultados: Os miRNA 143 e 145, apresentaram superexpressão em 62,5% e 73,8% dos casos, respectivamente. O gene ERK5 apresentou subexpressão de 59,4%, evidenciando um possível controle negativo por parte do miR-143. O gene MAP4K4 apresentou subexpressão na totalidade das amostras estudadas, demonstrando um possível controle por parte do miR-145. Os genes KRAS e MAP3K3 apresentaram superexpressão de 79,4% e 61,5% das amostras, respectivamente. De acordo com a expressão proteica, encontramos perfis semelhantes aos da expressão gênica. Foi encontrada maior expressão das proteínas KRAS e MAP3K3. Considerando a expressão gênica e proteica comparadas aos parâmetros clínicos, somente a proteína ERK5 apresentou significância (p=0,019), estando mais presente em pacientes com próstatas > 60 gramas. Conclusão: A superexpressão dos miRNAs 143 e 145 encontrada neste estudo pode estar envolvida na etiopatogenia da HPB alterando a homeostase do tecido fibromuscular principalmente, controlando proliferação e diferenciação. A superexpressão gênica e a forte expressão proteica de KRAS também pode estar envolvida na etiopatogenia da HPB, já que esta molécula quando ativada é responsável pelo estímulo de vias que resultam na proliferação, sobrevivência, motilidade celular e tráfego intracelular. A superexpressão do MAP3K3 pode estar sendo responsável pela angiogênese que ocorre em HPB. A subexpressão de MAP4K4, neste caso possivelmente controlada por miR-145, pode estar deixando de regular negativamente mTOR, gerando uma proliferação celular irregular responsável pela HPB. A detecção das proteínas em níveis semelhantes aos que foram encontrados na expressão gênica reforça estas hipóteses. / Introduction: Benign prostatic hyperplasia (BPH) is one of the most common male health problems associated with aging. The incidence of disease starts to increase after 40 years, and compromises half of men in the fifths and almost 90% over 80 years. The pathogenesis of BPH has not been fully elucidated, but it is known that some factors increase the risk of occurrence of the problem. A better understanding of BPH pathogenesis would substantially contribute to the establishment of a therapeutic consensus for the disease. Thus, molecular markers have been investigated attempting to help or even overcome the efficiency of traditional methods. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small non-coding regulatory RNA (19-25 nucleotides) that plays a key role in gene expression control. These small molecules are involved in various physiological and pathological cellular processes. Some studies have shown that miRNAs 143 and 145 play a fundamental role in cellular differentiation and proliferation of smooth muscles. The action of miRNAs in BPH has been poorly explored. Objectives: Analyze the expression of miR-143 and its target genes and proteins ERK5 and KRAS and miR-145 and its target genes and proteins MAP3K3 and MAP4K4, in patients with BPH and compare their expression profiles with clinical parameters of patients. Material and Methods: For analysis of miRNAs and its target genes, we studied 44 patients diagnosed with BPH undergoing transurethral resection of the prostate or open prostatectomy. The expression analysis was performed by quantitative RT-PCR. Control group consisted of normal prostate tissue from two young patients organ donors. Protein analysis was done from of 38 patients using Western Blotting technique. Results: miR-143 and 145 presented overexpression in 62.5% and 73.8% of cases, respectively. The ERK5 gene demonstrated underexpression in 59.4%, indicating a possible control by the miR-143. MAP4K4 gene showed underexpression in 100% of samples and could be under a potential control by the miR-145. KRAS and MAP3K3 genes revealed overexpression of 79.4% and 61.5% of cases, respectively. According protein expression, to find similar profiles of gene expression. We found an increased expression of the proteins MAP3K3 and KRAS. Considering the gene expression and protein compared to clinical parameters, only the protein ERK5 showed significance (p = 0.019), being more present in patients with prostates > 60 grams. Conclusions: Overexpression of miRNAs 143 and 145 found in this work may be involved in the pathogenesis of BPH mainly by changing the fibromuscular tissue homeostasis, controlling proliferation and differentiation. Overexpression of KRAS may also be involved in the pathogenesis of BPH, since this molecule when activated can trigger cell proliferation, survival, intracellular trafficking and motility. Overexpression of MAP3K3 can be responsible for BPH angiogenesis. The MAP4K4 underexpression, in this case possibly controlled by miR-145 overexpression, could inhibit mTOR pathway, leading to irregular cell proliferation responsible for disease. Detection of proteins at similar levels to those found in gene expression reinforce our hypothesis.

