Doctor of Philosophy / Department of Entomology / Marcelo Ramalho-Ortigao / The emergence and reemergence of vector-borne diseases pose significant threats to humans and other animals worldwide. Although vector control relies mostly on insecticides, the emergence of insecticide resistance urges for the development of new strategies to control the spread of such diseases. For sand fly-transmitted leishmaniasis, Transmission Blocking Vaccines (TBV) may constitute a feasible strategy to impair Leishmania transmission from infected to uninfected vertebrate hosts. Moreover, sand fly saliva-based vaccines represent an alternative or complementary approach as these vaccines protect different mammalian hosts against Leishmania. Based on the potential use of sand fly molecules as vaccines against leishmaniasis, we assessed the potential of Phlebotomus papatasi midgut secreted proteins as TBV candidates and the expression variability of sand fly salivary gland genes. Regarding the TBV approach, we took advantage of the RNA interference (RNAi) technique to evaluate the effects of knocking down P. papatasi midgut-specific genes on Leishmania major development within the sand fly midgut. Whereas peritrophin 1 (PpPer1) knock down led to increased Le. major load by 39%, knocking down chitinase 1 (PpChit1) reduced Le. major load in P. papatasi midguts by 63%. Thus, our data strongly suggest that PpChit1 constitutes a potential target for TBV approaches against Leishmania transmission in endemic areas. Concerning protective vaccines based on salivary gland secreted proteins, we searched for expression polymorphism in selected salivary gland genes in natural and colonized populations of P. papatasi. Significant differences in salivary gland gene expression were not only exhibited in P. papatasi specimens collected in different geographic habitats but also seasonal difference in gene expression was displayed by specimens belonging to the same population. As antigen dose is an important component of immune responses, different doses of salivary protein inoculated into host skin may interfere with vaccine protection. Thus, the efficacy of sand fly saliva-based vaccine upon exposure to different salivary protein doses must be evaluated before deployment in endemic areas. Our data also ruled out some biotic factors as responsible for fine-tuning the expression of such genes. Overall, this dissertation makes significant contribution to the development of sand fly-based vaccines against leishmaniasis.

O tratamento com o iodo-131, conhecido como iodoterapia, já é bem estabelecido para tumores de tireoide diferenciados, porém, pode ter como importante efeito colateral o desenvolvimento da hipofunção das glândulas salivares. Dados recentes da literatura relatam casos de sialoadenite e xerostomia em pacientes submetidos à iodoterapia, no entanto, poucos estudos analisam o seu efeito na função e morfologia do tecido glandular, o que dificulta o aparecimento de métodos preventivos e curativos para essas complicações. Com isso e baseado em estudos que indicam resultados promissores da terapia fotobiomoduladora, com laser de baixa potência, no tratamento da hipofunção das glândulas salivares; este trabalho teve como objetivo compreender o efeito da iodoterapia sobre as glândulas salivares e analisar se a terapia de fotobiomodulação é capaz de evitar o dano ao tecido. Para isto, foi estabelecido o protocolo de indução da hipofunção das glândulas salivares através da iodoterapia em 70 camundongos BALB/c; os quais foram divididos em três grupos: C, controle (n=30); I, submetidos à iodoterapia (n=20); e IL, submetidos à iodoterapia e terapia fotobiomoduladora para a hipofunção das glândulas salivares (n=20), com um comprimento de onda de 808 nm, espectro infravermelho, potência de 100 mW, energia de 1 J e 10 s por ponto, totalizando uma densidade de energia de 35,7J/cm². Os animais foram avaliados em três tempos experimentais; T1: antes da iodoterapia, T2: 10 dias após a iodoterapia, e T3: 90 dias após a iodoterapia. Logo após a eutanásia, houve a remoção das glândulas salivares parótidas e submandibulares, para análises morfológicas e