Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence. L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains. Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés. Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées. Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection. Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc. / Salmonella Typhimurium infections represent an important threat both to the swine industry and public health since pig is also a reservoir for human infections. Multiresistance to antimicrobial agents is often associated with S. Typhimurium belonging to phage type (PT) 104, and these isolates can cause septicemia in fattening pigs. It is thus necessary to control the infection at the herd level to avoid meat contamination by these isolates. However, in order to develop more efficacious control measures, it is important to characterize isolates, better understand the pathogenesis of infection and identify virulence factors. The main objective of this study was to characterize isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine and to compare them to isolates recovered from healthy pigs. Isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine (CS) were compared to isolates recovered from healthy animals at slaughterhouses (WCS). The phage type of each isolate was identified and these isolates were characterized by antimicrobial resistance, SDS-PAGE and immunoblotting, and PFGE. Among the CS isolates, PT 104 represented 36.4% of isolates while it represented 51.5% of WCS isolates. Resistance to as many as twelve antimicrobial agents was found in isolates from CS and WCS. However, it was not possible to associate any particular protein to septicemic isolates. Multiple genetic profiles were identified among the isolates of PT 104. Different steps of the pathogenesis of Salmonella infection were evaluated, in particularly the ability to adhere to and invade intestinal epithelial cell lines by CS and WCS isolates. The isolates recovered from diseased animals invaded intestinal epithelial cell lines at a higher rate than isolates from healthy pigs (P=0.003). Some isolates were selected according to their invasion rate and some analysis, using flow cytometry were done to evaluate phagocytosis, induction of apoptosis, and adhesion to intestinal mucus. The survival in monocytes was evaluated and the MATS method was used to evaluate the bacterial surface properties, measuring interactions with solvents. Isolates from WCS were more phagocytized than isolates fom CS at 15 minutes (P=0.02). We found no significant difference for the other methods used. Using SSH, we also compared the genome of a CS isolate (#36) to that of a WCS isolate (#1), for the identification of putative virulence factors. Clones with chromosome and plasmids homology were obtained. It was therefore decided to analyze the plasmid profiles of all isolates. Two profiles (PL14 and PL20) were more frequently observed in the PT 104 isolates than in the isolates belonging to other phage types (P=0.01 and P=0.01, respectively). Various profiles were found in both isolates from septicemic pigs and those from healthy pigs. An interesting plasmid of the CS isolate was sequenced. This plasmid possesses genetic information for replication as well as a beta-galactosidase-α. It would be needed to characterize the role of these putative virulence factors in the future. Our work suggests that isolates from septicemic pigs may be distinguished from isolates from healthy pigs by their better ability to invade intestinal cells as well as by a lower rate of phagocytosis in the early steps of infection. This study increased our knowledge on the pathogeny of S. Typhimurium infection in pigs.

ZUSAMMENFASSUNG Haukur Lindberg Sigmarsson PATHOGENITÄTSVERGLEICH VON SALMONELLA TYPHIMURIUM DT104 - WILDTYP UND SALMONELLA TYPHIMURIUM - DELETIONSMUTANTEN (sseD::aphT & invC::aphT) IN PERSISTENT INFIZIERTEN SCHWEINEN Salmonella (S.) Typhimurium DT104 ist ein gram-negatives Bakterium. Es weist keine Wirtsspezifität auf und gilt als Zoonoseerreger. Jährlich erkranken daran allein in Deutschland mehrere Tausend Menschen unter dem Bild einer schwerwiegenden Diarrhö mit zum Teil tödlichem Ausgang. Das Schwein gilt als eines der Reservoire für S. Typhimurium DT104 des Menschen. S. Typhimurium DT104 gelangt über vom Schwein stammende Produkte in den menschlichen Verzehr. Die Kontrolle von S. Typhimurium DT104 einschließlich effektiver Eradikationsmassnahmen in unseren Schweinebeständen ist deshalb von entscheidender Bedeutung, um den Eintrag dieses Bakteriums in die menschliche Nahrungskette wenn möglich zu eliminieren. Dafür ist das Verständnis über S. Typhimurium DT104 einschließlich der Kenntnis seine Pathogenitätseigenschaften notwendig. Ziel dieser Arbeit waren Untersuchungen zur Pathogenität von S. Typhimurium DT104. Dabei wurden der Wildstamm mit zwei seiner Deletionsmutanten (sseD::aphT und invC::aphT) verglichen. Die Untersuchungen erfolgten im Infektionsversuch an insgesamt 25 sechs Wochen alten männlichen Schweinen, die in einem vollklimatisierten Versuchsstall gehalten wurden. Den Tieren wurde im Anschluss an eine einwöchige Akklimatisierungsphase eines der nachfolgenden Stämme von S. Typhimurium DT104 oral in einer Konzentration von 1 x 1011 KBE verabreicht: Wildtyp (n = 8 Schweine), Deletionsmutante seeD::aphT (n = 8) und Deletionsmutante invC::aphT (n = 9). Bei den Mutanten handelt es sich um Varianten von S. Typhimurium DT104, die an den entsprechenden Abschnitten des Bakteriumgenoms (d.h. sseD-Gen bzw. invC-Gen) deletiert wurden. SseD regelt die Überlebensfähigkeit von S. Typhimurium in Makrophagen, invC dessen Invasionsvermögen. Im