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O Vírus de Influenza aviária pertence à família Orthomyxoviridae. Nos últimos anos vários subtipos da gripe aviária de baixa patogenicidade têm causado surtos e epidemia em humanos e aves domésticas. As aves selvagens e migratórias participam da manutenção e transmissão interespécie dos 16 subtipos de hemaglutinina e 9 subtipos de Neuraminidase na natureza. Nosso estudo teve como objetivo subtipar as amostras positivas através de teste sorológico de inibição da hemaglutinação (HI) e técnica de Biologia Molecular. Foram positivas as amostras das espécies: Elaenia mesoleuca (2), Sporophila lineola (1) Sporophila caerulescen (1), Vireo olivaceus (3), Columbina talpacoti (3), Paroaria dominicana (2), foram coletadas das reservas experimentais de campo localizadas no estado de São Paulo-Brasil,durante os anos de 1997 e 1998. Tais amostras foram identificadas por teste preconizado HI(de acordo com WHO) usando 20 soros imunes anti-influenza do tipo A e um do tipo B e análise de RT-PCR com sequenciamento do gene Hemaglutinina e Neuraminidase. O teste HI demonstrou que 12 amostras apresentou estreita afinidade com com soros imune A/HongKong/1/68 (H3N2), A/Equine/Miami/63 (H3N8) and A/Duck/Ukraine/63 (H3N8). As análises de sequenciamento do gene hemaglutinina e Neuraminidase desses isolados revelaram uma alta homologia com os do subtipos H3N2. As análise filogenética e variabilidade genética em comparação com as seqüências de Genbank representando diversos países, mostraram que nossas amostras apresentou estreita homologia com os vírus do subtipos que circularam em Victoria (1990), Siena (1991) e Beijim (1989). A análise de amino ácido indicou que há mutações não sinônimas no gene da Hemaglutinina exclusiva de nossas amostras e as mutações da Neuraminidase são sinônimos, quando comparadas com amostras de AIV de outros paises. Nossas Amostras quando análisadas a NA, não apresentaram mutações nos aminoácidos y285t e r297n que conferem resistencia aos inibidores da Neuminidase. / Avian Influenza virus belongs to Orthomyxoviridae family. The last years several low pathogenic avian influenza subtypes have caused outbreaks and epidemic in human and poultry. The wild and migrating birds may be participating of maintenance and interspecies transmission of the sixteen subtypes of the Hemagglutinina and nine Neuraminidase in nature. Our study was aimed to subtype the positive samples for influenza A isolated from migrating and wild birds by molecular technique and Haemagglutination inhibition test (HI). The samples from species Elaenia mesoleuca (2), Sporophila lineola (1) Sporophila caerulescens (1), Vireo olivaceus (3), Columbina talpacoti (3), Paroaria dominicana (2), were collected in reserves and experimental field stations located in the São Paulo State - Brazil, during the years 1997 and 1998. The samples were identified by HI test (according WHO) using the 20 antibody patterns anti-influenza A type and one for the influenza type B and RT-PCR and Sequence analysis of Hemaglutinina and Neuraminidase gene. The HI test demonstrated that 12 samples presented an antigenic close relationship with A/HongKong/1/68 (H3N2), A/ Equine/Miami /63 (H3N8) and A/Duck/ Ukraine/ 63 (H3N8) antiserum.The sequencing analyses of Hemaglutinin and Neuraminidase gene of these 12 isolates revealed a high homology with H3N2. Phylogenetic analysis and genetic variability compared with genbank sequence representing several countries, showed that our current samples submitted close homology to that circulated in Victoria (1990), Siena (1991) and Beijim (1989). Amino acid analysis compared our samples with representative genbank samples all of mutation are synonymous.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania e compreende um grupo de doenças que apresentam características clínicas, histopatológicas e imunológicas distintas. O diagnóstico é realizado em base epidemiológica, clínica e patológica, confirmadas por exames parasitológicos positivos e demonstração de hipersensibilidade retardada a antígeno de leishmânia. Os testes sorológicos para o diagnóstico, utilizados até o momento, apresentam várias limitações e por isso é de grande importância identificar proteínas recombinantes de leishmânia, para que sejam testadas como potenciais antígenos para o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico da LTA. Neste estudo, foram utilizadas duas proteínas recombinantes de leishmânia altamente conservadas, Lb8E e Lb6H, derivadas de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), avaliando a sua capacidade para detectar anticorpos no soro de vários grupos de pacientes por teste imunoenzimático (ELISA). Os antígenos recombinantes reagiram com amostras de 83,3% e 100,0% (Lb6H) dos pacientes com LTA e 95,4% (Lb8E) e 89,4% (Lb6H) dos soros de pacientes de leishmaniose visceral (LV). Em amostras de indivíduos saudáveis, as reações com Lb8E e Lb6H foram altamente específicas. Soros de 219 pacientes com LTA infectados com diferentes espécies de leishmânia prevalentes no Brasil (Leishmania (Leishmania) amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.) shawi) e amostras de pacientes com outras infecções parasitárias foram avaliados para a presença de anticorpos anti-rLb6H, obtendo-se sensibilidade de 100,0% nas 219 amostras de LTA e especificidade geral de 93,9% (considerando 68 indivíduos saudáveis e 213 pacientes com outras doenças infecciosas). Além disso, as amostras de outras doenças infecciosas indicaram provável ausência de reação cruzada, pois apenas