imuno-histoquímicas, para a determinação quantitativa de células apoptóticas e expressão dos canais de sódio e iodo, cujos resultados mostraram que a iodoterapia com o iodo-131 promoveu, nas glândulas salivares parótida e submandibular, a inibição dos canais de sódio e iodo, aumento de células apoptóticas e alteração do estroma glandular, com diminuição na concentração de colágeno e atrofia das unidades secretoras terminais. Além disso, também foi observado que a TFBM com laser de baixa potência foi eficaz na modulação dos efeitos inflamatórios causados pelo iodo-131, aumentando a produção de colágeno no tecido glandular, modulando a inflamação nas unidades secretoras terminais, reativando expressão do NIS e controlando a apoptose celular. Com os resultados obtidos no presente estudo, concluímos que que a iodoterapia causa hipofunção das glândulas salivares parótidas e submandibulares e que a terapia de fotobiomodulação se mostrou uma terapia eficaz e promissora para prevenir e atenuar estes efeitos colaterais. / Radioiodine treatment (RI), is a usual treatment for thyroid tumours, which may have the salivary gland hypofunction (SGH) as an important side effect. Sialoadenitis and xerostomia were reported in patients submitted to RI, however, only a few studies have analyzed its effect on function and morphology of glandular tissue, which makes it difficult to discover preventive and curative methods for these complications. Based on this and on the positive effects of photobiomodulation therapy (PBMT) in the treatment of HGS, the aim of the present study was to understand the effect of RI on salivary glands and to examine whether the PBMT is capable of preventing tissue damage. Thus, the protocol of induction of SGH by RI was performed in 70 BALB / c mice; which were divided into three groups: C, control (n = 30); I, submitted to RI (n = 20); and IL, submitted to RI and PBMT (n = 20). The animals were analysed in three different experimental times; T1: before RI, T2: 10 days after RI, and T3: 90 days after RI. Shortly after euthanasia, the parotid and submandibular salivary glands, were surgically removed for morphological and immunohistochemical analyzes, for the quantitative determination of apoptotic cells and expression of the sodium and iodine channels. The data showed an inhibition of sodium and iodine channels, increase of apoptotic cells and alteration of the glandular stroma, with destruction of collagen and atrophy of the secretory units in salivary glands, after RI. It was also observed that the PBMT seems to have been effective in modulating the effects of this inflammatory condition, increasing collagen production in the glandular tissue, modulating inflammation in the terminal secretory units, reactivating NIS expression and controlling cellular apoptosis. In conclusion, the RI caused hypofunction of the parotid and submandibular salivary glands and the PBMT was able to prevent and attenuate this side effect.

Sabendo que o conhecimento do sistema estomatognático é de fundamental importância para que os clínicos e cirurgiões cheguem a um diagnóstico preciso e instituam o tratamento adequado, propôs-se o presente estudo, que consistiu na dissecção da cabeça de quatro cadáveres caninos e quatro felinos. O objetivo foi a descrição e documentação das estruturas musculares e tegumentares detalhando a origem e inserção, inervação e função de cada estrutura dos tecidos moles bem como a descrição completa das glândulas salivares para a aplicação clínico-cirúrgica na prática odontológica de cães e gatos. / Concerned about the knowledge of the stomatognatic system as of fundamental importance to the practitioner and surgeons to reach a precise diagnosis and institute the appropriate treatment, the present study was proposed, consisting in the dissection of the head of four canine and four feline cadavers. The objective was the description and doccumentation of the muscular structures and tegument, detailing the origin and insertion, inervation and function of each structure of the soft tissue as well as the complete description of the salivary glands for a clinical-surgical application in dentistry.

