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[ES] En esta tesis doctoral se estudia el problema de secuenciación de máquinas paralelas no relacionadas con necesidad de ajustes y recursos adicionales asignados en los ajustes. En este problema, se tiene un grupo de tareas (también llamadas trabajos), donde cada una debe ser procesada en una de las máquinas paralelas disponibles. Para procesar una tarea después de otra en la misma máquina, se debe hacer un ajuste en la máquina. Se asume que estos ajustes deben ser realizados por un recurso adicional limitado (por ejemplo, operarios). En esta tesis doctoral se estudian dos variantes del problema planteado: 1) considerando el problema con el único objetivo de minimizar el tiempo máximo de finalización de todos los trabajos (makespan), y 2) considerando el problema multi-objetivo minimizando simultáneamente el makespan y el consumo máximo de recursos adicionales. Inicialmente, se realiza una completa revisión bibliográfica sobre estudios relacionados con el problema planteado. En esta revisión se detecta que, a pesar de existir numerosos estudios de secuenciación de máquinas paralelas, no muchos de estos estudios tienen en cuenta recursos adicionales. Posteriormente, para introducir el problema a estudiar antes de plantear métodos de resolución, se realiza una breve explicación de los principales problemas de secuenciación de máquinas paralelas. El problema de un solo objetivo está clasificado como NP-Hard. Por ello, para abordar su resolución se han diseñado e implementado heurísticas y metaheurísticas siguiendo dos enfoques diferentes. Para el primer enfoque, que ignora la información sobre el consumo de recursos adicionales en la fase constructiva, se adaptan dos de los mejores algoritmos existentes en la literatura para el problema de máquinas paralelas con ajustes sin necesidad de recursos adicionales. En el segundo enfoque, que sí tiene en cuenta la información sobre el consumo de recursos adicionales en la fase constructiva, se proponen nuevos algoritmos heurísticos y metaheurísticos para resolver el problema. Tras analizar los resultados de los experimentos computacionales realizados, concluimos que hay diferencias entre los dos enfoques, siendo significativamente mejor el enfoque que tiene en cuenta la información sobre los recursos adicionales. Al igual que en el caso de un solo objetivo, la complejidad del problema multi-objetivo obliga a presentar algoritmos heurísticos o metaheurísticos para resolverlo. En esta tesis se presenta un nuevo algoritmo metaheurístico multi-objetivo eficiente para encontrar buenas aproximaciones a la frontera de Pareto del problema. Además, se adaptaron otros tres algoritmos que han mostrado buenos resultados en diferentes estudios de problemas de secuenciación de máquinas multi-objetivo. Después de realizar experimentos computacionales exhaustivos, concluimos que el nuevo algoritmo propuesto en esta tesis es significativamente mejor que los otros tres algoritmos existentes, y que se han adaptado para resolver este problema. / [CAT] En aquesta tesi doctoral s'estudia el problema de seqüenciació de màquines paral·leles no relacionades amb necessitat d'ajustos i recursos addicionals assignats en els ajustos. En aquest problema, es tenen un grup de tasques (també anomenades treballs), on cadascuna ha de ser processada en una de les màquines paral·leles disponibles. Per processar una tasca després d'una altra en la mateixa màquina, s'ha de fer un ajustament en la màquina. S'assumeix que aquests ajustos en les màquines per a processar una tasca després del processament d'una altra, han de ser realitzats per un recurs addicional limitat (per exemple, operaris). En aquesta tesi doctoral s'estudien dos variants al problema plantejat: 1) considerant el problema com l'únic objectiu de minimitzar el temps màxim de finalització de tots els treballs (makespan), i 2) considerant el problema multi-objectiu minimitzant simultàniament el makespan i el consum màxim de recursos addicionals. Inicialment, es realitza una completa revisió bibliogràfica sobre estudis relacionats amb el problema plantejat. En esta revisió es detecta que, tot i existir nombrosos estudis de seqüenciació de màquines paral·leles, hi ha molts pocs que tenen en compte recursos addicionals. Posteriorment, per introduir el problema a estudiar abans de plantejar mètodes de resolució, es realitza una breu explicació dels principals problemes de seqüenciació de màquines paral·leles. El problema d'un sol objectiu està classificat com NP-Hard. Per això, per abordar la seua resolució s'han dissenyat i implementat heurístiques y metaheurístiques seguint dos enfocs diferents. El primer enfoc ignora la informació sobre el consum de recursos en la fase constructiva, adaptant dos dels millors algoritmes existents en la literatura per al problema de seqüenciació de màquines paral·leles amb ajustaments sense necessitat de recursos. Per al segon enfoc si es té en compte la informació sobre el consum de recursos en la fase constructiva. Després d'analitzar els resultats dels experiments computacionals realitzats, concloem que hi ha diferencies entre els dos enfocs, sent significativament millor l'enfoc que té en compte la informació sobre el recursos. De la mateixa manera que en el cas d'un sol objectiu, la complexitat del problema multi-objectiu obliga a presentar algoritmes heurístics o metaheurístics per a resoldre-ho. En aquesta tesi es presenta un nou algoritme metaheurístic multi-objectiu eficient per trobar bones aproximacions a la frontera de Pareto del problema. A més, es van adaptar altres tres algoritmes que han mostrat bons resultats en diferents estudis de problemes de seqüenciació de màquines multi-objectiu. Després de realitzar experiments computacionals exhaustius, concloem que el nou algoritme proposat en aquesta tesi és significativament millor que els altres tres algoritmes existents i que s'han adaptat per resoldre aquest problema. / [EN] In this thesis we study the unrelated parallel machine scheduling problem with setup times and additional limited resources in the setups. In this problem, we have a group of tasks (also called jobs), where each one must be processed on one of the available parallel machines. To process one job after another on the same machine, a setup must be made on the machine. It is assumed that these setups on machines must be made by a limited additional resource (eg, operators). In this thesis two variants of the problem are studied: 1) considering the problem with the objective of minimizing the maximum completion time of all jobs (makespan), and 2) considering the multi-objective problem, minimizing the makespan and the maximum consumption of additional resources. Initially, a complete literature review is carried out on studies related to the problem addressed in this thesis. This review finds that despite numerous parallel machine scheduling studies, there are very few that take into account additional resources. Subsequently, to introduce the problem addressed before proposing resolution methods, a brief explanation of the main parallel machines scheduling problems is made. The problem with a single objective is classified as NP-Hard. Therefore, to solve it, heuristics and metaheuristics have been designed and implemented following two different approaches. For the first approach, which ignores the information on the consumption of resources in the construction phase, two of the best algorithms existing in the literature for the problem of parallel machines with setups without additional resources are adapted. For the second approach, which does take into account information on the consumption of resources in the construction phase, new heuristic and metaheuristic algorithms are proposed to solve the problem. Following the results of the computational experiments, we conclude that there are differences between the two approaches, the approach that takes into account the information on resources being significantly better. As in the case of a single objective, the complexity of the multi-objective problem requires the formulation of heuristic or metaheuristic algorithms to solve it. In this thesis, a new efficient multi-objective metaheuristic algorithm is presented to find good approximations to the Pareto front of the problem. In addition, three other algorithms that have shown good results in different studies of multi-objective machine scheduling problems were adapted. After carrying out exhaustive computational experiments, we concluded that the new algorithm proposed in this thesis is significantly better than the other three adapted algorithms. / Yepes Borrero, JC. (2020). Secuenciación de máquinas con necesidad de ajustes y recursos adicionales [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/158742