Mäusemodel war die Pathogenität beider Mutanten deutlich vermindert. Nach der Infektion schloss sich ein 20 tägiger Beobachtungszeitraum an, während dessen nachfolgend genannte Parameter erfasst bzw. Proben genommen wurden: klinische Symptome (Allgemeinbefinden, Erbrechen, Durchfall, Futteraufnahme, Atmung, Temperatur); Blutentnahme für Erstellung des weißen Blutbildes; Kotentnahme zum Nachweis der Ausscheidung von S. Typhimurium. Einen Tag nach Ende der Beobachtung wurden die Tiere getötet und Proben von insgesamt 15 Organen (unter anderem Tonsille; Colon und Caecum sowie dazugehörige Lymphknoten; Leber; Milz; Muskulatur) genommen. Kot sowie Gewebeproben wurden kulturell und wenn positiv auch mittels PCR untersucht. Alle mit dem Wildtyp infizierten Schweine wurden mehr oder weniger stark krank. Häufig zeigten erkrankte Schweine zeitgleich mehrere Krankheitssymptome (z. B. Erbrechen und Durchfall). Die Erkrankung hielt über mehrere Tage an. Im Vergleich dazu waren die Krankheitssymptome der Tiere, die mit Mutanten infiziert wurden, mild. Nur wenige Tiere erkrankten und dann auch nur kurzzeitig. Gewöhnlich war nur einer der erfassten Parameter verändert. Typische Veränderungen im weißen Blutbild waren nur bei Wildtyp-infizierten Tieren zu beobachten, während Tiere beider Mutanten kaum auf die Infektion reagierten. Alle 25 infizierten Tiere schieden S. Typhimurium mit dem Kot während der ersten Woche post inocculationem aus. Danach wurden in allen drei Gruppen etwa gleichviel intermittierende Ausscheider beobachtet. Zwischen 65 und 67 % der Gewebeproben der mit dem Wildtyp und mit der sseD::aphT-Mutante infizierten Tiere waren sowohl in der Kultur als auch mittels PCR S. Typhimurium positiv, während dieser Anteil nach Infektion mit invC::aphT nur 49 % betrug. Alle Tiere waren in Mandibularlymphknoten und im Colon positiv, während S. Typhimurium nur selten in Muskulatur und Leber nachzuweisen war. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Infektionen mit dem Wildtyp von S. Typhimurium zu einer schweren Erkrankung führen können. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass beide in dieser Arbeit verwendeten Mutanten weniger krankmachend sind. Es muss davon ausgegangen werden, dass die Deletionen in den sseD bzw. invC-Bereichen tatsächlich zu Veränderungen bestimmter Eigenschaften geführt haben, die Teil der Pathogenitätsmechanismen für das Schwein sind. Im Unterschied zur Maus war sseD beim Schwein allerdings invasiv. Es kann vermutet werden, dass die durch sseD kodierten Pathogenitätseigenschaften von S. Typhimurium bei der Maus anders als beim Schwein wirken und somit unterschiedliche Bedeutung haben. Da die invC::aphT-Mutante jedoch und wie erwartet wesentlich schwächer als Wildtyp und sseD::aphT invadierte ist davon auszugehen, dass die Deletion im invC Bereich das Invasionsvermögen der Mutante beim Schwein ähnlich wie bei der Maus verringerte.

Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence. L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains. Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés. Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées. Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection. Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc. / Salmonella Typhimurium infections represent an important threat both to the swine industry and public health since pig is also a reservoir for human infections. Multiresistance to antimicrobial agents is often associated with S. Typhimurium belonging to phage type (PT) 104, and these isolates can cause septicemia in fattening pigs. It is thus necessary to control the infection at the herd level to avoid meat contamination by these isolates. However, in order to develop more efficacious control measures, it is important to characterize isolates, better understand the pathogenesis of infection and identify virulence factors. The main objective of this study was to characterize isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine and to compare them to isolates recovered from healthy pigs. Isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine (CS) were compared to isolates recovered from healthy animals at slaughterhouses (WCS). The phage type of each isolate was identified and these isolates were characterized by antimicrobial resistance, SDS-PAGE and immunoblotting, and PFGE. Among the CS isolates, PT 104 represented 36.4% of isolates while it represented 51.5% of WCS isolates. Resistance to as many as twelve antimicrobial agents was found in isolates from CS and WCS. However, it was not possible to associate any particular protein to septicemic isolates. Multiple genetic profiles were identified among the isolates of PT 104. Different steps of the pathogenesis of Salmonella infection were evaluated, in particularly the ability to adhere to and invade intestinal epithelial cell lines by CS and WCS isolates. The isolates recovered from diseased animals invaded intestinal epithelial cell lines at a higher rate than isolates from healthy pigs (P=0.003). Some isolates were selected according to their invasion rate and some analysis, using flow cytometry were done to evaluate phagocytosis, induction of apoptosis, and adhesion to intestinal mucus. The survival in monocytes was evaluated and the MATS method was used to evaluate the bacterial surface properties, measuring interactions with solvents. Isolates from WCS were more phagocytized than isolates fom CS at 15 minutes (P=0.02). We found no significant difference for the other methods used. Using SSH, we also compared the genome of a CS isolate (#36) to that of a WCS isolate (#1), for the identification of putative virulence factors. Clones