RESUMO: O complexo Irre Recognition Module (IRM) é um importante subgrupo de proteínas transmembranares da superfamília das imunoglobulinas que desempenham função de adesão celular e participam de diversos processos do desenvolvimento de Drosophila melanogaster, tais como: direcionamento axonal, fusão de mioblastos, espaçamento dos órgãos sensoriais, autofagia das glândulas salivares, eliminação de células suplementares e especificação de destino celular na retina pupal. A família IRM é composta por quatro membros bem caracterizados: roughest (rst; irregular-chiasmC); kin-of-irre (kirre); hibris (hbs) e sticksand-stones (sns). Uma característica marcante entre dois membros deste grupo, kirre e rst, é a ocorrência de redundância funcional durante o processo de fusão de mioblastos na musculatura somática embrionária e na fase de \"cell sorting\" das células interomatidiais na etapa final de padronização da retina pupal de Drosophila. Neste contexto, foi observado que kirre pode suprir a ausência ou diminuição nos níveis de expressão de mRNA de rst para manter o fenótipo selvagem destes tecidos. Em glândulas salivares larvais de Drosophila, modelo amplamente utilizado para estudo da morte celular programada (MCP), mutantes rstD, um alelo semidominante de rst, apresentaram fenótipo de persistência deste tecido mesmo após 12 horas à sua eliminação observada em animais selvagens. Considerando o importante processo de redundância funcional promovido por membros do grupo IRM, durante o desenvolvimento de tecidos de Drosophila melanogaster, avaliamos a correlação entre os 4 membros deste grupo durante o processo de autofagia da glândula salivar larval. Para tanto, os níveis de transcrição de genes do complexo foram analisados por RT-qPCR após a formação do pupário até o desfecho do processo de histólise. Verificamos uma diminuição a nível transcricional de rst após o pico no título de ecdisona que leva a histólise da glândula em animais selvagens, e níveis alterados dos mRNAs dos membros do complexo em animais mutantes rstD. Contudo, a superexpressão de rst não foi suficiente para gerar glândulas persistentes. Além disso, descrevemos a localização espacial, por imunohistoquímica, dos membros do complexo, enfatizando a colocalização de rst e kirre, contrariamente aos membros sns e hbs. / ABSTRACT: The complex Irre Recognition Module (IRM) is an important subgroup of transmembrane proteins of the immunoglobulin superfamily that play a role in cell adhesion and participates in several processes of development of Drosophila melanogaster, such as: axonal targeting, fusion of myoblasts, spacing of sensory organs , autophagy of the salivary glands, elimination of supplementary cells and specification of cellular target in the pupal retina. The IRM family is composed of four well-characterized members: roughest (rst; irregular-chiasmC); kin-of-irre (kirre); hibris (hbs) and sticks-and-stones (sns). A striking feature of this group is the occurrence of functional redundancy during the process of fusion of myoblasts in the embryonic somatic musculature and in the phase of cell sorting of the interomatid cells in the final step of standardization of the pupal retina of Drosophila. In this context, it can be concluded that it can not provide an absence or decrease the mRNA expression levels of maintaining the wild tissue phenotype. In larval salivary glands of Drosophila, a widely used model for the study of programmed cell death (MCP), rstD mutants, a semidominant rst allele, showed persistence phenotype of this tissue after 12 hours for its observed elimination in wild animals. During the development of Drosophila melanogaster tissues, we evaluated a correlation between the 4 members of this group during the autophagy process of the salivary gland. To that end, transcription levels of complex genes were analyzed by RT-qPCR after patient formation until the end of the histolysis process. We have seen a transcriptional decrease in the first unpronounced postdoc peak of ecdysone leading to histolysis of the gland in wild animals, and altered levels of mRNAs of the complex members in rstD mutant animals. However, a first overexpression was not enough to generate persistent glands. In addition, we describe a spatial location, by immunohistochemistry, of two members of the complex, emphasizing a first and second hand colocalization, unlike the sns and hbs members.

Displasia ectodérmica hipoidrótica é uma doença genética rara, clinicamente caracterizada por alterações envolvendo os dentes, pele e suas estruturas anexas. Manifestações orais comuns incluem anadontia ou oligodontia, dentes conóides e xerostomia. Poucos relatos associam displasia ectodérmica e redução do fluxo salivar. O objetivo desse estudo é analisar possíveis alterações nas glândulas salivares de dez portadores de displasia ectodérmica que fazem acompanhamento no Departamento de Dermatologia Pediátrica da Universidade de São Paulo. Ultrassonografia foi realizada em dez casos em infantes portadores de displasia ectodérmica hipoidrótica nas suas glândulas salivares parótida e submandibular. Três apresentaram alterações na glândula parótida e/ou submandibular. Aplasia ou hipoplasia das glândulas salivares maiores é associada a casos de displasia ectodérmica e sugere-se acompanhamento rotineiro das glândulas salivares maiores usando ultrassonografia para prevenção de alterações decorrentes da hiposalivação na cavidade oral. / Background- Hypohidrotic ectodermal dysplasia is a rare genetic disease, clinically characterized by defects involving skin and their adnexal structures, as well as oral structures such as teeth, and occasionally salivary glands. These latter manifestations include anodontia or hypodontia, conical teeth and xerostomia. Objective- To analyze possible alterations in major salivary glands of ten patients with ectodermal dysplasia, using image exam. Methods- Ultrasonography was performed in ten pediatric cases of hypohidrotic ectodermal dysplasia to investigate the status of parotid and submandibular salivary gland. Results- Three patients presented aplasia/hypoplasia of at least one gland examined. The other 7 patients did not present any alterations in parotid and submandibular glands. Limitations- Although ultrasonography exam is adequate to investigate the presence and status of major salivary glands, other important glands such as sublingual and minor mucous salivary glands are not well-visualized using this technique. Conclusions- Aplasia or hypoplasia of the major salivary gland is strongly related to ectodermal dysplasia and we suggest routine evaluation of the major salivary gland using ultrasound to monitor and manage the possible impact of xerostomia in oral health.