Tesis por compendio / [ES] El melanoma es el tipo de cáncer de piel más mortífero y peligroso, ya que tumores de pequeño tamaño pueden generar metástasis. Hasta la fecha, se ha tratado de clasificar desde el punto de vista clínico, epidemiológico y molecular, empleándose actualmente el nivel de exposición solar y la localización del tumor como criterios principales para dividir en distintos grupos a los pacientes de melanoma. En 1998, David Whiteman y colaboradores propusieron un "modelo de vías divergentes" para el desarrollo del melanoma. Este presentaba dos vías: una vinculada a la proliferación melanocítica (nevogénica) y otra relacionada con la exposición solar crónica (CSD). Corroborado desde el punto de vista clínico y epidemiológico, todavía no se ha aportado una caracterización molecular en profundidad. A nivel general se habían identificado genes cuyas mutaciones eran relevantes para el desarrollo del melanoma, como por ejemplo KIT. Sin embargo, todavía se había de estudiar con más detalle la distribución de estas mutaciones entre los distintos subgrupos de melanoma, así como su posible valor pronóstico. En esta tesis se han empleado técnicas de secuenciación - masiva y tradicional - para caracterizar los perfiles mutacionales de las poblaciones del modelo de vías divergentes. Encontramos diferencias tanto en el número de mutaciones como en los genes afectados. También hemos visto cómo los melanomas con mutaciones en KIT parecen desarrollarse por una vía independiente de la etiopatogenia conocida, careciendo el estatus mutacional de este gen de valor pronóstico para la supervivencia de los pacientes. / [CA] El melanoma és el tipus de càncer de pell més mortífer i perillós, ja que fins els tumors de menor mida poden acabar generant metàstasi. Al llarg dels anys, s'ha tractat de classificar des del punt de vista clínic, epidemiològic i molecular. Les classificacions actuals utilitzen el nivell d'exposició solar i la localització tumoral per dividir en diferents grups als pacients de melanoma. Al 1998, David Whiteman i col·laboradors proposaren un model de desenvolupament del melanoma que anomenaren "model de vies divergents". Aquest presentava dos vies per la melanomagènesi: una vinculada a la proliferació melanocítica (nevogènica) i l'altra relacionada amb l'exposició solar crònica (CSD). Malgrat aquest model fou corroborat des del punt de vista clínic i epidemiològic, encara no s'ha aportat una caracterització molecular en profunditat. A nivell general s'havien identificat gens les mutacions dels quals eren rellevants per al desenvolupament del melanoma, com el gen KIT. Però, encara s'havia d'estudiar amb més cura la distribució d'estes mutacions entre els distints subgrups de melanoma, així com el seu possible valor pronòstic. En aquesta tesi s'han emprat tècniques de seqüenciació -massiva i tradicional- per caracteritzar els perfils mutacionals de les dues poblacions proposades pel model de vies divergents, trobant diferències tant al nombre de mutacions com als gens afectats. També hem vist com els melanomes mutats en KIT semblen desenvolupar-se per una via independent de l'etiopatogènia coneguda, mancant l'estatus mutacional d'aquest gen de valor pronòstic per la supervivència dels pacients. / [EN] Melanoma is the deadliest and most dangerous type of skin cancer, given that a small tumor can spread and result in metastasis. Over the years, classifications have been made either from a clinical, epidemiological or molecular point of view. Current classifications use the degree of solar exposure and tumoral location to divide into different melanoma groups. In 1998, David Whiteman and collaborators proposed the divergent pathway model for melanoma development. This presented two pathways to melanomagenesis: one related to melanocytic proliferation (nevogenic) and the other related to chronic sun exposure (CSD). Despite corroborations of this model from the clinic and epidemiology, it is yet to be molecularly characterized in depth. At a general level, different genes had been identified with relevant mutations for the development of melanoma, as is the gene KIT. However, there was a lack of knowledge on how these mutations were distributed among different melanoma subgroups, as well as the potential prognostic value. In this thesis we have implemented sequencing techniques - both massive and traditional - to characterize the mutational profile of the two populations proposed by the divergent pathways model. We found differences both in the number of mutations and in the genes carrying the mutations. We have also seen how melanomas harboring KIT mutations seem to develop in a way which is independent from the known etiology, and how the mutational status of this gene lacks prognostic value on the outcome of the patients. / Millán Esteban, D. (2022). Next-Generation Sequencing in the Identification of Biomarkers in Cutaneous Melanoma According to the Etiopathogenic Development Pathway and their Potential Clinical Relevance [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182977 / Compendio

Tesis por compendio / [ES] El objetivo inicial de esta tesis era detectar y rastrear virus entéricos en diferentes matrices acuáticas mediante la combinación de protocolos moleculares y metagenómicos. Se establecieron como objetivos principales el desarrollo de procedimientos para la concentración de virus en muestras de aguas residuales, el análisis de virus indicadores de contaminación fecal y la caracterización del viroma de estas muestras. En cuanto al desarrollo de procedimientos para la concentración de virus entéricos emergentes en muestras de aguas residuales, el protocolo de floculación con hidróxido de aluminio, utilizado habitualmente en el grupo para la concentración de otros virus entéricos, resultó muy eficaz para el virus de la Hepatitis E, permitiendo su detección en muestras de aguas de entrada y salida de estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR). Por lo que respecta al seguimiento de la prevalencia de otros virus entéricos e indicadores virales en muestras de entrada y salida de EDARs, esta tesis proporciona información cuantitativa sobre la presencia del indicador crAssphage y otros virus entéricos de cápside intacta en aguas de diferentes EDARs valencianas. Además, los resultados de la correlación indican que crAssphage podría no ser un indicador óptimo de la presencia de virus entéricos infecciosos en las aguas residuales tratadas. En relación a la caracterización del viroma de las muestras de agua de las EDARs analizadas, en la presente tesis se describe un procedimiento de referencia que permite la detección y caracterización de las poblaciones virales en las muestras de aguas residuales recogidas a la entrada y salida de la planta depuradora. También se refleja el sesgo existente en los perfiles del viroma que se obtienen según las librerías de secuenciación que se empleen. En este sentido, esta investigación arroja luz sobre la diversidad de las comunidades virales en influentes y efluentes de aguas residuales, proporcionando información valiosa también en términos de indicadores fecales virales. Con la llegada de la pandemia de COVID-19 a principios de 2020, el SARS-CoV-pasó a ser el protagonista de la segunda parte de la tesis. En este aspecto, se marcaron como objetivos implementar un sistema de monitorización de SARS-CoV-2 en aguas residuales y desarrollar y optimizar métodos moleculares rápidos para inferir la infectividad del SARS-CoV-2. Los resultados obtenidos han demostrado que la aplicación de la epidemiología basada en aguas residuales (WBE) es eficiente para estimar la presencia de COVID-19 en comunidades y puede servir de herramienta para la salud pública como alerta temprana ante situaciones pandémicas. Asimismo, esta tesis incluye el primer estudio publicado en España que realizó un análisis metagenómico de la diversidad del SARS-CoV-2 presente en las aguas residuales en las tres primeras oleadas epidemiológicas, cuyos resultados confirmaron el potencial de la secuenciación masiva de aguas residuales para detectar nuevas mutaciones y linajes del SARS-CoV-2. Además, también se han comparado y optimizado los protocolos de concentración, extracción y detección de ácidos nucleicos de coronavirus a partir de muestras de aguas residuales, superficiales y de mar. Así, este trabajo amplía el conocimiento sobre los procedimientos analíticos para la detección del SARS-CoV-2 en aguas residuales favoreciendo la implementación global del COVID-19 WBE. Finalmente, se ha implementado un protocolo de RT-qPCR de viabilidad basado en el cloruro de platino para evitar la amplificación del ARN del SARS-CoV-2 no infeccioso. Además, los resultados de esta tesis apoyan la idea de que el SARS-CoV-2 presente en las aguas residuales no es infeccioso. En general, en el marco de esta tesis doctoral se ha desarrollado una herramienta analítica rápida basada en la RT-qPCR de viabilidad para inferir la infectividad del SARS-CoV-2 con potencial aplicación en la evaluación de riesgos, la prevención y el control en los programas de salud / [CA] L'objectiu inicial d'esta tesi era detectar i rastrejar virus entèrics en diferents matrius aquàtiques mitjançant la combinació de protocols moleculars i metagenòmics. Es van establir com a objectius específics el desenvolupament de procediments per a la concentració de virus en mostres d'aigües residuals, l'anàlisi de virus indicadors de contaminació fecal i la caracterització del viroma d'estes mostres. Pel que fa al desenvolupament de procediments per a la concentració de virus entèrics emergents en mostres d'aigües residuals, el protocol de floculació amb hidròxid d'alumini, utilitzat habitualment al grup per a la concentració d'altres virus entèrics, va resultar molt eficaç per al virus de l'hepatitis E, permetent-ne la detecció en mostres d'aigües d'entrada i de sortida d'estacions depuradores d'aigües residuals (EDAR). Pel que fa al seguiment de la prevalença d'altres virus entèrics i indicadors virals en mostres d'entrada i de sortida d'EDARs, esta tesi proporciona informació quantitativa sobre la presència de l'indicador crAssphage i altres virus entèrics de càpside intacta en aigües de diferents EDARs valencianes. A més, els resultats de la correlació indiquen que el bacteriòfag crAssphage podria no ser un indicador òptim de la presència de virus entèrics infecciosos a les aigües residuals tractades. Pel que fa a la caracterització del viroma de les mostres d'aigua de les