Das COP9-Signalosom (CSN) ist ein evolutionär konservierter Proteinkomplex. Er besteht aus acht Untereinheiten und wird als Paralog des Lid-Subkomplexes des 26S Proteasoms angesehen. Das CSN verfügt über diverse enzymatische Aktivitäten, die es zu einem regulatorischen Faktor des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) machen. Das UPS ist für den Abbau von einem Großteil der zellulären Proteine notwendig. Für die Proteolyse bestimmter Proteine werden diese mit einer Polyubiquitinkette markiert. Dies geschieht über eine Enzymkaskade von E1, E2s und E3-Ligasen, wobei die E3s die Substratspezifität bestimmen. Die Interaktion von E3s mit dem CSN ist für deren Assemblierung und Aktivität von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren bindet das CSN eine Vielzahl von proteasomalen Substraten und scheint deren Abbau direkt zu kontrollieren. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion des CSN mit dem Mikrotubuli-bindenden Protein EB1 nachgewiesen werden. EB1 wirkt präferentiell an den (+)-Enden von Mikrotubuli und fördert die Polymerisierung und Stabilität von Mikrotubulifilamenten. EB1 bindet über die Untereinheit CSN5 an das CSN. Die Interaktion von EB1 mit dem CSN findet im Centrosom statt und führt zur Phosphorylierung und Stabilisierung von EB1. Eine verminderte Bindung von EB1 an das CSN oder eine reduzierte Phosphorylierung von EB1 führt zu einem beschleunigten Abbau. Die Funktion der Interaktion zwischen EB1 und dem CSN wurde in CSN-siRNA-Zelllinien untersucht. Dazu wurden die Untereinheiten CSN1, 3 und 5 in HeLa-Zellen permanent herunterreguliert. Die siRNAs gegen CSN1 und 3 (siCSN1, siCSN3) führen zur Reduktion des gesamten CSN Komplexes, der Knockdown von CSN5 (siCSN5) nur zur Verminderung von CSN5. In allen drei Zelllinien ist der Abbau von EB1 beschleunigt, was auf eine verminderte Bindung an, bzw. Phosphorylierung durch das CSN zurückzuführen ist. Dies hat Konsequenzen für die Stabilität von Mikrotubulifilamenten in siCSN1- und siCSN3-Zellen. Diese zeigen eine erhöhte Sensibilität gegenüber Nocodazol, welches die Polymerisierung von Mikrotubuli inhibiert. Des Weiteren konnte ein durch Nocodazol ausgelöster Zellzyklusarrest durch die Überexpression von EB1 oder CSN1 in HeLa-Zellen überwunden werden. / The COP9 signalosome (CSN) is an evolutionary conserved protein complex. It consists out of eight subunits and is a paralogue to the lid subcomplex of the 26S proteasome. The CSN posesses several activities, supporting its function as a regulator of the Ubiquitin Proteasome System (UPS). The UPS mediates the degradation of the majority of the cellular proteins. Prior to degradation, a poly-ubiquitin chain is attached to the proteins. This process is catalyzed by a cascade of E1, E2s and E3-ligases. The CSN is a regulator of the E3-ligases, which determine substrate selectivity of the ubiquitination. The CSN also directly binds and thereby controls degradation of several proteasomal substrates. In the present study a direct interaction between the CSN and the microtubule binding protein EB1 is shown, which is mediated by the subunit CSN5. EB1 binds preferentially to the (+)-ends of microtubules and thereby promotes polymerisation rates and enhances the stability of microtubule filaments. The interaction between the CSN and EB1 is localized to the centrosome and results in EB1 phosphorylation and stabilization. A compromised binding of EB1 to the CSN results in an accelerated degradation. For functional studies of the CSN-EB1 interaction in HeLa cells, siRNA mediated knockdowns of CSN subunits were used. The subunits CSN1, CSN3 and CSN5 were knocked down permanently resulting in a faster proteolysis of EB1. This was a result of decreased amounts of CSN complex in cells with downregulated CSN1 and CSN3. The knockdown of CSN5 affects only subunit CSN5 levels causing a compromised binding of EB1 to the CSN complex. An increased sensitivity to the microtubule disrupting agent nocodazole was observed in the CSN1 and CSN3 knockdown cells. A cell cycle arrest induced in HeLa cells by nocodazole treatment was rescued by overexpression of EB1 or CSN1. The data presented in this study suggest a functional relationship of EB1 and the CSN resulting in a stabilization of microtubule filaments.