A proteína Akt modula a função de numerosos substratos envolvidos na regulação da sobrevivência celular, progressão do ciclo celular e crescimento celular. Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram a superexpressão de Akt em adenoma pleomórfico, mioepitelioma e carcinoma adenóide cístico. O objetivo deste estudo foi analisar a via da proteína Akt através da avaliação da expressão das proteínas NFkB e PTEN em neoplasias benignas e malignas de glândulas salivares através das técnicas de imunohistoquímica, western blotting e imunofluorescência, e a possível interação protéica direta entre p-Akt/Mdm2 e p-Akt/PTEN em linhagem de carcinoma adenóide cístico. A superexpressão nuclear na proteína PTEN foi encontrada nas duas neoplasias malignas estudadas. Além disso, não foi observada interação direta entre as proteínas p-Akt/Mdm2 e p-Akt/PTEN, as quais apresentam localização nuclear em neoplasias de glândulas salivares. / The Akt protein modulates the function of numerous substrates involved in the regulation of cell survival, cell cycle progression and cell growth. Previous studies from our laboratories showed overexpression of Akt and Mdm2 followed by the lack of p53 expression in pleomorphic adenoma, myoepithelioma and adenoid cystic carcinoma. The aim of this study was to analyze the Akt pathway through evaluation of expression of NFkB and PTEN proteins in pleomorphic adenoma, carcinoma ex pleomophic adenoma and adenoid cystic carcinoma by western blotting, immunofluorescence and immunohistochemical techniques, and we have intended to analyse a possible direct interaction between p-Akt/Mdm2 and p-Akt/ PTEN protein in salivary gland tumours. Overexpression of nuclear PTEN was present in both carcinomas studied. In addition, there was no direct interaction between p-Akt/Mdm2 and p-Akt/ PTEN protein, which presents a nuclear localization in salivary gland tumours.

O objetivo do presente estudo foi o de analisar o efeito da irradiação com laser em baixa intensidade no sistema antioxidante enzimático de glândulas salivares submandibular (GSM) e parótida (GP) de ratas diabéticas induzidas por estreptozotocina. As ratas foram inicialmente divididas em grupos não-diabéticas (C) e diabéticas (D) e mantidas pelo período experimental de 30 dias. No vigésimo nono dia as ratas foram subdivididas em seis grupos, sendo três grupos de animais não diabéticos (C0, C5 e C20) e três de animais diabéticos (D0, D5 e D20), de acordo com a dose de irradiação laser que cada grupo recebeu (0, 5 e 20 J/cm2 respectivamente). Para a indução do diabetes foi realizada a injeção intraperitoneal de estreptozotocina (60 mg/kg de peso corporal) dissolvida em tampão citrato de sódio 0,1 M, pH 4,5. Os animais pertencentes aos grupos C (não diabéticos) receberam a injeção somente do veículo. As glicemias foram verificadas 72 horas após a indução do diabetes, para a confirmação do estado diabético nos grupos D. Foram considerados diabéticos os animais que apresentaram glicemia superior a 250mg de glicose/dl de sangue. A irradiação com laser em baixa intensidade seguiu a metodologia determinada pelo método de Simões et. al. (2009). Os animais foram eutanasiados 24 horas após a irradiação, sendo imediatamente removidas as glândulas salivares para a realização das análises bioquímicas. Foram determinados através de espectrofotometria, os valores de total antioxidante (TAS) e as atividades das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). Através da análise dos resultados podemos concluir que em GSM de ratas diabéticas o laser com dose de 20J/cm2 causou aumento na atividade da enzima SOD. E independente da dose, causou aumento nos valores de TAS e atividade da enzima CAT. Já em GSM de ratas não diabéticas a dose de 20J/cm2 causou diminuição dos valores de TAS. E independente da dose a irradiação com laser levou a um aumento da atividade da enzima CAT. Nas parótidas de ratas diabéticas, independente