Eragrostis curvula es una gramínea estudiada por su tolerancia al estrés por sequía y por tener la capacidad de reproducirse por apomixis, la cual es definida como un mecanismo que permite la clonación natural por medio de semillas resultando la descendencia genéticamente idéntica a la planta madre. E. curvula tiene un número básico de cromosomas de 10 y contiene genotipos con distintos niveles de ploidias. Una de las características la especie es que los genotipos diploides son siempre sexuales mientras que los poliploides son generalmente apomícticos aunque existen tetraploides sexuales. Desde hace décadas la apomixis ha sido estudiada con el fin de identificar las bases moleculares y genéticas para ser transferidas a otros cultivos de importancia económica. Las técnicas de secuenciación de ADN son una herramienta sumamente útil para descubrir genes y regiones asociadas a distintos caracteres biológicos, así como para realizar análisis filogenéticos y de sintenia entre especies. En el trabajo de esta tesis se propuso obtener secuencias genómicas de E. curvula utilizando tecnologías de última generación con el fin de identificar los genes relacionados a la apomixis y otros genes de interés como los de la tolerancia al estrés por sequía y la calidad forrajera. El primer genoma de la especie secuenciado fue el genotipo diploide sexual Victoria que fue originado del tetraploide apomíctico Tanganyika INTA. Las plataformas utilizadas para su secuenciación fueron PacBio, Chicago y Hi-C y fue ensamblado a través del software FALCON con el que se obtuvo un N50 de ~43 mega pares de bases (Mb) y 1.143 contigs. Los genes anotados fueron 56.469 los cuales fueron utilizados para determinar la historia evolutiva de la especie. Además se caracterizaron las secuencias de los genes de las vías de la lignina relacionados con la calidad forrajera y los genes de la familia WRKY, vinculados a la tolerancia al estrés por sequía. Por otro lado se encontraron genes de E. curvula ortólogos a los expresados en etapas específicas de la vía sexual de Oryza sativa. Los genomas tetraploides apomícticos secuenciados fueron el del cultivar Tanganyika INTA obtenido mediante la plataforma Illumina y el de Don Walter combinando las tecnologías Chromium 10X y Oxford Nanopore. El ensamblado de Tanganyika INTA con el software Masurca resultó en un N50 de 4.715 pb y 293.300 contigs, mientras que en el genoma de Don Walter ensamblado con Supernova+DBG2OLC se obtuvo un N50 de 224.390 pb y 7.542 contigs. Por medio de un análisis comparativo se pudo identificar la región vinculada la apomixis en todos los genomas en la cual se encontraron genes que podrían tener un rol activo en la regulación del modo reproductivo de acuerdo con la literatura. A través de esta tesis se pudieron secuenciar, ensamblar y anotar tres genomas de E. curvula lo cual representa un avance significativo en la caracterización de la especie. La identificación de regiones asociadas a la apomixis y sus posibilidades de expresión y regulación permitirá, en una instancia futura, manipular el carácter e intentar la introgresión del mismo en especies sexuales de interés agrícola por medio de ingeniería genética. / Eragrostis curvula is forage grass studied for its tolerance to draught stress and because its characteristic reproductive pathway, the apomixis. Apomixis is an asexual way of reproduction by seeds in which the progeny result genetically identical to the mother plant. The basic number of chromosomes of E. curvula is 10 and has different ploidy levels being the diploids always sexual while the polyploids are mainly apomictic despite there are fully sexual tetraploids. Apomixis has been studied in order to identify its molecular and genetic basis to transfer this trait to economically import crops. The DNA sequencing is a powerful tool to detect genes and/or regions associated to different traits and disclose the evolutionary history of the species. In this Thesis the latest generation technologies have been used to sequencing and assembly the E. curvula genome to identify the genes related to apomixis and other interesting traits like draught tolerance and forage quality. The first sequenced genome of the species was the diploid sexual genotype Victoria originated from the apomictic tetraploid Tanganyika INTA. The technologies used for the sequencing were a combination of PacBio, Chicago and Hi-C and the assembler with best performance was FALCON. The final N50 obtained here was ~43 Mb and the number of contigs was 1,143. The 56,469 genes annotated in this genome were used to unravel the evolutionary history of E. curvula. Furthermore we identify genes in the lignin pathway associated to the forage quality and genes of the WRKY family which are related to al multiple abiotic stress like drought stress. The genes related to the sexual pathway were evaluated through a comparative analysis with specific development stages in Oryza sativa. The tetraploids genomes of E. curvula sequenced here were derived from Tanganyika INTA, sequenced with Illumina, and Don Walter using a combination of Chromium 10x and Oxford Nanopore. The Tanganyika INTA assembly was performed with Masurca software obtaining an N50 of 4,715 bp and 293,000 contigs, while Don Walter was assembled with Supernova+DBG2OLC rendering an N50 of 224,390 bp and 7,542 contigs. Interestingly a region linked to apomixis was found through a comparative analysis between the genomes of E. curvula that could have an active role in the regulation of the reproductive pathway based on the literature. In this Thesis were sequenced, assembled and annotated three genomes of E. curvula representing a significant step forward in terms of characterisation of the species. The identification of the regions linked to apomixis, its expression and regulation could allow handling the trait and, in future instances, to introduce apomixis to sexual economically important crops.