EDARs analitzades, a la present tesi es descriu un procediment de referència que permet la detecció i caracterització de les poblacions virals a les mostres d'aigües residuals recollides a l'entrada i sortida de la planta depuradora. També es reflecteix el biaix existent als perfils del viroma que s'obtenen segons les llibreries de seqüenciació que s'utilitzen. En este sentit, esta investigació aporta coneixement sobre la diversitat de les comunitats virals en influents i efluents d'aigües residuals, proporcionant informació valuosa també en termes d'indicadors fecals virals. Amb l'arribada de la pandèmia de COVID-19 a principis del 2020, el SARS-CoV-va passar a ser el protagonista de la segona part de la tesi. En este aspecte, es van establir com a objectius implementar un sistema de monitorització de SARS-CoV-2 en aigües residuals i desenvolupar i optimitzar mètodes moleculars ràpids per inferir la infectivitat del SARS-CoV-2. Els resultats obtinguts han demostrat que l'aplicació de l'epidemiologia basada en aigües residuals (WBE) és eficient per estimar la presència de COVID-19 a les comunitats i pot servir d'eina per a la salut pública com a alerta primerenca davant de situacions pandèmiques. Així mateix, esta tesi inclou el primer estudi publicat a Espanya que va realitzar una anàlisi metagenòmica de la diversitat del SARS-CoV-2 present a les aigües residuals a les tres primeres onades epidemiològiques, els resultats del qual van confirmar el potencial de la seqüenciació massiva d'aigües residuals per a detectar noves mutacions i llinatges del SARS-CoV-2. A més, també s'han comparat i optimitzat els protocols de concentració, extracció i detecció d'àcids nucleics de coronavirus a partir de mostres d'aigües residuals, superficials i de mar. Així, este treball amplia el coneixement sobre els procediments analítics per a la detecció del SARS-CoV-2 en aigües residuals afavorint la implementació global del COVID-19 WBE. Finalment, s'ha implementat un protocol de RT-qPCR de viabilitat basat en el clorur de platí per evitar l'amplificació de l'ARN del SARS-CoV-2 no infecciós. A més, els resultats d'esta tesi donen suport a la idea que el SARS-CoV-2 present a les aigües residuals no és infecciós. En general, en el marc d'esta tesi doctoral s'ha desenvolupat una eina analítica ràpida basada en la RT-qPCR de viabilitat per inferir la infectivitat del SARS-CoV-2 amb potencial aplicació en l'avaluació de riscos, la prevenció i el control en els programes de Salut Pública. / [EN] The initial aim of this thesis was to detect and monitor the presence of enteric viruses in different aquatic matrices using both molecular and metagenomic protocols. The specific objectives were the development of procedures for the concentration of viruses in wastewater samples, the analysis of viruses indicative of faecal contamination and the characterisation of the virome in these samples. Regarding the development of procedures for the concentration of emerging enteric viruses in wastewater samples, the flocculation protocol with aluminium hydroxide, commonly used in the group for the concentration of other enteric viruses, proved to be very effective for Hepatitis E virus, allowing its detection in influent and effluent water samples from wastewater treatment plants (WWTPs). Regarding the monitoring of the prevalence of other enteric viruses and viral indicators in incoming and outgoing samples from WWTPs, this thesis provides quantitative information on the presence of the indicator crAssphage and other enteric viruses with intact capsid in water from different Valencian WWTPs. Moreover, the correlation results indicate that crAssphage may not be an optimal indicator of the presence of infectious enteric viruses in treated wastewater. In relation to the virome characterisation of the WWTP water samples analysed, the present thesis describes a reference procedure that allows the detection and characterisation of viral populations in wastewater. It also reflects the existing bias in the virome profiles obtained depending on the sequencing libraries used. In this sense, this research sheds light on the diversity of viral communities in influent and effluent wastewater, providing valuable information also in terms of faecal viral indicators. With the advent of the COVID-19 pandemic in the early 2020s, SARS-CoV-2 became the focus of the second part of the thesis. In this aspect, the objectives were to implement a monitoring system for SARS-CoV-2 in wastewater and to develop and optimise rapid molecular methods to infer SARS-CoV-2 infectivity. The results obtained have demonstrated that the application of wastewater-based epidemiology (WBE) is efficient for estimating the presence of COVID-19 in communities and can serve as a Public Health tool for early warning of pandemic situations. Furthermore, this thesis includes the first study published in Spain that performed a metagenomic analysis of the SARS-CoV-2 diversity present in wastewater in the first three epidemiological waves, the results of which confirmed the potential of mass sequencing of wastewater to detect new SARS-CoV-2 mutations and lineages. In addition, protocols for the concentration, extraction and detection of coronavirus nucleic acids from sewage, surface and seawater samples have also been compared and optimised. Thus, this work expands the knowledge on analytical procedures for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater favouring the global implementation of the COVID-19 WBE. Finally, a viability RT-qPCR protocol based on platinum chloride has been implemented to avoid amplification of non-infectious SARS-CoV-2 RNA. Furthermore, the results of this thesis support the idea that SARS-CoV-2 present in wastewater is not infectious. Overall, in the framework of this PhD thesis, a rapid analytical tool based on feasibility RT-qPCR has been developed to infer the infectivity of SARS-CoV-2 with potential application in risk assessment, prevention and control in Public Health programmes. / This thesis has been funded by an "Ayudas para contratos predoctorales para la formación de doctores 2018” grant, awarded by the Ministry of Science and Innovation. / Cuevas Ferrando, E. (2022). Detection and tracking of emerging viruses of public health interest in waters through molecular and metagenomic procedures [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/190899 / Compendio

[ES] La insuficiencia cardiaca (IC) es un síndrome multifactorial resultado de una compleja red de alteraciones estructurales, funcionales y moleculares que conducen a la progresión de la disfunción ventricular. La IC es denominador común de la mayoría de cardiopatías y su complejidad da lugar a diagnósticos y tratamientos imprecisos que comportan el aumento progresivo de su prevalencia, morbimortalidad y coste sanitario. Es por ello que existe la necesidad de desarrollar nuevas estrategias, a través de la investigación básica y clínica, que permitan diagnósticos más precisos y tratamientos más eficaces que las terapias actuales. Dicha compleja red de alteraciones en la morfología, composición e interacciones entre los distintos componentes del corazón se conoce como remodelado cardiaco. Histopatológicamente, el remodelado se caracteriza por proliferación y migración celular, fibrosis cardiaca, hipertrofia de cardiomiocitos y por muerte celular necrótica y apoptótica. Subyacente a estos procesos podemos encontrar, entre otros, alteraciones del metabolismo del colágeno que pueden conducir a rigidez ventricular y/o debilitamiento de las uniones estructurales y dilatación cardiaca, cuya progresión producirá disfunción ventricular e IC. El principal objetivo de esta tesis es estudiar la fibrosis miocárdica y el remodelado cardiaco en pacientes con IC (miocardiopatía isquémica, MCI; y miocardiopatía dilatada, MCD) a través del análisis de expresión de las moléculas de colágeno, así como investigar la relevancia de las posibles alteraciones de su expresión mediante el estudio de las relaciones con distintos marcadores moleculares del proceso de remodelado y con parámetros de disfunción ventricular. Los resultados obtenidos muestran un aumento en la expresión de colágenos fibrilares y no fibrilares en ambas cardiomiopatías, destacando el porcentaje de genes codificantes de colágenos no fibrilares que se encuentran alterados y que no habían sido descritos en la IC hasta ahora. Los cambios en la expresión de algunos de estos colágenos fueron validados por PCR cuantitativa en tiempo real y, mediante western blot, se determinó que la alteración en la expresión se mantenía a nivel proteico. En cuanto al estudio de la relación entre los cambios de la expresión de estos genes con parámetros de función y remodelado ventricular, así como con marcadores de fibrosis, hipertrofia y apoptosis por ser los principales procesos que subyacen al remodelado cardiaco, observamos que, en la MCI, la sobre-expresión de COL4A5 y COL16A1 está relacionada significativamente con la fracción de acortamiento y con los diámetros tele-sistólico y tele-diastólico del ventrículo izquierdo, respectivamente; mientras que, en la MCD, la sobre-expresión de COL8A1 se relaciona con el índice de masa ventricular izquierdo. Además, encontramos relaciones significativas entre la alteración de estos colágenos y los marcadores moleculares de los principales procesos biológicos que tienen lugar durante el remodelado ventricular. En definitiva, estos resultados confirman la hipótesis de la existencia de una alteración en la expresión de los genes que codifican colágenos fibrilares y no fibrilares que podría estar participando de forma crucial en el