uma minoria de amostras de pacientes com doença de Chagas possuía anticorpos contra rLb6H e essas respostas foram baixas. Enfim, os resultados obtidos sugerem que a técnica de ELISA utilizando o antígeno rLb6H pode ser consideradoa para uso na rotina do diagnóstico sorológico da LTA. / American tegumentary leishmaniasis (ATL) is caused by various species of protozoan of the genus Leishmania and comprises a group of diseases that present distinct clinical, histopathological and immunological characteristics. The diagnosis is performed based on epidemiological, clinical and pathological features, supported by positive parasitological tests and presence of delayed hypersensitivity to Leishmania antigens. The serological tests used to date have several limitations and therefore it is of great importance to identify recombinant proteins from Leishmania so that they can be tested as potential antigens for the development of techniques for the diagnosis of ATL. In this study, two highly conserved Leishmania recombinant proteins, Lb8E and Lb6H, derived from Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), were used, evaluating their ability to detect antibodies in the serum of several groups of patients by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Recombinant antigens detected 83.3% (Lb8E) and 100.0% (Lb6H) ATL patients, and 95.4% (Lb8E) and 89.4% (Lb6H) visceral leishmaniasis (VL) patients. These reactions with Lb8E and Lb6H were highly specific in healthy subjects. Sera from ATL patients infected with different species of Leishmania, prevalent in Brazil, (Leishmania (Leishmania) amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis and L. (V.) shawi) and samples from patients with other parasitic infections were evaluated for the presence of anti-rLb6H antibodies. In 219 ATL, the sensitivity was 100.0% e the general specificity, considering 68 healthy subjects and 213 patients with other infectious diseases. In addition, samples from other infectious diseases indicated a probable lack of cross-reactivity, as only a minority of samples from patients with Chagas disease had antibodies against rLb6H and all of these responses were low. Finally, the results suggest that the ELISA using rLb6H antigen may be considered for routine use for serological diagnosis of ATL.

A toxoplasmose, protozoose disseminada de baixa morbidade, apresenta número significativo de doença ocular, congênita ou do sistema nervoso central. O diagnóstico é sorológico por diferentes testes, mas limiares baixos e variação individual levam a frequentes problemas. Novos imunoensaios fluorescentes de fase sólida (FLISA) usam a quantificação direta de anticorpos. Aqui, desenvolvemos um FLISA multiplex (FLISAm) para a detecção simultânea de anticorpos IgG e IgM contra Toxoplasma gondii. Após padronização, a eficiência do FLISAm com conjugados comerciais foi feita inicialmente de forma isolada para cada imunoglobulina em 140 amostras de soro de universitários previamente analisadas pelo ELISA IgG/IgM. FLISA IgG mostrou boa concordância (Kappa=0,7088), com sensibilidade de 83,3% e especificidade de 94,2%, enquanto FLISA IgM apresentou boa concordância (K=0,6026), menor sensibilidade de 55,5% e igual especificidade de 98,4%. Foram produzidos novos conjugados fluorescentes de maior especificidade e seu desempenho no FLISAm foi validado em 24 amostras e sua eficiência foi avaliada em 120 amostras conhecidas de soro de gestantes. FLISAm mostrou excelente concordância, tanto para a detecção de anticorpos IgG (K=0.8837, sensibilidade=100,0%, especificidade=87,5%), quanto para a detecção de anticorpos IgM (K=0,9187, sensibilidade=100%, especificidade=99,1%) com excelente reprodutibilidade. O teste desenvolvido é rápido, econômico, de fácil execução, alto rendimento e que pode ser utilizado como método de triagem de soroconversão em mulheres grávidas, útil em aplicações de grande número de amostras como o cuidado pré-natal. / Toxoplasmosis, a disseminated low morbidity protozoan disease, presented significant numbers of affected people, mainly ocular disease, fetal infections or encephalitis in immune deficient patients. Serology is the main diagnosis with commercial antibody assays, but individual variation or low thresholds cause many inconsistencies. New solid phase immunofluorescence assays (FLISA) allows direct antibody quantification in microplates. Here, we developed a multiplex FLISA (FLISAm) for simultaneous detection of IgG and IgM anti-Toxoplasma gondii antibodies. After standardization, the efficiency of this method was initially analyzed in isolated FLISA for each immunoglobulin with commercial conjugates in 140 serum samples of the students previously screened by IgG/IgM ELISA. IgG FLISA showed good concordance (Kappa=0.7088), 83,3% sensitivity and 94,2% specificity, while IgM FLISA also showed good concordance (Kappa=0,6026), lower 55,5% sensitivity and similar 98,4% specificity. New higher efficiency conjugated were prepared and tested in 120 serum samples of the pregnant woman in a same well conjunct IgG/IgM FLISAm. We also validate the FLISAm in 24 serum samples. Compared to isolated ELISA IgG/IgM, FLISAm demonstrated excellent concordance for IgG (Kappa=0.8837; sensitivity=100%; specificity=87,5%,) and IgM (Kappa=0,9187; sensitivity=100%; specificity=99,1%), with excellent reproducibility. The standardized FLISAm is quick, inexpensive, easily performed and high throughput and the assay can be used for screening serum conversion in pregnant women, useful in large numbers applications as antenatal care.

