CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O acidente vascular cerebral (AVC) resulta da interrupÃÃo aguda do fluxo sanguÃneo aos tecidos cerebrais, resultando no decrÃscimo de oxigÃnio e glicose para os tecidos e consequentemente em perda rÃpida da funÃÃo neurolÃgica. à a segunda principal causa de morte no mundo e uma das principais causas de incapacidade fÃsica segundo dados da OrganizaÃÃo Mundial de SaÃde. No Brasil ocorrem cerca de 100 mil Ãbitos por ano devido ao AVC. O AVC pode ser dividido em dois tipos, isquÃmico, quando ocorre a interrupÃÃo do fluxo sanguÃneo devido à obstruÃÃo por um trombo ou Ãmbolo, e hemorrÃgico, quando ocorre rompimento de uma artÃria cerebral. Aproximadamente, 80% dos casos de AVC sÃo devidos a isquemia cerebral. A falta de glicose e oxigÃnio no tecido neuronal promove uma deficiÃncia da sÃntese de ATP que resulta em um colapso nos mecanismos dependentes de energia precipitando uma cascata de eventos que envolvem estresse oxidativo, inflamaÃÃo e morte neuronal. O Ãcido rosmarÃnico à um polifenol encontrado nas plantas da famÃlia das Laminaceae que possui atividade anti-inflamatÃria, antioxidante e anti-apoptÃtica jà descritas. Apesar de muitos estudos buscarem drogas neuroprotetoras para o AVC isquÃmico, poucos se mostraram realmente efetivos. Assim se torna evidente a necessidade de estudar os polifenÃis que possam vir a ser uma estratÃgia terapÃutica no tratamento do AVC. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do Ãcido rosmarÃnico sobre o dano neuronal, dÃficits de memÃria e resposta infamatÃria de camundongos submetidos à isquemia cerebral focal permanente experimental induzida por oclusÃo da artÃria cerebral mÃdia. O modelo de isquemia cerebral focal permanente foi comprovado atravÃs do aumento significativo nas percentagens das Ãreas de infarto, atravÃs da coloraÃÃo com TTC, nos animais isquemiados. O Ãcido rosmarÃnico diminuiu a de Ãrea de lesÃo isquÃmica nos animais isquemiados nas doses de 1, 10 e 20 mg/kg. A ICF produziu dÃficits sensÃrio-motor significativos na avaliaÃÃo neurolÃgica. O Ãcido rosmarÃnico preveniu significativamente o dÃficits sensÃrio-motor nas doses de 1, 10 e 20 mg/kg. O modelo utilizado nÃo apresentou alteraÃÃes na atividade locomotora dos animais. O modelo de isquemia produziu dÃficits de memÃria de trabalho, memÃria episÃdica, memÃria espacial e de memÃria aversiva. O tratamento com o Ãcido rosmarÃnico na dose de 20 mg/kg preveniu os dÃficits na memÃria de trabalho, memÃria episÃdica e memÃria espacial. A ICF provocou aumento da mieloperoxidase (CÃtex temporal: FO: 0,85Â0,42; FO + AR 20: 1,23Â0,71; ICF: 5,65Â1,4; Corpo estriado: FO: 0,60Â0,29; FO + AR 20: 0,75Â0,36; ICF: 1,34Â0,33) e ativaÃÃo de astrÃcitos no cÃrtex temporal e no corpo estriado (FO: 109,2 4,3; ICF: 152,9 8,8). O Ãcido rosmarÃnico na dose de 20 mg/kg preveniu o aumento da MPO no cÃrtex temporal (ICF + AR 20: 3,50Â0,87) e a astrogliose no cÃrtex temporal e corpo estriado (ICF + AR 20: 124,4Â6,2). Os resultados do presente estudo sugerem que o Ãcido rosmarÃnico possui atividade neuroprotetora provavelmente devido a sua aÃÃo anti-inflamatÃria. / Ischemic cerebrovascular accident results from reduced blood supply to brain tissue, resulting in deprivation of glucose and oxygen characterized by rapid loss of neurological function. Stroke itâs the second leading cause of death and the first cause of disability worldwide. In Brazil occurs one hundred cases of death a year. The stroke can be divided into two types: ischemic, that results of a obstruction in the blood flux, and hemorrhagic, that results of a ruption of blood vessels. Aproximately 80% of strokes are due to cerebral ischemia. Glucose and oxygen deprivation leads to a cascade of events, including oxidative stress and inflammation, that culminate in neuronal death. Rosmarinic acid is a polifenol found in the Laminaceae family with known anti-inflammatory, antioxidant and antiapoptotic activities. Although many studies seek neuroprotective drugs for ischemic stroke, few have proved really effective. Thus it becomes evident the need to study the polyphenols that may be a therapeutic strategy in the treatment of stroke. The aim of this work was study the effect of rosmarÃnico acid in the neuronal damage, memory deficits and inflammatory response in mice subjected to experimental model of focal cerebral brain ischemia by occlusion of middle cerebral artery (oMCA). The model of cerebral ischemia was proven by the significant increase in the percentage of infarct area by TTC staining in ischemic animals. The rosmarÃnico acid (1, 10 e 20 mg/kg) significantly decreased the percentage of lesion area caused by ischemia. oMCA produced significant sensorimotor dÃficits in neurological evaluation. The rosmarÃnico acid (1, 10 e 20 mg/kg) prevented the sensorimotor deficits. The MCAo showed no changes in locomotor activity in animals. The MCAo produced deficits in operational memory, episodic memory, spatial memory and aversive memory. The treatment with rosmarinic acid (20 mg/kg) prevented memory deficits. The MCAo increased the MPO level (temporal cÃrtex: FO: 0,85Â0,42; FO + AR 20: 1,23Â0,71; ICF: 5,65Â1,4; striatum: FO: 0,60Â0,29; FO + AR 20: 0,75Â0,36; ICF: 1,34Â0,33) and the astroglioses (FO: 109,2 4,3; ICF: 152,9 8,8) in the temporal cortex and striatum. The treatment with rosmarinic acid prevented MPO increase (ICF + AR 20: 3,50Â0,87) and activation of astrÃcitos (ICF + AR 20: 124,4Â6,2). The MCAo induced an decrease in synaptofisin expression and rosmarÃnico acid prevented (FO: 100,0Â1,9; ICF: 77,1Â5,7; ICF + AR 20: 88,6Â4,0). The results of this study suggests that rosmarinic acid has neuroprotective activity probably due to its antinflammatory action.