Polimorfismos de um nucleotídeo (SNPs) podem alterar, além de códons de leitura da tradução de genes, posições genômicas importantes do processo de regulação gênica, como sítios de iniciação de transcrição, de splicing e, mais especificamente, sítios alvos de microRNAs (miRNAs). Em parti- cular, a identificação de SNPs alterando sítios alvos de miRNAs é um problema em aberto, embora venha ganhando um importante destaque nos últimos anos decorrente dos avanços descobertos sobre a capacidade dos miRNAs como elementos reguladores do genoma, associados inclusive a muitas doenças como o câncer e vários transtornos psiquiátricos. Os recursos computacionais atualmente disponíveis para esta finalidade (alguns bancos de dados e uma ferramenta) estão restritos à análise de SNPs na região 3UTR (UnTranslated Regions) de RNAs mensageiros, onde miRNAs geralmente se ligam para reprimir sua tradução. No entanto, essa é uma simplificação do problema, dado que já se conhece a regulação por miRNAs ativando ou reprimindo a transcrição gênica quando ligados à sua região promotora, aumentando a efetividade da regulação negativa da tradução quando ligados à região codificante do gene ou ainda miRNAs se ligando a RNAs não codificantes. Esses recursos se limitam também à identificação de SNPs na região seed dos sítios de miRNAs, e portanto só identificam criação ou ruptura de sítios. Porém, SNPs localizados fora dessa região não só podem colaborar na criação e ruptura de sítios como também interferir na estabilidade de ligação de miRNAs e, por- tanto, na efetividade da regulação. Além disso, considerando toda a extensão do sítio, não somente a seed , é possível ocorrer mais de um SNP e, sendo assim, a combinação desses SNPs pode ter uma influência ainda maior na ligação com o miRNA. Os recursos atuais também não informam quais alelos dos SNPs, muito menos quais combinações deles, estão causando qual efeito. Por fim, tais recursos estão restritos a Homo sapiens e Mus musculus. Assim, este trabalho apresenta a ferramenta computacional SIMTar (SNPs Interfering in MicroRNA Targets), desenvolvida para identificar SNPs que alteram sítios alvos de miRNAs e que preenche as lacunas mencionadas. Além disso, é descrita uma aplicação de SIMTar na análise de 114 SNPs associados à esquizofrenia, na qual todos foram preditos interferindo em sítios alvos de miRNAs. / Single nucleotide polymorphisms (SNPs) can be involved in alteration of not only open reading frame but also important genomic positions of gene regulation process such as transcription initiation sites, splicing sites and microRNA target sites. In particular, the identification of SNPs interfering on microRNA target sites is still an open problem, despite its increasing prominence in recent years due to the discoveries about the microRNA abilities as regulatory elements in the genome and association with severals diseases such as cancer and psychiatric disorders. The computational resources currently available for this purpose (four databases and one tool) are restricted to the analysis of SNPs in the 3UTR (UnTranslated Regions) of mRNAs, where the microRNAs typically bind in order to repress their translation. However, this is a simplification of the problem, since it is already known the gene transcription activation by microRNAs bound to its promoter region, increasing of the effectiveness of negative regulation of translation when microRNAs are bound to the coding region of the gene or binding of microRNA into non-coding RNAs. These resources are also limited to the identification of SNPs in the seed region of miRNAs, and therefore they can only identify sites creation or disruption. However, SNPs located outside this region can not only create and disrupt target sites but also interfere on the stability of miRNAs binding and therefore on the regulation effectiveness. Moreover, considering the target site length, more than one SNP can occur inside of a site and thus, the combination of these SNPs can have an even greater influence on the microRNA binding. Also, current resources do not display which alleles of SNPs or what combinations of them are causing which effect. Finally, these features are restricted to the Homo sapiens and Mus musculus species. This work presents the computational tool SIMTar (SNPs Interfering on MicroRNA Targets), developed to identify SNPs that alter miRNA target sites and fills the mentioned gaps. Finally, it is described an application of SIMTar on the analysis of 114 SNPs associated with schizophrenia, all of them being predicted interfering with miRNA target sites.