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[EN] The economic lot scheduling problem (ELSP) focuses on accommodating cyclical production patterns of several items on a single facility where only one product can be produced at a time. In this way, the ELSP is an extension to various products of the classic economic order quantity problem, whose analysis was originally addressed by Harris (1913) and his famous EOQ formula. There are multiple approaches to the resolution and modeling of the ELSP. However, most papers focus on the evaluation or optimization of a single class of policies without distinct comparison with other strategies (Winands et al. 2011). It is very unlikely that a certain policy will outperform the competing strategies in each production environment. As a result of this, the objective of this thesis is to conduct a simulation study to compare the performance of different heuristics designed for ELSP. The aim of this study is to prove that the effectiveness of a heuristic procedure, designed from a particular approach to the problem, is heavily dependent on the productive environment in which it is used. Therefore, a simulation study to analyze the performance of ten different heuristic rules under different working conditions is addressed. These different working conditions are considered from the perspective of the complexity and uncertainty of production scenario. Thus, a set of drivers of complexity (number of items and homogeneity regarding different features of the products) and drivers of uncertainty (Uncertainty in demand) that define the productive environment are considered. The results of the study confirm that the performance of the heuristics designed for ELSP is strongly dependent upon the conditions of complexity and uncertainty of the scenario in which they are used. This result is notably relevant to the applicability of the decision algorithms in industrial environments. This conclusion implies that changes on the particular characteristics of the articles, or on the product mix itself, will determine the performance of the rules used, even if the changes do not alter the overall workload of the plant. / [ES] El problema de programación del lote económico consiste en la programación de la producción de varios artículos diferentes en una única máquina en la que sólo un artículo puede ser producido en cada momento. Este problema es conocido en la literatura por el acrónimo de su descripción en inglés: ELSP (Economic Lot Scheduling Problem). Según esta definición, el ELSP supone una extensión a varios productos del clásico problema del lote económico de pedido, cuyo análisis fue originalmente abordado en el modelo de Harris (1913) y su conocida fórmula del lote económico. Existen múltiples aproximaciones al modelado y la resolución del ELSP. Sin embargo, la mayoría de los trabajos se centran en la evaluación y optimización de reglas de decisión para el resolver el problema, sin abordar una comparación entre diferentes reglas con respecto a su comportamiento (Winands et al. 2011). Es muy poco probable que existan reglas de decisión que superen a todas las demás en cualquier situación, independientemente del entorno productivo. A partir de esta observación, el objetivo de esta tesis es realizar un estudio mediante simulación para comparar el comportamiento de diferentes heurísticas diseñadas para el ELSP. Por medio de este estudio se pretende demostrar que la validez de las heurísticas, diseñadas a partir de una aproximación particular al problema, es función del entorno productivo en el que se emplean. Para ello, se aborda un análisis de simulación que permite evaluar el rendimiento de diez diferentes reglas heurísticas de decisión, bajo diferentes condiciones de trabajo. Esas diferentes condiciones de trabajo se plantean desde la perspectiva de la complejidad e incertidumbre del escenario de producción considerado. Este enfoque considera para ello un conjunto de drivers de complejidad (número de artículos y homogeneidad respecto a diferentes características de los productos) y drivers de incertidumbre (variabilidad de la demanda) que definen el entorno productivo. Los resultados del estudio confirman que el rendimiento de las heurísticas diseñadas para el ELSP es fuertemente dependiente de las condiciones de complejidad e incertidumbre del escenario en el que se aplican. Se trata de una conclusión muy relevante para la aplicabilidad de los algoritmos de decisión en entornos industriales. Esta conclusión implica que modificaciones sobre las características particulares de los artículos, o sobre el propio mix de productos, condicionan el rendimiento de las reglas empleadas, aún cuando los cambios no modifican la carga de trabajo total de la planta. / [CA] El problema de programació del lot econòmic consisteix en la programació de la producció de diversos productes diferents en una única màquina en què només un producte pot ser produït en cada moment. Aquest problema és conegut en la literatura per l'acrònim de la seva descripció en anglès: ELSP (Economic Lot Scheduling Problem). Segons aquesta definició, el ELSP suposa una extensió a diversos productes del clàssic problema del lot econòmic de comanda, l'anàlisi del qual va ser originalment abordat en el model de Harris (1913) i la seva coneguda fórmula del lot econòmic. Hi ha múltiples aproximacions al modelatge i la resolució del ELSP. No obstant això, la majoria dels treballs es centren en l'avaluació i optimització de regles de decisió per a la resolució del problema, sense abordar una comparació entre diferents regles pel que fa al seu comportament (Winands et al. 2011). És molt poc probable que hi hagi regles de decisió que superin a totes les altres en qualsevol situació, independentment de l'entorn productiu. A partir d'aquesta observació, l'objectiu d'aquesta tesi és realitzar un estudi mitjançant simulació per comparar el rendiment de diferents heurístiques dissenyades per al ELSP. Per mitjà d'aquest estudi es pretén demostrar que la validesa de les heurístiques, dissenyades a partir d'una aproximació particular al problema, és funció de l'entorn productiu en què es fan servir. Amb aquest objectiu, s'aborda una anàlisi de simulació que permet avaluar el rendiment de deu diferents regles heurístiques de decisió, sota diferents condicions de treball. Aquestes diferents condicions de treball es plantegen des de la perspectiva de la complexitat i incertesa de l'escenari de producció considerat. Aquest plantejament considera per això un conjunt de drivers de complexitat (nombre d'articles i homogeneïtat respecte a diferents característiques dels productes) i drivers d'incertesa (variabilitat de la demanda) que defineixen l'entorn productiu. Els resultats de l'estudi confirmen que el rendiment de les heurístiques dissenyades per al ELSP és fortament depenent de les condicions de complexitat i incertesa de l'escenari en el qual s'apliquen. Es tracta de una conclusió força rellevant per a l'aplicabilitat dels algoritmes de decisió en entorns industrials. Aquesta conclusió implica que modificacions sobre les característiques particulars dels articles, o sobre el propi mix de productes, condicionen el rendiment de les regles empleades, tot i que els canvis no modifiquin la càrrega de treball total de la planta. / Cortés Fibla, R. (2016). Efectos de la complejidad y la incertidumbre sobre la programación del lote económico de producción [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61300