La présente étude porte tout d’abord sur la mesure de l’activité antimicrobienne de 42 plantes médicinales qui sont utilisées traditionnellement en Iran et en Guadeloupe, contre 36 souches microbiennes résistantes à de multiples drogues afin de sélectionner la plante la plus intéressante. Les résultats obtenus révèlent la présence des principes actifs antimicrobiens dans chacune des plantes.Nous avons finalement sélectionné Hyptis atrorubens Poit. qui présente une forte activité antimicrobienne. De plus, cette plante n’a jamais été étudiée dans la littérature. Des analyses phytochimiques et biologiques sur l’extrait hydro-méthanolique des tiges, nous ont permis de trouver pour la première fois les quatre principaux composés actifs de cette plante : acide rosmarinique, rosmarinate de méthyle, quercétine-3-glucoside (isoquercétine) et quercétine-3-galactoside (hyperoside). L’activité antibactérienne de ces composés a été évaluée par différentes valeurs microbiologiques (CMI, CMB, synergie, dénombrement bactérien et courbes de croissance). La meilleure activité inhibitrice et bactéricide a été trouvée pour le rosmarinate de méthyle (0,3 mg/ml). Cette recherche suggère la forte potentialité d’activité antimicrobienne pour la combinaison de quatre composés avec une CMI de 70 µg/ml, qui s’approche de la CMI des antibiotiques.Ce travail présente les composés d’Hyptis atrorubens Poit. comme étant de nouveaux agents antimicrobiens et comme étant une source potentielle de lutte contre les bactéries, de plus en plus résistantes aux antibiotiques. / This study focuses firstly on the extent of the antimicrobial activity of 42 medicinal plants that are traditionally used in Iran and Guadeloupe, against a panel of 36 pathogenic and multi-resistant bacteria and fungi. The results show presence of the antimicrobial agents in all plants.We finally selected Hyptis atrorubens Poit. which has a strong antimicrobial activity. In addition, this plant has never been studied in the literature. Phytochemical and biological analysis of the hydro-methanolic extract of stems, enabled us to find for the first time the four main active compounds of this plant: rosmarinic acid, methyl rosmarinate, quercetin-3-glucoside (isoquercetin) and quercetin-3-galactoside (hyperoside).The antibacterial activity of these compounds was evaluated by various microbiological values ​​(MIC, MBC, synergy, kill-time and growth curves).The best inhibitory and bactericidal activity was found for methyl rosmarinate (0.3 mg/ml).This research suggests the high potential of antimicrobial activity for a combination of all four compounds (MIC = 70 µg/ml), which is very close to MICs of antibiotics.This work presents the main compounds of Hyptis atrorubens Poit. as new antimicrobial agents and as potentially useful tools against bacteria that are more and more resistant to antibiotics.

Orientador: Maria Angela de Almeida Meireles / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-26T17:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zabot_GiovaniLeone_D.pdf: 24740321 bytes, checksum: 93e515a410574c1037b0a53340db63d2 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Substâncias naturais extraídas de plantas têm propriedades funcionais que as tornam preferíveis em relação às substâncias sintéticas, havendo grande interesse para aplicação farmacológica e na elaboração de bioprodutos. Técnicas de extração, como a que utiliza fluidos supercríticos, vêm se destacando por proporcionarem a obtenção seletiva de compostos bioativos com elevada qualidade. No campo da tecnologia supercrítica, pesquisas são desenvolvidas para aumentar o rendimento de extração através da alteração de condições de processo, como pressão e temperatura. No entanto, há a necessidade de discriminar mais a influência tecno-econômica de outras variáveis, como a geometria do leito de extração. Em vista disso, realizou-se a avaliação técnica da extração com CO2 supercrítico de compostos bioativos de cravo-da-índia e alecrim em uma unidade de extração laboratorial constituída por dois extratores de 1 L com diferentes razões de altura do leito (HB) pelo diâmetro (DB), sendo para o extrator 1 (E-1) a razão de 7,1 e para o extrator 2 (E-2) a razão de 2,7. Dois critérios utilizados para mudança de geometria e aumento de escala foram aplicados, consistindo em: (1) manutenção da velocidade intersticial do solvente igual em ambas as geometrias; e (2) manutenção da razão de massa de solvente por massa de matéria-prima (S/F) igual em ambas as geometrias para um determinado tempo de processo. De acordo com os resultados cinéticos de rendimento de extrato e composição química, o critério (1) não se mostrou indicado para ser aplicado em processos de extração com fluidos supercríticos (SFE) de compostos de cravo-da-índia. O critério (2) mostrou-se apropriado para a obtenção de óleo volátil de cravo-da-índia, pois houve igualdade nos perfis das curvas de extração em E-1 e E-2, avaliados em termos de parâmetros cinéticos como taxa de transferência de massa, duração dos períodos de taxa constante de extração (CER) e taxa decrescente de extração (FER), rendimento de extrato e razão mássica de soluto no solvente. No entanto, o critério (2) não se mostrou adequado para a obtenção de compostos bioativos de alecrim, sendo que o leito de extração E-2 proporcionou rendimentos até 86 % maiores em relação ao E-1, sendo a diferença mais notória no final do período FER. Houve diferença também no custo de manufatura (COM) dos extratos de alecrim simulado pelo SuperPro Designer 8.5®, sendo 23 % menor em E-2 do que em E-1 para uma planta industrial com 2 extratores de 100 L. Com relação ao alecrim, terpenoides majoritários como 1,8-cineol e cânfora foram extraídos com CO2 supercrítico. No entanto, alguns compostos fenólicos foram extraídos em pequena quantidade (ácido carnósico) ou nem foram extraídos via SFE (ácido rosmarínico). Logo, o conceito de intensificação de processos foi utilizado para facilitar a extração das duas frações presentes em alecrim. O processo consistiu em extrair inicialmente a fração rica em terpenoides com CO2 supercrítico (SFE-CO2) e logo após, no mesmo equipamento e sem desempacotar o leito, a fração rica em terpenos fenólicos foi extraída com água líquida pressurizada (PWE). Com isso, aproximadamente 2,5 % (m/m, base seca) de óleo volátil contendo terpenoides e 18,6 % (m/m, base seca) de extrato não-volátil contendo terpenos fenólicos foram obtidos em frações separadas. Um método analítico para quantificação de terpenos fenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência foi desenvolvido e validado, com tempo total de análise de apenas 10 min. O custo operacional anual de uma planta produtiva instalada no Brasil com 2 extratores de 100 L foi simulado para os processos SFE-CO2 + PWE para obtenção de compostos de alecrim. O aproveitamento maior da matriz vegetal para a obtenção diversificada de compostos bioativos permitiu a redução em 28 % dos custos anuais de produção em relação ao processo SFE-CO2 / Abstract: Natural substances extracted from plants present functional properties which are