O carcinoma de célula renal (RCC) subtipo célula clara é o câncer mais letal e prevalente do sistema urinário. O diagnóstico deste tipo de câncer frequentemente é tardio em conseqüência da falta de sintomas perceptíveis aos pacientes. Um dos objetivos deste trabalho é a identificação de novos marcadores moleculares para diagnóstico precoce, o que ajudaria a diminuir a mortalidade em função de complicações resultantes do avanço da doença. Outro objetivo é a identificação de um conjunto de marcadores moleculares de prognóstico, de modo à prever com acurácia a evolução clínica da doença e, por conseqüência, o tempo de sobrevida do paciente. As modificações transcricionais associadas à carcinogênese e à progressão do câncer de rim ainda não foram completamente elucidadas. Além dos oncogenes e genes supressores de tumor, RNAs não-codificadores (ncRNAs) recentemente foram apontados como importantes reguladores da expressão gênica em humanos, e podem ter um papel importante na transformação maligna do câncer de rim. Para analisar a expressão gênica de ncRNAs e de genes codificadores para proteína foram utilizados dois microarranjos desenvolvidos por nosso grupo, enriquecidos em sondas para ncRNAs. Uma das plataformas possui 4 mil sondas de cDNA, das quais 822 sondas são para ncRNAs mapeando em regiões intrônicas. Outra possui 44 mil elementos e combina sondas de oligonucleotídeos (60-mer) intrônicas e exônicas de um mesmo locus genômico. Análises estatísticas foram feitas com a ferramenta Significance Analysis of Microarrays (q &#8804; 0,05) combinadas ou com a técnica de \"patient leave-one-out\" (genes com presença em 8 100% dos subconjuntos), ou alternativamente com o teste discriminante de Golub (p &#8804; 0,01 ou p < 0,05). Com a plataforma de 4 mil sondas foram estudadas 30 amostras de tecido renal de 18 pacientes com RCC subtipo célula clara. Um conjunto de 36 ncRNAs foi identificado como diferencialmente expresso entre amostras tumorais e não-tumorais. Uma assinatura adicional de 265 genes codificadores de proteínas foi identificada, indicando possíveis novos marcadores moleculares. Uma análise estatística supervisionada com dados de 16 pacientes identificou uma assinatura de ncRNAs correlacionada com sobrevida de 5 anos, formada por 27 ncRNAs com significativa expressão alterada em pacientes livres da doença em comparação com pacientes que morreram em função da doença. Uma assinatura adicional de 64 genes codificadores de proteínas também foi identificada como significativamente correlacionada com o acompanhamento clínico dos pacientes. Com a plataforma de 44 mil sondas foram analisados 17 pacientes, com amostras pareadas de tecido renal tumoral e não-tumoral agrupadas em 8 pools, sendo 4 de amostras tumorais e 4 de não-tumorais. Um conjunto de 66 ncRNAs parcialmente intrônicos antisenso e outro de 52 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso foram identificados como diferencialmente expressos. Identificamos um subconjunto de 28 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso e senso cuja expressão do gene codificador de proteína do mesmo locus estava simultaneamente alterada. Estes dados apontam para possíveis redes de regulação da expressão gênica dos ncRNAs em câncer. A extensa lista de ncRNAs e de genes codificadores para proteína identificados neste estudo podem ser promissores marcadores moleculares de carcinoma renal subtipo célula clara. / Renal cell carcinoma (RCC) is the most common malignancy of the adult kidney, and the clear cell subtype is the most prevalent and lethal cancer of the urinary system. Late diagnosis for this type of cancer is frequent, usually as a consequence of the lack of symptoms. One of the objectives of the present work is the identification of new molecular markers for the early diagnosis, which would help decrease mortality that develops as a function of disease progression. Another objective is the identification of a set of prognosis molecular markers, so as to accurately predict the clinical outcome of the disease, and consequently, patient survival. Transcriptional changes associated to carcinogenesis and to kidney cancer progression have not been entirely elucidated. Besides oncogenes and tumor suppressor genes, non-coding RNAs (ncRNAs) have been recently indicated as important regulators of gene expression in humans, and could have an important role in the malignant transformation in renal cancer. In order to measure ncRNA and protein-coding gene expression we have used two microarray platforms developed by our group, which are enriched in ncRNA probes. One of the platforms has 4 thousand cDNA probes, of which 822 are for ncRNAs that map to intronic regions. Another has 44 thousand elements and combines 60-mer oligonucleotide probes for intronic and exonic regions from the same genomic locus. Statistical analyses have been performed with the Significance Analysis of Microarrays tool (q &#8804; 0.05) combined with a patient leave-one-out approach (genes present in 100% of the sub-sets), or alternatively with Golubs discriminant test (p &#8804; 0.01 or p < 0.05). 11 With the 4-thousand probes platform we studied 30 samples from renal tissue of 18 RCC patients with clear cell subtype. A set of 36 ncRNAs has been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. An additional signature of 265 protein-coding genes has been identified, indicating possible new molecular markers. A supervised statistical analysis with data from 16 patients has identified a ncRNA signature correlated to 5-year survival outcome, comprised of 27 ncRNAs with significantly altered expression in diseasefree patients compared to patients who died from cancer within the 5-year follow-up. An additional 64-gene signature of protein-coding genes has been identified as significantly correlated to clinical outcome. With the 44-thousand probes platform we have analyzed 17 patients, with paired tumor and non-tumor samples grouped into 8 pools, of which 4 were from tumor and 4 from nontumor samples. A set of 66 partially intronic antisense ncRNAs and another of 52 totally intronic antisense ncRNAs have been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. A sub-set of 28 totally intronic antisense or sense ncRNAs were identified as having a simultaneous change in expression of the protein-coding gene from the same locus. Overall, the data point to a possible ncRNA regulatory network in cancer. The extensive lists of ncRNAs and of protein-coding genes identified in the present study can be seen as promising molecular markers of RCC from the clear-cell subtype.