desarrollo de remodelado cardiaco, proporcionando nuevas dianas para futuras investigaciones que permitan dilucidar el papel de estos colágenos y ofrecer nuevas opciones terapéuticas para las personas que padecen IC. / [CA] La insuficiència cardíaca (IC) és una síndrome multifactorial resultat d'una complexa xarxa d'alteracions estructurals, funcionals i moleculars que conduïxen a la progressió de la disfunció ventricular. La IC es denominador comú de la majoria de cardiopaties i la seua complexitat dóna lloc a diagnòstics i tractaments imprecisos que comporten l'augment progressiu de la seua prevalença, morbimortalitat i cost sanitari. Es per això que existix la necessitat de desenvolupar noves estratègies, a través de la investigació bàsica i clínica, que permeten diagnòstics més precisos i tractaments més eficaços que les teràpies actuals. Dita complexa xarxa d'alteracions en la morfologia, composició i interaccions entre els distints components del cor es coneix com remodelat cardíac. Histopatològicament, el remodelat es caracteritza per proliferació i migració cel·lular, fibrosi cardíaca, hipertròfia de cardiomiòcits i per mort cel·lular necròtica i apoptótica. Subjacent a estos processos podem trobar, entre altres, alteracions del metabolisme del col·lagen que poden conduir a rigidesa ventricular i/o debilitament de les unions estructurals i dilatació cardíaca, la progressió dels quals produirà disfunció ventricular i IC. El principal objectiu d'esta tesi és estudiar la fibrosi miocardíaca i el remodelat cardíac en pacients amb IC (miocardiopatia isquèmica, MCI; i miocardiopatia dilatada, MCD) a través de l'anàlisi d'expressió de les molècules de col·lagen, així com investigar la rellevància de les possibles alteracions de la seua expressió mitjançant l'estudi de les relacions amb distints marcadors moleculars del procés de remodelat i amb paràmetres de disfunció ventricular. Els resultats obtinguts mostren un augment en la expressió de col·làgens fibril·lars i no fibril·lars en ambdues cardiomiopaties, destacant el percentatge de gens que codifiquen col·làgens no fibril·lars que es troben alterats i que no han sigut descrits en la IC fins ara. Els canvis en la expressió d'alguns d'estos col·làgens, van ser validats per PCR quantitativa en temps real i, mitjançant western blot, es determinà que l'alteració en l'expressió es mantenia a nivell proteic. En quant al estudi de la relació entre els canvis de l'expressió d'aquestos gens amb paràmetres de funció i remodelat ventricular, així com amb marcadors de fibrosi, hipertrofia i apoptosis per ser els principals processos subjacents al remodelat cardíac, vam observar que, en la MCI, la sobre-expressió de COL4A5 i COL16A1 està relacionada significativament amb la fracció d'acurtament i amb els diàmetres tele-sistòlic i tele-diastòlic del ventricle esquerre, respectivament; mentre que, en la MCD, la sobre-expressió de COL8A1 es relaciona amb l'índex de massa ventricular esquerre. A més, trobarem relacions significatives entre l'alteració d'aquestos col·làgens i els marcadors moleculars dels principals processos biològics que es produeixen durant el remodelat ventricular. En definitiva, estos resultats confirmen la hipòtesi de l'existència d'una alteració en la expressió dels gens que codifiquen col·làgens fibril·lars i no fibril·lars que podrien estar participant de forma crucial en el desenvolupament de remodelat cardíac, proporcionant noves dianes per a futures investigacions que permeten dilucidar el paper d'estos col·làgens i oferir noves opcions terapèutiques per a les persones que pateixen IC. / [EN] Heart failure (HF) is a multifactorial syndrome resulting from a complex network of structural, functional and molecular alterations that ultimately lead to ventricular dysfunction. HF is the common denominator in most heart diseases, and its complexity originates imprecise diagnoses and treatments, so that its prevalence, morbidity and mortality increase progressively. For this reason, there is a significant requirement to develop new strategies through basic scientific and clinical research that will enable more accurate diagnoses and more effective treatments than are currently available. The complex network of alterations in the morphology, composition, and interactions between different components of the heart is known as cardiac remodelling. Histopathologically, remodelling is characterised by cell proliferation and migration, fibrosis, cardiomyocyte hypertrophy, and apoptotic and necrotic cell death. Underlying these processes, we have found, among others, alterations in collagen turnover within the myocardium that may lead to ventricular stiffness and/or weakening of structural linkages and cardiac dilation. Progression of these states is accompanied by ventricular dysfunction and HF. The main objective of this thesis is to study myocardial fibrosis and cardiac remodelling in patients with HF (ischaemic cardiomyopathy, ICM, and dilated cardiomyopathy, DCM) through analysis of the expression of collagen molecules, as well as to investigate the relevance of possible alterations in their expression by studying relationships with molecular markers of the remodelling process and with parameters of ventricular dysfunction. Our results show an increase in the expression of both fibrillar and non-fibrillar collagens in both cardiomyopathies, highlighting changes in the number of non-fibrillar collagen genes that have not previously been described in HF. Changes in the expression of some of these collagens were validated by quantitative real-time PCR. Alterations in expression at protein level were shown by western blot. Regarding the relationship between changes in collagen gene expression and parameters of ventricular remodelling and function, as well as with markers of fibrosis, hypertrophy, and apoptosis, the main processes underlying cardiac remodelling, we observed that in patients with ICM, COL4A5 and COL16A1 overexpression is significantly related to the shortening fraction and left ventricular end-systolic and end-diastolic diameters, respectively; whereas in the DCM group, COL8A1 overexpression is related to left ventricular mass index. In addition, we observed significant relationships between the changes in these collagens and established molecular markers for the major biological processes that occur during ventricular remodelling. In conclusion, these results support the hypothesis that alterations in the expression of genes encoding fibrillar and non-fibrillar collagens might be crucially involved in the development of cardiac remodelling. This in turn will identify new targets for future work aimed at elucidating the role of these collagens, and offer new therapeutic options for patients with HF. / “Cinética del transporte núcleo-citoplasmático de los cardiomiocitos humanos en la insuficiencia cardiaca. Análisis celular y de expresión génica”. PI-10/00275, Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS). IP: Dr. J. Miguel Rivera Otero. “Alteraciones moleculares y estructurales en la insuficiencia cardiaca”. RD12/0042/0003, Red de Investigación Cardiovasular (RIC), Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS). IP: Dr. J. Miguel Rivera Otero. “Transporte núcleo-citoplasma y cambios de expresión génica en la insuficiencia cardiaca. Puesta en marcha de una nueva estrategia terapéutica”. PI-13/00100, Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS). IP: Dr. J. Miguel Rivera Otero. “Seguimiento de pacientes sometidos a trasplante cardiaco. Estudio de marcadores de rechazo implicados en el transporte núcleo-citoplasma”. PI-14/01506, Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS). IP: Dra. Esther Roselló Lletí. “Daño miocárdico y sus consecuencias. Identificación de nuevos biomarcadores en insuficiencia cardiaca”. CB16/11/00261, Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Cardiovasculares (CIBERCV), Instituto de Salud Carlos III. IP: Dr. J. Miguel Rivera Otero. Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). / Gil Cayuela, C. (2019). Estudio del papel físiopatológico del colágeno en la insufíciencia cardiaca. Implicaciones en el remodelado ventricular [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/118657