preferable against the synthetic ones, being useful in formulating bioproducts and in the pharmaceutical area. Novel extraction techniques, as the use of supercritical fluids, are acquiring notoriety by providing the selective extraction of bioactive compounds with high quality. In the supercritical technology field, researches are performed to increase the extraction yield by changing process conditions (i.e., pressure, temperature). However, there is a need for further techno-economic discriminations about the influence of other variables, as the bed geometry. Thus, we performed the evaluation of the supercritical CO2 extraction of clove and rosemary bioactive compounds using a laboratory equipment containing two extractors of 1 L with different height (HB) to bed diameter (DB) ratios. Bed 1 (E-1) and 2 (E-2) present HB/DB ratios of 7.1 and 2.7, respectively. Two criteria used for geometry shift and scale up were applied: (1) maintaining the solvent interstitial velocity equal in both bed geometries; and (2) maintaining the solvent mass to feed mass (S/F) ratio equal in both bed geometries for a fixed processing time. According to the kinetic results of extraction yields and chemical composition, the criterion (1) is not indicated for supercritical fluid extraction (SFE) of rosemary compounds. Criterion (2) is suitable for obtaining clove extract, because the extraction curves profiles were similar in E-1 and E-2. We evaluated the extraction curves in relationship to kinetic parameters as mass transfer rate, duration of constant extraction rate (CER) and falling extraction rate (FER) periods, extraction yield and mass ratio of solute in the fluid phase. However, criterion (2) is inappropriate for obtaining rosemary bioactive compounds. E-2 provided extraction yields up to 86% higher than E-1. The difference was more pronounced in the end of FER period. We observed differences on the cost of manufacturing (COM) of rosemary extracts simulated by SuperPro Designer 8.5®. COM¿s were 23% lower in E-2 than in E-1 for an industrial plant of 2 extractors of 100 L. With respect to rosemary, major terpenoids as 1,8-cineole and camphor were extracted with supercritical CO2, while some phenolic compounds were low (carnosic acid) or no extracted (rosmarinic acid) using SFE. Thus, process intensification concept was used for becoming possible the extraction of two fractions of bioactive compounds found in rosemary. The procedure comprised the initial extraction of the terpenoids-rich fraction with supercritical CO2 (SFE-CO2) and, thereafter, in the same equipment without unloading the bed, performing the extraction of the polyphenols-rich fraction with pressurized water (PWE). Approximately 2.5 wt.% (dry basis) of volatile oil containing terpenoids and 18.6 wt.% (dry basis) of non-volatile extract containing phenolic terpenes were obtained in separated fractions. We developed and validated an analytical method for quantifying phenolic terpenes by high performance liquid chromatography, presenting a total time of analysis of 10 min. Also, we simulated the annual operating cost of a plant installed in Brazil containing 2 vessels of 100 L applying SFE-CO2 + PWE processes for obtaining rosemary compounds. The higher use of the vegetal matrix for diversifying the extraction of bioactive compounds enabled 28% reduction in the annual production costs whether compared to SFE-CO2 process alone / Doutorado / Engenharia de Alimentos / Doutor em Engenharia de Alimentos

De nos jours, l'apport de polyphénols s'avère être bénéfique dans la lutte contre les dommages oxydatifs liés au stress oxydant. Cependant, leur biodisponibilité est limitée par leur polarité. Pour contourner ce problème, une des stratégies consiste à ajuster la lipophilie de l'antioxydant par des réactions de lipophilisation mettant en jeu un vecteur lipidique. Ainsi, des précédentes études ont montré que l'activité antioxydante était directement liée à la longueur de la chaîne alkyle greffée et ont également révélé un effet non linéaire dit effet « cut-off ». L'objectif de notre étude a donc été de comprendre l'effet non linéaire de la lipophilisation sur l'activité antioxydante de l'acide rosmarinique. Ainsi, des rosmarinates d'alkyle et de diacylglycérol ont été synthétisés, et leurs propriétés antioxydantes évaluées sur des fibroblastes surexprimant une quantité d'EROs. L'effet « cut-off » a été à nouveau observé avec ces phénolipides. En effet, le rosmarinate de décyle et le 1-rosmarinoyl-2,3-dilauroyl glycérol sont les antioxydants les plus actifs. Cependant, la série des rosmarinates d'alkyle étant la plus efficace, l'influence du vecteur lipidique a été étudié uniquement sur cette dernière. Il a été ainsi constaté que la lipophilisation de l'acide rosmarinique avec une chaîne alkyle de 4 à 10 atomes de carbone améliore son transport au sein de la cellule, alors que les esters à 16 et 18 atomes de carbone s'organisent sous forme d'agrégats extracellulaires limitant ainsi leur internalisation. De plus, alors qu'une partie de ces esters est localisée dans le cytoplasme, tout comme l'acide rosmarinique et le rosmarinate de butyle, le rosmarinate de décyle est en revanche situé dans la mitochondrie. Cette propriété en fait donc une molécule très prometteuse pour la conception de nouveaux antioxydants à activité mitochondriale ciblée. Néanmoins, sa cytotoxicité joue un rôle majeur dans son mécanisme d'action. A fortes concentrations, il affecte la viabilité cellulaire, tandis qu'à faibles concentrations, aucun effet cytotoxique notable n'est mis en évidence. / Nowadays, polyphenols supply has proved to be beneficial against oxidative damages linked to oxidative stress. However, their bioavaibility is limited by their polarity. To solve the issue, one strategy consists in adjusting the antioxidant hydrophobicity by lipophilization reactions with lipidic carriers. Indeed, previous studies showed that antioxidant activity was directly linked to the alkyl chain length grafted and also revealed a “cut-off” effect. The objective of this study is to understand this nonlinear effect of the lipophilization of rosmarinic acid on antioxidant activity. Thus, alkyl rosmarinate and diacylglycerol rosmarinate were synthesized and their antioxidant activity was evaluated into fibroblasts cells overexpressing radical oxygen species. The “cut-off” effect was again observed with these phenolipids. In fact, decyl rosmarinate and dilauroyl rosmarinate were shown to the best antioxydants. The lipophilization of rosmarinic acid with an alkyl chain from 4 to 10 carbon atoms improve its cell uptake whereas esters of 16 and 18 carbon atoms assemble in extracellular aggregate limiting their cell uptake. Furthermore, one part of these esters is located into cytoplasm like rosmarinic acid and butyl rosmarinate. On the contrary, the decyl rosmarinate (R10) is located into mitochondria. This property allows targeting mitochondria. Nevertheless, its cytotoxicity is involved in mechanism. At high concentration, R10 affects cell viability, while at low concentration, no cytotoxic effect is observed.