O câncer de mama é o carcinoma que mais acomete mulheres no Brasil. Os tratamentos disponíveis são recomendados a partir da análise de fatores de prognóstico como a classificação pelo sistema TNM, tipo histológico, status de receptores hormonais e marcadores de proliferação tumoral. No entanto, a classificação dos tumores de mama é muito variável e o poder prognóstico dos marcadores tumorais atuais ainda é limitado, levando muitas pacientes à terapia adjuvante desnecessária. Portanto, novos métodos de prognóstico mais sensíveis são necessários para melhorar a tomada de decisão na clínica oncológica de pacientes com câncer de mama. Do ponto de vista de ciência básica, as modificações transcricionais associadas à oncogênese e progressão do câncer de mama ainda são pouco conhecidas. Além da alteração na expressão de genes codificadores para proteínas, evidências recentes sugerem que RNAs não-codificadores (ncRNAs) podem ter um papel importante na transformação maligna. Este projeto teve como principais objetivos: i) investigar a expressão de ncRNAs intrônicos em amostras de adenocarcinoma de mama e ii) identificar assinaturas de expressão gênica associadas a características anatomo-patológicas e clínicas de tumores de mama com potencial aplicação clínica. Para isso, foram comparados os perfis de expressão gênica de 58 amostras de tecido tumoral de mama, com seguimento clínico conhecido, utilizando uma plataforma de microarranjos de cDNA, enriquecida em ncRNAs provenientes de regiões intrônicas de genes humanos conhecidos. 9 Durante o projeto foram testadas diferentes metodologias para análise da expressão gênica utilizando microarranjos de cDNA com uma ou duas cores. O desenho experimental das hibridizações incluiu a co-hibridização de cada microarranjo com alvos fluorescentes representando o transcritoma da amostra de tumor juntamente com um oligonucleotídeo referência complementar a uma região presente em todas as sondas de cDNA (RefOligo). Este desenho experimental permitiu a avaliação de duas abordagens de análise da expressão gênica: a primeira baseada nas intensidades diretas de cada transcrito (One-Color) e a segunda baseada em razões de expressão onde a intensidade de cada transcrito foi normalizada pelo oligonucleotídeo referência (RefOligo). A utilização direta das intensidades se mostrou mais reprodutível e sensível para a detecção de assinaturas de expressão correlacionadas com características das amostras de mama, e essa abordagem foi escolhida para as análises subseqüentes. Os dados provenientes dos experimentos de microarranjos revelaram níveis de expressão ubíqüos dos transcritos intrônicos nas amostras analisadas, extendendo para o câncer de mama a relevância do estudo desta classe de ncRNAs. Além disso, foi identificada uma assinatura contendo 95 transcritos, correlacionada com o status de expressão do receptor de estrogênio (REr), dos quais cerca de 15% correspondem a ncRNAs. Utilizando apenas amostras com seguimento clínico superior a 4 anos, foi identificada uma assinatura com 113 transcritos, dos quais cerca de 30% são ncRNAs intrônicos, capaz de distinguir com 100% de acurácia pacientes que desenvolveram metástase daqueles que permaneceram livres da doença. Além de contribuir com novos candidatos a marcadores de prognóstico no câncer de mama, este estudo aponta para a participação de ncRNAs intrônicos em complexas redes transcricionais, possivelmente modulando a expressão de genes codificadores para proteínas. A caracterização detalhada da função de ncRNAs com expressão correlacionada a características fenotípicas e clínicas dos tumores de mama deverá fornecer novas informações sobre as bases moleculares da tumorigênese e progressão desta neoplasia. / Breast carcinoma is the most frequently occurring cancer amongst women in Brazil. The treatments available for breast cancer are prescribed based on the results of prognostic factors, such as the TNM classification system, histological type, hormonal receptor status and tumoral markers for cell proliferation. Nevertheless, breast cancer classification can be variable and inconsistent, and the prognosis power of tumoral markers is still limited, resulting in many patients unnecessarily undergoing adjuvant therapy. Therefore, there is an urge for new prognosis methods that are more sensitive, as well as accurate, in order to improve treatment decisions for breast cancer patients. From a basic science perspective, transcriptional modifications associated with oncogenesis and breast cancer progression are still poorly understood. Beyond alterations of the expression of protein-coding genes, recent evidences suggest that non-coding RNAs (ncRNAs) might have an important role in malignant transformation. The main goals of this project are: i) to investigate the expression of intronic ncRNAs in breast cancer tissue and ii) to identify gene expression signatures correlated to anatomo-pathological and clinical characteristics of human breast tumors, with a potential clinical aplication. To achieve this, gene expression profiles of 58 breast tumor samples with clinical follow-up were compared using a microarray platform enriched in non-coding RNAs (ncRNAs) derived from intronic regions of known human genes. During this project different gene expression methodologies were tested for the analysis of one- or two-color cDNA microarrays. The experimental design included the co-hybridization of the microarrays with fluorescent targets representing the tumor sample transcriptome with a reference oligonucleotide that is complementary to a 12 common region present in all cDNA probes (RefOligo). This experimental design permited the evaluation of two gene expression analysis approaches: the first based on direct intensities of each transcript (One-Color) and the second based in expression ratios where the intensity of each transcript is normalized by the reference oligonucleotide (RefOligo). One-Color methodology has shown to provide a more reproducible and sensitive gene expression signatures correlated to the breast samples characteristics and, therefore, this approach was chosen for subsequent analysis. The data provided by the microarray experiments revealed that ubiquitous expression of intronic ncRNAs was observed, confirming the relevance of investigating the role of this class of ncRNAs in breast cancer. Furthermore, a gene expression signature comprising 95 transcripts and correlated to the estrogen receptor status of breast tumor samples was identified, from which approximately 15% are ncRNAs. Using only samples from patients with known follow-up, a signature of 113 transcripts was identified, of which 30% are ncRNAs. This gene expression signature was able to distinguish with 100% accuracy patients that developed metastasis from those that remained disease-free up to 4 years after surgery. Besides the contribution of new molecular prognostic markers for breast cancer, the present study indicates that intronic ncRNAs might play a role in complex transcriptional networks, possibly regulating the expression of protein-coding genes. The detailed caracterization of the functional roles of ncRNAs, whose expression levels are correlated to fenotypical and clinical characteristics of breast tumors, is likely to provide new insigths on the molecular basis of tumorigenesis and progression of this neoplasia.