with chromosome and plasmids homology were obtained. It was therefore decided to analyze the plasmid profiles of all isolates. Two profiles (PL14 and PL20) were more frequently observed in the PT 104 isolates than in the isolates belonging to other phage types (P=0.01 and P=0.01, respectively). Various profiles were found in both isolates from septicemic pigs and those from healthy pigs. An interesting plasmid of the CS isolate was sequenced. This plasmid possesses genetic information for replication as well as a beta-galactosidase-α. It would be needed to characterize the role of these putative virulence factors in the future. Our work suggests that isolates from septicemic pigs may be distinguished from isolates from healthy pigs by their better ability to invade intestinal cells as well as by a lower rate of phagocytosis in the early steps of infection. This study increased our knowledge on the pathogeny of S. Typhimurium infection in pigs.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Juliana Lacerda Dissertacao.pdf: 580972 bytes, checksum: afedaefa404680a1d528d495b7558c61 (MD5) Previous issue date: 2011-02-26 / The objective of this study was to verify the physical, chemical and microbiological quality of Japanese quail eggs artificially contaminated with Salmonella Typhimurium, sanitized and stored at different temperatures (between 5 and 25 ºC) for 27 days. We used 768 eggs with opaque shells (Experiment 1) and bright shells (Experiment 2) with typical pigments of the species and average weight of 11 g. The experimental design was completely randomized in a 2x2x2 factorial arrangement (contamination x sanitation x cooling) with six replications, with one egg per experimental unit. The eggs were contaminated by handling with 1.5 x 105 colony forming unit (CFU) of Salmonella Typhimurium / mL and according to the treatments, sanitized with 5ppm Cl a solution, and stored at 5 or 25 ° C. The physical (egg weight, specific gravity, shell thickness, yolk, albumen and shell ratio, Haugh unit, yolk albumen index), chemical (pH of yolk and albumen) and bacteriological (bacterial count in eggshell and egg content) qualities were analyzed. Results of Experiment 1 showed a inear regression of sorage time (P <0.05) of storage time (up to 27 days) worsening the variables of egg weight, albumen and yolk index and albumen ratio. A quadratic effect (p <0.05) of storage time worsening the pH of albumen and Haugh units. There was an interaction for the yolk pH variable between sanitation and refrigeration (p <0.05) after 27 days, while those for non refrigerated eggs the best result was for sanitized eggs, showing the importance of sanitization. In Experiment 2 (eggs with bright shells) there was a linear effect (P <0.05) of storage time (27 days), worsening the variables of egg weight, albumen ratio and Haugh units and quadratic effects (p <0.05) worsening albumen index and pH. These results indicate that eggs with opaque or bright, had a poorer quality with increasing internal storage time, especially at 25 ° C. Quail eggs with opaque or bright shell, stored up to 27 days, should be sanitized (5 ppm of chlorine) and cooled to 5 ° C during storage to maintain physical and chemical qualities, regardless of bacterial contamination. The sanitization (5 ppm Cl) and cooling (5 º C) are effective in reducing the growth of Salmonella in experimentally infected quail eggs. / Objetivou-se com este estudo verificar a qualidade física, química e microbiológica de ovos de codornas japonesas contaminados artificialmente com Salmonella Typhimurium, sanitizados e armazenados a diferentes temperaturas (5 e 25 ºC) durante 27 dias. Foram utilizados 768 ovos com cascas opacas (Experimento 1) e brilhantes (Experimento 2) com pigmentos típicos da espécie e com peso médio de 11 g. O delineamento empregado foi inteiramente casualisados com esquema fatorial 2x2x2 (contaminação x sanitização x refrigeração) com seis repetições, sendo um ovo a unidade experimental. Os ovos foram contaminados pelo manuseio com 1,5 x 105 unidade formadoras de colônias (UFCs) de Salmonella Typhimurium/mL e de acordo com os tratamentos foram sanitizados com solução com 5ppm de Cl e armazenados a 5 ou 25 ºC. Foi analisada a qualidade física (peso do ovo, gravidade específica, espessura de casca, percentagem de gema, albume e casca, unidade Haugh, índices de gema e albume), química (pH de gema e albume) e bacteriológica (contagem de bactérias na casca e no conteúdo do ovo). Os resultados de peso do ovo, uH, índice de gema e de albume e pH de gema e de albume, quando contaminados experimentalmente com Salmonella Typhimurium prejudicou a qualidade física do ovo a partir de 18 dias de armazenamento. Com relação a qualidade bacteriológica do ovo, a sanitização com 5 ppm de Cl pode ser uma alternativa simples e de baixo custo para reduzir a possibilidade de contaminação por Salmonella em ovos de codornas. Pode-se afirmar, que o tempo de estocagem dos ovos e a temperatura de armazenamento influenciaram a qualidade interna dos ovos de codornas em todas as variáveis estudadas. Esses resultados indicam que ovos com cascas opacas ou brilhantes, apresentaram pior qualidade interna com o aumento do tempo de armazenamento, principalmente na temperatura de 25 ºC. Ovos de codornas com casca opaca ou brilhante, armazenados até 27 dias, devem ser sanitizados ( 5 ppm de cloro) e refrigerados a 5 ºC durante a estocagem para manter a qualidade física e química, independentemente da contaminação por bactérias. A sanitização (5 ppm de Cl) e a refrigeração (temperatura de 5 ºC) são eficientes na redução do crescimento da Salmonella em ovos de codornas contaminados experimentalmente.