A epilepsia é uma das desordens mais frequente do sistema nervoso central com aproximidamente 2% de prevalência mundial e 30% de refratariedade. O uso das plantas medicinais é uma possibilidade de identificar novas moléculas com potencial terapêutico. Nesse estudo, utilizamos o modelo de convulsão induzida pelo ácido caínico em zebrafish adulto, para explorar o potencial terapêutico da samambaia Blechnum brasiliense Desv. Primeiramente, utilizando cromatografia liquida de ultra eficiência, foi validado método analítico para quantificação do ácido rosmarínio na fração acetato de etila, obtida por fracionamento do extrato bruto da planta. A fração apresentou teor de 0,0764 g% de ácido rosmarínico. A partir desta fração foi realizado isolamento em coluna preparativa para obtenção do composto para testes em peixe-zebra. Nos ensaios toxicológicos em embriões de zebrafish foram avaliados o extrato bruto e a fração acetato de etila de B. brasiliense, bem como ácido rosmarínico isolado, possibilitando o cálculo das doses letais médias (DL50). Os valores foram 363,3 μg/mL para o extrato, 196,3 μg/mL para a fração e 250,3 μM para o ácido rosmarínico. Os resultados demonstraram que as amostras apresentaram toxicidade aos embriões apenas nas maiores concentrações testadas. Nos ensaios realizados com zebrafish adultos, todas as amostras foram capazes de modular o perfil e a intensidade da convulsão causada pelo ácido caínico, bem como a latência para a primeira crise clônica. As doses ativas foram: 20 mg/kg para o extrato bruto, 5 e 10 mg/kg para a fração acetato de etila e 1 mg/kg para o ácido rosmarínico, sendo capazes de reduzir as crises e aumentar o tempo de latência no modelo de epilepsia em zebrafish. Assim, nosso estudo indica a espécie Blechnum brasiliense como fonte de substância com potencial terapêutico a ser explorada para o tratamento da epilepsia. / Epilepsy is one of the most frequent disorders of the central nervous system with approximately 2% of world prevalence and 30% of refractoriness. The use of medicinal plants is a possibility to identify new molecules with therapeutic potential. In this study, we used the caynic acid-induced convulsion model in adult zebrafish to explore the therapeutic potential of the Blechnum brasiliense Desv fern. Firstly, using ultra-efficient liquid chromatography, we validated an analytical method for the quantification of rosmarinic acid in the ethyl acetate fraction, obtained by plant crude extract fractionation. The fraction presented a content of 0.0764 g% of rosmarinic acid. From this fraction was carried out the preparative column isolation of the compound for tests in zebrafish. In the toxicological tests using zebrafish embryos, were evaluated the crude extract and the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, as well as, the isolated rosmarinic acid, allowing the calculation of median lethal doses (LD50). The values were 363.3 μg/mL for the extract, 196.3 μg/mL for the fraction and 250.3 μM for the rosmarinic acid. The results showed that samples presented toxicity to the embryos only in the highest concentrations tested. In the trials with adult zebrafish, all samples were able to modulate the profile and intensity of the convulsion caused by kainic acid, as well as, the latency for the first clonic crisis. The active doses were 20 mg/kg for the crude extract, 5 and 10 mg/kg for the ethyl acetate fraction, and 1 mg/kg for rosmarinic acid, being able to reduce the crises and increase the latency time in the zebrafish model of epilepsy. Thus, our study indicates the species Blechnum brasiliense as a source of substance with therapeutic potential to be explored for the treatment of epilepsy.