da dose, a irradiação com laser causou diminuição da atividade da enzima CAT. E em GP de ratas não diabéticas a dose de 5J/cm2 causou diminuição da atividade da enzima CAT. / The aim of the present study was to analize the effect of low-power laser irradiation in the antioxidant enzymatic system of submandibular (GSM) and parotid (GP) salivary glands of diabetic rats induced by streptozotocin. The rats were initially divided into non-diabetic animals (C) and diabetic-animals (D) and maintained by the experimental period of thirty days. Twenty-nine days after diabetes induction, the animals were randomly divided into six groups: three diabetic groups (D0, D5 and D20) and three non-diabetic groups (C0, C5 and C20), according with laser irradiation dose that each one received (0, 5 and 20J/cm2, respectively). For diabetes induction an intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) (60mg/Kg body weight), dissolved in 0.1M sodium citrate buffer, pH 4.5 was performed. In non-diabetic animals, only the citrate buffer was used. The diabetes condition was confirmed seventy-two hours after animals have received the STZ injection. Rats with blood glucose level higher than 14mM (250 mg/100ml) were considered diabetic. The laser irradiation was performed according to Simões et.al. method (2009). Twenty-four hours after the irradiation rats were euthanized. Then, immediately after the euthanasia, salivary glands were removed for biochemical analysis. The total antioxidant values (TAS) and the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxide (GPx) enzymes were determined in spectrophotometer. Analyzing the results we can conclude that in GSM of diabetic rats the laser irradiation with 20J/cm2 increased the SOD activity. With the two different doses, increased the TAS values and CAT activity. However, in GSM of non-diabetic rats, laser irradiation with 20J/cm2, decreased the TAS values and led to an increase in CAT activity, regardless of the dose. In parotid glands laser irradiation decreased the CAT activity with either dose of 5J/cm2 or 20 J/cm2 and the laser irradiation with dose of 5J/cm2, decreased the CAT activity in parotid glands of non-diabetic rats.

Considerando que o diabetes experimental altera a morfologia e função das glândulas salivares de ratos, o objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação com laser em baixa intensidade no metabolismo das glândulas parótidas (GP) e submandibulares (GSM) de ratas diabéticas, assim como analisar a glicemia destes animais. Ratas Wistar com aproximadamente 195 g foram divididas em diabéticas (D) e controles (C), e subdivididas de acordo com a dose de irradiação recebida: C-D0 (0 J/cm2), C-D5 (5 J/cm2), C-D10 (10 J/cm2), C-D20 (20 J/cm2). O diabetes foi induzido por injeção de estreptozotocina 60 mg/kg p.c., e confirmado após 72 h, através da glicemia. Vinte e nove dias após a indução, as ratas receberam a irradiação de acordo com o grupo a qual pertenciam. O laser de diodo (Ecco Fibras®), 660nm, foi utilizado nas áreas correspondentes às GP e GSM. Após 24 h, as ratas foram eutanasiadas e as glândulas removidas para posterior análise iônica, histológica e bioquímica de concentração total de proteína, atividade das enzimas catalase, peroxidase e amilase. Além disso, análise glicêmica também foi realizada. Análise de variância e teste de Tukey revelaram diminuição da glicemia nos grupos D5 e D20 (p<0,05), assim como diminuição na atividade da enzima catalase, nestas mesmas dosagens, nas GP e GSM para valores similares às ratas não-diabéticas (p>0,05), sendo que para as GSM, a dose de 10 J/cm2 também se mostrou efetiva. Análise histológica demonstrou acúmulo de lipídeos nas GP dos animais diabéticos, sendo que para os grupos que receberam irradiação, este acúmulo foi reduzido. Com base nos resultados, podemos concluir que a irradiação com laser vermelho nas GP e GSM altera a atividade enzimática da