O sorodiagnóstico da toxocaríase humana é geralmente baseado na detecção de anticorpos IgG anti-Toxocara spp. em amostras de soro pelo teste ELISA utilizando os antígenos de excreção-secreção de larvas de T. canis (TES). No entanto, observa-se uma ocorrência de reatividade cruzada com outras helmintíases nas áreas endémicas de poliparasitismo. Vários estudos têm mostrado que as glicanas presentes nos antígenos dos helmintos podem ser as responsáveis pela reatividade cruzada. Neste estudo, avaliamos o efeito da deglicosilação dos antígenos TES na sensibilidade e especificidade dos testes de ELISA e Western-blotting para detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE. Para a deglicosilação dos antígenos TES, estes foram tratados com diferentes concentrações de hidróxido de sódio (NaOH) ou metaperiodato de sódio (NaIO4) e foram testados 58 amostras de soro de pacientes com toxocaríase visceral, 75 amostras de soros de pacientes com outras helmintíases, e 95 amostras de soro de indivíduos saudáveis. Nossos resultados mostraram que os antígenos TES foram totalmente deglicosilados com NaOH 100mM por 4 horas a 37°C (dTES), enquanto que o tratamento com NaIO4 não gerou bons resultados. A sensibilidade e especificidade dos antígenos TES e dTES na detecção de anticorpos IgG pelo teste de ELISA foi de 100%, com menor reatividade cruzada (5,3%) para os antígenos dTES, se comparada com os antígenos TES (13,3%). Todos os pacientes com toxocaríase mostraram anticorpos IgG contra as cinco frações dos antígenos TES (32, 45, 55, 70 e 120 kDa) e contra a única fração de 26kDa dos antígenos dTES, com sensibilidades e especificidades de 100% para ambos os antígenos. A reatividade cruzada, observada com as frações de 70 kDa, 55 kDa e 32 kDa dos antígenos TES, foi eliminada totalmente quando utilizaram-se os antígenos dTES. A detecção de anticorpos IgM pelo teste de ELISA mostrou reatividade inespecífica nos três grupos estudados, com sensibilidades de 39,7% e 34,5% e especificidades de 95,8% e 96,8%, para os antígenos TES e dTES, respectivamente, porém com ocorrência de reatividade cruzada de 24% e 28% para ambos os antígenos. Os três grupos estudados apresentaram reatividade contra quase todas as frações dos antígenos TES e dTES. A detecção de anticorpos IgE apresentou sensibilidades de 63,79% e 62,07% e uma especificidade de 100%, e uma reatividade cruzada de 26,6% e 53,3% para ambos os antígenos. A maioria dos pacientes com toxocaríase (74,1%) mostraram anticorpos contra as frações de 32, 55 e 70 kDa, em quanto que não houve reatividade nos pacientes com outras helmintíases ou nos indivíduos saudáveis. Estes resultados mostraram que a deglicosilação dos antígenos TES permite reduzir a ocorrência de reatividade cruzada nos pacientes com outras helmintíases, elevando o valor diagnóstico da detecção de anticorpos IgG. No entanto, este procedimento não permite melhorar a sensibilidade e especificidade na detecção de anticorpos IgM e não permite elevar a sensibilidade na detecção de anticorpos IgE pelo teste de ELISA. Por outro lado, os resultados discordantes na especificidade do Western-blotting para a detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE sugerem a presença de epítopos conformacionais presentes no estado nativo dos antígenos TES que estariam implicados na reação cruzada observada no teste de ELISA / Serodiagnosis of human toxocariasis is usually based on the detection of anti-Toxocara spp. IgG antibodies in serum samples by ELISA test using T.canis larvae excretory-secretory (TES) antigens. However, a cross-reactivity occurrence is observed in endemic areas of polyparasitism. Many studies have shown that the glycan structures, present in helminth antigens, can be the responsible for the cross-reactivity. In this study, we evaluated the deglycosylation of the TES antigens on the sensitivity and specificity of both the ELISA and Western-blotting for the detection of IgG, IgM, and IgE antibodies. For the deglycosylation of the TES antigens, they were treated with different concentrations of sodium hydroxide (NaOH) or sodium metaperiodate (NaIO4), and 58 serum samples of 58 patients with visceral toxocariasis, 75 serum samples of patients with other helminth infections, and 95 serum samples of healthy individuals. Our results show that the TES antigens were totally deglycosylated with 100 mM NaOH for 4 hours at 37°C (dTES), whereas not good results were obtained with sodium metaperiodate. The sensitivity and specificity of both TES and dTES antigens were 100% in detecting IgG antibodies by ELISA; the cross-reactivity observed with TES antigens (13.3%) was reduced (5.3%) when dTES antigens were used. All toxocariasis patients showed IgG antibodies against the five fractions of TES antigens (32, 45, 55, 70, and 120 kDa), but also with the 26-kDa single fraction of dTES antigens, with sensitivities and specificities of 100% for both antigens. The occurrence of cross-reactivity, observed mainly with the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, was totally eliminated when the dTES antigens were used. The detection of IgM antibodies by ELISA test showed unspecific reactivity in all studied groups, with sensitivities of 39.7% and 34.5%, and specificities of 95.8% and 96.8% for both antigens; the occurrence of cross-reactivity for both antigens were 24% and 28%, respectively. All studied groups have IgM antibodies against almost all fractions of TES antigens and the single fraction