Introdução: A cicatrização subconjuntival excessiva é a maior causa de falha cirúrgica no glaucoma. Uma vez que o ácido rosmarínico apresenta ação antifibrótica, é interessante avaliar seu uso como adjuvante na cirurgia filtrante do glaucoma. Objetivos: Comparar os achados clínicos e histopatológicos e a expressão gênica de fatores relacionados à cicatrização tecidual entre coelhos submetidos à cirurgia antiglaucomatosa experimental (CAGE) e tratados com injeções subconjuntivais de ácido rosmarínico ou com injeções de solução salina 0,9%. Material e Métodos: Estudo experimental intervencionista, do tipo ensaio clínico randomizado, no qual 41 coelhos New Zealand foram submetidos à CAGE no olho direito e divididos em dois grupos de tratamento: grupo A (n=21), tratados com injeções subconjuntivais de 0,1 ml de solução salina 0,9% e grupo B (n=20), tratados com injeções subconjuntivais de 0,1 ml de ácido rosmarínico 15 mg/ml (3 dias antes da cirurgia, ao final desta e a cada 3 dias até a eutanásia). Os efeitos do tratamento foram avaliados com cinco dias (grupos A1 e B1) e com 15 dias (grupos A2 e B2) por meio da avaliação da pressão intraocular (PIO) com Tonopen, de aspectos da ampola filtrante com base no Moorfields Bleb Grading System, do estudo histopatológico (contagem de neutrófilos/campo, vasos/campo, densidade de colágeno corado com Sirius Red, imuno-histoquímica anti--actina e anti-VEGF) e do RT-PCR (colágeno tipo 1 alfa-1 COL1A1 e TGF-2). As fotomicrografias foram avaliadas quantitativamente com o software ImageJ® 1.36 (Sirius Red, -actina e VEGF) e os dados comparados por testes não paramétricos, sendo p<0,05 considerado estatisticamente significativo. Resultados: Não houve diferença significativa nas comparações da PIO entre os grupos. Nas avaliações da ampola filtrante, apenas o grupo B2 apresentou maiores escores de área central (p=0,0004), área máxima (p=0,0007) e altura (p=0,0239). Os grupos B1 (p<0,0001) e B2 (p=0,0011) apresentaram escores significativamente menores no parâmetro vascularização que os seus respectivos controles. Houve diminuição significativa de neutrófilos/campo somente no grupo B2 (p=0,0159). O número de vasos/campo também foi significativamente menor nos grupos B1 e B2, em comparação aos seus respectivos controles (p=0,0079 e p=0,0345, respectivamente). Não foram observadas diferenças significativas na coloração com Sirius Red e na imuno-histoquímica para anti--actina entre os grupos, porém o grupo B1 apresentou menor marcação anti-VEGF (p=0,0190). As análises por RT-PCR para TGF-2 e COL1A1 não demonstraram diferenças entre os grupos, com exceção do grupo B2, que apresentou maior expressão de COL1A1 quando comparado ao seu controle (p=0,0159). Conclusões: Os resultados apontaram para os potenciais efeitos anti-inflamatórios e moduladores da neovascularização do ácido rosmarínico em cirurgias antiglaucomatosas. Apesar do grupo B demonstrar melhor aspecto clínico (exceto a PIO, que não demonstrou diferença entre os grupos), a ação antifibrótica do ácido rosmarínico não pôde ser comprovada. / Introduction: Excessive subconjunctival scarring is a major cause of surgical failure in glaucoma. Since rosmarinic acid has antifibrotic action, we evaluate its usage as an adjunctive treatment to glaucoma filtration surgery. Objectives: To compare clinical, histopathological and expression of factors related to the healing process between rabbit underwent experimental glaucoma surgery (EGS) and treated with subconjunctival injections of rosmarinic acid or with saline solution 0.9%. Methods: Interventional experimental study (randomized clinical trial) in which 41 New Zealand rabbits were submitted to EGS in the right eye and divided into two treatment groups: group A (n=21) - eyes treated with subconjunctival injections of 0.1 ml of saline solution 0.9% and B (n=20) - eyes treated with subconjunctival injections of 0.1 ml of rosmarinic acid 15mg/ml (three days prior to surgery, at the end of surgery and every three days until euthanasia). Treatment effects were assessed after five days (groups A1 and B1) and 15 days (groups A2 and B2) by evaluation of intraocular pressure (IOP) with Tonopen and bleb characteristics based on the Moorfields Bleb Grading System, as well as histopathology analysis (neutrophil/field count; vessels/field count; collagen density after stained with Sirius Red; and anti--actin and anti-VEGF immunohistochemistry) and by RT-PCR (for collagen type 1 alpha 1 - COL1A1 and TGF-2). The photomicrographs were evaluated quantitatively with ImageJ® 1.36 software (Sirius Red, -actin and VEGF) and data were compared through non-parametric tests, considering p<0.05 as statistically significant. Results: No significant difference was observed in IOP measurements between groups. Group B2 displayed significant higher scores of bleb central area (p=0.0004), maximum area (p=0.0007) and height (p=0.0239). Both B1 (p<0.0001) and B2 (p=0.0011) groups presented significantly lower vascularization scores than their respective controls. A significant decrease in neutrophils/field counting was observed only in group B2 (p=0.0159), however vessels/field counting was significantly lower in groups B1 and B2, compared to their controls (p=0.0079 and p=0.0345, respectively). No significant differences were observed in the collagen staining with Sirius Red and in the anti--actin immunohistochemistry between the all groups comparison, but group B1 displayed lower anti-VEGF measurement (p=0.0190) than group A1. RT-PCR analysis for TGF-2 and COL1A1 showed no difference between groups, except by group B2, which presented higher expression of COL1A1, compared to its control (p=0.0159). Conclusions: The findings point to the potential anti-inflammatory and anti-neovascular effects of rosmarinic acid in glaucoma surgery. Although group B show better clinical aspect (except IOP, which showed no difference between groups), the antifibrotic action of rosmarinic acid could not be proved.