Introdução: A hiperplasia prostática benigna (HPB) é apontada como um dos mais comuns problemas de saúde associado ao envelhecimento dos homens. A incidência da doença começa a aumentar a partir dos 40 anos de idade, e se torna frequente em cerca de 50% dos homens com 50 anos e em quase 90% dos homens após a oitava década. A etiopatogenia da HPB ainda não foi totalmente elucidada, mas sabe-se que alguns fatores aumentam os riscos de aparecimento do problema. Seu melhor entendimento contribuiria substancialmente para o estabelecimento de um consenso terapêutico para a doença. Nesse sentido, os marcadores moleculares têm sido pesquisados na tentativa de auxiliar ou mesmo suplantar a eficiência dos métodos tradicionais. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNA regulatórios (19-25 nucleotídeos), não codificadores que possuem um papel fundamental no controle da expressão gênica. Essas pequenas moléculas estão envolvidas em vários processos celulares fisiológicos e patológicos. Alguns estudos demonstraram que os miRNAs 143 e 145 têm papel fundamental na diferenciação e proliferação celular da musculatura lisa. A ação de miRNAs na HPB ainda foi pouco explorada. Objetivos: Analisar a expressão do miR-143 e de seus genes e proteínas alvo ERK5 e KRAS e do miR-145 e dos seus genes e proteínas alvo MAP3K3 e MAP4K4, em pacientes portadores de HPB e comparar os perfis de expressão destes com parâmetros clínicos dos pacientes. Material e Métodos: Para análise dos miRNAs e dos seus genes alvo, foram estudados 44 pacientes diagnosticados com HPB submetidos à ressecção transuretral da próstata ou prostatectomia aberta. A análise da expressão foi realizada pela técnica de RT-PCR quantitativo. O grupo controle foi composto de tecido prostático normal de dois pacientes jovens doadores de órgãos. A análise proteica foi feita a partir de 38 pacientes, pela técnica de Western Blotting. Resultados: Os miRNA 143 e 145, apresentaram superexpressão em 62,5% e 73,8% dos casos, respectivamente. O gene ERK5 apresentou subexpressão de 59,4%, evidenciando um possível controle negativo por parte do miR-143. O gene MAP4K4 apresentou subexpressão na totalidade das amostras estudadas, demonstrando um possível controle por parte do miR-145. Os genes KRAS e MAP3K3 apresentaram superexpressão de 79,4% e 61,5% das amostras, respectivamente. De acordo com a expressão proteica, encontramos perfis semelhantes aos da expressão gênica. Foi encontrada maior expressão das proteínas KRAS e MAP3K3. Considerando a expressão gênica e proteica comparadas aos parâmetros clínicos, somente a proteína ERK5 apresentou significância (p=0,019), estando mais presente em pacientes com próstatas > 60 gramas. Conclusão: A superexpressão dos miRNAs 143 e 145 encontrada neste estudo pode estar envolvida na etiopatogenia da HPB alterando a homeostase do tecido fibromuscular principalmente, controlando proliferação e diferenciação. A superexpressão gênica e a forte expressão proteica de KRAS também pode estar envolvida na etiopatogenia da HPB, já que esta molécula quando ativada é responsável pelo estímulo de vias que resultam na proliferação, sobrevivência, motilidade celular e tráfego intracelular. A superexpressão do MAP3K3 pode estar sendo responsável pela angiogênese que ocorre em HPB. A subexpressão de MAP4K4, neste caso possivelmente controlada por miR-145, pode estar deixando de regular negativamente mTOR, gerando uma proliferação celular irregular responsável pela HPB. A detecção das proteínas em níveis semelhantes aos que foram encontrados na expressão gênica reforça estas hipóteses. / Introduction: Benign prostatic hyperplasia (BPH) is one of the most common male health problems associated with aging. The incidence of disease starts to increase after 40 years, and compromises half of men in the fifths and almost 90% over 80 years. The pathogenesis of BPH has not been fully elucidated, but it is known that some factors increase the risk of occurrence of the problem. A better understanding of BPH pathogenesis would substantially contribute to the establishment of a therapeutic consensus for the disease. Thus, molecular markers have been investigated attempting to help or even overcome the efficiency of traditional methods. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small non-coding regulatory RNA (19-25 nucleotides) that plays a key role in gene expression control. These small molecules are involved in various physiological and pathological cellular processes. Some studies have shown that miRNAs 143 and 145 play a fundamental role in cellular differentiation and proliferation of smooth muscles. The action of miRNAs in BPH has been poorly explored. Objectives: Analyze the expression of miR-143 and its target genes and proteins ERK5 and KRAS and miR-145 and its target genes and proteins MAP3K3 and MAP4K4, in patients with BPH and compare their expression profiles with clinical parameters of patients. Material and Methods: For analysis of miRNAs and its target genes, we