Einleitung: Salmonellen und Yersinien haben als zweit- und dritthäufigste Verursacher bakterieller Gastroenteritiden in Deutschland und Europa im Jahr 2017 eine große Bedeutung als Lebensmittelinfektionserreger. Übertragen werden sie hauptsächlich durch den Verzehr roher, unzureichend gekühlter oder ungenügend erhitzter Schweinefleischerzeugnisse (Schweinemett, Hackepeter, kurz gereifte Rohwürste). Der Eintrag in die Lebensmittelkette erfolgt über symptomlose Trägertiere, die am Schlachthof in der Lebendund Fleischuntersuchung nicht als solche identifizierbar sind. Durch Kreuzkontaminationen kann es zur Verschleppung der Erreger auf die Schlachttierkörperoberflächen eigentlich gesunder Tiere kommen. Die vorherrschenden Hygienemaßnahmen am Schlachthof haben bisher nicht zu einer Verringerung des Auftretens dieser Bakterien geführt. Alternativ könnte gepulstes Licht (GL) als zusätzliches Dekontaminationsverfahren zum Einsatz kommen. Dessen antimikrobielle Wirksamkeit wurde bereits in zahlreichen Studien nachgewiesen. In der Literatur fehlten jedoch bislang Daten zur Inaktivierung von Salmonella ssp. auf Schwarte und Schweinelachs. Bezüglich Yersinia ssp. lagen noch gar keine Studien vor. Ziel der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war es, die Inaktivierung beider Erreger auf oben genannten Matrices zu testen und, unter Berücksichtigung chemischer und sensorischer Attribute der Produkte sowie die Eignung des Verfahrens für die Praxis abzuschätzen. Material und Methoden: Für die Untersuchungen mit künstlich inokulierten Schwarte- und Schweinefleischproben wurden die humanpathogenen Bakterien S. Typhimurium und Y. enterocolitica (Biotyp 4) verwendet. Die antimikrobielle Wirkung von GL wurde bei Fluences zwischen 0,52 und 19,11 J/cm² geprüft. Farb- bzw. Temperaturveränderungen auf der Probenoberfläche wurden mit Hilfe eines Spektrophotometers (CM 600 d, Konica Minolta) respektive eines Infrarotthermometers (104 IR, Testo) ermittelt. Zur Beurteilung der Lipidoxidation wurde die TBARS-Methode angewandt und die Proben maximal 10 Tage bei 4° C gelagert. Veränderungen bezüglich des Geruchs wurden bei Fluences von 0.52, 4.96 und 12.81 J/cm² mittels eines Konsensprofils beurteilt. Ergebnisse: Auf Schwarte konnten innerhalb von Sekunden Reduktionen von 1,73-3,16 log (S.) und von 1,48-4,37 log (Y.), auf Schweinelachs hingegen 1,7 log-Stufen für beide Mikroorganismen erreicht werden. Moderate bis starke Behandlungsregime (≥7,36 J/cm²) führten zu einer deutlich wahrnehmbaren Farbveränderung (E*ab ≥ 3) von Schwarte, ab 9,66 J/cm² zu einem signifikanten Verlust des roten Farbanteils von Schweinelachs. Zur Bewertung einer forcierten Fettoxidation wurde Malondialdehyd (MDA) in den Proben quantitativ bestimmt. Keine der getesteten Einstellungen hatte eine Überschreitung des Grenzwertes von 0,5 μg/g, ab dem Testpersonen die Produkte als ranzig wahrnehmen, zur Folge. Eine Überprüfung des Geruches erfolgte anhand von drei getesteten Fluences, die eine niedrige (0,52 J/cm²), moderate (4,96 J/cm²) und starke (12,81 J/cm²) Behandlung repräsentieren sollten. Mit 0,52 J/cm² bestrahlte Schwarte wurde von den Panel-Mitgliedern als weniger nach Schwein und weniger fettig riechend bewertet und somit als angenehm empfunden, ansonsten wurden chemische Gerüche wahrgenommen. Schlussfolgerungen: Aus den erzielten Daten geht hervor, dass sich gepulstes Licht in niedrigen Dosen (≤0,52 J/cm²) zur Dekontamination von Schwarte eignet. Praktisch umsetzbar wäre dies am Schlachthof als geschlossene Behandlungskammer, unmittelbar nach der Eviszeration. Somit könnte der noch nicht geteilte Schlachtkörper oberflächlich behandelt werden, ohne das unter der Haut befindliche Fleisch zu erreichen und die oben genannten Veränderungen hervorzurufen. Notwendig ist hierbei die Gewährleistung des Arbeitsschutzes. In diesem Zusammenhang muss entstehendes Ozon unschädlich beseitigt werden und das Tragen einer UV-Schutzbrille in der unmittelbaren Umgebung des Gerätes angeordnet werden. Abschließend ist hervorzuheben, dass das GL als zusätzliche, unterstützende Maßnahme zur Bekämpfung von Lebensmittelinfektionserregern zu sehen ist und keine bestehenden Hygienemaßnahmen (gute Hygienepraxis) ersetzen darf. Aufgrund der geringeren Wirksamkeit auf Schweinelachs und den damit verbundenen geruchlichen Veränderungen ist eine Applikation auf Schweinefleisch ohne weiterführende Untersuchungen nicht zielführend.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................III 1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................ 3 2.1 Gepulstes Licht und gesetzliche Rahmenbedingungen ............................................. 3 2.2 Wirk- und Reparaturmechanismen, Resistenzbildung und Inaktivierungskinetik ....... 7 2.2.1 Photochemischer Effekt ................................................................................... 7 2.2.2 Photoreaktivierung ........................................................................................... 8 2.2.3 Photothermischer Effekt ................................................................................... 8 2.2.4 Physikalischer Effekt ........................................................................................ 