Introdução: A cicatrização subconjuntival excessiva é a maior causa de falha cirúrgica no glaucoma. Uma vez que o ácido rosmarínico apresenta ação antifibrótica, é interessante avaliar seu uso como adjuvante na cirurgia filtrante do glaucoma. Objetivos: Comparar os achados clínicos e histopatológicos e a expressão gênica de fatores relacionados à cicatrização tecidual entre coelhos submetidos à cirurgia antiglaucomatosa experimental (CAGE) e tratados com injeções subconjuntivais de ácido rosmarínico ou com injeções de solução salina 0,9%. Material e Métodos: Estudo experimental intervencionista, do tipo ensaio clínico randomizado, no qual 41 coelhos New Zealand foram submetidos à CAGE no olho direito e divididos em dois grupos de tratamento: grupo A (n=21), tratados com injeções subconjuntivais de 0,1 ml de solução salina 0,9% e grupo B (n=20), tratados com injeções subconjuntivais de 0,1 ml de ácido rosmarínico 15 mg/ml (3 dias antes da cirurgia, ao final desta e a cada 3 dias até a eutanásia). Os efeitos do tratamento foram avaliados com cinco dias (grupos A1 e B1) e com 15 dias (grupos A2 e B2) por meio da avaliação da pressão intraocular (PIO) com Tonopen, de aspectos da ampola filtrante com base no Moorfields Bleb Grading System, do estudo histopatológico (contagem de neutrófilos/campo, vasos/campo, densidade de colágeno corado com Sirius Red, imuno-histoquímica anti--actina e anti-VEGF) e do RT-PCR (colágeno tipo 1 alfa-1 COL1A1 e TGF-2). As fotomicrografias foram avaliadas quantitativamente com o software ImageJ® 1.36 (Sirius Red, -actina e VEGF) e os dados comparados por testes não paramétricos, sendo p<0,05 considerado estatisticamente significativo. Resultados: Não houve diferença significativa nas comparações da PIO entre os grupos. Nas avaliações da ampola filtrante, apenas o grupo B2 apresentou maiores escores de área central (p=0,0004), área máxima (p=0,0007) e altura (p=0,0239). Os grupos B1 (p<0,0001) e B2 (p=0,0011) apresentaram escores significativamente menores no parâmetro vascularização que os seus respectivos controles. Houve diminuição significativa de neutrófilos/campo somente no grupo B2 (p=0,0159). O número de vasos/campo também foi significativamente menor nos grupos B1 e B2, em comparação aos seus respectivos controles (p=0,0079 e p=0,0345, respectivamente). Não foram observadas diferenças significativas na coloração com Sirius Red e na imuno-histoquímica para anti--actina entre os grupos, porém o grupo B1 apresentou menor marcação anti-VEGF (p=0,0190). As análises por RT-PCR para TGF-2 e COL1A1 não demonstraram diferenças entre os grupos, com exceção do grupo B2, que apresentou maior expressão de COL1A1 quando comparado ao seu controle (p=0,0159). Conclusões: Os resultados apontaram para os potenciais efeitos anti-inflamatórios e moduladores da neovascularização do ácido rosmarínico em cirurgias antiglaucomatosas. Apesar do grupo B demonstrar melhor aspecto clínico (exceto a PIO, que não demonstrou diferença entre os grupos), a ação antifibrótica do ácido rosmarínico não pôde ser comprovada. / Introduction: Excessive subconjunctival scarring is a major cause of surgical failure in glaucoma. Since rosmarinic acid has antifibrotic action, we evaluate its usage as an adjunctive treatment to glaucoma filtration surgery. Objectives: To compare clinical, histopathological and expression of factors related to the healing process between rabbit underwent experimental glaucoma surgery (EGS) and treated with subconjunctival injections of rosmarinic acid or with saline solution 0.9%. Methods: Interventional experimental study (randomized clinical trial) in which 41 New Zealand rabbits were submitted to EGS in the right eye and divided into two treatment groups: group A (n=21) - eyes treated with subconjunctival injections of 0.1 ml of saline solution 0.9% and B (n=20) - eyes treated with subconjunctival injections of 0.1 ml of rosmarinic acid 15mg/ml (three days prior to surgery, at the end of surgery and every three days until euthanasia). Treatment effects were assessed after five days (groups A1 and B1) and 15 days (groups A2 and B2) by evaluation of intraocular pressure (IOP) with Tonopen and bleb characteristics based on the Moorfields Bleb Grading System, as well as histopathology analysis (neutrophil/field count; vessels/field count; collagen density after stained with Sirius Red; and anti--actin and anti-VEGF immunohistochemistry) and by RT-PCR (for collagen type 1 alpha 1 - COL1A1 and TGF-2). The photomicrographs were evaluated quantitatively with ImageJ® 1.36 software (Sirius Red, -actin and VEGF) and data were compared through non-parametric tests, considering p<0.05 as statistically significant. Results: No significant difference was observed in IOP measurements between groups. Group B2 displayed significant higher scores of bleb central area (p=0.0004), maximum area (p=0.0007) and height (p=0.0239). Both B1 (p<0.0001) and B2 (p=0.0011) groups presented significantly lower vascularization scores than their respective controls. A significant decrease in neutrophils/field counting was observed only in group B2 (p=0.0159), however vessels/field counting was significantly lower in groups B1 and B2, compared to their controls (p=0.0079 and p=0.0345, respectively). No significant differences were observed in the collagen staining with Sirius Red and in the anti--actin immunohistochemistry between the all groups comparison, but group B1 displayed lower anti-VEGF measurement (p=0.0190) than group A1. RT-PCR analysis for TGF-2 and COL1A1 showed no difference between groups, except by group B2, which presented higher expression of COL1A1, compared to its control (p=0.0159). Conclusions: The findings point to the potential anti-inflammatory and anti-neovascular effects of rosmarinic acid in glaucoma surgery. Although group B show better clinical aspect (except IOP, which showed no difference between groups), the antifibrotic action of rosmarinic acid could not be proved.