Das COP9 Signalosom ist ein hochkonservierter Proteinkomplex bestehend, aus acht Untereinheiten. In der vorgelegten Promotionsarbeit konnte ein bislang unbekannter Regulationsmechanismus der Biogenese des COP9 Signalosoms identifiziert werden. Die siRNA-vermittelte Reduktion der CSN1-Expression führte zu einer Reduktion der Expression aller CSN-Untereinheiten. Die Transfektion von His-CSN1 in siCSN1-Zellen induzierte die CSN-Neusynthese und ferner einen Anstieg der c-Myc- und STAT1 Expression. Durch die Stimulation der Zellen mit IFN alpha bzw. IFN gamma konnte die de novo Synthese des CSN-Komplexes induziert werden. Die siRNA-vermittelte Inhibition von STAT1, c-Myc bzw. Lin28B führte ebenso wie die Behandlung der Zellen mit AG9 bzw. AG490, pharmakologischen Inhibitoren der JAK-Kinasen, zu einer Reduktion der Proteinexpression der CSN-Untereinheiten. Dabei standen signifikanten Veränderungen auf der Proteinebene geringfügige Änderungen auf der mRNA-Ebene gegenüber. Daher wurde ein post-transkriptioneller Mechanismus zur Regulation der Expression der CSN-Untereinheiten unter Beteiligung von miRNAs postuliert. Diese Regulation wird vermutlich durch die Aktivität von c-Myc und Lin28B verstärkt. Dies stellt einen neuen, bislang unbekannten Mechanismus für die Regulation der Biogenese des COP9 Signalosoms, vermutlich über den c-Myc/Lin28B/let-7-Weg, dar. Die Co-Transfektion der siCSN1-Zellen mit spezifischen komplementären Inhibitoren dieser miRNAs führte zu einer Induktion der Proteinexpression der CSN-Untereinheiten. Die Transfektion von let-7 miRNA-Mimics bewirkte eine Reduktion der Expression der CSN-Untereinheiten in den siCSN1-Zellen. Ferner konnten im Rahmen dieser Arbeit mittels der miRBase Sanger Datenbank und der Software MicroInspector Bindestellen für let-7 miRNAs an den mRNAs der CSN- und der proteasomalen Lid-Untereinheiten identifiziert werden. Der gezeigte Regulationsmechanismus könnte auch für die Biogenese des proteasomalen Lids von Bedeutung sein. / The COP9 signalosome is a highly conserved protein complex composed of eight subunits. In this study a novel, regulatory mechanism of CSN biogenesis was identified. We used stable transfected siCSN1 cells in which the protein and the mRNA expression of CSN subuntis were downregulated. Transfection of His-CSN1 in those siCSN1 cells led to the induction of the de novo Synthesis of the whole CSN complex. In addition the expression of the transcription factors STAT1 and c-Myc was elevated. The cells were treated with IFN alpha or IFN gamma, respectively. This resulted in the induction of the CSN de novo synthesis. Moreover, the siRNA-mediated inhibition of STAT1, c-Myc, Lin28B as well as treatment with the pharmacological inhibitors AG9 or AG490 led to a reduced protein expression of the analysed CSN subunits. We found that in all experiments there was a significant change on protein level in contrast to a marginal change on the RNA level. Based on our study we hypothesized that the CSN biogenesis ist regulated post-transcriptionally by miRNAs. The participation of miRNAs in the regulation of CSN biogenesis was further analysed. The siCSN1 cells were transfected with complementary hairpin inhibitors of let-7 miRNAs, leading to an induction of the CSN synthesis. The transfection of let-7 miRNA-mimics, which enhance the impact of miRNA on target mRNAs, resulted in an decrease of the CSN expression. These findings prove the involvement of miRNAs in CSN biogenesis, presumably via the c-Myc/Lin28B/let-7 pathway. Furthermore, using miRBase Sanger database and MicroInspector software, potential binding sites for let-7 miRNAs were detected within the mRNA sequences of CSN subunits as well as of subunits of the proteasomal lid. Therefore, there is evidence to suggest that this mechanism is crucial for the regulation of the biogenesis of the proteasomal lid as well.