Tesis por compendio / [ES] El síndrome de Usher (USH) es un trastorno raro autosómico recesivo definido principalmente por sordera neurosensorial (SNHL), y una distrofia retiniana conocida como retinosis pigmentaria (RP). La patología muestra heterogeneidad genética, puesto que se conocen al menos 10 genes responsables. No obstante, las mutaciones en USH2A son la causa más frecuente de la enfermedad, en gran medida por la recurrencia de la variante patogénica c.2299delG. En esta tesis se ha desarrollado un ensayo de edición génica para revertir dicha anomalía genética por medio del sistema CRISPR/Cas9. Se diseñaron y probaron varios complejos CRISPR específicos de locus, y el más eficiente fue usado para la corrección de la mutación c.2299delG en células derivadas de pacientes. La tasa de corrección de la mutación obtenida fue del 2.5%. Otro objetivo de esta tesis ha sido la caracterización genética de pacientes USH aún sin diagnóstico molecular. Una primera fase implicó la secuenciación masiva dirigida de las regiones codificantes de todos los genes asociados a la enfermedad. Este estudio, cuya cohorte incluyó 58 pacientes no escrutados previamente, permitió la identificación de 42 nuevas mutaciones presuntamente patológicas, y una tasa general de detección de alelos responsables de la enfermedad de prácticamente el 83%. Sorprendentemente, uno de los sujetos presentaba mutaciones en CEP250, uno de los últimos genes correlacionados con la enfermedad. Una exhaustiva revisión clínica reveló que la degeneración retiniana se trataba en realidad de una distrofia de conos y bastones en lugar de RP clásica, lo cual permitió consolidación del gen CEP250 como responsable de un fenotipo similar al USH. El resto de casos sin resolver induce a sospechar de la existencia de otros genes vinculados con USH. Así pues, se analizó el exoma íntegro de dichos casos negativos del panel por medio de secuenciación de exoma completo, lo cual proporcionó resultados relevantes en seis de las muestras estudiadas. Uno de tales sujetos resultó ser un claro caso de fenocopia de USH, al albergar mutaciones patogénicas en dos genes independientes, TECTA y REEP6, siendo el primero responsable de la SNHL y el segundo de la RP. De forma parecida, en otro paciente se detectaron variantes patológicas para RP en el gen EYS, pero no se identificó paralelamente ningún cambio genético que explicara la SNHL. Tres individuos adicionales resultaron haber sido erróneamente diagnosticados como USH, dada la conclusiva inexistencia o ambigüedad de la sordera. Uno de ellos fue definido como homocigoto de una mutación en CNGB1, ya reconocido como responsable de RP. En el segundo de dichos sujetos se identificó una mutación en homocigosis en el gen GRN, cuyos defectos en estado heterocigoto están asociados a demencia frontotemporal y más raramente combinada con RP si ambos alelos se encuentran alterados. Por otro lado, el tercer paciente fue resuelto como heterocigoto compuesto de variantes en WDR19, un gen asociado en mayor medida a una distrofia retiniana acompañada de trastornos renales y, más raramente, a la forma aislada del síntoma. En el último de los seis casos resaltados de este objetivo se detectó una mutación homocigota sin sentido en el gen ASIC5, cuyo papel en el organismo todavía se desconoce. Sin embargo, se han correlacionado funciones visuales y auditivas para miembros de la misma familia proteica. En conjunto, los hallazgos obtenidos en este trabajo avalan la importancia del uso de las más novedosas tecnologías en la búsqueda de soluciones para enfermedades raras, las cuales presentan por ahora un pronóstico terapéutico bastante desamparado. Asimismo, otras consecuencias positivas en cuanto a la caracterización genética de los pacientes son la corroboración (o rectificación) del diagnóstico inicial, así como la contribución a la estimación demográfica y correlaciones de genotipo-fenotipo, que en definit / [CA] La síndrome d'Usher (USH) és una malaltia rara autosòmic recessiu definit principalment per sordera neurosensorial (SNHL) i una distròfia retiniana coneguda com a retinosi pigmentària (RP). La patologia mostra heterogeneïtat genètica, ja que es coneixen almenys 10 gens responsables. No obstant això, les mutacions en USH2A són la causa més freqüent de la malaltia, a causa de la recurrència de la variant patogènica c.2299delG. En aquesta tesi s'ha desenvolupat un assaig d'edició gènica per a revertir la dita anomalia genètica per mitjà del sistema CRISPR/Cas9. Es van dissenyar i van probar diversos complexos CRISPR específics de locus, i el més eficient va ser usat per a la correcció de la mutació en cèl·lules derivades de pacients. La taxa de correcció de la mutació obtinguda va ser del 2.5%. Un altre objectiu d'aquesta tesi ha sigut la caracterització genètica de pacients USH encara sense diagnòstic molecular. Una primera fase va implicar la seqüenciació massiva dirigida de les regions codificants de tots els gens associats a la malaltia. Aquest estudi, la cohort de la qual va incloure 58 pacients no escrutats prèviament, va permetre la identificació de 42 noves mutacions presumptament patològiques, i una taxa general de detecció d'al·lels responsables de la malaltia de pràcticament el 83%. Sorprenentment, un dels subjectes presentava mutacions en CEP250, un dels últims gens correlacionats amb la malaltia. Una exhaustiva revisió clínica va revelar que la degeneració retiniana es tractava en realitat d'una distròfia de cons i bastons en lloc de RP clàssica. Aquestes troballes han permés la consolidació del gen CEP250 com a responsable d'un fenotip similar al USH. La resta de casos sense resoldre induïx a sospitar de l'existència d'altres gens vinculats amb USH. Així, doncs, es va analitzar l'exoma íntegre dels casos negatius del panell a través de seqüenciació d'exoma complet, cosa que va proporcionar resultats rellevants en sis de les mostres estudiades. Un de tals subjectes va resultar ser un clar cas de fenocopia d'USH, a l'albergar mutacions patogèniques en dos gens independents, TECTA i REEP6, sent el primer responsable de la SNHL i el segon de la RP. De forma semblant, en un altre pacient es van detectar variants patològiques per a RP al gen EYS, però no es va identificar paral·lelament cap canvi genètic que explicara la SNHL. Tres individus addicionals van resultar haver sigut erròniament diagnosticats com USH, donada la final inexistència o ambigüitat de la sordera. Un d'ells va ser definit com a homozigot d'una mutació en CNGB1, ja reconegut com a responsable de RP. En el segon d'aquestes subjectes es va identificar una mutació en homozigosi en el gen GRN, els defectes del qual estan associats a demència frontotemporal en estat heterozigot, i més rarament en combinació amb RP si ambdós al·lels es troben alterats. D'altra banda, el tercer pacient va ser resolt com a heterozigot compost de variants en WDR19, un gen associat en major grau a una distròfia retiniana acompanyada de trastorns renals i, més rarament, a la forma aïllada del símptoma. En l'últim dels sis casos ressaltats d'aquest objectiu es va detectar una mutació homozigota sense sentit en el gen ASIC5, el paper en l'organisme del qual encara es desconeix. Amb tot, s'han correlacionat funcions visuals i auditives per a membres de la mateixa família proteica. En conjunt, les troballes obtingudes en aquest treball avalen la importància de l'ús de les més noves tecnologies en la recerca de solucions per a malalties rares, les quals presenten per ara un pronòstic terapèutic prou desemparat. Així mateix, altres conseqüències positives quant a la caracterització genètica dels pacients són la corroboració (o rectificació) del diagnòstic inicial, així com la contribució a l'estimació demogràfica i correlacions de genotip-fenotip, que en definitiva ajuden en la compressió d'US / [EN] Usher syndrome (USH) is a rare autosomal recessive disorder defined essentially by sensorineural hearing loss (SNHL) and a retinal dystrophy known as retinitis pigmentosa (RP). The condition shows a genetic heterogeneity, since there are at least 10 genes known to be causative of the syndrome. However, mutations in USH2A are the most frequent cause of the disease, due in a large measure to the recurrence of the c.2299delG pathogenic variant. A gene editing assay to reverse this specific genetic anomaly was developed in this thesis by means of the groundbreaking CRISPR/Cas9 system. Several locus-specific CRISPR complexes were designed and tested, and the most efficient was used to proceed with the c.2299delG mutation correction on patient-derived cells. The trial resulted in a mutation correction rate of 2.5%. Another goal of this thesis was the genetic characterization of molecularly undiagnosed USH patients. Given the genetic diversity of the disease, the procedure required the implementation of high-throughput sequencing, a technology that enables in bulk sequencing of any number of selected loci (or the indiscriminate totality) of the genome. The first phase implied the targeted sequencing of the coding-relevant regions of all