studied 44 patients diagnosed with BPH undergoing transurethral resection of the prostate or open prostatectomy. The expression analysis was performed by quantitative RT-PCR. Control group consisted of normal prostate tissue from two young patients organ donors. Protein analysis was done from of 38 patients using Western Blotting technique. Results: miR-143 and 145 presented overexpression in 62.5% and 73.8% of cases, respectively. The ERK5 gene demonstrated underexpression in 59.4%, indicating a possible control by the miR-143. MAP4K4 gene showed underexpression in 100% of samples and could be under a potential control by the miR-145. KRAS and MAP3K3 genes revealed overexpression of 79.4% and 61.5% of cases, respectively. According protein expression, to find similar profiles of gene expression. We found an increased expression of the proteins MAP3K3 and KRAS. Considering the gene expression and protein compared to clinical parameters, only the protein ERK5 showed significance (p = 0.019), being more present in patients with prostates > 60 grams. Conclusions: Overexpression of miRNAs 143 and 145 found in this work may be involved in the pathogenesis of BPH mainly by changing the fibromuscular tissue homeostasis, controlling proliferation and differentiation. Overexpression of KRAS may also be involved in the pathogenesis of BPH, since this molecule when activated can trigger cell proliferation, survival, intracellular trafficking and motility. Overexpression of MAP3K3 can be responsible for BPH angiogenesis. The MAP4K4 underexpression, in this case possibly controlled by miR-145 overexpression, could inhibit mTOR pathway, leading to irregular cell proliferation responsible for disease. Detection of proteins at similar levels to those found in gene expression reinforce our hypothesis.

La maladie de Chagas est une maladie parasitaire causée par le protozoaire Trypanosoma cruzi et transmise par des insectes hématophages . Elle est composée de 2 phases : la phase aiguë et la phase chronique. Parmi les individus infectés, 30 % développent la forme chronique de la maladie. Les patients présentent des atteintes cardiaques, digestives (œsophage, côlon) et cardiodigestives. Notre étude a été focalisée sur les patients atteints de cardiomyopathie chagasique (CCC). Notre objectif est d’identifier des gènes de susceptibilité pouvant être impliqués dans le développement des formes chroniques. Notre étude a permis de mettre en évidence une variation d’expression de certains gènes entre les CCC et les contrôles. Nous nous sommes également intéressés aux processus épigénétiques pouvant réguler l’expression des gènes. Une étude de la méthylation de l’ADN croisée avec l’étude du transcriptome nous ont permis d’identifier des gènes présentant à la fois des variations d’expression et de méthylation. Pour certains de ces gènes, nous avons démontré que la méthylation est responsable de la variation d’expression observée. Enfin, nous avons étudié un ARN long non-codant, MIAT. Nous avons démontré qu’il est surexprimé chez les CCC par rapport aux contrôles et dans un modèle murin infecté par T. cruzi. De plus, l’analyse de l’expression de micro-ARNs couplée à une analyse de transcriptome nous a permis d'identifier plusieurs micro-ARNs indispensables à la régulation de l’expression des gènes. Enfin, une étude protéomique nous a permis de mettre en évidence une augmentation de la production de protéine pour certains gènes, en lien avec l’augmentation de l’expression observée. / Chagas disease is a parasitic disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and transmitted by the hematophagous insects. The disease is composed by acute and chronic phases. Among the infected individuals, 30 % develop chronic form. They suffer from heart, digestive (esophagus, colon) and cardiodigestives injury. Our study was focused on patients with dilated chagasic cardiomyopathy (CCC). Our goal is to identify susceptibility genes that may be involved in the development of chronic forms. Our study revealed a variation in the expression of certain genes between CCC group and controls. We are also interested in epigenetic processes that can regulate the expression of genes. A study of the DNA methylation crossed with the transcriptome allowed us to identify genes presenting both variations in expression and methylation. For some of these genes we demonstrated that methylation is responsible for the expression variation observed. Finally, we studied a long non-coding RNA called MIAT. Our study demonstrated that it is overexpressed in CCC compared to controls and in a murine model infected by T. cruzi. Furthermore, the analysis of the expression of micro-RNAs crossed with transcriptome analysis allowed us to identify several micro-RNAs whose functions are essential in the regulation of gene expression. Finally, a proteomic study allowed us to demonstrate an increase in the production of protein for certain genes, correlated with the increase in expression levels observed.