9 2.2.5 Resistenzbildung .............................................................................................. 9 2.2.6 Inaktivierungskinetik ......................................................................................... 9 2.3 Einflussparameter ................................................................................................... 10 2.3.1 Mikroorganismus .............................................................................................10 2.3.2 Zeitpunkt der Bestrahlung ...............................................................................12 2.3.3 Matrix ..............................................................................................................12 2.4 Gepulstes Licht zur Inaktivierung von lebensmittelassoziierten Erregern in Fleischwaren .......................................................................................................... 13 2.5 Zielstellung dieser Arbeit ......................................................................................... 17 3 VERÖFFENTLICHUNG ..........................................................................................18 3.1 Eigenanteil zur Veröffentlichung ............................................................................. 18 3.2 Publikation .............................................................................................................. 18 4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ..........................................................................46 4.1 Eignung des Verfahrens „Gepulstes Licht“ zur Dekontamination von Schwarte und Schweinelachs ................................................................................................. 46 4.2 Vergleich von GL mit anderen Dekontaminationsverfahren .................................... 49 4.2.1 Chemische Dekontamination ...........................................................................49 4.2.2 Physikalische Dekontamination .......................................................................49 4.2.3 Biologische Dekontamination ..........................................................................50 4.3 Alternativer Einsatz von GL..................................................................................... 51 4.4 Schlussfolgerungen ................................................................................................ 51 5 ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................................53 6 SUMMARY .............................................................................................................55 7 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................57 ANHANG ..............................................................................................................................66 DANKSAGUNG ....................................................................................................................72 / Introduction: Since Salmonella ssp. and pathogenic Yersinia ssp. were the second and third most frequent causes for bacterial gastroenteritis in Germany and throughout Europe in 2017 they are of high significance as foodborne infectious agents. They are mainly transmitted by consumption of raw, inadequately cooled or insufficiently heated pork meat products (ground pork, minced pork, shortly ripened raw sausages). Subclinically infected pigs, so-called “carriers”, cannot be detected during ante- and post-mortem inspection in the slaughterhouse. Cross-contamination can lead to bacterial dissemination onto actually S.- or Y.-free carcasses. Prevailing hygienic measures could not reduce bacterial prevalence in the abattoir so far. Thus, pulsed light (PL) may be used as an additional decontamination procedure. Its antimicrobial potential was proven in numerous studies. However, there are no data in the scientific literature about inactivation of Salmonella ssp. on pork skin and loin. Moreover, no experiments with Yersinia in connection with pulsed light have been performed until now. Aim of this study: Hence, the aim of this work was to investigate the inactivation of both microorganisms on above-mentioned matrices and to assess the suitability of the PL treatment for implementation in a slaughterhouse considering chemical and sensory alterations of the products. Materials and Methods: For experiments with artificially inoculated pork skin and loin samples human-pathogenic bacteria S. Typhimurium and Y. enterocolitica (Biotype 4) were used. The antimicrobial effect of PL was tested at fluences between 0.52 and 19.11 J/cm². Color and temperature changes on the sample surface were determined by means of a spectrophotometer (CM 600 d, Konica Minolta) or an infrared thermometer (104 IR, Testo). The TBARS method was used to assess lipid per-oxidation and the samples were stored at 4° C for a maximum of 10 days. Odor changes were appraised at fluences of 0.52, 4.96 and 12.81 J/cm² using consensus profiling. Results: On pork skin reductions of 1.73-3.16 log (S.) and of 1.48-4.37 log (Y.) were achieved within seconds. In contrast, on pork loin only 1.7 log of both