known causative or disease-associated genes at the moment. The study, comprising a cohort of 58 previously unscreened patients, enabled the identification of 42 novel putative pathogenic mutations, and an etiologic-allele detection ratio shy of 83%. Remarkably, one of the subjects harbored nonsense mutations in CEP250, which is one of the latest USH-associated genes. However, an exhaustive review of the clinical features unmasked the retinal degeneration as a cone-rod dystrophy rather than RP, which reinforced the linkage of the gene to an USH-like phenotype. The remaining portion of unresolved cases lead to suspicion of the existence of other genes accountable for USH. Hence, the complete exome of such panel-negative cases was screened through whole exome sequencing. This venture provided relevant findings in six of the surveyed samples. One subject was plainly exposed as an USH phenocopy by harboring pathogenic splice-site mutations in two independent genes, TECTA and REEP6, the former responsible for the SNHL and the latter for the RP. Similarly, RP-causative variants in EYS were detected in another patient, yet no pathogenic changes explaining the HL were discovered. Three additional individuals were ultimately unveiled as USH misdiagnosed cases, being the HL actually absent or ambiguous. One of the patients in this set was homozygous for a mutation in CNGB1, already known to be accountable for RP. The other two cases showed a more peculiar outcome being compound heterozygous for putatively pathogenic variants in genes generally associated to other disorders. One presented a homozygous mutation in GRN, a gene associated to frontotemporal dementia under heterozygous condition and less commonly to combined RP for homozygous alterations. The third subject was found to be a carrier of mutations in WDR19, a gene best associated with retinal disorders accompanied by renal signs and rarely with the isolated visual symptom. The last case presented a homozygous nonsense variant in the ASIC5 gene, whose role has yet to be learned. However, some correlations to visual and hearing functions have been reported for members of the same protein family. Altogether, the results obtained from this work attest to the importance of applying the most up-to-date technologies in the search of solutions for rare diseases that realistically pose a despairing therapeutic prognosis. In addition, the positive consequences of the genetic characterization of the patients are the corroboration (or else correction) of the initial diagnosis, and the contribution to the appraisal of demographic and genotype-phenotype correlations, which ultimately aid in the understanding USH and other related diseases. / This work was financially supported by the Institute of Health Carlos III and FEDER funds (ISCIII; grants PI13/00638, PI16/00425, PI16/00539, and PIE13/00046), Fundación ONCE (grant 2015/0398), XVIII Fundaluce-FARPE, and “Telemaratón: Todos Somos Raros, Todos Somos Únicos” (grant IP58). C.F.-G. is a recipient of a fellowship (grant IFI14/00021) from the ISCIII. R.P.V.-M. is a Miguel Servet researcher (grant CP11/00090 funded by ISCIII, Madrid, Spain). The funds from the ISCIII are partially supported by the European Regional Development Fund. R.-P.V.M. is also a Marie Curie fellow (grant CIG322034 from the European Commission). / Fuster García, C. (2020). Therapeutic approaches and development of genomic diagnostic tools for Usher syndrome [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137034 / Compendio

Tesis por compendio / [EN] The importance of the microbiota for host health and disease is now widely appreciated. Microbial communities that inhabit the human body have been proposed as an essential aspect of the hypothesis focused on the developmental origin of health and disease (DOHaD), suggesting that altered microbial exposure during infancy could play a role in the risk of some immune-based diseases, such as obesity, allergy development or T2 diabetes mellitus. Indeed, associational studies have related perinatal factors that could disrupt neonatal microbial colonization, such as antibiotic intake, Csection and formula feeding, to these diseases later in life. Some authors have suggested that the interaction between the initial microbiome and the developing immune system could be crucial for a correct maturation of the latter. However, the exact molecular mechanisms that regulate the host−microbiome interconnection during this period are still unknown. Furthermore, despite the importance of maternal microbiota on initial neonatal microbial seeding, data concerning the effect of these perinatal factors on maternal microbiota are still scarce. Objectives: The general aim of the thesis was to to ascertain the impact of perinatal factors, such as mode and place of delivery, antibiotic use, maternal diet and gestational age on maternal-neonatal microbiota composition and their implications on health outcomes. Subjects: Participants in this study were part of a larger longitudinal cohort study conducted in the Mediterranean area, between 2015 and 2019. Mothers were enrolled in the Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Hospital Clinico Universitario de Valencia, primary health-care units from Valencia and CEIC-Parc de Salut MAR. In this thesis, faecal samples at birth, 7 and 31 days were used as well as the saliva, amniotic fluid and placenta samples from a subset of participants. Methods: Next-generation sequencing targeting the V3−V4 region of the 16S rRNA gene was performed to assess the microbiota composition at each time point. Enzymelinked immunosorbent assay and Luminex assay were used for the determination of the molecular hormonal, metabolic and immune status of the participants and/or cellular models. Quantitative polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription PCR were also performed in a quantitative measurement of microbiota composition and for the assessment of gene expression in placental tissue and cellular models, respectively. The culture of different cell lines, including intestinal epithelial cells (Caco-2), mucusproducer cells (LSTH-17) and monocyte-like cells (THP-1), were used for the in vitro assays. Results and conclusion: Maternal microbiota at delivery was influenced by several perinatal factors, including immune status of amniotic cavity, diet during gestation and delivery mode. Maternal consumption of fat was positively related to Firmicutes spp. while carbohydrates, fibre and polyunsaturated fatty acids (PUFA) intakes were associated with higher relative abundance of Bacteroidetes and Proteobacteria levels. Some of these relations were also reflected in the neonatal microbiota at delivery. Indeed, children born by C-section and from mothers with higher fat intakes showed higher body mass index (BMI) index z-scores than those born from mothers with higher fibre consumption. Two bacterial profiles were found during the study. The first one was composed of health-related bacteria with short-chain fatty acids (SCFA) production activity, such as Roseburia, Faecalibacterium, Blautia, Lachnospira or Bacteroides genera. This group was associated with a distinct amniotic cytokine profile characterized by higher concentrations of IL-2, IL-5, IL-17 and TNF-α. Indeed, salivary cortisol concentration also showed positive relations with some of these genera independently of the delivery mode. The other group was characterized by Finegoldia, Peptoniphilus, Anaeroaoccus, Porphyromonas and Campylobacter genera. Those were associated with another amniotic cytokine profile dominated by IL-4, IL-13, IL-18, and IL-10 cytokines and more highly represented in mothers who had undergone a Csection. Some of these genera were negatively associated with salivary cortisol concentration. Thus, our results suggested that amniotic fluid immune status and cortisol concentration were related to maternal microbiota at delivery with implications also in neonatal microbiota. Furthermore, we described the effect of mode and place of birth in the microbial colonization evolution during the first month of life, showing that neonates born by Csection had a distinct microbial pattern and higher BMI index z-scores than vaginalborn infants, both at home and hospital. We