catalase, assim como altera a concentração de glicose sangüínea e o acúmulo de lipídeos. Com isto, mais estudos devem ser realizados objetivando continuar as análises de parâmetros antioxidantes, assim como, análise glicêmica, uma vez que a hiperglicemia e alterações no sistema antioxidante são diretamente relacionadas às complicações do diabetes. / Considering that experimental diabetes alters rat salivary gland morphology and function, the aim of this study was to evaluate the effect of laser irradiation (LI) on the glycaemic state and some biochemical parameters of the parotid glands (PG) and submandibulary glands (SMG) in diabetic and non diabetic rats, which were divided into 8 groups: D0/5/10/20 and C0/5/10/20, respectively. Diabetes was induced by administration of streptozotocin (60 mg/kg) and confirmed later by the glycaemia results. Twenty-nine (29) days after the induction, the PG and SMG of groups D-C5, D-C10 and D-C20, were irradiated with 5, 10 and 20 J/cm2 of laser diode (660nm/100mW) respectively. On the following day, the rats were euthanized and the blood glucose determined. The PG and SMG were removed and total protein concentration and amylase, peroxidase and catalase activities were performed, as well as, ionic and histological analysis. The analysis of the results (ANOVA and Tukey tests) revealed a decrease in the glycaemia level for groups D5 and D20 (p<0.05). In addition, diabetic rats showed higher catalase and peroxidase activities than non diabetic groups, without radiation. The doses of 5 and 20 J/cm2 decreased catalase activity, of PG and SMG, of diabetic groups to non diabetic values (p<0.05). Moreover, the dose of 10 J/cm2 also was effective to SMGs. Histological analysis showed accumulation of lipids droplets on parotid glands of diabetic animals. However, the lipid droplets quantity was lower in comparison with that observed to non irradiated diabetic animals. The results of the present study suggest that the classical organs which control glycaemia should also be analyzed after being irradiated with LI, once hyperglycaemia and alterations of the antioxidant system are the main causes of diabetes complications.

O câncer é um problema de saúde pública mundial, apresentando acréscimo na sua incidência a cada ano. O seu processo de evolução ainda não foi completamente desvendado, dificultando a elaboração de terapias adequadas. Na busca por um melhor prognóstico, pesquisas recentes têm discutido o papel das citocinas inflamatórias, do nicho perivascular e das células-tronco nos mecanismos de desenvolvimento e manutenção dos tumores malignos. Os tumores de glândula salivar representam uma pequena porcentagem das patologias malignas da região de cabeça e pescoço, podendo ocorrer em adultos e em crianças. O diagnóstico dificilmente é precoce e a taxa de sobrevida é extremamente baixa comparada aos demais tumores da região. Assim, este estudo teve como objetivo estudar as células provenientes dos tumores de glândula salivar do tipo adenoide cístico (CAC) e adenocarcinoma NOS (AdNOS) quanto ao seu perfil imunofenotípico, quanto à existência ou não de células-tronco tumorais nessa população, bem como investigar possíveis modificações na ativação de STAT3, Akt e ERK (moléculas envolvidas em vias de sinalização de manutenção do tumor), quando em contato com fatores secretados por células endoteliais. Foram coletados 5 CACs e 4 AdNOS, no Hospital da Universidade de Michigan (Ann Arbor, MI, EUA), durante 2010 e 2012. As células foram isoladas e caracterizadas em citometria de fluxo em P0 e P7, demonstrando um perfil de células CD44+ALDH+Lin- variando de 0,33 a 3,19% e 0,36 a 2,00%, respectivamente, entre 5 linhagens avaliadas. Na avaliação por western blotting, a e-caderina, o Snail e a actina de músculo liso foram ausentes em todos os tipos tumorais, enquanto que a citoqueratina 20 (Ck20) foi presente apenas nos AdNOS. Comparando os tumores com suas