Das COP9 Signalosom (CSN) ist ein hoch konservierter Proteinkomplex, der an der Regulation des Ubiquitin (Ub)-26S Proteasomsystems (UPS) beteiligt ist. Das UPS ist die wichtigste Proteolysemaschinerie in eukaryotischen Zellen, bei der Proteine über eine dreistufige Kaskade der Enzyme E1-E3 mit einer Ub-Kette markiert werden, die als Erkennungssignal für den Abbau durch das 26S Proteasom dient. Das CSN gilt als Paralog zum Lid, einem Subkomplex des 26S Proteasoms, und interagiert mit einer Vielzahl von Proteinen, unter anderem mit E3-Ligasen und Kinasen. In dieser Arbeit konnte die direkte Bindung des CSN an das 26S Proteasom gezeigt werden, was zu einem Einfluss auf die Peptidaseaktivität des 26S Proteasoms in vitro führt. In Flag-Pulldown-Experimenten aus B8 Mausfibroblasten, die stabil mit Flag-CSN2 transfiziert waren, wurde ein vollständiger Flag-CSN-Komplex nachgewiesen, der mit dem 26S Proteasom assoziiert vorliegt. Co-Immunpräzipitationen beider Komplexe in vitro wiesen auf eine konzentrationsabhängige Verdrängung des Lid-Subkomplexes durch das CSN hin. Diese Interaktion führte zur Reduktion der proteolytischen Aktivität des 26S Proteasoms. Darüber hinaus wurde eine assoziierte deubiquitinierende Aktivität am CSN entdeckt und als USP15 identifiziert. Die Charakterisierung von USP15 zeigte, dass es durch die am CSN assoziierte Kinase CK2 phosphoryliert und stabilisiert wird. Erstmalig konnte durch Inhibitorstudien mit ortho-Phenanthrolin eine Metallabhängigkeit der Aktivität von USP15 nachgewiesen werden, die zur Identifizierung eines bisher unbekannten Zn-Fingers führte. Mutationsanalysen des Zn-Fingers zeigen, dass dieser für die Bindung und Spaltung von Ub-Ketten, nicht aber von linearen Ub-Konstrukten, notwendig ist. In Zellexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass USP15 die E3 Ligase Rbx1 stabilisiert, was vermutlich auf eine Umkehr der Autoubiquitinierung zurückzuführen ist. Das CSN scheint somit sowohl das 26S Proteasom als auch die E3-Ligasen direkt zu beeinflussen. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen eine Vertiefung der Erkenntnisse über das CSN als Regulator des UPS dar. / The COP9 signalosome (CSN) is a conserved protein complex that is involved in the regulation of the ubiquitin (Ub)/26S proteasome system (UPS). The UPS is the most important degradation machinery in eukaryotic cells. By the concerted action of three enzymes, E1-E3, proteins are labelled with a Ub-chain that serves as a recognition signal for the degradation by the 26S proteasome. The CSN is homologous to the lid, a subcomplex of the 26S proteasome, and interacts with numerous proteins, including E3 Ub ligases and kinases. In this study a direct interaction of the CSN with the 26S proteasome could be shown which has consequences for the peptidase activity of the 26S proteasome in vitro. In Flag-pull-down experiments from mouse B8 fibroblasts, that permanently expressed Flag-CSN2, an intact Flag-CSN complex was detected that is associated with the 26S proteasome. Co-immunoprecipitation of both complexes in vitro indicated a concentration-dependent replacement of the lid subcomplex by the CSN. This interaction led to a decrease of the proteolytic activity of the 26S proteasome. Moreover, a deubiquitinating activity associated with the CSN was discovered and identified as USP15. The USP15 was phosphorylated by the CSN-associated kinase CK2 that stabilised the enzyme. For the first time inhibitor studies with ortho-phenanthroline demonstrated a metal-dependency for the activity of USP15 that could be attributed to a formerly unidentified Zn-finger. Mutational analysis of the Zn-finger showed that it is necessary for the binding and cleavage of poly-Ub-chains but not for linear Ub-constructs. Cell culture experiments demonstrated a stabilisation of the E3 ligase Rbx1 by USP15 most likely by reversing its autoubiquitination. Therefore the CSN seems to directly influence the 26S proteasome as well as E3 ligases in their functions. These results expand the present knowledge on the CSN as a regulator of the UPS.