As plantas medicinais são consideradas importantes fontes de compostos biologicamente ativos. Para muitas doenças crônicas, como as neurodegenerações, substâncias que apresentam atividades simultâneas em mais de um alvo relacionado à etiopatologia dessas desordens, constituem potenciais agentes terapêuticos. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram a avaliação química e biológica de três espécies de samambaias de ocorrência no sul do Brasil: Blechnum binervatum, B. brasiliense e B. occidentale. O isolamento bioguiado foi utilizado para a identificação da(s) substância(s) com potencial atividade em modelos in vitro e in silico relacionados às desordens neurodegenerativas. A avaliação dos extratos e frações permitiu destacar a fração acetato de etila de B. brasiliense como a mais ativa na estabilização de radicais hidroxila (CI50: 12,5 μg/mL) e na inibição da lipoperoxidação (CI50: 10,4 μg/mL), sendo uma das mais ativas frente ao óxido nítrico (CI50: 55,6 μg/mL). Adicionalmente, na inibição da isoforma A da enzima monoamina oxidase (MAO), esta fração foi a que apresentou menor valor de CI50 (28,6 μg/mL). As frações diclorometano também apresentaram bons resultados na inibição da MAO-A, sendo algumas ativas igualmente como antioxidantes. Frente à MAO-B, os extratos e frações das três espécies vegetais demonstraram menores efeitos e foram inativos frente às enzimas acetil e butiril colinesterase, não demonstrando toxicidade em células polimorfonucleares (PMN) de ratos Wistar, na concentração de 1 mg/mL. Utilizando células-tronco cultivadas, os extratos e frações selecionadas, nas concentrações de 100 a 500 μg/mL, não afetaram a viabilidade celular e não apresentaram efeitos tóxicos. Análises químicas por cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada a detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas, permitiram a identificação de isômeros dos ácidos cafeoil quínico e cafeoil chiquímico nos extratos das três espécies estudadas. B. binervatum apresentou, ainda, ácido cafeico glicosilado, ácido isosalvianólico A e ácido rosmarínico sulfatado. Ácido salvianólico F foi identificado em B. binervatum e B. occidentale, bem como isômeros do ácido brainico. Ácido rosmarínico foi caracterizado em B. binervatum e B. brasiliense. Quercetina 3-O-glicosídeo e vicenina-2 também foram identificadas. As análises por cromatografia gasosa, acoplada à espectrometria de massas demonstraram que o diterpeno neofitadieno foi o composto majoritário nas frações diclorometano de Blechunm e nas frações hexano de B. occidentale e B. binervatum. Para a fração hexano de B. brasiliense, β-sitosterol foi o principal componente. A partir da fração acetato de etila de B. brasiliense foi isolado o ácido rosmarínico, o qual se mostrou ativo nos ensaios de atividade antioxidante, na inibição da catecol-O-metil transferase (CI50: 26,7 μM) e da MAO-A (CI50: 50,1 μM), sendo proposto mecanismo reversível de inibição desta enzima. Nos estudos de docking foram verificadas as interações moleculares entre o composto e as enzimas MAO-A e COMT, por ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas nos sítios ativos enzimáticos. O composto não apresentou efeitos tóxicos em células PMN de roedores, nas concentrações de 0,5 e 5 mM. Os ácidos rosmarínico e clorogênico isolados do extrato de B. binervatum não influenciaram na viabilidade celular e não induziram efeito tóxico sobre células-tronco (100 a 500 μM), sendo que o ácido rosmarínico foi capaz, ainda, de induzir proliferação celular. Capacidade protetora contra danos celulares causados por H2O2 (1400 μM) foi observada para ambas as substâncias, nas concentrações de 10-100 μM, sendo os resultados corroborados pelas imagens de microscopia celular. O ácido rosmarínico apresentou melhores respostas quando comparado ao ácido clorogênico, sendo mais efetivo na inibição dos danos por H2O2. O conjunto dos resultados obtidos ressalta a importância dos estudos associados químico-biológico de espécies vegetais e aponta para as potencialidades de samambaias como fontes de produtos bioativos, capazes de atuar sobre múltiplos alvos enzimáticos e não-enzimáticos relacionados a doenças neurodegenerativas. / Medicinal plants are considered important sources of biologically active compounds. For many chronic diseases, such as neurodegenerations, substances that present simultaneous activities in more than one target related to the etiopathology of these disorders are considered potential therapeutic agents. In this context, the aims of the study were the chemical and biological evaluation of three fern species, occurring in south Brazil: Blechnum binervatum, B. brasiliense and B. occidentale. The bioguided isolation was employed to identify compound(s) with potential activities at in vitro and in silico models associated to neurodegenerative disorders. The biological evaluation of extracts and fractions allowed to highlight the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, which was the most active in the stabilization of hydroxyl radicals (IC50: 12.5 μg/mL) and on lipoperoxidation inhibition (IC50: 10.4 μg/mL), being one of the most active sample against nitric oxide (IC50: 55.6 μg/mL). Furthermore, on the inhibition of isoform A from monoamine oxidase (MAO), this fraction showed the lowest IC50 value (28.6 μg/mL). The dichloromethane fractions also presented good results in the MAO-A inhibition, being some of them active as antioxidants, too. Against MAO-B, extracts and fractions of the three species demonstrated reduced effects and all samples were inactive in the acetyl and butyryl cholinesterase inhibition, showing no toxic effects to polymorphonuclear cells (PMN) from Wistar rats, at 1 mg/mL. Using cultured stem cells, the selected extracts and fractions at 100 to 500 μg/mL did not affect cell viability and absence of cytotoxic effects was observed. The chemical analysis by high performance liquid chromatography, coupled to photodiode array detector and mass spectrometry, allowed the identification of caffeoyl quinic acid and caffeoyl shikimic acid isomers in the three studied fern species. B. binervatum presented also glycosilated caffeic acid, isosalvianolic acid A and sulphated rosmarinic acid. Salvianolic acid F was identified in B. binervatum and B. occidentale, as well as, brainic acid isomers. Rosmarinic acid was characterized in B. binervatum and B. brasiliense. Quercetin 3-O-glycoside and vicenin-2 were also found. Analysis by gas chromatography with mass spectrometry showed the diterpene neophytadiene was the major compound in dichloromethane fractions of Blechunm and in hexane fractions of B. occidentale and B. binervatum. For the hexane fraction from B. brasiliense, β-sitosterol was majority. From the ethyl acetate fraction of B. brasiliense was isolated rosmarinic acid, which was shown to be active in antioxidant assays, in the inhibition of catechol-O-methyltransferase (IC50: 26.7 μM) and MAO-A (IC50: 50.1 μM), being suggested a reversible inhibition mechanism against this enzyme. In docking studies were observed molecular interactions between the compound and MAO-A and COMT enzymes, via hydrogen bonds and hydrophobic interactions in enzyme active sites. The compound did not induce toxic effects to rodent PMN cells, at concentrations of 0.5 and 5 mM. The rosmarinic and chlorogenic acids, isolated from B. binervatum extract, did not influence cell viability and did not induce toxicity to stem cells (100 to 500 μM), the rosmarinic acid was also capable to induce cell proliferation. Protective ability against H2O2-induced cell damage (1400 μM) was observed for both substances at concentrations of 10-100 μM, and the results were supported by cellular microscopy images. Rosmarinic acid presented better responses compared with chlorogenic acid, being powerful inhibitor against H2O2-induced damage. The overall results highlights the importance of associated chemical-biological studies of plant species and points at the potential of ferns as sources of bioactive compounds, capable of modulating multiple enzymatic and non-enzymatic targets related to neurodegenerative diseases.