of dTES. The detection of IgE antibodies by ELISA test showed sensitivities of 63.8% and 62%, specificities of 100%, and occurrence of reactivity of 26.6% and 53.3% for TES and dTES antigens, respectively. The majority of the toxocariasis patients (74.1%) showed IgE antibodies against the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, whereas there was not reactivity in sera from patients with other helminth infections or healthy individuals. These results showed that the deglycosylation of the TES antigens reduces the occurrence of cross-reactivity in patients with other helminth infections, increasing the diagnostic value for the detection of IgG antibodies. However, this procedure does not improve the sensitivity nor reduces the occurrence of cross-reactivity in the detection of IgM antibodies. Likewise, this procedure does not improve the sensitivity in the detection of IgE antibodies by the ELISA test. On the other hand, the high specificity obtained in the detection of IgG, IgM, and IgE by Western-blotting suggest that conformational epitopes of the TES antigens may also be the responsible for the cross-reactivity in the ELISA test

Canine brucellosis is a zoonotic disease, caused by Brucella canis, which is the main cause of abortion and infertility in dogs. This study had the objective to investigate a B. canis outbreak in a breeding kennel, to describe a multistep approach to characterize the B. canis isolates obtained, and to identify B. canis proteins specifically reacting with antibodies from naturally infected dogs. The kennel was located in São Paulo, SP, Brazil. At the time of sampling, in 2014, the kennel comprised 17 adult Pug dogs. Blood samples were used both to isolate the bacteria and to detect Brucella spp. DNA by the polymerase chain reaction. Serum samples were used to detect antibodies against B. canis using an immunocromatographic test, the rapid slide agglutination test with or without 2-mercaptoethanol and two ELISA kits. The Brucella isolates were characterized through the classical bacteriological tests, mass spectrometry and whole genome sequencing. The total protein content of Brucella isolates was extracted and separated using one and two-dimension polyacrylamide gel electrophoresis (1D and 2D, respectively), and then tested against sera collected from bacteremic, non-bacteremic and non-B. canis infected dogs using western immunoblotting. The reacting protein spots were identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Vaginal discharge, abortion, stillbirth, conception failure and general lymphadenopathy were the clinical signs found in the infected dogs. Gram-negative, coccoid rod-shaped bacteria were isolated from 24 blood samples. Antibodies against B. canis were detected in all dogs at least once by the performed serological tests. Mass spectrometry analysis assigned all isolates to the genus Brucella. The phenotypic data clearly identified the isolates as B. canis with only slight differences in phage typing patterns. The 2D separated protein spots were identified by MALDI-TOF MS as 93 different proteins, out of them, 19 were identified in infected dogs (during the bacteremic and non-bacteremic phases of the infection) and were not identified in non-infected dogs. These proteins have the potential to be used as antigens in serological tests in an attempt to improve the diagnosis of the infection, since a reliable diagnosis is an essential measure for the control and prevention of canine brucellosis. The multistep approach using classical microbiological methods, mass spectrometry and whole genome sequencing allowed the characterization of the B. canis with high discriminatory power, which may be useful for outbreak investigations. / A brucelose canina é uma doença zoonótica, causada pela Brucella canis, que é uma das principais causas de abortamentos e infertilidade em cães. O objetivo deste estudo foi investigar um surto de B. canis em um canil, caracterizar os isolados de Brucella obtidos e identificar proteínas de B. canis reagentes especificamente a anticorpos de cães naturalmente infectados. O canil é localizado em São Paulo, SP, Brasil e no momento da amostragem, em 2014, o canil era composto por 17 cães adultos da raça Pug. Amostras de sangue foram utilizadas tanto para isolar as bactérias quanto para detectar o DNA de Brucella spp. pela reação em cadeia pela polimerase. Amostras de soro foram utilizadas para detectar anticorpos contra B. canis nos soros dos cães, utilizando um teste imunocromatográfico, o teste de soroaglutinação rápida em placa com ou sem 2-mercaptoetanol e dois kits de ELISA. Os isolados foram caracterizados pelos métodos bacteriológicos clássicos, espectrometria de massa e pelo sequenciamento do genoma completo. O conteúdo proteico total dos isolados de B. canis foi extraído e as proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de uma e duas dimensões (1D e 2D, respeectivamente), sendo então testadas frente aos soros dos cães infectados (com ou sem bacteremia) e não infectados, utilizando Western Immunoblotting. Os spots proteicos reagentes foram identificados usando espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Secreção vaginal, aborto, natimorto, falha na concepção e linfoadenopatia foram os sinais clínicos observados nos cães infectados. Coco-bacilos gram-negativos foram isolados em 24 amostras de sangue. Anticorpos contra B. canis foram observadas em todos os cães, em pelo menos uma