INTRODUCCIÓN. Las enfermedades cardiovasculares constituyen la principal causa de muerte en el mundo. La mayoría de las miocardiopatías y canalopatías son de origen genético y se caracterizan por el riesgo de muerte súbita y morbilidad crónica. La detección de mutaciones en los pacientes, permite establecer el diagnóstico molecular y en algunos casos definir su pronóstico o medidas terapéuticas o preventivas, así como asesorar a las familias del afecto. Sin embargo, el gran número de genes implicados, hace que sea difícil su análisis utilizando técnicas convencionales de secuenciación. OBJETIVOS. Con este trabajo se pretende caracterizar, desde el punto de vista molecular, a un grupo de pacientes afectos de patología cardiovascular de origen heterogéneo, mediante la utilización de paneles de resecuenciación dirigida de 72 genes. Los objetivos propuestos fueron: 1. Diseñar y validar un panel de resecuenciación dirigida a enfermedades cardiovasculares genéticas heterogéneas con riesgo de muerte súbita. 2. Desarrollar una estrategia de estudio de alta sensibilidad y especificidad para aplicar al diagnóstico de enfermedades cardiogenéticas con riesgo de muerte súbita mediante secuenciación masiva. 3. Trasladar a la práctica clínica las nuevas técnicas de secuenciación masiva. Para ello se va a utilizar un modelo de enfermedades con gran heterogeneidad genética y un panel de genes asociado al desarrollo de diferentes patologías cardiovasculares para confirmar su diagnóstico. PACIENTES Y MÉTODOS. El diseño del panel para enfermedades cardiovasculares con riesgo de muerte súbita fue de 72 genes y se realizó mediante la búsqueda de información clínica y genética en las diferentes fuentes de información biomédica. Este diseño incluyó genes asociados a miocardiopatías, trastornos del ritmo cardíaco y aneurismas de aorta de tipo genético, monogénico y heterogéneo. El diseño bioinformático se realizó en la Unidad de Bioinformática de Sistemas Genómicos e incluyó 1.4 Mb de exones de los que 100 nucleótidos/gen correspondían a las zonas de splicing. Las regiones no traducidas 5’ y 3’ de los 72 genes se diseñaron con 1000 y 200 nucleótidos, respectivamente, mediante la herramienta eArray, proporcionado por Agilent. La validación bioinformática se llevó a cabo con la línea celular HapMap12144 y la validación clínica se realizó con 10 muestras de pacientes previamente diagnosticados de enfermedades cardiovasculares con riesgo de muerte súbita. El desarrollo de un pipeline de diagnóstico incluyó la aplicación de un sistema de filtrados para categorizar a las diferentes variantes encontradas, consulta de bases de datos, estudios de predicción in silico, clasificación de las variantes, validación por secuenciación Sanger de todas las variantes potencialmente patogénicas y de las variantes de significado desconocido y elaboración del informe clínico biológico. Este modelo de trabajo se aplicó sobre un grupo de 163 pacientes afectados de diferentes patologías cardiovasculares de tipo monogénico, analizados durante dos años en la Unidad de Genética Médica de Sistemas Genómicos. RESULTADOS. Los resultados obtenidos en 163 pacientes con diferentes enfermedades cardiovasculares y riesgo de muerte súbita, mediante el análisis de 4795 genes, fueron: detección de 45 mutaciones, 26 de ellas previamente descritas, 14 nuevas mutaciones y 178 variantes de significado desconocido que fueron evaluadas a través de predicciones in silico y validadas por secuenciación Sanger. En resumen, un 27.6% de los pacientes afectados de diferentes patologías susceptibles de producir muerte súbita, pudieron ser genéticamente diagnosticados y establecer el diagnóstico precoz y medidas preventivas en los familiares en riesgo. La sensibilidad bioinformática del panel de 72 genes fue de 96.68% para SNPs y 70.85% para Indels en la plataforma SOLID v.4, mientras que la validación diagnóstica fue del 100% para SNPs y del 90% para Indels. CONCLUSIÓN. La resecuenciación dirigida del panel de 72 genes asociado a patología cardiovascular de origen genético heterogéneo permite un análisis rápido, eficiente, de alto rendimiento y coste efectivo para la detección de mutaciones en todos los genes descritos, implicados en una patología, mejorando los registros de mutaciones. Estos resultados son importantes para establecer el diagnóstico molecular del paciente, explicar la variabilidad fenotípica de la enfermedad cardíaca y asesorar a la familia del afecto sobre la necesidad de políticas preventivas si son portadores de mutaciones.

La presente tesis doctoral aborda el análisis y modelización de los problemas de programación en el corte de perfiles estructurales de acero, así como la propuesta de diferentes metodologías y algoritmos basados en técnicas heurísticas que permiten resolverlos de manera óptima. En concreto se profundiza en los siguientes temas: - Se estudia la problemática concreta en el corte de vigas estructurales en una empresa de transformados metalúrgicos. Dicho estudio motiva y justifica todo el trabajo posterior, a la vez que proporciona un contexto concreto en el que aplicar de forma práctica los resultados obtenidos con los algoritmos desarrollados. - Se modeliza matemáticamente el Problema del Corte de vigas a partir de perfiles estructurales. - Se presenta una metodología que resuelve de manera eficiente, mediante el uso de patrones, el Problema del Corte para satisfacer la demanda de vigas en un periodo concreto. A tal efecto se desarrolla: un primer algoritmo genético que genera patrones de corte idóneos (fase 1); un segundo algoritmo genético que determina las frecuencias de uso de cada patrón para minimizar tanto el desperdicio como la sobreproducción (fase 2); y cuatro algoritmos adicionales que mejoran la solución obtenida en la fase anterior (fase 3). - A fin de evaluar la metodología propuesta, se desarrolla un generador de problemas que a partir de unos parámetros de instancia obtiene distintos problemas de test. - Se propone otro algoritmo genético para resolver el Problema multiobjetivo de Secuenciación de Patrones optimizando dos objetivos: minimizar las necesidades de espacio para el apilamiento de pedidos en curso y minimizar la extensión temporal requerida para procesar los pedidos. - Finalmente se propone una metodología para la resolución del Problema Global de Corte y Secuenciación. / Gracia Calandin, CP. (2010). Métodos y Algoritmos para resolver problemas de Corte unidimensional en entronos realistas. Aplicación a una empresa del sector Siderúrgico [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/7530

[ES] La leucemia mieloide aguda (LMA) se trata de un grupo heterogéneo de desórdenes hematológicos producidos por alteraciones genéticas en las células precursoras mieloides. Las mutaciones en la enzima Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son unas de estas alteraciones. Las mutaciones más frecuentes en esta proteína afectan a las posiciones R140 y R172, provocando una ganancia de función con la producción del oncometabolito D-2-hidroxiglutarato (2-HG). A pesar de que ambas inducen la producción de 2-HG, la mutación R172 produce mayor cantidad de oncometabolito, presenta menos concurrencias con otras alteraciones genéticas y se asocia a una peor respuesta a la quimioterapia y un mayor riesgo de recaída. Los modelos de investigación han permitido conocer el papel de las mutaciones genéticas en el desarrollo de la enfermedad. A pesar de ello, es necesario desarrollar nuevos modelos que expresen de forma endógena estas mutaciones para estudiar en profundidad las vías moleculares afectadas. Por todo ello, en esta Tesis se han desarrollado nuevas estrategias de edición génica mediante el sistema CRISPR/Cas9 con el objetivo de desarrollar nuevos modelos in vitro e in vivo de mutaciones implicadas en LMA. Debido a la baja eficiencia de transfección de los plásmidos CRISPR en las líneas celulares leucémicas, el método más empleado para introducir los elementos CRISPR han sido principalmente vectores lentivirales. Para evitar los inconvenientes de este tipo de vectores, en esta Tesis se ha desarrollado una estrategia alternativa para la introducción de la nucleasa Cas9 y los guías CRISPR. El gen codificante de la Cas9 se introdujo en el genoma de células NB4 mediante transducción con lentivirus, generando una línea celular con expresión constitutiva de la nucleasa. Por otro lado, se desarrolló un sistema sencillo de producción de los guías CRISPR mediante PCR con los elementos esenciales para su expresión y la expresión del reportero GFP de forma opcional. Con el objetivo de optimizar la técnica y probar su eficiencia en distintas dianas se modificaron dos genes implicados en LMA. Estos fueron el gen IDH2, en el cuál se buscó introducir la mutación R172, y el gen MYBL2. Finalmente, las eficiencias de edición obtenidas se compararon con el uso de complejos de ribonucleoproteínas CRISPR, muy utilizados por su alta eficiencia. Mientras que los complejos de ribonucleoproteínas presentaron una mayor eficiencia de corte, la eficiencia de edición de la mutación R172 fue similar en ambas estrategias. Mediante secuenciación masiva se confirmó y caracterizó esta edición y se comprobó que la maquinaria de edición no había producido cortes inespecíficos en regiones similares del genoma. Por tanto, la nueva metodología desarrollada permitió editar de forma precisa líneas celulares leucémicas con eficiencias similares a otras técnicas CRISPR más extendidas y sin producir efectos inespecíficos no deseados. Por otro lado, gracias a la gran conservación evolutiva del gen IDH2, los residuos R140 y R172 se encuentran conservados en la proteína idh-2 de Caenorhabditis elegans. Se empleó la estrategia co-CRISPR para desarrollar y seleccionar cepas mutantes con las mutaciones ortólogas a R140 y R172, y una cepa con ambas mutaciones. A pesar de la conservación, no se observó el aumento del oncometabolito 2-HG esperado en las cepas mutantes en comparación con la cepa salvaje control N2. Un estudio exhaustivo de las vías implicadas nos serviría para desarrollar modelos de investigación con las alteraciones moleculares observadas en los pacientes. Para concluir, la estrategia desarrollada de introducción de elementos CRISPR en líneas celulares, junto a los modelos producidos en C. elegans, permitirán en futuros estudios investigar en detalle los efectos moleculares de mutaciones detectadas en pacientes de LMA, su implicación en el desarrollo y pronóstico de la LMA y comprender su papel en la estratificación de los pacientes. / [CA] La leucèmia mieloide aguda (LMA) es tracta d'un grup heterogeni de desordres hematològics produïts per alteracions genètiques en les cèl·lules precursores mieloides. Les mutacions en l'enzim Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son d'aquestes alteracions. Les mutacions més freqüents en aquesta proteïna afecten a les posicions R1240 i R172, produint un guany de funció amb la producció de l'oncometabolit D-2-hidroxiglutarat (2-HG). A pesar que ambdues indueixen la producció de 2-HG, la mutació R172 produeix mes quantitat