proposed an in vitro molecular mechanism by which the differences observed in C-section-born neonates in terms of microbiota composition would promote a shift in immune system maturation through the lack of immune stimulation observed in these samples compared with those from vaginal-born infants, especially those from the home birth group. Thus, disruptions in the colonization process during the first month of life could have long-lasting consequences through an alteration of immune system development during this period. / [ES] El gran impacto del microbioma humano sobre la salud del huésped es ampliamente conocido. Se cree que las comunidades microbianas que habitan el cuerpo humano serían un aspecto fundamental en la hipótesis promulgada sobre el posible origen de la enfermedad durante el desarrollo (DOHad) sugiriendo que alteraciones en la exposición microbiana durante la infancia podrían estar implicadas en el mayor riesgo de algunas enfermedades de base inmunológica como la obesidad, la alergia o la diabetes mellitus de tipo II. Además, se han encontrado relaciones significativas entre este tipo de enfermedades con algunos factores perinatales que se han descrito como disruptores del proceso de colonización, como la cesárea, el uso de antibióticos o la alimentación mediante leche de formula. Algunos autores sugieren que la interacción entre la microbiota inicial y el sistema inmunológico que está desarrollándose sería crucial para una correcta maduración de este. Sin embargo, los mecanismos exactos que mediarían en esta relación huésped-microbiota durante este periodo todavía se desconocen. Además, a pesar de la importancia de la microbiota materna para el inicio del proceso de colonización, todavía es escasa la información sobre como los diferentes factores perinatales afectan a la microbiota materna. Objetivos: El objetivo general de esta tesis fue definir el impacto de los diferentes factores perinatales como el tipo de parto, el uso de antibióticos, la dieta materna o la edad gestacional en la composición de la microbiota materno-neonatal y sus posibles implicaciones para la salud. Participantes: Los participantes del presente análisis son parte de un estudio longitudinal de cohorte desarrollado en el área mediterránea entre 2015 y 2019. Las madres fueron reclutadas en el Hospital Universitario y Politécnico de la Fe, el Hospital Clínico Universitario de Valencia, centros de atención primaria de la ciudad de Valencia y el CEIC-Parc de Salut MAR. En el presente trabajo se utilizaron las muestras fecales recogidas al parto, a los 7 y 31 días, así como las muestras de saliva, líquido amniótico y placenta de un grupo reducido de participantes. Métodos: Se utilizaron técnicas de secuenciación de nueva generación dirigidas a la región V3-V4 del gen 16S rRNA para la determinación de la composición de la microbiota de cada muestra a los tiempo estudiados. Además, el ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas y la técnica Luminex fueron usadas para la determinación de moléculas relacionadas con el estado hormonal, metabólico e inmune de las muestras y/o de los ensayos celulares. La PCR cuantitativa y la de transcripción reversa fueron usadas para realizar una medida cuantitativa de la composición microbiana y de la expresión de algunos genes seleccionados en las muestras de placenta y modelos celulares, respectivamente. EL cultivo de diferentes líneas celulares, como líneas epiteliales (Caco-2), productoras de moco (LSTH-17) y líneas similares a macrófagos (THP-1) fueron utilizadas en los ensayos in vitro. Resultados y conclusión: La microbiota materna al parto estuvo influenciada por diversos factores perinatales, incluyendo el estado inmunológico de la cavidad amniótica, la dieta durante el embarazo y el tipo de parto. El consumo materno de grasa estuvo positivamente relacionado con Fimicutes spp. Mientras que el consumo de carbohidratos, fibra y ácidos grasos poliinsaturados fueron asociados con mayores abundancias relativas de los filos Bacteroidetes y Proteobacteria. Algunas de estas relaciones fueron observadas también en la microbiota neonatal. Además, los niños nacidos por cesárea y de madres con altos consumos de grasa mostraron mayores IMC (índice de masa corporal) z-scores que aquellos que nacieron de madres consumidoras de fibra. Dos patrones microbianos fueron encontrados a lo largo de todos los análisis. El primero de ellos estaba compuesto por especies asociadas a la salud y productoras de SCFA como los géneros Roseburia, Faecalibacterium, Blautia, Lachnospira o Bacteroides. Este grupo estuvo asociado a un perfil de citoquinas caracterizado por IL2, IL-5, IL-17 y TNF-α. Los niveles de cortisol en saliva estuvieron positivamente correlacionados con algunos de estos géneros independientemente del tipo de parto. El otro patrón microbiano estuvo caracterizado por los géneros Finegoldia, Peptoniphilus, Anaeroaoccus, Porphyromonas y Campylobacter. Estos estuvieron relacionados con un perfil de citoquinas en la cavidad amniótica dominados por la presencia de IL-4, IL-13, IL-18 y IL-10 y con el parto por cesárea. Además, algunos de estos géneros estuvieron negativamente correlacionados con los niveles de cortisol en saliva. Así, nuestros resultados sugieren que el ambiente inmunológico de la cavidad uterina y la concentración de cortisol estuvieron relacionados con la composición de la microbiota materna al parto con implicaciones para la microbiota neonatal. Además, describimos el efecto del tipo de parto y el lugar en el proceso de colonización durante el primer mes de vida mostrando que los niños nacidos por cesárea tienen un perfil diferencial de microbiota y mayores IMC z-scores que los niños nacidos de forma vaginal, tanto en el hospital como en casa. En nuestra investigación, hemos propuesto un mecanismo molecular por el cual las diferencias en la composición microbiana de los niños nacidos por cesárea podrían provocar una alteración en la maduración del sistema inmunológico mediante la falta de imnunoestimulación observada estas muestras comparadas con aquellas obtenidas de los niños nacidos por parto vaginal, especialmente de aquellos nacidos en casa. Así, las alteraciones en el proceso de colonización durante el primer mes de vida podrían tener consecuencias a largo plazo en la salud infantil debido a una alteración del desarrollo del sistema inmunológico durante este periodo. / [CA] El gran impacte del microbioma humà sobre la salut humana del hoste és amplament reconegut. Es creu que les comunitats microbianes que habiten el cos humà serien un aspecte fonamental en la hipòtesi promulgada sobre el possible origen de la malaltia durant el desenvolupament (coneguda com DOHad) suggerint que alteracions en l’exposició microbiana al llarg de la infància podrien estar implicades en el augment del risc a patir algunes malalties amb base immunològica com són l’obesitat, l’al·lèrgia o la diabetis mellitus tipus II. Així mateix, s’han trobat relacions significatives entre aquest tipus de malalties amb alguns factors perinatals que s’han descrit com disruptors del procés de colonització, com la cesària, l’ús d’antibiòtics o l’alimentació mitjançant llet de fórmula. Alguns autors suggereixen que la interacció entre la microbiota inicial i el sistema immunològic que estaria desenvolupant-se seria crucial per a una correcta maduració d’aquest últim. No obstant això, els mecanismes exactes que mediten en aquesta relació hoste-microbiota durant aquest període encara es desconeixen. A pesar de la importància de la microbiota materna en l’inici del procés de colonització, encara és escassa la informació sobre els diferents factors perinatals que afecten a la microbiota materna. Objectius: L’objectiu general d’aquesta tesi fou definir l’impacte dels diferents factors perinatals com el tipus de part, l’ús d’antibiòtics, la dieta materna o l’edat gestacional en la composició de la microbiota materno-neoantal i les possibles implicacions sobre la salut. Participants: Els participants del present anàlisi són part d’un estudi longitudinal de cohort de l’àrea mediterrània entre el 2015 i 2019. Les mares van ser reclutades en l’Hospital Universitari i Politècnic La Fe, l’Hospital Clínic Universitari de València, centres d’atenció primària de la ciutat de