amostragem, pelos testes sorológicos empregados. A MS atribuiu todos os isolados ao gênero Brucella. Os dados fenotípicos identificaram claramente B. canis com apenas pequenas diferenças nos padrões de lise por fagos. Os spots de proteínas, separados por 2D, foram identificados por MALDI-TOF MS como 93 diferentes proteínas, dentre elas, 19 foram identificadas em cães infectados (com ou sem bacteremia) e não foram identificadas nos cães não infectados. Tais proteínas são candidatas a serem utilizadas como antígenos para o aprimoramento do sorodiagnóstico, uma vez que a existência de um diagnóstico confiável constitui uma medida essencial para o controle e a prevenção da brucelose canina. A abordagem múltipla utilizada, envolvendo métodos microbiológicos clássicos, espectrometria de massa e sequenciamento completo do genoma bacteriano possibilitou a caracterização dos isolados de B. canis com elevado poder discriminatório, o que pode auxiliar em investigações de surtos.

Canine brucellosis is a zoonotic disease, caused by Brucella canis, which is the main cause of abortion and infertility in dogs. This study had the objective to investigate a B. canis outbreak in a breeding kennel, to describe a multistep approach to characterize the B. canis isolates obtained, and to identify B. canis proteins specifically reacting with antibodies from naturally infected dogs. The kennel was located in São Paulo, SP, Brazil. At the time of sampling, in 2014, the kennel comprised 17 adult Pug dogs. Blood samples were used both to isolate the bacteria and to detect Brucella spp. DNA by the polymerase chain reaction. Serum samples were used to detect antibodies against B. canis using an immunocromatographic test, the rapid slide agglutination test with or without 2-mercaptoethanol and two ELISA kits. The Brucella isolates were characterized through the classical bacteriological tests, mass spectrometry and whole genome sequencing. The total protein content of Brucella isolates was extracted and separated using one and two-dimension polyacrylamide gel electrophoresis (1D and 2D, respectively), and then tested against sera collected from bacteremic, non-bacteremic and non-B. canis infected dogs using western immunoblotting. The reacting protein spots were identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Vaginal discharge, abortion, stillbirth, conception failure and general lymphadenopathy were the clinical signs found in the infected dogs. Gram-negative, coccoid rod-shaped bacteria were isolated from 24 blood samples. Antibodies against B. canis were detected in all dogs at least once by the performed serological tests. Mass spectrometry analysis assigned all isolates to the genus Brucella. The phenotypic data clearly identified the isolates as B. canis with only slight differences in phage typing patterns. The 2D separated protein spots were identified by MALDI-TOF MS as 93 different proteins, out of them, 19 were identified in infected dogs (during the bacteremic and non-bacteremic phases of the infection) and were not identified in non-infected dogs. These proteins have the potential to be used as antigens in serological tests in an attempt to improve the diagnosis of the infection, since a reliable diagnosis is an essential measure for the control and prevention of canine brucellosis. The multistep approach using classical microbiological methods, mass spectrometry and whole genome sequencing allowed the characterization of the B. canis with high discriminatory power, which may be useful for outbreak investigations. / A brucelose canina é uma doença zoonótica, causada pela Brucella canis, que é uma das principais causas de abortamentos e infertilidade em cães. O objetivo deste estudo foi investigar um surto de B. canis em um canil, caracterizar os isolados de Brucella obtidos e identificar proteínas de B. canis reagentes especificamente a anticorpos de cães naturalmente infectados. O canil é localizado em São Paulo, SP, Brasil e no momento da amostragem, em 2014, o canil era composto por 17 cães adultos da raça Pug. Amostras de sangue foram utilizadas tanto para isolar as bactérias quanto para detectar o DNA de Brucella spp. pela reação em cadeia pela polimerase. Amostras de soro foram utilizadas para detectar anticorpos contra B. canis nos soros dos cães, utilizando um teste imunocromatográfico, o teste de soroaglutinação rápida em placa com ou sem 2-mercaptoetanol e dois kits de ELISA. Os isolados foram caracterizados pelos métodos bacteriológicos clássicos, espectrometria de massa e pelo sequenciamento do genoma completo. O conteúdo proteico total dos isolados de B. canis foi extraído e as proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida de uma e duas dimensões (1D e 2D, respeectivamente), sendo então testadas frente aos soros dos cães infectados (com ou sem bacteremia) e não infectados, utilizando Western Immunoblotting. Os spots proteicos reagentes foram identificados usando espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Secreção vaginal, aborto, natimorto, falha na concepção e linfoadenopatia foram os sinais clínicos observados nos cães infectados. Coco-bacilos gram-negativos foram isolados em 24 amostras de sangue. Anticorpos contra B. canis foram observadas em todos os cães, em pelo menos uma amostragem, pelos testes sorológicos empregados. A MS atribuiu todos os isolados ao gênero Brucella. Os dados fenotípicos identificaram claramente B. canis com apenas pequenas diferenças nos