de oncometabolit, presenta menys co ocurrències con altres alteracions genètiques i s'associa a una pitjor resposta a la quimioteràpia i un major risc de recaiguda. Els models d'investigació han permés conéixer el paper de les mutacions genètiques en el desenvolupament de la malaltia. Malgrat això, és necessari desenvolupar nous models que expressen de manera endògena aquestes mutacions per a estudiar en profunditat les vies moleculars afectades. Per tot això, en aquesta Tesis s'han desenvolupat noves estratègies d'edició gènica mitjançant el sistema CRISPR/Cas9 amb l'objectiu de desenvolupar nous models in vitro i in vivo de les mutacions implicades en la LMA. Degut a la baixa eficiència de transfecció dels plasmids CRISPR en les línies cel·lulars leucèmiques, el mètode més emprat per a introduir els elements CRISPR han sigut principalment vectors lentivirals. Per a evitar els inconvenients d'aquesta mena de vectors, en aquesta Tesis s'ha desenvolupat una estratègia alternativa per a la introducció de la nucleasa Cas9 i els guies CRISPR. El gen codificant de la Cas9 es va introduir al genoma de cèl·lules NB4 mitjançant transducció amb lentivirus, generant una línia cel·lular amb expressió constitutiva de la nucleasa. D'altra banda, es va desenvolupar un sistema fàcil de producció dels guies CRISPR mitjançant PCR amb els elements essencials d'expressió i amb l'expressió del reporter GFP de manera opcional. Amb l'objectiu d'optimitzar la tècnica i provar la seua eficiència en diferents dianes es van modificar dos gens implicats en LMA. Aquests van ser el gen IDH2, en el qual es va buscar introduir la mutació R172, i el gen MYBL2. Finalment, les eficiències d'edició obtingudes amb la nova estratègia es van comparar amb l'ús de complexos ribonucleotproteïnes CRISPR, molt utilitzats per la seua alta eficiència. Mentre que els complexos de ribonucleoproteïnes van presentar una major eficiència de tall, l'eficiència d'edició de la mutació R172 va ser similar en les dues estratègies. Mitjançant seqüenciació massiva es va confirmar i caracteritzar aquesta edició i es va comprovar que la maquinària d'edició no havia produït talls inespecífics en regions similars del genoma. D'aquesta manera, la nova metodologia desenvolupada permet editar de manera precisa línies cel·lulars leucèmiques amb eficiències similars a altres tècniques CRISPR més esteses i sense produir efectes inespecífics no desitjats. D'altra banda, gràcies a la gran conservació evolutiva del gen IDH2, els residus R140 i R172 es troben conservats en la proteïna idh-2 de Caenorhabditis elegans. Es va utilitzar l'estratègia co-CRISPR per a desenvolupar i seleccionar ceps mutants amb les mutacions ortòlogues a R140 i R172, i un cep amb dues mutacions. Malgrat l'alta conservació, no es va observar l'augment del oncometabolit 2-HG esperat en els ceps mutants en comparació amb el cep salvatge control N2. Un estudi exhaustiu de les vies implicades ens serviria per a desenvolupar models d'investigació amb les alteracions moleculars observades en els pacients. Per a concloure, l'estratègia desenvolupada d'introducció d'elements CRISPR en línies cel·lulars, al costat dels models produïts en C. elegans permetran en estudis futurs investigar detalladament els efectes moleculars de mutacions detectades en pacients, la seua implicació en el desenvolupament i prognosi de la LMA i comprendre el seu paper en l'estratificació dels pacients. / [EN] Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a heterogeneous group of haematological disorders caused by genetic alterations in myeloid precursors. Mutations in the Isocitrate dehydrogenase enzyme are among these alterations. The most frequent mutations in this protein affect R140 and R172 positions, leading to a gain of function with the production of the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (2-HG). Although both induce the 2-HG production, the R172 mutation generates greater amount of oncometabolite, has fewer co-occurrences with other genetic alterations and is associated with worse chemotherapy response and higher relapse risk. Research models have made possible to study the role of genetic mutations in disease development. Despite this progress, new models with endogenous expression of these mutations are needed to study in depth the molecular pathways involved. Therefore, in this Thesis we have developed new gene editing strategies using the CRISPR/Cas9 system with the aim of developing new in vitro and in vivo models of mutations involved in AML. Regarding in vitro model, due to the low transfection efficiency of CRISPR plasmids in leukemic cell lines, the most commonly method used for introducing CRISPR elements have been mainly lentiviral vectors. To avoid the disadvantages of this type of vectors, in this Thesis we have developed an alternative strategy for introducing Cas9 nuclease and CRISPR guides. The gene encoding the Cas9 was introduced into NB4 genome by lentiviral transduction producing a stable cell line that constitutively express the nuclease. On the other hand, a simple system for the production of CRISPR guides by PCR with essential elements of expression was developed and with GFP reporter expression optionally. In order to optimise the technique and test its efficiency in different targets, two genes involved in AML were modified. These were IDH2 gene, in which R172 mutation was introduced, and MYBL2 gene. Finally, editing efficiencies obtained with the new strategy were compared with CRISPR ribonucleoproteins methodology, widely used for its high efficiency. Whereas ribonucleoprotein complexes showed higher cut efficiencies, the efficiency of edition of R172 mutation efficiency was similar in both strategies. These results were validated and characterized by means of next generation sequencing, and no off-target effects were found. Therefore, the new developed methodology allows precise gene editing in leukemic cell lines with similar efficiencies with other popular CRISPR techniques and without off-target effects. On the other hand, thanks to the high evolutive conservation of IDH2 gene R140 and R172 residues are conserved in Caenorhabditis elegans idh-2 protein. The co-CRISPR strategy was used to produce and select mutant strains with ortholog mutations to R140, R172 and one strain with both mutations. Despite the high conservation, the expected increase in oncometabolite 2-HG concentration was not detected in mutant strains compared to the N2 wild type strain. A comprehensive study of the pathways involved would help us to develop a research model with molecular alterations noticed in patients. In conclusion, the new developed strategy for CRISPR elements introduction in cell lines, together with C. elegans models, will allow an in-depth research of molecular effect of mutations detected in patients, its implication in AML progression and prognosis and understand their role in patient stratification. / González Romero, E. (2022). Investigación de la Leucemia Mieloide Aguda mediante el desarrollo de modelos in vitro e in vivo [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181891

[ES] La biotecnología moderna se basa en la aplicación de una mezcla de herramientas experimentales y computacionales para llevar a cabo de forma dirigida la ingeniería genética. El objetivo es obtener células (re)programadas que implementen nuevas funciones o que sirvan como herramientas para el estudio de sistemas biológicos. En este contexto, el uso de bacterias en biotecnología está muy extendido. Sin embargo, la implementación de circuitos genéticos para el aprovechamiento de estos seres vivos puede verse limitada por procesos biológicos naturales; es decir, los circuitos diseñados (o naturales) pueden verse afectados por el transcurso del tiempo o por cambios en el entorno en el que crecen las bacterias. En esta tesis, nos propusimos seguir un enfoque integrador para estudiar cómo las bacterias responden en el tiempo y el espacio a los cambios genéticos y ambientales, que pueden afectar la funcionalidad de los circuitos de interés biotecnológico. Usamos Escherichia coli como organismo modelo, explotando una variedad de herramientas experimentales para trabajar con él. En primer lugar, estudiamos cómo los cambios ambientales y genéticos afectan la funcionalidad de un circuito genético sintético que implementa un comportamiento lógico sofisticado. Descubrimos que hay amplios rangos de concentración de entrada que el sistema puede procesar correctamente, que el circuito diseñado es bastante sensible a los efectos de la temperatura, que la expresión de pequeños ARN heterólogos es costosa para la célula y que una reorganización genética adecuada del sistema para reducir la cantidad de ADN heterólogo en la célula puede mejorar su estabilidad evolutiva. En segundo lugar, estudiamos el crecimiento bacteriano en entornos en los que existen materiales nanoestructurados. Descubrimos que las poblaciones bacterianas se pueden controlar en gran medida mediante el uso de marcos organometálicos, ya que estos materiales nanoestructurados pueden descomponerse lentamente en medios biológicos liberando agentes antimicrobianos (metales y compuestos orgánicos, incluidos los antibióticos). Analizamos la respuesta bacteriana espaciotemporal siguiendo un enfoque experimental y teórico combinado en un entorno tan complejo y desafiante en medios líquidos y sólidos. Además de las variaciones en el rendimiento debido a cambios ambientales, también se debe considerar que esos circuitos genéticos evolucionarán con el tiempo debido a la acumulación estocástica de mutaciones. Estas mutaciones pueden dar lugar a cambios en la funcionalidad