Für die Progression des Wachstums maligner Tumoren und ihre Metastasierung ist die Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden, eine essentielle Voraussetzung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die proangiogenen Transkriptionsfaktoren c-Jun, Id1 und Id3 in ihrer Stabilität gegenüber dem Ubiquitin/26S-Proteasom-System durch das COP9-Signalosom (CSN) kontrolliert werden. Dieses bildet einen multimeren Proteinkomplex, der deutliche Homologien mit dem Lid-Subkomplex des 26S-Proteasoms aufweist. Sowohl c-Jun als auch Id3 binden an die Untereinheit CSN5. Id3 interagiert zusätzlich mit CSN7. Rekombinantes c-Jun, ein bekanntes Substrat der CSN-assoziierten Kinasen CK2 und PKD, wird durch Curcumin, einen Hemmstoff dieser Kinasen, deutlich destabilisiert. Daneben induziert Curcumin hochmolekulare Formen von c-Jun, bei denen es sich höchstwahrscheinlich um Ubiquitin-Konjugate handelt. Ferner beschleunigt Curcumin, ebenso wie die CK2- und PKD-Inhibitoren Emdodin, DRB und Resveratrol, in HeLa-Zellen den proteasomalen Abbau von c-Jun. Die c-Jun-abhängige Produktion von VEGF wird durch alle vier Kinase-Hemmstoffe signifikant reduziert. Verstärkt wird dieser Effekt noch durch den proteasomalen Inhibitor MG-132. Id3 wird nicht von den CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert. Allerdings hemmt es in einem Kinase-Assay die Phosphorylierung von c-Jun, ICSBP und CSN2. Curcumin und Emodin regen in HeLa-Zellen die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von Id3 an. Die Proteolyse von Id1 wird in HeLa-Zellen ebenfalls in Anwesenheit dieser beiden Hemmstoffe stimuliert. Mittels Kotransfektion von Id3 und His-markiertem Ubiquitin konnte eine verstärkte Ubiquitinierung von Id3 in Gegenwart von Curcumin direkt nachgewiesen werden. Außerdem wird Id3 durch die Überexpression von CSN2 stabilisiert. Auf diesen Daten basiert die Schlussfolgerung, dass die CSN-abhängige Phosphorylierung den Abbau von c-Jun und der beiden Id-Proteine über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System inhibiert und dadurch ein interessantes neues Ziel einer antiangiogenen Tumortherapie repräsentiert. / Angiogenesis, the formation of new blood vessels from the existing vasculature, is a prerequisite for the progression of solid tumor growth and metastasis. In this study it is shown that the COP9 signalosome (CSN) regulates the stability of the angiogenic transcription factors c-Jun, Id1 and Id3 towards the ubiquitin/26S proteasome system. The COP9 signalosome constitutes a multimeric protein complex that shares sequence homology with the 26S proteasome lid complex. Both c-Jun and Id3 physically interact with the CSN subunit CSN5. In addition, Id3 can bind to CSN7. Recombinant c-Jun, a substrate of the CSN-associated kinases CK2 und PKD, is destabilized by curcumin, an inhibitor of these two kinases. Furthermore, curcumin induces high molecular weight c-Jun species, most likely ubiquitin conjugates. All tested inhibitors of the CK2 and PKD, emodin, DRB, resveratrol, as well as curcumin accelerate the degradation of c-Jun by the 26S proteasome in HeLa cells. The c-Jun-dependent expression of VEGF, the most potent angiogenic factor, is significantly reduced by the four kinase inhibitors. MG-132, an inhibitor of the 26S proteasome, also diminishes the production of VEGF. Id3 is not phosphorylated by the CSN-associated kinases. However, it inhibits c-Jun, ICSBP and CSN2 phosphorylation. Curcumin and emodin significantly induce ubiquitination and proteasome-dependent degradation of Id3 in HeLa cells. Proteasome-dependent degradation Id1 in HeLa cells is also stimulated by treatment with curcumin or emodin. Ubiquitination of Id3 is shown directly by cotransfection of HeLa cells with Id3 and His-tagged ubiquitin. Curcumin increases Id3-ubiquitin conjugate formation. In addition, overexpression of CSN2 leads to stabilization of Id3 protein. On the basis of these data it is concluded that CSN-mediated phosphorylation inhibits ubiquitination and proteasome-dependent degradation of c-Jun, Id1 and Id3. The COP9 signalosome thus represents an interesting new target for antiangiogenic tumor therapy.

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