microorganisms were maximally inactivated. Moderate to strong treatments (≥7.36 J/cm²) led to distinct color changes (E*ab ≥ 3) in pork skin, fluences above 9.66 J/cm² to a significant loss of red color in pork loin. For evaluation of possible accelerated lipid peroxidation malondialdehyde (MDA) was analyzed quantitatively in samples. None of the tested parameter combinations resulted in threshold value exceedance of 0.5 μg MDA/g which is the point where panel members start to perceive products as rancid. Odor appraisal was carried out using three fluences representing a mild (0.52 J/cm²), moderate (4.96 J/cm²) and strong (12.81 J/cm²) treatment. Pork skin treated with 0.52 J/cm² was assessed as less porky, less fatty and, thus, pleasant by panel members, apart from that chemical odors were perceived. Conclusions: From the available data it appears that pulsed light could be used in mild doses (≤0.52 J/cm²) for pork skin decontamination. Practically, a PL-unit could be designed as a closed chamber, implemented directly after the evisceration in the abattoir. This way, the not yet separated carcass could be treated superficially without reaching the meat surface preventing the above-mentioned alterations. Guarantee of safety at work also plays an important role. Emerging ozone must be evacuated safely and UV-protection glasses should be worn in direct proximity to the PL-system. Finally, one needs to consider, that PL should be regarded as an additional, supportive measure to control foodborne pathogens and not as a replacement for existing hygiene standards (good hygiene practice). An application on pork meat does not seem to be conducive because of its lower effect on pork loin and the associated odor changes.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................III 1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................ 3 2.1 Gepulstes Licht und gesetzliche Rahmenbedingungen ............................................. 3 2.2 Wirk- und Reparaturmechanismen, Resistenzbildung und Inaktivierungskinetik ....... 7 2.2.1 Photochemischer Effekt ................................................................................... 7 2.2.2 Photoreaktivierung ........................................................................................... 8 2.2.3 Photothermischer Effekt ................................................................................... 8 2.2.4 Physikalischer Effekt ........................................................................................ 9 2.2.5 Resistenzbildung .............................................................................................. 9 2.2.6 Inaktivierungskinetik ......................................................................................... 9 2.3 Einflussparameter ................................................................................................... 10 2.3.1 Mikroorganismus .............................................................................................10 2.3.2 Zeitpunkt der Bestrahlung ...............................................................................12 2.3.3 Matrix ..............................................................................................................12 2.4 Gepulstes Licht zur Inaktivierung von lebensmittelassoziierten Erregern in Fleischwaren .......................................................................................................... 13 2.5 Zielstellung dieser Arbeit ......................................................................................... 17 3 VERÖFFENTLICHUNG ..........................................................................................18 3.1 Eigenanteil zur Veröffentlichung ............................................................................. 18 3.2 Publikation .............................................................................................................. 18 4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ..........................................................................46 4.1 Eignung des Verfahrens „Gepulstes Licht“ zur Dekontamination von Schwarte und Schweinelachs ................................................................................................. 46 4.2 Vergleich von GL mit anderen Dekontaminationsverfahren .................................... 49 4.2.1 Chemische Dekontamination ...........................................................................49 4.2.2 Physikalische Dekontamination .......................................................................49 4.2.3 Biologische Dekontamination ..........................................................................50 4.3 Alternativer Einsatz von GL..................................................................................... 51 4.4 Schlussfolgerungen ................................................................................................ 51 5 ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................................53 6 SUMMARY .............................................................................................................55 7 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................57 ANHANG ..............................................................................................................................66 DANKSAGUNG ....................................................................................................................72