de los circuitos reguladores. Por tanto, en tercer lugar, realizamos un experimento de evolución a largo plazo para estudiar la contribución de un sistema de chaperonas de proteínas en la modulación de la estabilidad evolutiva. En los últimos años, se ha demostrado que los sistemas de chaperonas, como GroES/EL, pueden amortiguar o purgar mutaciones. Realizamos la secuenciación del genoma completo en diferentes líneas con diferentes niveles de expresión de GroEL y también medimos la tasa de crecimiento de las células al principio y al final del experimento evolutivo. Sin embargo, nuestros resultados no fueron concluyentes, por lo que se necesita más investigación para comprender completamente el papel de GroES/EL en la evolución y evaluar su utilidad potencial en biotecnología. En conjunto, esta tesis intenta avanzar en nuestro conocimiento sobre cómo las bacterias, y E. coli en particular, se comportan como se espera cuando el entorno se altera, la fisiología cambia y pasa mucho tiempo, para posibles aplicaciones industriales o (pre)clínicas. / [CA] La biotecnologia moderna es basa en l'aplicació d'una mescla d'eines experimentals i computacionals per a realitzar de forma dirigida l'enginyeria genètica. L'objectiu és obtindre cèl·lules (re)programades que implementen noves funcions o que servisquen com a eines per a l'estudi de sistemes biològics. En aquest context, l'ús de bacteris en biotecnologia està molt estés. No obstant això, la implementació de circuits genètics per a l'aprofitament d'aquests éssers vius pot veure's limitada per processos biològics naturals; és a dir, els circuits dissenyats (o naturals) poden veure's afectats pel transcurs del temps o per canvis en l'entorn en el qual creixen els bacteris. En aquesta tesi, ens vam proposar seguir un enfocament integrador per a estudiar com els bacteris responen en el temps i l'espai als canvis genètics i ambientals, que poden afectar la funcionalitat dels circuits d'interés biotecnològic. Usem Escherichia coli com a organisme model, explotant una varietat d'eines experimentals per a treballar amb ell. En primer lloc, estudiem com els canvis ambientals i genètics afecten la funcionalitat d'un circuit genètic sintètic que implementa un comportament lògic sofisticat. Descobrim que hi ha amplis rangs de concentració d'entrada que el sistema pot processar correctament, que el circuit dissenyat és bastant sensible a l'efecte de la temperatura, que l'expressió de xicotets ARN heteròlegs és costosa per a la cèl·lula i que una reorganització genètica adequada del sistema per a reduir la quantitat d'ADN heteròleg en la cèl·lula pot millorar la seua estabilitat evolutiva. En segon lloc, estudiem el creixement bacterià en entorns en els quals existeixen materials nanoestructurats. Descobrim que les poblacions bacterianes es poden controlar en gran manera mitjançant l'ús de marcs organometàlics, ja que aquests materials nanoestructurats poden descompondre's lentament en medis biològics alliberant agents antimicrobians (metalls i compostos orgànics, inclosos els antibiòtics). Analitzem la resposta bacteriana espai-temporal seguint un enfocament experimental i teòric integrador en un entorn tan complex i desafiador en mitjans líquids i sòlids. A més de les variacions en el rendiment degut a canvis ambientals, també s'ha de considerar que aqueixos circuits genètics evolucionaran amb el temps degut a l'acumulació estocàstica de mutacions. Aquestes mutacions poden donar lloc a canvis en la funcionalitat dels circuits reguladors. Per tant, en tercer lloc, realitzem un experiment d'evolució a llarg termini per a estudiar la contribució d'un sistema de chaperones de proteïnes en la modulació de l'estabilitat evolutiva. En els últims anys, s'ha demostrat que els sistemes de chaperones, com GroES/EL, poden esmorteir o purgar mutacions. Realitzem la seqüenciació del genoma complet en diferents línies amb diferents nivells d'expressió de GroEL i també mesurem la taxa de creixement de les cèl·lules al principi i al final de l'experiment evolutiu. No obstant això, els nostres resultats no van ser concloents, per la qual cosa es necessita més investigació per a comprendre completament el paper de GroES/L en l'evolució i avaluar la seua utilitat potencial en biotecnologia. En conjunt, aquesta tesi intenta avançar en el nostre coneixement sobre com els bacteris, i E. coli en particular, es comporten com s'espera quan l'entorn s'altera, la fisiologia canvia i passa molt temps, per a possibles aplicacions industrials o (pre)clíniques. / [EN] Modern biotechnology is based on applying a mix of experimental and computational tools to perform in a directed way genetic engineering. The aim is to obtain (re)programmed cells that implement new functions or that serve as tools for the study of biological systems. In this context, the use of bacteria in biotechnology is widespread. However, the implementation of genetic circuits for the use of these living beings may be limited due to natural biological processes; that is, the engineered (or natural) circuits may be affected by the course of time or by changes in the environment in which bacteria grow. In this thesis, we proposed to follow an integrative approach to study how bacteria respond in time and space to genetic and environmental changes, which may affect the functionality of the circuits of biotechnological interest. We used Escherichia coli as a model organism, exploiting a variety of experimental tools to work with it. Firstly, we studied how environmental and genetic changes affect the functionality of a synthetic genetic circuit that implements a sophisticated logic behavior. We found that there are wide input concentration ranges that the system can correctly process, that the engineered circuitry is quite sensitive to temperature effects, that the expression of heterologous small RNAs is costly for the cell, and that a proper genetic reorganization of the system to reduce the amount of heterologous DNA in the cell can improve its evolutionary stability. Secondly, we studied of bacterial growth in environments in which there are nanostructured materials. We found that bacterial populations can be greatly controlled through the use of metal-organic frameworks, as these nanostructured materials can slowly decompose in biological media releasing antimicrobials (metals and organic compounds, including antibiotics). We analyzed the spatiotemporal bacterial response following a combined experimental and theoretical approach in a such a complex and challenging environment in both liquid and solid media. In addition to variations in performance due to environmental changes, it must also be considered that those gene circuits will evolve over time due to the stochastic accumulation of mutations. These mutations can lead to changes in the functionality of the regulatory circuits. Then thirdly, we performed an experiment of long-term evolution to study the contribution of a protein chaperone system in modulating evolutionary stability. In recent years, it has been shown that chaperone systems, such as GroES/EL, can buffer or purge mutations. We performed whole-genome sequencing over different lines with varying expression levels of GroEL, and also measured the growth rate of the cells at the beginning and the end of the evolutionary experiment. However, our results were not conclusive, so further research is needed to fully understand the role of GroES/EL in evolution and to assess its potential utility in biotechnology. Taken together, this thesis tries to advance our knowledge on how bacteria, and E. coli in particular, behave as expected when the environment is perturbed, the physiology changes, and long time passes, for potential industrial or (pre)clinical applications. / Montagud Martínez, R. (2023). Study of Spatiotemporal Responses of Bacterial Cells [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193030

Tesis por compendio / [ES] La optimización en las empresas manufactureras es especialmente importante, debido a las grandes inversiones que realizan, ya que a veces estas inversiones no obtienen el rendimiento esperado porque los márgenes de beneficio de los productos son muy ajustados. Por ello, las empresas tratan de maximizar el uso de los recursos productivos y financieros minimizando el tiempo perdido y, al mismo tiempo, mejorando los flujos de los procesos y satisfaciendo las necesidades del mercado. El proceso de planificación es una actividad crítica para las empresas. Esta tarea implica grandes retos debido a los cambios del mercado, las alteraciones en los procesos de producción dentro de la empresa y en la cadena de suministro, y los cambios en la legislación, entre otros. La planificación del aprovisionamiento, la producción y la distribución desempeña un papel fundamental en el rendimiento de las empresas manufactureras, ya que una planificación ineficaz de los proveedores, los procesos de producción y los sistemas de distribución contribuye a aumentar los costes de los productos, a alargar los plazos de entrega y a reducir los beneficios. La planificación eficaz es un proceso complejo que abarca una amplia gama de actividades para garantizar que los equipos, los materiales y los recursos humanos estén disponibles en el momento y el lugar adecuados. Motivados por la complejidad de la planificación en las empresas manufactureras, esta tesis estudia y desarrolla herramientas cuantitativas para ayudar a los planificadores en los procesos de la planificación del aprovisionamiento, producción y distribución. Desde esta perspectiva, se proponen modelos realistas y métodos eficientes para apoyar la toma de decisiones en