padrões de lise por fagos. Os spots de proteínas, separados por 2D, foram identificados por MALDI-TOF MS como 93 diferentes proteínas, dentre elas, 19 foram identificadas em cães infectados (com ou sem bacteremia) e não foram identificadas nos cães não infectados. Tais proteínas são candidatas a serem utilizadas como antígenos para o aprimoramento do sorodiagnóstico, uma vez que a existência de um diagnóstico confiável constitui uma medida essencial para o controle e a prevenção da brucelose canina. A abordagem múltipla utilizada, envolvendo métodos microbiológicos clássicos, espectrometria de massa e sequenciamento completo do genoma bacteriano possibilitou a caracterização dos isolados de B. canis com elevado poder discriminatório, o que pode auxiliar em investigações de surtos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-08Bitstream added on 2014-06-13T19:22:37Z : No. of bitstreams: 1 meirellesbartoli_rb_dr_jabo.pdf: 1929206 bytes, checksum: 883e01315443e9cd54216ff593abd250 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo deste trabalho foi analisar os aspectos epidemiológicos da brucelose suína, estudando a disseminação da enfermidade num surto detectado em julho de 2006, em um rebanho em Jaboticabal, no Estado de São Paulo, Brasil. De 271 matrizes examinadas, 254 (93,7%) foram positivas na reação de fixação de complemento (RFC), e de 62 animais da terminação testados, 17 (27,4%) foram positivos na mesma prova. Todos os 33 bovinos, 5 equinos, 126 ovinos e 25 gansos foram negativos no teste do antígeno acidificado tamponado (AAT), porém 3 (23,07%) dos 13 cães da propriedade foram positivos na RFC. Foram colhidas amostras de sangue dos 14 trabalhadores da granja; 3 (21,42%) deles apresentaram títulos de anticorpos contra brucelas lisas na prova de soroaglutinação em tubos, e apenas 1 (7,14%) apresentou sinais clínicos da doença. O biovar 1 de Brucella suis foi cultivado a partir de 14 fetos abortados e de 6 matrizes necropsiadas, e a identificação foi confirmada por provas de rotina. Não foram encontrados anticorpos específicos contra amostras lisas de Brucella em 1.100 amostras sanguíneas de suínos e em 24 de funcionários de um frigorífico do Estado de São Paulo. Foi avaliado o desempenho de 6 técnicas sorológicas, AAT, 2-mercaptoetanol realizado simultaneamente à soroaglutinação lenta (SAL+ME), RFC, antígeno acidificado tamponado após tratamento com rivanol (AAT-RIV), e teste de polarização fluorescente (TPF) no diagnóstico da brucelose suína a partir do soro sanguíneo colhidos de 333 suínos da fazenda do foco e de mais 1.100 animais abatidos no frigorífico. As informações relatadas neste trabalho indicaram que, apesar da redução da incidência da brucelose suína no Brasil, ainda ocorre infecção por B.suis, sendo um risco para a saúde animal e a saúde pública / The purpose of this study was to analyze epidemiological aspects of swine brucellosis, studying an outbreak in a herd in Jaboticabal, State of São Paulo, Brazil, detected in July 2006. Of 271 sows, 254 (93.7%) tested positive by the complement fixation test (CFT), and among 62 randomly bled fattening animals, 17 (27.4%) tested positive. All the 33 cattle, 5 horses, 126 sheep and 25 geese tested negative by the rose Bengal test (RBPT), however, 3 of the 13 dogs in the farm tested positive by the CFT. Blood samples were taken from 14 farm workers; 3 (21.42%) of them had antibody titers to smooth Brucella by the slow agglutination test, and 1 (7.14%) presented clinical signs. B.suis biovar 1 was cultured from 14 aborted fetuses and 6 sows. Brucella identification was accomplished by routine methods. Blood samples were taken from 1,100 pigs and 24 abaittor workers in a slaughterhouse in the state of São Paulo; all the animal and human sera tested negative to smooth Brucella antibodies. The performance of 6 serological tests were evaluated, RBPT, standart tube agglutination test plus mercaptoethanol test (STAT+2-ME), CFT, rose Bengal plate test after serum treatment with rivanol (RBPT-RIV), and fluorescence polarization assay (FPA), for the diagnosis of swine brucellosis in serum samples of 333 pigs from the outbreak and 1,100 pigs from the slaughterhouse. The results showed that, in spite of the reduction of swine brucellosis prevalence in Brazil, B.suis infection still occurs, posing a risk to animal and human health

Submitted by AMANDA CARLA ACIPRESTE GALVÃO null (amanda@milgran.com.br) on 2016-03-12T21:11:16Z No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO AMANDA.pdf: 2810723 bytes, checksum: c44702fbccf1142e637672c1cbccb2dd (MD5) / Rejected by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: No campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” foi informado que seria disponibilizado o texto parcial porém no campo “Data para a disponibilização do texto completo” foi informado que o prazo para disponibilização de texto completo não se aplica por se tratar de texto completo a ser disponibilizado imediatamente. Caso opte pela disponibilização do texto completo selecione no campo “Versão a ser disponibilizada online imediatamente” a opção “Texto completo”. Caso queira disponibilizar imediatamente apenas o texto parcial indique no campo “data para disponibilização do texto completo” o tempo em que apenas a versão parcial estará disponível. Esta opção é utilizada caso você tenha planos de publicar seu trabalho em periódicos científicos ou em formato de livro, por exemplo e fará com que apenas as páginas