ZUSAMMENFASSUNG Haukur Lindberg Sigmarsson PATHOGENITÄTSVERGLEICH VON SALMONELLA TYPHIMURIUM DT104 - WILDTYP UND SALMONELLA TYPHIMURIUM - DELETIONSMUTANTEN (sseD::aphT & invC::aphT) IN PERSISTENT INFIZIERTEN SCHWEINEN Salmonella (S.) Typhimurium DT104 ist ein gram-negatives Bakterium. Es weist keine Wirtsspezifität auf und gilt als Zoonoseerreger. Jährlich erkranken daran allein in Deutschland mehrere Tausend Menschen unter dem Bild einer schwerwiegenden Diarrhö mit zum Teil tödlichem Ausgang. Das Schwein gilt als eines der Reservoire für S. Typhimurium DT104 des Menschen. S. Typhimurium DT104 gelangt über vom Schwein stammende Produkte in den menschlichen Verzehr. Die Kontrolle von S. Typhimurium DT104 einschließlich effektiver Eradikationsmassnahmen in unseren Schweinebeständen ist deshalb von entscheidender Bedeutung, um den Eintrag dieses Bakteriums in die menschliche Nahrungskette wenn möglich zu eliminieren. Dafür ist das Verständnis über S. Typhimurium DT104 einschließlich der Kenntnis seine Pathogenitätseigenschaften notwendig. Ziel dieser Arbeit waren Untersuchungen zur Pathogenität von S. Typhimurium DT104. Dabei wurden der Wildstamm mit zwei seiner Deletionsmutanten (sseD::aphT und invC::aphT) verglichen. Die Untersuchungen erfolgten im Infektionsversuch an insgesamt 25 sechs Wochen alten männlichen Schweinen, die in einem vollklimatisierten Versuchsstall gehalten wurden. Den Tieren wurde im Anschluss an eine einwöchige Akklimatisierungsphase eines der nachfolgenden Stämme von S. Typhimurium DT104 oral in einer Konzentration von 1 x 1011 KBE verabreicht: Wildtyp (n = 8 Schweine), Deletionsmutante seeD::aphT (n = 8) und Deletionsmutante invC::aphT (n = 9). Bei den Mutanten handelt es sich um Varianten von S. Typhimurium DT104, die an den entsprechenden Abschnitten des Bakteriumgenoms (d.h. sseD-Gen bzw. invC-Gen) deletiert wurden. SseD regelt die Überlebensfähigkeit von S. Typhimurium in Makrophagen, invC dessen Invasionsvermögen. Im Mäusemodel war die Pathogenität beider Mutanten deutlich vermindert. Nach der Infektion schloss sich ein 20 tägiger Beobachtungszeitraum an, während dessen nachfolgend genannte Parameter erfasst bzw. Proben genommen wurden: klinische Symptome (Allgemeinbefinden, Erbrechen, Durchfall, Futteraufnahme, Atmung, Temperatur); Blutentnahme für Erstellung des weißen Blutbildes; Kotentnahme zum Nachweis der Ausscheidung von S. Typhimurium. Einen Tag nach Ende der Beobachtung wurden die Tiere getötet und Proben von insgesamt 15 Organen (unter anderem Tonsille; Colon und Caecum sowie dazugehörige Lymphknoten; Leber; Milz; Muskulatur) genommen. Kot sowie Gewebeproben wurden kulturell und wenn positiv auch mittels PCR untersucht. Alle mit dem Wildtyp infizierten Schweine wurden mehr oder weniger stark krank. Häufig zeigten erkrankte Schweine zeitgleich mehrere Krankheitssymptome (z. B. Erbrechen und Durchfall). Die Erkrankung hielt über mehrere Tage an. Im Vergleich dazu waren die Krankheitssymptome der Tiere, die mit Mutanten infiziert wurden, mild. Nur wenige Tiere erkrankten und dann auch nur kurzzeitig. Gewöhnlich war nur einer der erfassten Parameter verändert. Typische Veränderungen im weißen Blutbild waren nur bei Wildtyp-infizierten Tieren zu beobachten, während Tiere beider Mutanten kaum auf die Infektion reagierten. Alle 25 infizierten Tiere schieden S. Typhimurium mit dem Kot während der ersten Woche post inocculationem aus. Danach wurden in allen drei Gruppen etwa gleichviel intermittierende Ausscheider beobachtet. Zwischen 65 und 67 % der Gewebeproben der mit dem Wildtyp und mit der sseD::aphT-Mutante infizierten Tiere waren sowohl in der Kultur als auch mittels PCR S. Typhimurium positiv, während dieser Anteil nach Infektion mit invC::aphT nur 49 % betrug. Alle Tiere waren in Mandibularlymphknoten und im Colon positiv, während S. Typhimurium nur selten in Muskulatur und Leber nachzuweisen war. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Infektionen mit dem Wildtyp von S. Typhimurium zu einer schweren Erkrankung führen können. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass beide in dieser Arbeit verwendeten Mutanten weniger krankmachend sind. Es muss davon ausgegangen werden, dass die Deletionen in den sseD bzw. invC-Bereichen tatsächlich zu Veränderungen bestimmter Eigenschaften geführt haben, die Teil der Pathogenitätsmechanismen für das Schwein sind. Im Unterschied zur Maus war sseD beim Schwein allerdings invasiv. Es kann vermutet werden, dass die durch sseD kodierten Pathogenitätseigenschaften von S. Typhimurium bei der Maus anders als beim Schwein wirken und somit unterschiedliche Bedeutung haben. Da die invC::aphT-Mutante jedoch und wie erwartet wesentlich schwächer als Wildtyp und sseD::aphT invadierte ist davon auszugehen, dass die Deletion im invC Bereich das Invasionsvermögen der Mutante beim Schwein ähnlich wie bei der Maus verringerte.