metástases, a presença de Ck20, p63 e β-catenina foi semelhante, enquanto que citoqueratina 7, a vimentina e o Bmi-1 foram maiores nas metástases. Tanto os AdNOS quanto CACs apresentaram receptores para IL-6, IL-8 e EGF. Foi observado que mediadores solúveis liberados pelas células endoteliais foram capazes de fosforilar STAT3, Akt e ERK em todas as células salivares estudadas, no entanto, a proteína recombinante humana IL-6, isoladamente, não foi capaz de ativar Akt. Orosferas foram geradas em todos os tipos tumorais, demonstrando o potencial de auto-renovação celular. Um maior número de esferas foi observado nas células metastáticas em relação às primárias. Células CD44+ALDH+, comparadas com CD44-ALDH-, geraram mais esferas, quando plaqueadas em alta densidade (5.000 células). No entanto, o inverso foi encontrado, quando uma única célula foi utilizada para o ensaio (p>0,05). Devido à dificuldade de obtenção e manipulação de células de tumores de glândula salivar, ainda há muito que se investigar mecanisticamente. Considerando a fosforilação de STAT3 na presença de IL-6, semelhante ao verificado em outros tumores, o uso de anticorpos contra IL-6, talvez sejam uma opção no futuro. / Cancer is a public health problem worldwide, with an increase in incidence every year. The process of its evolution is still not completely understood, hindering the development of appropriate therapies. In the search for a better prognosis, recent reports have discussed the role of inflammatory cytokines, perivascular niche and stem cells in the mechanisms of development and maintenance of malignant tumors. The salivary gland tumors represent a small percentage of malignancies of the head and neck and can occur in both adults and children. Early diagnosis is difficult and the survival rate is extremely low compared to other tumors in the same region. Thus, this study aimed to study cells from the adenoid cystic carcinoma (ACC) and adenocarcinoma NOS (AdNOS) tumors of salivary gland regarding its immunophenotypic profile and the existence or absence of tumor stem cells in this population, as well as investigate possible changes in the activation of STAT3, Akt and ERK (molecules involved in signaling pathways of tumor maintenance), when exposed to factors secreted by endothelial cells. ACCs (n=5) and AdNOS (n=4) were collected at the Hospital of the University of Michigan (Ann Arbor, MI, USA), during 2010 to 2012. Cells were isolated and characterized by flow cytometry at P0 and P7, showing a profile of ALDH+CD44+Lin- ranging from 0.33% to 3.19% and 0.36% and 2.00%, respectively, between 5 cell lines evaluated. In the protein profile, e-cadherin, Snail and SMA were absent in all tumor types. Ck20 was present only in AdNOS. Comparing primary tumors and their metastases, the presence of Ck20, and p63 β-catenin was similar, while Ck7, vimentin and Bmi-1 were higher in metastases. Both AdNOS as ACCs had receptors for IL-6, IL-8 and EGF. It was observed that soluble mediators released by endothelial cells were able to activate STAT3, Akt and ERK phosphorylation in all cells studied. However, recombinant human IL-6 alone was not able to activate Akt. Orospheres were generated in all tumor types, indicating the potential for cellular self-renewal. Highest number of spheres was observed in metastatic cells compared to primary. ALDH+CD44+ cells compared to ALDH-CD44- generated more spheres when plated in high density (5,000 cells), however, the opposite was found when one single cell seed was evaluated (p> 0.05). There is doubt if these cell markers would be consider for a stem cell model in salivary tumors. Due to the difficulty of obtaining and manipulating salivary gland tumor cells, there is still much to investigate mechanistically. As the phosphorylation of STAT3, in the presence of IL-6, was similar to that observed in other tumors, the use of antibodies against IL-6, may be an option in the future.