O carcinoma de célula renal (RCC) subtipo célula clara é o câncer mais letal e prevalente do sistema urinário. O diagnóstico deste tipo de câncer frequentemente é tardio em conseqüência da falta de sintomas perceptíveis aos pacientes. Um dos objetivos deste trabalho é a identificação de novos marcadores moleculares para diagnóstico precoce, o que ajudaria a diminuir a mortalidade em função de complicações resultantes do avanço da doença. Outro objetivo é a identificação de um conjunto de marcadores moleculares de prognóstico, de modo à prever com acurácia a evolução clínica da doença e, por conseqüência, o tempo de sobrevida do paciente. As modificações transcricionais associadas à carcinogênese e à progressão do câncer de rim ainda não foram completamente elucidadas. Além dos oncogenes e genes supressores de tumor, RNAs não-codificadores (ncRNAs) recentemente foram apontados como importantes reguladores da expressão gênica em humanos, e podem ter um papel importante na transformação maligna do câncer de rim. Para analisar a expressão gênica de ncRNAs e de genes codificadores para proteína foram utilizados dois microarranjos desenvolvidos por nosso grupo, enriquecidos em sondas para ncRNAs. Uma das plataformas possui 4 mil sondas de cDNA, das quais 822 sondas são para ncRNAs mapeando em regiões intrônicas. Outra possui 44 mil elementos e combina sondas de oligonucleotídeos (60-mer) intrônicas e exônicas de um mesmo locus genômico. Análises estatísticas foram feitas com a ferramenta Significance Analysis of Microarrays (q &#8804; 0,05) combinadas ou com a técnica de \"patient leave-one-out\" (genes com presença em 8 100% dos subconjuntos), ou alternativamente com o teste discriminante de Golub (p &#8804; 0,01 ou p < 0,05). Com a plataforma de 4 mil sondas foram estudadas 30 amostras de tecido renal de 18 pacientes com RCC subtipo célula clara. Um conjunto de 36 ncRNAs foi identificado como diferencialmente expresso entre amostras tumorais e não-tumorais. Uma assinatura adicional de 265 genes codificadores de proteínas foi identificada, indicando possíveis novos marcadores moleculares. Uma análise estatística supervisionada com dados de 16 pacientes identificou uma assinatura de ncRNAs correlacionada com sobrevida de 5 anos, formada por 27 ncRNAs com significativa expressão alterada em pacientes livres da doença em comparação com pacientes que morreram em função da doença. Uma assinatura adicional de 64 genes codificadores de proteínas também foi identificada como significativamente correlacionada com o acompanhamento clínico dos pacientes. Com a plataforma de 44 mil sondas foram analisados 17 pacientes, com amostras pareadas de tecido renal tumoral e não-tumoral agrupadas em 8 pools, sendo 4 de amostras tumorais e 4 de não-tumorais. Um conjunto de 66 ncRNAs parcialmente intrônicos antisenso e outro de 52 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso foram identificados como diferencialmente expressos. Identificamos um subconjunto de 28 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso e senso cuja expressão do gene codificador de proteína do mesmo locus estava simultaneamente alterada. Estes dados apontam para possíveis redes de regulação da expressão gênica dos ncRNAs em câncer. A extensa lista de ncRNAs e de genes codificadores para proteína identificados neste estudo podem ser promissores marcadores moleculares de carcinoma renal subtipo célula clara. / Renal cell carcinoma (RCC) is the most common malignancy of the adult kidney, and the clear cell subtype is the most prevalent and lethal cancer of the urinary system. Late diagnosis for this type of cancer is frequent, usually as a consequence of the lack of symptoms. One of the objectives of the present work is the identification of new molecular markers for the early diagnosis, which would help decrease mortality that develops as a function of disease progression. Another objective is the identification of a set of prognosis molecular markers, so as to accurately predict the clinical outcome of the disease, and consequently, patient survival. Transcriptional changes associated to carcinogenesis and to kidney cancer progression have not been entirely elucidated. Besides oncogenes and tumor suppressor genes, non-coding RNAs (ncRNAs) have been recently indicated as important regulators of gene expression in humans, and could have an important role in the malignant transformation in renal cancer. In order to measure ncRNA and protein-coding gene expression we have used two microarray platforms developed by our group, which are enriched in ncRNA probes. One of the platforms has 4 thousand cDNA probes, of which 822 are for ncRNAs that map to intronic regions. Another has 44 thousand elements and combines 60-mer oligonucleotide probes for intronic and exonic regions from the same genomic locus. Statistical analyses have been performed with the Significance Analysis of Microarrays tool (q &#8804; 0.05) combined with a patient leave-one-out approach (genes present in 100% of the sub-sets), or alternatively with Golubs discriminant test (p &#8804; 0.01 or p < 0.05). 11 With the 4-thousand probes platform we studied 30 samples from renal tissue of 18 RCC patients with clear cell subtype. A set of 36 ncRNAs has been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. An additional signature of 265 protein-coding genes has been identified, indicating possible new molecular markers. A supervised statistical analysis with data from 16 patients has identified a ncRNA signature correlated to 5-year survival outcome, comprised of 27 ncRNAs with significantly altered expression in diseasefree patients compared to patients who died from cancer within the 5-year follow-up. An additional 64-gene signature of protein-coding genes has been identified as significantly correlated to clinical outcome. With the 44-thousand probes platform we have analyzed 17 patients, with paired tumor and non-tumor samples grouped into 8 pools, of which 4 were from tumor and 4 from nontumor samples. A set of 66 partially intronic antisense ncRNAs and another of 52 totally intronic antisense ncRNAs have been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. A sub-set of 28 totally intronic antisense or sense ncRNAs were identified as having a simultaneous change in expression of the protein-coding gene from the same locus. Overall, the data point to a possible ncRNA regulatory network in cancer. The extensive lists of ncRNAs and of protein-coding genes identified in the present study can be seen as promising molecular markers of RCC from the clear-cell subtype.