<p>  </p> <p>PhoQP is a two-component system that regulates the transcription of ~5% of the genes of <em>Salmonella enterica</em>. The membrane-bound PhoQ protein is phosphorylated in response to low extracellular Mg²⁺ concentration, acid pH, and a number of antimicrobial peptides. The inorganic phosphate bound to PhoQ is transferred to PhoP, which according to the classical model, acts as a typical transcriptional activator of its target genes. However, Will et al. (doi.org/10.1038/ncomms6270) proposed an alternate “counter-silencing” model, according to which genes in the PhoP regulon that were acquired by <em>Salmonella</em> via horizontal transfer are repressed by the generalized DNA-binding protein H-NS at high [Mg²⁺] and are induced at low [Mg²⁺] because the phosphorylated PhoP displaces the H-NS from the promoters and lifts repression. We evaluated this model by examining the transcriptional regulation of the <em>mgtCBRU-cigR </em>operon, which encodes the virulence protein MgtC and the Mg²⁺ transport protein MgtB and is in the SPI-3 pathogenesis island that has been acquired by <em>Salmonella</em> via horizontal transfer. Our main finding was that in the non-pathogenic strain of <em>S</em>. Typhimurium (LT2), induction of the <em>mgtCBRU-cigR</em> operon by Mg²⁺ limitation requires a functional PhoP protein, regardless of the presence or absence of H-NS. Interestingly, the pathogenic strain of <em>S</em>. Typhimurium (ATCC 14028s) revealed PhoP-independent transcription in the absence of H-NS, but only under inducing conditions. Thus, our results do not support the counter-silencing model and are consistent with the canonical view that PhoP is needed as a transcriptional activator of genes in the PhoP regulon.</p>

<p>Mast cells (MCs) are increasingly recognized as powerful sentinel cells responsible for modulating the early immune responses to a wide range of infectious agents. This protective role is attributable in part to their preponderance at the host-environment interface and their innate capacity to rapidly release modulators of immune cell trafficking which promotes the early recruitment of pathogen-clearing immune cells from the blood. However, host-adapted pathogens had been a critical threat to human for a long time because they have evolved mechanisms directed at overcoming protective immunity. </p><p>In this work, we outline <italic>Salmonella enterica</italic> serovar Typhimurium has evolved a novel mechanism to inactivate peripheral MCs resulting in limited neutrophil responses at infection sites in early stage of infection. Because of the delay in bacterial clearance at the point of entry, <italic>Salmonella</italic> are able to multiply and rapidly disseminate to distal sites. Suppression of local MCs' degranulation restricted outflow of vascular contents into infection sites, thus facilitating bacterial spread. </p><p>We discover MC suppression is mediated by the Salmonella Protein Tyrosine Phosphatase (SptP), which shares structural homology with <italic>Yersinia</italic> YopH. Interestingly, SptP, not only shares homology with phosphatases found in MCs, they are also homologous to YopH an effector protein expressed by plague causing <italic>Yersinia pestis</italic>. We show that YopH had MC suppressing abilities as SptP suggesting that this activity is shared among some of the more virulent bacterial pathogens. The functionally relevant domain in SptP is its enzymatic site and that it works by dephosphorylating the vesicle fusion protein N-ethylmalemide-sensitive factor (NSF) and by blocking phosphorylation of Syk, which is located in downstream and upstream of tyrosine phosphorylation signaling pathway in MCs. </p><p>Without SptP, orally challenged <italic>S.</italic> Typhimurium failed to suppress MC degranulation and exhibited limited colonization of the mesenteric lymph nodes. Administration of SptP to sites of Escherichia coli infection markedly enhanced its virulence. Thus, SptP-mediated inactivation of local MCs is a powerful mechanism utilized by <italic>S.</italic> Typhimurium to impede early innate immunity. This finding provides a logical explanation for why previous attempts by others to demonstrate a protective role for MCs against <italic>Salmonella</italic> infections have resulted in equivocal results. </p><p>Taken together, this work highlights an overlooked virulence mechanism possessed by certain host adapted pathogens to avoid the host's innate immune system. Additionally, this innate immune-quelling property of SptP may hold future promise in tempering harmful inflammatory disorders in the body of an immune competent host.</p> / Dissertation

Horizontal gene transfer (HGT) is now indisputably the predominant driving force, if not the sole force, behind speciation and the evolution of novelty in bacteria. Of all mechanisms of horizontal gene transfer (HGT), conjugation, the contact-dependent plasmid-mediated transfer of DNA from a bacterial donor to a recipient cell, is probably the most universal. First observed between bacteria, conjugation also mediates gene transfer from bacteria to yeast, plant and even animal cells. The range of environments in which bacteria naturally exchange DNA has not been extensively explored. The interior of the animal cell represents a novel and potentially medically relevant environment for gene transfer. Since most antibiotics are ineffective inside mammalian cells, our cells may be a niche for the evolution of resistance and virulence in invasive pathogens. Invading bacteria accumulate in vacuoles inside human cells, protected from antibiotics. Herein, I demonstrate the ability of intracellular Salmonella typhimurium to meet and exchange plasmid DNA by conjugation within animal cells, revealing the animal intracellular milieu as a permissive environment for gene exchange. This finding evokes a model for the simultaneous dissemination of virulence and antibiotic resistance within a niche protected from both antibiotics and the immune system and extends the variety of environments in which bacteria are known to exchange genes. Unlike conjugation between bacteria, conjugation between bacteria and eukaryotic cells requires the import of transferred DNA into the nucleus before the transferred genes can be expressed and inherited. Plant-cell nuclear transformation by the conjugation system of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid is believed to be mediated by nuclear localization sequences (NLSs) carried within the proteins that accompany the T-DNA during transfer. Whether NLSs are equally important for transmission of other conjugative plasmids to eukaryotic cells is unknown. Herein, I demonstrate nuclear localization potential within the putative conjugative escort protein TraI of the IncPa plasmid RP4. In contrast, MobA, the putative escort protein from the IncQ plasmid RSF1010, lacked any clear nuclear localization potential. It is therefore likely that specific nuclear localization signals within conjugative proteins are not essential for nuclear transformation per se, although they may assist in efficient plasmid transmission.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.