O carcinoma mucoepidermoide (CME) representa a neoplasia maligna de glândula salivar mais comum. Tumores com alto grau histológico e casos avançados, com metástase regional ou a distância, apresentam taxas de sobrevida extremamente baixas em decorrência da falta de terapias eficazes. A radioterapia é usualmente aplicada como terapia adjuvante ou primeira linha de tratamento de tumores inoperáveis, entretanto o perfil de resistência do CME à radioterapia permanece não elucidado. Outra abordagem em tumores avançados é a quimioterapia, usualmente a base de cisplatina, aplicada como tratamento meramente paliativo. Um dos principais pontos chave envolvidos na resistência tumoral às terapias convencionais é a manutenção de uma população celular com alto potencial tumorigênico, chamadas de células tronco tumorais (CTT). Estas células apresentam capacidade de evadir terapias convencionais e são responsáveis pelo aparecimento de metástases e recidivas. Evidências recentes sugerem que a utilização de terapias combinadas possuem maior potencial de reduzir a resistência tumoral. Desta forma, no primeiro estudo nosso objetivo foi identificar o perfil de resistência à radioterapia de linhagens celulares de CME, vias associadas com a radio-resistência adquirida e formas de sensibilizar farmacologicamente as células de CME, incluindo as CTT, à radiação ionizante. Os resultados demonstraram que as linhagens de CME apresentam diferentes perfis de resistência à radiação ionizante, sendo a linhagem mais resistente capaz de ativar intrinsicamente o NFκB frente a baixas doses de radiação. Além disso, a resistência das linhagens mais sensíveis foi estimulada quando a vida do NFκB foi excitada. A inibição farmacológica do NFκB com Emetine foi realizada com sucesso através da inibição do eixo IKK-β/IκBα/NFκB. A utilização de Emetine previamente a radiação ionizante foi capaz de aumentar a sensibilidade das células de CME assim como diminuir o percentual de CTT. No segundo estudo nosso objetivo foi identificar a resposta tumoral, incluindo das CTT, à terapia única ou combinada utilizando dois alvos terapêuticos distintos: NFκB (tratamento com Emetine) e acetilação de histonas (tratamento com SAHA). Os resultados mostraram que uma dose de Emetine é capaz de inibir a proliferação celular em todas as linhagens de CME analisadas, enquanto que o SAHA apresentou este efeito em apenas 50% das linhagens. Por outro lado, o SAHA foi mais eficaz em reduzir a população de CTT que o Emetine. A terapia combinada foi mais eficaz do que as terapias individuais em relação a proliferação celular e a depleção de CTT. Através da analise dos resultados dos dois estudos, podemos concluir que a resistência tumoral do CME é superada com maior êxito quando mais de uma forma de tratamento é empregada. A associação de Emetine com a irradiação ou de SAHA com Emetine se mostrou eficaz no controle do tumor através da erradicação da população de CTT. / Mucoepidermoid carcinoma (MEC) represents the most common salivary gland cancer. High-grade tumors and advanced cases, presenting regional or distant metastasis, exhibit extremely low survival rates due to a lack of effective therapies. Radiotherapy is frequently applied as adjuvant therapy or as first-line treatment in inoperable cases. Nevertheless, the resistance profile of MEC to radiotherapy remains unclear. Chemotherapy, most commonly cisplatin, used for advanced cases is considered merely palliative. A key point involved in tumor resistance to conventional therapies is the maintenance of a cell population with high tumorigenic potential, called cancer stem cells (CSC). These cells have the ability to evade conventional therapies and are responsible for metastases and recurrences. Recent evidences support that combined therapies are more effective in reducing tumor resistance. Therefore, in the first study our objective was to identify the resistance profile of MEC cell lines to ionizing radiation, pathways associated with acquired resistance and ways to sensitize pharmacologically MEC cells, including CSC, to ionizing radiation. The results demonstrated that MEC cell lines present different resistance profile to ionizing radiation and the most resistant cell line is capable to activate intrinsically NFκB after low doses of irradiation. Moreover, resistance of sensitive cell lines can be triggered by NFκB activation. Pharmacological inhibition of NFκB with Emetine was achieved through IKK-β/IκBα/NFκB axis inhibition. The use of Emetine prior to irradiation was efficient in increasing cell sensibility as well as decrease the percentage of CSC. In the second study, our aim was to identify the tumor response, including of CSC, to single or combined therapy using two distinc therapeutic targets: NFκB (treated with Emetine) and histone acetylation (treated with SAHA). The results demonstrated that a single dose of Emetine was capable to inhibit cell proliferation in all MEC cell lines, while SAHA achieved this result in only 50% of cell lines analyzed. On the other side, SAHA was more efficient than Emetine in disrupting CSC population. The combined therapy was more effective than both single agent therapies regarding cell proliferation and CSC depletion. By analysing both studies results, we can conclude that the tumor resistance of MEC is overcome with greater success when more than one form of treatment is employed. The association of Emetine with irradiation or SAHA with Emetine is effective in tumor control by eradicating the CSC population.