València i el CEIC-Pac de Salut Mar de Catalunya. En el present treball s’utilitzaren les mostres fecals recollides al part, als 7 i als 31 dies, així com les mostres de saliva, líquid amniòtic i placenta. Mètodes: S’utilitzaren tècniques de seqüenciació de nova generació dirigides a la regió V3-V4 del gen 16S rRNA per a la determinació de la composició de la microbiota de cada mostra als temps estudiats. Així mateix, l’assaig per immune adsorció lligat a enzims i la tècnica Luminex foren utilitzades per a la determinació de molècules relacionades amb l’estat hormonal, metabòlic e immunològic de les mostres i/o els assajos cel·lulars. La PCR quantitativa i la de transcripció en mode revers foren utilitzades per a realitzar una mesura quantitativa de la composició de la microbiota i de l’expressió d’alguns gens seleccionats en les mostres de placenta i models cel·lulars, respectivament. El cultiu de diferents tipus cel·lulars, com tipus epitelials (Caco-2), productors de moc (LSTH-17) i línies similars a macròfags (THP-1) foren utilitzades en els assajos in vitro. Resultats i conclusió: La microbiota materna en el moment del part va estar influenciada per diversos factors perinatals, incloent l’estat immunològic de la cavitat amniòtica, la dieta durant l’embaràs i el tipus de part. El consum matern de greix es va vore associat amb Fimicutes spp. Pel contrari, el consum de carbohidrats, fibra i àcids grassos poliinsaturades es van veure relacionats amb majors abundàncies relatives dels phylum Bacteroidetes i Proteobacteria. Algunes d’aquestes relacions foren també observades en la microbiota neonatal. Tan mateix, els nounats nascuts per cesària i de mares consumidores de greixos van mostrar majors índexs de massa corporal (IMC) zscores que els nonats nascuts de mares consumidores de fibra. Dos patrons microbians es trobaren al llarg de totes les anàlisis. La primera d’elles va estar composta per espècies associades amb la salut i productes d’àcids grassos de cadena curta (SCFA), com són els gèneres Rosburia, Faecalibacterium, Blautia, Lachnospira o Bacteroides. Aquest grup va estar associat a un perfil de citocines caracteritzat per interleucines (IL)-2, IL-5, IL-17 i TNF-alpha. Els nivells de cortisol en saliva al part estigueren positivament correlacionats amb alguns d’aquests grups , independentment del tipus de part. L’altre patró microbià estava caracteritzat per els gèneres Finegoldia, Peptoniphilus, Anaeroccocus, Porphyromonas i Campylobacter. Aquests grups foren relacionats amb el part per cesària i un perfil de citoquines en la cavitat amniòtica dominat per la presència de IL-4, IL-13, IL.18 i IL-10. A més, alguns d’aquests gèneres estigueren negativament relacionats amb els nivells de cortisol en saliva en el moment del part. Així, els nostres resultats suggereixen que l’ambient immunològic de la cavitat uterina i la concentració de cortisol tenien una relació amb la composició de la microbiota materna al part amb implicacions per a la microbiota neonatal. Tan mateix, descrivim l’efecte del tipus de part i el lloc de naixement (hospital vs. casa) en el procés de colonització durant el primer mes de vida, mostrant que els nonats nascuts per cesària tenien un perfil diferencial de microbiota i majors índexs de massa corporal (IMC) z-scores que aquells nonats nascuts de forma vaginal, tant a l’hospital com a casa. En la nostra investigació, hem proposat un mecanisme molecular pel qual les diferències en la composició microbiana podrien provocar una alteració en la maduració del sistema immunològic mitjançant una manca de inmuno-estimulació, observada en les mostres obtingudes dels nounats nascuts per cesària, especialment si es compara amb aquells nascuts a casa. Així, les alteracions en el procés de colonització, durant el primer mes de vida podrien tenir conseqüències a llarg termini en la salut infant debut a alteracions en el desenvolupament del sistema immunològic durant el període. / Selma Royo, M. (2020). Impact of perinatal factors on the maternal- neonatal microbiota and influence on health outcomes [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/153159 / Compendio

[ES] La enfermedad de Wilson (EW) es un trastorno hereditario del metabolismo del cobre causado por mutaciones en ATP7B, que codifica una proteína transportadora de cobre en el hígado. Su mal funcionamiento provoca un fallo en la excreción biliar de cobre y una acumulación progresiva de este metal en el organismo, especialmente en hígado y cerebro. En este trabajo, se explora la posible utilidad de miRNAs circulantes en plasma para identificar biomarcadores que sirvan para controlar la progresión de la enfermedad en pacientes con EW bajo tratamiento. Los modelos desarrollados para cada miRNA mostraron un buen rendimiento al clasificar a los pacientes con factores de evolución desfavorable, por lo que estos tres miRNAs se proponen como candidatos para mejorar el seguimiento clínico o para respaldar la eficacia de nuevas terapias en la EW. / [CA] La malaltia de Wilson és un trastorn hereditari del metabolisme del coure causat per mutacions en ATP7B, que codifica per a una proteïna transportadora del coure al fetge. El seu mal funcionament produeix alteracions en l'excreció biliar i l'acumulació progressiva de coure, especialment en fetge i cervell. Es va explorar la possible utilitat del perfil de miRNAs circulants com biomarcadors de progressió de la patologia hepàtica. L'avaluació dels models obtinguts per a cadascun dels tres miRNAs va mostrar un bon rendiment per a classificar al grup de pacients amb factors d’evolució desfavorable, en conseqüència, es proposen com a candidats per tal de millorar el seguiment clínic o comprovar l’efectivitat de noves teràpies en la malaltia de Wilson. / [EN] Wilson disease (WD) is an inherited disorder of copper metabolism caused by mutations in ATP7B, which encodes for a liver copper-transporting protein. Its dysfunction causes a deficit in biliary copper excretion and a progressive accumulation of this metal in the organism, mainly in liver and brain. In this work, circulating miRNAs profiling in plasma has been accomplished to identify biomarkers that could serve to monitor disease progression in WD patients under chelation therapy. Developed models for each miRNA exhibited good performance classifying patients with poor outcome factors, consequently, these three miRNAs are proposed as candidates to improve clinical follow-up or to support efficacy of novel therapies in WD. / Esta Tesis Doctoral ha sido financiada por los siguientes proyectos de investigación: “Avanzar en el diagnóstico y la prognosis de la enfermedad de Wilson” Duración: 2016-2019, Fundació Per Amor a l’Art (FPAA) IP: C. Espinós; “Bases genéticas y biomarcadores pronóstico de la enfermedad de Wilson y Wilson-like” 2020-2022, Fundació Per Amor a l’Art (FPAA) IP: C. Espinós; “Estudios clínicos, bases genéticas y biomarcadores pronóstico en enfermedades raras neurodegenerativas” 2019-2021, Instituto de Salud Carlos III (Expediente: PI18/00147) IP: C. Espinós; “De genes a terapia en enfermedades neurodegenerativas y neuromusculares” 2018-2021, Generalitat Valenciana, Programa Prometeo para grupos de investigación de excelencia (Expediente: PROMETEO/2018/135) Consorcio de investigadores formado por F. V. Pallardó (coordinador), J.M. Millán, I. Galindo, P. Sanz, T. Sevilla y C. Espinós. / Sánchez Monteagudo, A. (2021). Genética molecular y biomarcadores de la enfermedad de Wilson [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171454