Introdução: O ácido rosmarínico (AR) é um composto fenólico que apresenta inúmeras atividades biológicas, dentre estas, destaca-se a atividade antioxidante. Entretanto, a biodisponibilidade do AR por via oral é de apenas 0,91 a 5,0%, fator que pode estar relacionado à sua solubilidade, estabilidade em meio gastrointestinal e mecanismo de absorção. Ciclodextrinas (CDs) são excipientes farmacêuticos utilizados com o objetivo de promover a absorção oral de fármacos por propiciarem aumento de solubilidade, estabilidade química e permeação pela membrana intestinal a partir da complexação com o fármaco. Tendo em vista o desenvolvimento de uma formulação farmacêutica, estudos de compatibilidade entre a substância e excipientes se fazem necessários. Objetivo: Obter complexo do AR com CDs derivadas, avaliar a atividade antioxidante dos complexos e compatibilidade entre excipientes. Materiais e métodos: Estudo de solubilidade de fase foi realizado para se determinar estequiometria e constante de estabilidade entre o AR e duas CDs: HPβCD e MβCD. Os complexos foram obtidos por liofilização e caracterizados por métodos espectroscópicos, calorimétrico e microscópico. A atividade antioxidante foi determinada pelo método DPPH e estudo de compatibilidade entre excipientes foi realizado por método espectroscópico, calorimétrico e cromatográfico. Resultados: O AR apresentou proporção estequiométrica 2:1 AR:CD e alta constante de estabilidade. Os métodos de caracterização permitiram inferir a presença de formação de complexo de inclusão e complexo de não-inclusão, nos quais uma molécula do AR estaria interagindo com prótons internos e outra estaria interagindo com prótons externos da CD. A atividade antioxidante dos complexos foi superior à apresentada pelo AR não complexado, demonstrando a ação das CDs sobre a doação de prótons do AR e o estudo de compatibilidade de excipientes não demonstrou incompatibilidades viabilizando a obtenção de formas farmacêuticas. Conclusão: Considerando todos os resultados, pode-se inferir que complexos AR:CD podem ser uma alternativa tecnológica para superar a baixa absorção pela via oral, sem ocasionar perda na atividade antioxidante, propiciando também o desenvolvimento de formulações sólidas orais. / Introduction: Rosmarinic acid (RA) is phenolic compound which present several biological activities, among these, antioxidant is remarkable. However, oral bioavailability of RA is only 0.91 to 5.0%, a factor that may be related to its solubility, stability in gastrointestinal environment and absorption mechanism. Cyclodextrins (CDs) are pharmaceutical excipients used in oral drug absorption by promoting increased solubility, chemical stability and permeation by the intestinal membrane through complexation with the drug. In view of the development of a pharmaceutical formulation, excipients compatibility studies are also expected. Objective: To obtain RA complex with derivative CDs (HPβCD and MβCD), to evaluate the antioxidant activity of complexes and compatibility between excipients. Materials and methods: Phase-solubility study was performed to determine stoichiometry and constant between RA and CD. The complexes were obtained by lyophilization and characterized by spectroscopic, calorimetric and microscopic techniques. The antioxidant activity was determined by the DPPH method and compatibility study among excipients was performed by spectroscopic, calorimetric and chromatographic methods.

Darbo tikslas: atlikti preparatų, turinčių augalinių žaliavų kaupiančių rozmarino rūgštį, sudėčių palyginamąją analizę, nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį, rozmarino rūgšties kiekį ir antioksidacinį aktyvumą. Darbo uždaviniai:  Išrinkti preparatus su rozmarino rūgštimi;  Atlikti šių preparatų sudėčių palyginamąją analizę;  Nustatyti ir palyginti bendrą fenolinių junginių kiekį preparatuose;  Nustatyti ir palyginti rozmarino rūgšties kiekį ESC metodu;  Nustatyti ir palyginti antioksidacinį aktyvumą. Tyrimo objektai ir metodai: preparatai, turintys augalines žaliavas, kaupiančias rozmarino rūgštį ir kvapiųjų rozmarinų skystasis ekstraktas. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas atliktas spektrofotometriniu būdu, naudojant standartinį Folin – Ciocalteu reagentą. Rozmarino rūgšties kiekis preparatuose nustatytas ESC metodu. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas DPPH radikalo sujungimo metodu. Literatūros analizės metodu atlikta rozmarino rūgšties preparatų sudėčių analizė. Išvados: Tyrimams išrinkti 3 kompleksiniai preparatai su kvapiųjų rozmarinų augaline žaliava ir skystasis rozmarinų ekstraktas. Daugiausia kvapiųjų rozmarinų žaliavos ir RR kiekio RPD buvo keturkomponentiniame Verdin. Žaliavos dalis sudaro 50,68 % preparato. Atlikus bendro fenolinių junginių kiekio tyrimą, nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis yra skystajame rozmarinų ekstrakte (160,34 RRE mg/ml) (P<0.05). Didžiausias rozmarino rūgšties kiekis rastas skystajame rozmarinų... [toliau žr. visą tekstą] / Aim: to make comparable analysis of preparations containing plant materials accumulating rosmarinic acid, determine the total phenolic compound content, rosmarinic acid content and compare antioxidant activity. Objective:  Elect the preparations with rosmarinic acid;  Make the comparative analysis of compositions of these preparations;  Determine and compare the total phenolic compound content;  Determine and compare the rosmarinic acid content using HPLC method;  Determine and compare their antioxidant activity. Objects and methods: products with plant materials accumulating rosmarinic acid and rosemary leaf liquid extract. Total content of phenolic compounds was carried out spectrophotometrically using a standart Folin- Ciocalteu reagent. Rosmarinic acid content was determined by HPLC method. Antioxidant activity determined by DPPH radical scavenging method. The comparable analysis of products composition performed by literary analysis method. Conclusion: For research were selected 3 complex preparations with rosemary plant material and liquid rosemary extract. The highest quantity of raw rosemary material and RR quantity in RDD had Verdin, the preparation containing 4 components. Rosemary plant material makes 50,68 % in the preparation. Total phenolic compounds study showed that the highest amount of phenolic coumpounds had liquid rosemary extract (160,34 RAE mg/ml). The biggest quantity of rosmarinic acid was found in liquid rosemary extract (0.03 mg/ml). Combined... [to full text]