Polimorfismos de um nucleotídeo (SNPs) podem alterar, além de códons de leitura da tradução de genes, posições genômicas importantes do processo de regulação gênica, como sítios de iniciação de transcrição, de splicing e, mais especificamente, sítios alvos de microRNAs (miRNAs). Em parti- cular, a identificação de SNPs alterando sítios alvos de miRNAs é um problema em aberto, embora venha ganhando um importante destaque nos últimos anos decorrente dos avanços descobertos sobre a capacidade dos miRNAs como elementos reguladores do genoma, associados inclusive a muitas doenças como o câncer e vários transtornos psiquiátricos. Os recursos computacionais atualmente disponíveis para esta finalidade (alguns bancos de dados e uma ferramenta) estão restritos à análise de SNPs na região 3UTR (UnTranslated Regions) de RNAs mensageiros, onde miRNAs geralmente se ligam para reprimir sua tradução. No entanto, essa é uma simplificação do problema, dado que já se conhece a regulação por miRNAs ativando ou reprimindo a transcrição gênica quando ligados à sua região promotora, aumentando a efetividade da regulação negativa da tradução quando ligados à região codificante do gene ou ainda miRNAs se ligando a RNAs não codificantes. Esses recursos se limitam também à identificação de SNPs na região seed dos sítios de miRNAs, e portanto só identificam criação ou ruptura de sítios. Porém, SNPs localizados fora dessa região não só podem colaborar na criação e ruptura de sítios como também interferir na estabilidade de ligação de miRNAs e, por- tanto, na efetividade da regulação. Além disso, considerando toda a extensão do sítio, não somente a seed , é possível ocorrer mais de um SNP e, sendo assim, a combinação desses SNPs pode ter uma influência ainda maior na ligação com o miRNA. Os recursos atuais também não informam quais alelos dos SNPs, muito menos quais combinações deles, estão causando qual efeito. Por fim, tais recursos estão restritos a Homo sapiens e Mus musculus. Assim, este trabalho apresenta a ferramenta computacional SIMTar (SNPs Interfering in MicroRNA Targets), desenvolvida para identificar SNPs que alteram sítios alvos de miRNAs e que preenche as lacunas mencionadas. Além disso, é descrita uma aplicação de SIMTar na análise de 114 SNPs associados à esquizofrenia, na qual todos foram preditos interferindo em sítios alvos de miRNAs. / Single nucleotide polymorphisms (SNPs) can be involved in alteration of not only open reading frame but also important genomic positions of gene regulation process such as transcription initiation sites, splicing sites and microRNA target sites. In particular, the identification of SNPs interfering on microRNA target sites is still an open problem, despite its increasing prominence in recent years due to the discoveries about the microRNA abilities as regulatory elements in the genome and association with severals diseases such as cancer and psychiatric disorders. The computational resources currently available for this purpose (four databases and one tool) are restricted to the analysis of SNPs in the 3UTR (UnTranslated Regions) of mRNAs, where the microRNAs typically bind in order to repress their translation. However, this is a simplification of the problem, since it is already known the gene transcription activation by microRNAs bound to its promoter region, increasing of the effectiveness of negative regulation of translation when microRNAs are bound to the coding region of the gene or binding of microRNA into non-coding RNAs. These resources are also limited to the identification of SNPs in the seed region of miRNAs, and therefore they can only identify sites creation or disruption. However, SNPs located outside this region can not only create and disrupt target sites but also interfere on the stability of miRNAs binding and therefore on the regulation effectiveness. Moreover, considering the target site length, more than one SNP can occur inside of a site and thus, the combination of these SNPs can have an even greater influence on the microRNA binding. Also, current resources do not display which alleles of SNPs or what combinations of them are causing which effect. Finally, these features are restricted to the Homo sapiens and Mus musculus species. This work presents the computational tool SIMTar (SNPs Interfering on MicroRNA Targets), developed to identify SNPs that alter miRNA target sites and fills the mentioned gaps. Finally, it is described an application of SIMTar on the analysis of 114 SNPs associated with schizophrenia, all of them being predicted interfering with miRNA target sites.