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Tesis por compendio / [ES] En las últimas décadas, se ha observado un incremento en la emergencia de nuevas virosis en los cultivos del sudeste español, principal región abastecedora de frutas y hortalizas al resto de Europa. Entre las virosis emergentes más recientes en esta área de cultivo, se encuentra el tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV), un begomovirus de genoma bipartito transmitido por moscas blancas (Bemisia tabaci). En 2012 se detectó por primera vez en las provincias de Murcia y Almería, y desde entonces se está propagando por otros países de la cuenca del Mediterráneo, generando graves daños en los cultivos de cucurbitáceas, y limitando la producción, principalmente, de calabacín (Cucurbita pepo) y melón (Cucumis melo). En esta tesis doctoral se ha desarrollado un programa de mejora genética enfocado a la obtención de variedades de cucurbitáceas resistentes al aislado español del ToLCNDV(-ES). Por primera vez, hemos identificado fuentes de resistencia al ToLCNDV en el género Cucurbita y en pepino (Cucumis sativus). Todas las accesiones resistentes que describimos pertenecen a tipos silvestres o variedades locales, la mayoría originarias de la India, donde se describió por primera vez el ToLCNDV. Es posible que en esta área se haya producido un fenómeno de co-evolución entre plantas silvestres de cucurbitáceas y este begomovirus. Dos accesiones de Cucurbita moschata han mostrado un elevado nivel de resistencia, y a pesar de su cruzabilidad intermedia con C. pepo, ha sido posible la obtención de descendencia interespecífica y la transferencia parcial de la resistencia. Las accesiones resistentes identificadas se han caracterizado para determinar el tipo de herencia que regula la resistencia al ToLCNDV. Mediante el desarrollo de poblaciones segregantes de mejora y el aprovechamiento de herramientas genéticas de mapeo y cartografía hemos identificado tres QTLs que controlan la resistencia al ToLCNDV en melón, uno de efecto mayor y herencia parcialmente dominante en el cromosoma 11 y dos que modifican su efecto mediante interacciones epistáticas en los cromosomas 2 y 12. Siguiendo esta estrategia, también hemos identificado un locus de resistencia recesiva a ToLCNDV en el cromosoma 8 de C. moschata, aunque la penetración incompleta cuando se intenta transferir a C. pepo pone de manifiesto la influencia del fondo genético en el carácter. Las regiones genómicas involucradas en la resistencia de ambas especies son sinténicas y agrupan un conjunto de genes comunes no descritos previamente en la resistencia a otros virus en cucurbitáceas. Los genotipados mediante colecciones de SNPs han permitido identificar marcadores moleculares ligados a la resistencia al ToLCNDV en melón, calabaza y calabacín. Estos marcadores suponen un valioso recurso en programas de mejora, ya que permiten transferir de manera asistida las resistencias identificadas a fondos genéticos comerciales. Para profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que dan lugar a la resistencia, hemos realizado un ensayo de RNA-seq, comparando los transcriptomas de un genotipo resistente y otro susceptible de melón durante la infección con ToLCNDV. Los resultados obtenidos al analizar la expresión diferencial son compatibles con el tipo de herencia cuantitativa de la resistencia y reflejan un complejo sistema de regulación transcripcional. La infección sistémica del ToLCNDV en melón se ve influenciado por la desregulación de genes implicados en la ruta de señalización hormonal del ácido jasmónico, transportadores transmembrana, fotosíntesis y factores de transcripción. Además, hemos observado cambios en la expresión de genes implicados en la metilación del DNA, tanto en el genotipo resistente como susceptible, lo que sugiere que el silenciamiento génico mediado por RNA puede estar involucrado en la inhibición de la transcripción del genoma viral, favoreciendo la resistencia. / [EN] Different factors promote the emergence of new viruses in crops of the Southeastern Spain, the main supplier region of vegetables and fruits to the rest of European countries. A new strain of tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) is among the most recent emergent viral diseases in this farming area, a bipartite begomovirus naturally transmitted by whiteflies (Bemisia tabaci). This strain was first detected in 2012 in the provinces of Murcia and Almeria, from where it propagated to other Mediterranean countries. ToLCNDV generates severe damages in cucurbits, decreasing yields mainly in squash (Cucurbita pepo) and melon (Cucumis melo) crops. In this doctoral thesis, a breeding program has been developed to obtain cucurbit varieties with resistance to the Spanish strain of ToLCNDV(-ES). Although cucurbit germplasm with resistance genes to this virus is poor and localized in few accessions, in this work we have identified for the first-time resistance sources to ToLCNDV in Cucurbita spp. and cucumber (Cucumis sativus). All resistant accessions here described are landraces or wild types not domesticated or with low levels of genetic manipulation. Moreover, most of these genotypes are originals from India, where ToLCNDV was first described. Likely, the occurrence of co-evolution events took place between wild cucurbits plants and this begomovirus. Despite not identifying resistance sources in squash, two Cucurbita moschata accessions have shown high resistance levels. Both species present intermediate crossability, even so the obtention of interspecific offspring and the partial transference of the resistance was possible. The resistant accessions identified in the works of this thesis and those identified by our group in previous assays, have been characterized to determine the heritage controlling ToLCNDV resistance. The development of breeding segregating populations and exploiting getenic tools for mapping and cartography, we identifed three QTLs controlling resistance to ToLCNDV in melon, one partially dominant with mayor effect in chromosome 11, and two minor modifiers in chromosomes 2 and 12. Epistatic interactions between them have been detected. Following the same strategy, we have also identified a locus with recessive heritage in chromosome 8 of C. moschata. However, when we tried to transfer it to C. pepo incomplete penetrance occurrence was observed, reflecting the influence of the genetic background on the trait. The genomic regions identified in both species are synthenic and share a common cluster of genes not described previously in cucurbits conferring resistance to other viruses. The advances in next generation sequencing technologies have offered us a huge quantity of genomic and transcriptomic information. Genotyping by SNPs collections allowed the identification of molecular markers linked to ToLCNDV resistance in melon, pumpkin and squash. These markers suppose a valuable resource in breeding programs, since can be used to assist the transference of the identified resistances to commercial genetic backgrounds. To further understand the molecular mechanism regulating the resistance, we have performed an RNA sequencing assay (RNAseq), comparing transcriptomes between a resistant and a susceptible accession of C. melo in the time course of ToLCNDV infection. The results obtained from the analysis of differential expression levels are compatible whit a complex transcriptional regulation. Deregulation of genes involved in hormonal jasmonic signaling, transmembrane transport, photosynthesis and transcription factors are involved in the ToLCNDV systemic infection through melon plants. Furthermore, in both resistant and susceptible genotypes, we observed expression changes of genes described in DNA methylation pathway. This suggests that RNA silencing mechanisms might be responsible of inhibit viral genome transcription, enhancing the resistance response. / [CA] Durant les últimes dècades, s'ha observat un increment en l'emergència de noves virosis als cultius del sud-est espanyol, principal regió proveïdora de fruites i hortalisses a la resta d'Europa. Entre les virosis emergents més recents en aquesta àrea de cultiu, es troba un nou aïllat del tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV), un begomovirus de genoma bipartit transmés per mosca blanca (Bemisia tabaci). En 2012 es va detectar per primera vegada a les províncies de Múrcia i Almeria, i des d'aleshores s'està propagant per altres països de la conca del Mediterrani, ací genera greus danys en els cultius de cucurbitàcies, i hi limita la producció, principalment de carabasseta (Cucurbita pepo) i meló (Cucumis melo). En aquesta tesi doctoral s'ha desenvolupat un programa de millora genètica enfocat a l'obtenció de varietats de cucurbitàcies resistents a l'aïllat espanyol del ToLCNDV(-ES). Hem pogut identificar per primera vegada fonts de resistència al ToLCNDV en el gènere Cucurbita i en cogombre (Cucumis sativus). Totes les accesions resistents que descrivim pertanyen a tipus silvestres