pré-textuais, introdução, considerações e referências sejam disponibilizadas. Por favor, corrija esta informação realizando uma nova submissão. on 2016-03-14T21:47:46Z (GMT) / Submitted by AMANDA CARLA ACIPRESTE GALVÃO null (amanda@milgran.com.br) on 2016-03-15T16:34:19Z No. of bitstreams: 1 TESE DE DOUTORADO AMANDA.pdf: 2810723 bytes, checksum: c44702fbccf1142e637672c1cbccb2dd (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-15T17:01:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 galvao_aca_dr_jabo.pdf: 2810723 bytes, checksum: c44702fbccf1142e637672c1cbccb2dd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-15T17:01:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 galvao_aca_dr_jabo.pdf: 2810723 bytes, checksum: c44702fbccf1142e637672c1cbccb2dd (MD5) Previous issue date: 2016-01-29 / A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) preocupa as autoridades sanitárias devido ao aumento de sua incidência nos últimos anos, aliado ao fato da situação epidemiológica da enfermidade ser desconhecida na maioria das regiões. Desta forma, o presente estudo objetou realizar o diagnóstico de situação epidemiológica da leishmaniose visceral canina (LVC) no Município de Rio Verde/GO. Para tanto, a pesquisa foi desenvolvida em bairros pré-definidos da região norte do município com a avaliação das condições das três esferas da saúde (animal, humana e ambiental) relacionadas à LVC, por meio de questionários semiestruturados com a participação dos tutores dos animais; a avaliação clínica dos cães e classificação segundo a sintomatologia; a realização do diagnóstico sorológico (ELISA, RIFI e TR DPP) e o geoprocessamento da localidade dos cães reagentes. Na avaliação das condições da saúde animal, os resultados evidenciaram superpopulação canina, especialmente aqueles animais considerados sem controle de mobilidade e sem supervisão, com trânsito livre, sem assistência médicoveterinária. Com relação à saúde humana, destacou-se o convívio íntimo entre o ser humano e o seu animal de estimação, além do agravante do desconhecimento da enfermidade pela população, de seus mecanismos de transmissão, de controle e de prevenção. Sob o olhar ambiental, observou-se problemas de infraestrutura, sendo a falta de saneamento básico a principal delas, além da presença de árvores frutíferas e animais de produção favorecendo o acúmulo de matéria orgânica, facilitando e promovendo o desenvolvimento do vetor. A classificação segundo a avaliação clínica dos cães reagentes (ELISA e RIFI) foi de 65% (13/20) assintomáticos e 35% (7/20) oligossintomáticos. Na avaliação sorológica, 10,38% (55/530) foram reagentes no ELISA, desses 36,37% (20/55) foram reagentes também na RIFI, e desses todas (17/17) as amostras foram consideradas não reagentes no TR DPP®. Os cães positivos no ELISA e RIFI estavam localizados em moradias próximas, reforçando os resultados dos testes. A população, cão e ser humano, e a região estudada apresentam características favoráveis ao desenvolvimento da LVC. Desta forma, existe a necessidade de profissionais capacitados para realizar diagnóstico preciso da enfermidade, iniciando as ações de controle e prevenção, aliado à readequação do protocolo de diagnóstico, pelas autoridades competentes, para as diferentes situações epidemiológicas. / Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is a concern to sanitary authorities due increase on incidence observed recently and lack of knowledge about the disease epidemiological situation in most regions. So, this study focused on to perform epidemiological diagnosis of canine visceral leishmaniasis situation in Rio Verde Municipality, state of Goiás, Brazil. For this purpose, the research was performed in pre-selected neighborhoods in the north region of the municipality embracing all three areas in health (animals, human beings and environment) related to CVL using semi-structured questionnaires to animals’ owners, clinical evaluation of animals and classification according to clinical signs, serological diagnosis (ELISA, RIFI and TR DPP) and geospatial analyses of positive dogs. ). A canine overpopulation, especially on those animals that lives free in streets, without supervision of owners and veterinaries were highlighted. In relation to human health, the close contact among humans and animals and the ignorance about this disease epidemiology, prevention and control by the population were shown. About the environmental situation, infrastructural problems, as the needs of basic sanitation, were observed. Also, fruit trees and production animals’ presence were observed, which favors organic matter accumulation and allows the vector’s development. The clinical classification of the reagents animals (ELISA and RIFI) was 65% (13/20) asymptomatic and 35% (7/20) oligosymptomatic during evaluation on CI. On serological evaluation, 10.38% (55/530) were positive on ELISA and from these animals, 36.37% (20/55) were also positive on RIFI. None of the samples were considered as positive on TR DPP®. The animals considered as positives in ELISA and RIFI were located in nearby houses agreeing with the results of serological tests. The human beings and canine populations in the studied areas have favorable characteristics for the development of CVL. So, trained professionals to perform the disease accurate diagnosis, beginning actions to control and prevention, thus a adjustment of diagnostic protocol, by authorities, to different epidemiological situation.