las empresas industriales, principalmente en las pequeñas y medianas empresas (PYMES). Las aportaciones de esta tesis suponen un avance científico basado en una exhaustiva revisión bibliográfica sobre la planificación del aprovisionamiento, la producción y la distribución que ayuda a comprender los principales modelos y algoritmos utilizados para resolver estos planes, y pone en relieve las tendencias y las futuras direcciones de investigación. También proporciona un marco holístico para caracterizar los modelos y algoritmos centrándose en la planificación de la producción, la programación y la secuenciación. Esta tesis también propone una herramienta de apoyo a la decisión para seleccionar un algoritmo o método de solución para resolver problemas concretos de la planificación del aprovisionamiento, producción y distribución en función de su complejidad, lo que permite a los planificadores no duplicar esfuerzos de modelización o programación de técnicas de solución. Por último, se desarrollan nuevos modelos matemáticos y enfoques de solución de última generación, como los algoritmos matheurísticos, que combinan la programación matemática y las técnicas metaheurísticas. Los nuevos modelos y algoritmos comprenden mejoras en términos de rendimiento computacional, e incluyen características realistas de los problemas del mundo real a los que se enfrentan las empresas de fabricación. Los modelos matemáticos han sido validados con un caso de una importante empresa del sector de la automoción en España, lo que ha permitido evaluar la relevancia práctica de estos novedosos modelos utilizando instancias de gran tamaño, similares a las existentes en la empresa objeto de estudio. Además, los algoritmos matheurísticos han sido probados utilizando herramientas libres y de código abierto. Esto también contribuye a la práctica de la investigación operativa, y proporciona una visión de cómo desplegar estos métodos de solución y el tiempo de cálculo y rendimiento de la brecha que se puede obtener mediante el uso de software libre o de código abierto. / [CA] L'optimització a les empreses manufactureres és especialment important, a causa de les grans inversions que realitzen, ja que de vegades aquestes inversions no obtenen el rendiment esperat perquè els marges de benefici dels productes són molt ajustats. Per això, les empreses intenten maximitzar l'ús dels recursos productius i financers minimitzant el temps perdut i, alhora, millorant els fluxos dels processos i satisfent les necessitats del mercat. El procés de planificació és una activitat crítica per a les empreses. Aquesta tasca implica grans reptes a causa dels canvis del mercat, les alteracions en els processos de producció dins de l'empresa i la cadena de subministrament, i els canvis en la legislació, entre altres. La planificació de l'aprovisionament, la producció i la distribució té un paper fonamental en el rendiment de les empreses manufactureres, ja que una planificació ineficaç dels proveïdors, els processos de producció i els sistemes de distribució contribueix a augmentar els costos dels productes, allargar els terminis de lliurament i reduir els beneficis. La planificació eficaç és un procés complex que abasta una àmplia gamma d'activitats per garantir que els equips, els materials i els recursos humans estiguen disponibles al moment i al lloc adequats. Motivats per la complexitat de la planificació a les empreses manufactureres, aquesta tesi estudia i desenvolupa eines quantitatives per ajudar als planificadors en els processos de la planificació de l'aprovisionament, producció i distribució. Des d'aquesta perspectiva, es proposen models realistes i mètodes eficients per donar suport a la presa de decisions a les empreses industrials, principalment a les petites i mitjanes empreses (PIMES). Les aportacions d'aquesta tesi suposen un avenç científic basat en una exhaustiva revisió bibliogràfica sobre la planificació de l'aprovisionament, la producció i la distribució que ajuda a comprendre els principals models i algorismes utilitzats per resoldre aquests plans, i posa de relleu les tendències i les futures direccions de recerca. També proporciona un marc holístic per caracteritzar els models i algorismes centrant-se en la planificació de la producció, la programació i la seqüenciació. Aquesta tesi també proposa una eina de suport a la decisió per seleccionar un algorisme o mètode de solució per resoldre problemes concrets de la planificació de l'aprovisionament, producció i distribució en funció de la seua complexitat, cosa que permet als planificadors no duplicar esforços de modelització o programació de tècniques de solució. Finalment, es desenvolupen nous models matemàtics i enfocaments de solució d'última generació, com ara els algoritmes matheurístics, que combinen la programació matemàtica i les tècniques metaheurístiques. Els nous models i algoritmes comprenen millores en termes de rendiment computacional, i inclouen característiques realistes dels problemes del món real a què s'enfronten les empreses de fabricació. Els models matemàtics han estat validats amb un cas d'una important empresa del sector de l'automoció a Espanya, cosa que ha permés avaluar la rellevància pràctica d'aquests nous models utilitzant instàncies grans, similars a les existents a l'empresa objecte d'estudi. A més, els algorismes matheurístics han estat provats utilitzant eines lliures i de codi obert. Això també contribueix a la pràctica de la investigació operativa, i proporciona una visió de com desplegar aquests mètodes de solució i el temps de càlcul i rendiment de la bretxa que es pot obtindre mitjançant l'ús de programari lliure o de codi obert. / [EN] Optimisation in manufacturing companies is especially important, due to the large investments they make, as sometimes these investments do not obtain the expected return because the profit margins of products are very tight. Therefore, companies seek to maximise the use of productive and financial resources by minimising lost time and, at the same time, improving process flows while meeting market needs. The planning process is a critical activity for companies. This task involves great challenges due to market changes, alterations in production processes within the company and in the supply chain, and changes in legislation, among others. Planning of replenishment, production and distribution plays a critical role in the performance of manufacturing companies because ineffective planning of suppliers, production processes and distribution systems contributes to higher product costs, longer lead times and less profits. Effective planning is a complex process that encompasses a wide range of activities to ensure that equipment, materials and human resources are available in the right time and the right place. Motivated by the complexity of planning in manufacturing companies, this thesis studies and develops quantitative tools to help planners in the replenishment, production and delivery planning processes. From this perspective, realistic models and efficient methods are proposed to support decision making in industrial companies, mainly in small- and medium-sized enterprises (SMEs). The contributions of this thesis represent a scientific breakthrough based on a comprehensive literature review about replenishment, production and distribution planning that helps to understand the main models and algorithms used to solve these plans, and highlights trends and future research directions. It also provides a holistic framework to characterise models and algorithms by focusing on production planning, scheduling and sequencing. This thesis also proposes a decision support tool for selecting an algorithm or solution method to solve concrete replenishment, production and distribution planning problems according to their complexity, which allows planners to not duplicate efforts modelling or programming solution techniques. Finally, new state-of-the-art mathematical models and solution approaches are developed, such as matheuristic algorithms, which combine mathematical programming and metaheuristic techniques. The new models and algorithms comprise improvements in computational performance terms, and include realistic features of real-world problems faced by manufacturing companies. The mathematical models have been validated with a case of an important company in the automotive sector in Spain, which allowed to evaluate the practical relevance of these novel models using large instances, similarly to those existing in the company under study. In addition, the matheuristic algorithms have been tested using free and open-source tools. This also helps to contribute to the practice of operations research, and provides insight into how to deploy these solution methods and the computational time and gap performance that can be obtained by using free or open-source software. / This work would not have been possible without the following funding sources: Conselleria de Educación, Investigación, Cultura y Deporte, Generalitat Valenciana for hiring predoctoral research staff with Grant (ACIF/2018/170) and the European Social Fund with the Grant Operational Programme of FSE 2014-2020. Conselleria de Educación, Investigación, Cultura y Deporte, Generalitat Valenciana for predoctoral contract students to stay in research centers outside the research centers outside the Valencian Community (BEFPI/2021/040) and the European Social Fund. / Guzmán Ortiz, BE. (2022). Models and Algorithms for the Optimisation of Replenishment, Production and Distribution Plans in Industrial Enterprises [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/187461 / Compendio