o varietats locals, la major part originaris de l'Índia, on es va descriure per primera vegada el ToLCNDV. És possible que en aquesta àrea s'haja produït un fenomen de coevolució entre plantes silvestres de cucurbitàcies i aquest begomovirus. Dos accesions de Cucurbita moschata han mostrat un elevat nivell de resistència, i tot i la compatibilitat intermèdia que presenten ambdues espècies, ha sigut possible l'obtenció de descendència interespecífica i la transferència parcial de la resistència. Les accessions resistents identificades s'han caracteritzat per tal de determinar el tipus d'herència que regula la resistència al ToLCNDV. Mitjançant el desenvolupament de poblacions segregants de millora i l'aprofitament de ferramentes genètiques de mapeig i cartografia, hem identificat tres QTLs que controlen la resistència al ToLCNDV en meló, un d'efecte major i herència parcialment dominant en el cromosoma 11 i dos que modifiquen el seu efecte mitjançant interaccions epistàtiques als cromosomes 2 i 12. Seguint aquesta estratègia, també hem identificat un locus de resistència recessiva a ToLCNDV en el cromosoma 8 de C. moschata, encara que la penetració incompleta quan s'intenta transferir a C. pepo evidència la influència del fons genètic en el caràcter. Les regions genòmiques involucrades en la resistència de les dos espècies són sintèniques i agrupen un conjunt de gens comuns no descrits prèviament en la resistència a altres virus en cucurbitàcies. Els genotipats utilitzant col·leccions de SNPs han permés identificar marcadors moleculars lligats a la resistència al ToLCNDV en meló, carabassa i carabasseta. Aquests marcadors suposen un valuós recurs en programes de millora, ja que permeten transferir de forma assistida les resistències identificades a fons genètics comercials. Per tal d'aprofundir en el coneixement dels mecanismes moleculars que confereixen la resistència, hem realitzat un assaig de seqüenciació del RNA (RNA-seq), i hem comparat els transcriptomes d'un genotip resistent i altre susceptible de meló durant la infecció amb ToLCNDV. Els resultats obtinguts en analitzar l'expressió diferencial són compatibles amb el tipus d'herència quantitativa de la resistència i reflecteixen un complex sistema de regulació transcripcional. La infecció sistèmica del ToLCNDV en meló es veu influenciada per la desregulació de gens implicats en la ruta de senyalització hormonal de l'àcid jasmònic, transportadors transmembrana, fotosíntesi i factors de transcripció. A més, hem observat canvis en l'expressió de gens implicats en la metilació del DNA, tant en el genotip resistent com susceptible, el que suggereix que el silenciament gènic mediat per RNA pot estar involucrat en la inhibició de la transcripció del genoma viral, afavorint la resistència. / La Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Esports (Generalitat Valenciana) y el Fondo Social Europeo (FSECV 2014-2020) han cofinanciado la contratación de la doctoranda como personal investigador de carácter predoctoral (ACIF/2016/188) y dos estancias predoctorales fuera de la Comunitat Valenciana (BEPFI/2017/011 y BEFPI/2018/028). La realización de esta tesis doctoral también se ha realizado en el marco de dos proyectos de investigación del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, con cofinanciación de fondos FEDER [Proyectos AGL2017-85563-C2-1-R y RTA2017-00061-C03-03 (INIA)] y del proyecto PROMETEO para grupos de excelencia (2017/078) de la Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Esports (Generalitat Valenciana). / Sáez Sánchez, C. (2020). Mejora Genética de la Resistencia al tomato leaf curl New Delhi virus en Cucurbitaceas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/153801 / Compendio

El melón (Cucumis melo) y el calabacín (Cucurbita pepo) son especies cucurbitáceas de gran importancia económica a nivel nacional y mundial. Para optimizar su producción se requiere de la obtención de nuevas variedades mejor adaptadas a los sistemas de cultivo, más resistentes frente a nuevas enfermedades o plagas y con mejores características organolépticas, que respondan a las cada vez mayores exigencias del mercado. La mejora debe realizarse de una forma eficiente y competitiva, apoyándose en los crecientes conocimientos genéticos en estas dos especies y en los últimos avances biotecnológicos. El desarrollo de herramientas genómicas con el fin de impulsar la mejora de estos cultivos es el principal objetivo de la presente Tesis doctoral. El desarrollo de marcadores moleculares es esencial para la construcción de mapas genéticos, para la realización de una selección más eficiente, para el análisis y cartografía de QTLs (Quantitative trait loci) y para el desarrollo de líneas de premejora, además de ser una herramienta fundamental para el análisis de la biodiversidad. En esta Tesis se han desarrollo y/o validado marcadores de alta calidad, de tipo microsatélite (Simple Sequence Repeats, SSRs) y SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), para estas dos especies. La generación de información de secuencia, necesaria para el desarrollo de este tipo de marcadores, ha cambiado en el transcurso de los trabajos presentados en la Tesis, habiéndose abordado finalmente la secuenciación del transcriptoma de melón mediante técnicas de secuenciación de alto rendimiento (NGS, Next generation sequencing). La obtención de grandes colecciones de SSRs y SNPs en ambas especies, resultado del ensamblaje de ESTs (Expressed Sequence Tags) procedentes de secuencias Sanger previamente disponibles y de las nuevas secuencias obtenidas por secuenciación masiva, ha supuesto un gran avance para estas especies no modelo, permitiendo la construcción de mapas más densos en melón y del primer mapa ba / Esteras Gómez, C. (2012). Desarrollo y aplicación de herramientas genómicas para la mejora de especies cucurbitáceas por calidad y resistencia a enfermedades [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/17046

The recent advent of High-Throughput Sequencing (HTS) methods has triggered a revolution in gene regulation studies. Demand has never been higher to process the immense amount of emerging data to gain insight into the regulatory mechanisms of the cell. We address this issue by describing methods to analyze, integrate and interpret HTS data from different sources. In particular, we developed and benchmarked Pyicos, a powerful toolkit that offers flexibility, versatility and efficient memory usage. We applied it to data from ChIP-Seq on progesterone receptor in breast cancer cells to gain insight into regulatory mechanisms of hormones. Moreover, we embedded Pyicos into a pipeline to integrate HTS data from different sources. In order to do so, we used data sets from ENCODE to systematically calculate signal changes between two cell lines. We thus created a model that accurately predicts the regulatory outcome of gene expression, based on epigenetic changes in a gene locus. Finally, we provide the processed data in a Biomart database to the scientific community. / La llegada reciente de nuevos métodos de High-Throughput Sequencing (HTS) ha provocado una revolución en el estudio de la regulación génica. La necesidad de procesar la inmensa cantidad de datos generados, con el objectivo de estudiar los mecanismos regulatorios en la celula, nunca ha sido mayor. En esta tesis abordamos este tema presentando métodos para analizar, integrar e interpretar datos HTS de diferentes fuentes. En particular, hemos desarollado Pyicos, un potente conjunto de herramientas que ofrece flexibilidad, versatilidad y un uso eficiente de la memoria. Lo hemos aplicado a datos de ChIP-Seq del receptor de progesterona en células de cáncer de mama con el fin de investigar los mecanismos de la regulación por hormonas. Además, hemos incorporado Pyicos en una pipeline para integrar los datos HTS de diferentes fuentes. Hemos usado los conjuntos de datos de ENCODE para calcular de forma sistemática los cambios de señal entre dos líneas celulares. De esta manera hemos logrado crear un modelo que predice con bastante precisión los cambios de la expresión génica, basándose en los cambios epigenéticos en el locus de un gen. Por último, hemos puesto los datos procesados a disposición de la comunidad científica en una base de datos Biomart.