Orientador: Luis Antonio Mathias / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Maria da Gloria Buzinaro / Banca: Fernando Padilha Poester / Banca: Luis Ernesto Samartino / Resumo: O objetivo deste trabalho foi analisar os aspectos epidemiológicos da brucelose suína, estudando a disseminação da enfermidade num surto detectado em julho de 2006, em um rebanho em Jaboticabal, no Estado de São Paulo, Brasil. De 271 matrizes examinadas, 254 (93,7%) foram positivas na reação de fixação de complemento (RFC), e de 62 animais da terminação testados, 17 (27,4%) foram positivos na mesma prova. Todos os 33 bovinos, 5 equinos, 126 ovinos e 25 gansos foram negativos no teste do antígeno acidificado tamponado (AAT), porém 3 (23,07%) dos 13 cães da propriedade foram positivos na RFC. Foram colhidas amostras de sangue dos 14 trabalhadores da granja; 3 (21,42%) deles apresentaram títulos de anticorpos contra brucelas lisas na prova de soroaglutinação em tubos, e apenas 1 (7,14%) apresentou sinais clínicos da doença. O biovar 1 de Brucella suis foi cultivado a partir de 14 fetos abortados e de 6 matrizes necropsiadas, e a identificação foi confirmada por provas de rotina. Não foram encontrados anticorpos específicos contra amostras lisas de Brucella em 1.100 amostras sanguíneas de suínos e em 24 de funcionários de um frigorífico do Estado de São Paulo. Foi avaliado o desempenho de 6 técnicas sorológicas, AAT, 2-mercaptoetanol realizado simultaneamente à soroaglutinação lenta (SAL+ME), RFC, antígeno acidificado tamponado após tratamento com rivanol (AAT-RIV), e teste de polarização fluorescente (TPF) no diagnóstico da brucelose suína a partir do soro sanguíneo colhidos de 333 suínos da fazenda do foco e de mais 1.100 animais abatidos no frigorífico. As informações relatadas neste trabalho indicaram que, apesar da redução da incidência da brucelose suína no Brasil, ainda ocorre infecção por B.suis, sendo um risco para a saúde animal e a saúde pública / Abstract: The purpose of this study was to analyze epidemiological aspects of swine brucellosis, studying an outbreak in a herd in Jaboticabal, State of São Paulo, Brazil, detected in July 2006. Of 271 sows, 254 (93.7%) tested positive by the complement fixation test (CFT), and among 62 randomly bled fattening animals, 17 (27.4%) tested positive. All the 33 cattle, 5 horses, 126 sheep and 25 geese tested negative by the rose Bengal test (RBPT), however, 3 of the 13 dogs in the farm tested positive by the CFT. Blood samples were taken from 14 farm workers; 3 (21.42%) of them had antibody titers to smooth Brucella by the slow agglutination test, and 1 (7.14%) presented clinical signs. B.suis biovar 1 was cultured from 14 aborted fetuses and 6 sows. Brucella identification was accomplished by routine methods. Blood samples were taken from 1,100 pigs and 24 abaittor workers in a slaughterhouse in the state of São Paulo; all the animal and human sera tested negative to smooth Brucella antibodies. The performance of 6 serological tests were evaluated, RBPT, standart tube agglutination test plus mercaptoethanol test (STAT+2-ME), CFT, rose Bengal plate test after serum treatment with rivanol (RBPT-RIV), and fluorescence polarization assay (FPA), for the diagnosis of swine brucellosis in serum samples of 333 pigs from the outbreak and 1,100 pigs from the slaughterhouse. The results showed that, in spite of the reduction of swine brucellosis prevalence in Brazil, B.suis infection still occurs, posing a risk to animal and human health / Doutor