Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-11T14:41:32Z No. of bitstreams: 1 2008_IsabelaTristanLourenco.pdf: 848788 bytes, checksum: 214c95dbc0900473fba14a30a8fbb720 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-07-27T16:43:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_IsabelaTristanLourenco.pdf: 848788 bytes, checksum: 214c95dbc0900473fba14a30a8fbb720 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-27T16:43:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_IsabelaTristanLourenco.pdf: 848788 bytes, checksum: 214c95dbc0900473fba14a30a8fbb720 (MD5) Previous issue date: 2008-10 / Fitonematóides são responsáveis por grandes perdas econômicas na agricultura mundial estimadas em US$ 125 bilhões anuais. Esses fitopatógenos têm seu ciclo de vida dividido em seis estádios de desenvolvimento (ovo, juvenil 1-4 e adulto), durando em torno de 28 dias. O juvenil 2 penetra na raiz de planta hospedeira por força mecânica e degradação enzimática para estabelecer a interação planta-patógeno e se diferenciar em fêmea adulta apomítica, depositando em torno de 2000 ovos. Práticas agronômicas têm tido geralmente pouco sucesso e alto custo, sendo o cultivo de variedades resistentes, quando existentes, a forma mais eficiente de controle. Uma estratégia alternativa promissora é a transformação genética de plantas para expressão de moléculas que afetem o parasitismo. A metodologia de RNA interferente tem revolucionado a pesquisa experimental e muitas aplicações biotecnológicas estão sendo desenvolvidas. A abordagem planejada é a transformação genética de icotiana tabacum com construções plasmidiais para expressão de RNA dupla fita, tendo como propósito o silenciamento dos genes-alvo Isocitrato Liase, Arginina Quinase, Proteína 14-3-3 e Proteína de choque térmico 90 de Meloidogyne incognita. Desses genes-alvo, quatro fragmentos gênicos foram selecionados, isolados, subclonados em vetor para RNAi e estão em fase de transformação de planta, para futura realização de bioensaios avaliação de resistência a fitonematóides. Adicionalmente, foi realizada uma análise da expressão dos quatro genes-alvo, normalizados com os genes constitutivos de β- actina e 18S rRNA, por PCR quantitativo em tempo real. Observou-se que alguns genes-alvo são diferencialmente expressos quando comparados as fases de ovo, juvenil 2 e fêmea. A maior diferença de expressão foi do gene codificador de Isocitrato Liase, que é 100 vezes mais expresso em ovo e fêmeas, comparado com J2. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Plant parasitic nematodes are responsible for huge economic losses in world agriculture that reaches US$ 125 billion yearly. The most important of these phytopatogens, Meloidogyne incognita, has six developmental stages during the life cycle (egg, four juveniles and female). The juvenile 2 enters the host root via mechanical force and enzymatic degradation to establish the host-pathogen interaction and differentiate in apomitic adult female, which deposits 2000 eggs. Current agronomic practices have usually been unsuccessful and expensive, so the cultivation of resistant varieties is actually the most efficient way to control nematodes. In this work, it was chosen to transform icotiana tabacum using plasmidial constructions for double strand RNA expression, aiming silencing target genes Isocitrate Lyase, Arginine Kinase, 14-3-3 Protein and Heat Shock Protein 90 of Meloidogyne incognita. Four regions of target genes were selected, isolated, subcloned in RNAi vector and are being used for plant transformation. In addition, it was done an expression analysis of the four target genes, normalized with housekeeping genes β- actin e 18S rRNA, using quantitative real time PCR. This experiment showed that these genes are differentially expressed when compared during egg, J2 and female phases. The major expression difference observed was the Isocitrate Lyase gene, which is a hundred times more expressed in egg or female when compared with J2.

LIMA, A.B.de. Respostas Oxidativas em Plantas de Arroz Duplamente Silenciadas em APX Citosólica Submetidas a Estresses Abióticos. 117 f. 2011. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Aline Nascimento (vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T18:54:07Z No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Nascimento(vieiraaline@yahoo.com.br) on 2013-05-20T19:17:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-20T19:17:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tes_abdelima.pdf: 2803999 bytes, checksum: ab4a07dd7f7f49300f45b71a76c43628 (MD5) Previous issue date: 2011 / O H2O2 é tido como molécula sinalizadora de vários eventos celulares e seu nível endógeno é controlado pelas diferentes isoformas de APX e CAT que estão distribuídas na célula vegetal. No presente estudo, foram utilizadas diferentes abordagens visando um melhor entendimento do papel das isoformas citosólicas de APX, consideradas por muitos autores as isoformas mais importantes dentre as APXs, e sua sincronia com CAT, tendo em vista que estas são as principais removedoras do H2O2 intracelular. Inicialmente, foi observado que plantas de arroz submetido à combinação de estresse salino e alta temperatura apresentaram modulação positiva da atividade de APX associada com menor acúmulo de H2O2. Intrigantemente, plantas duplamente silenciadas nas isoformas de APX citosólica (APx1/2s) apresentaram desenvolvimento normal em condições controle. Em condições estressantes, as APx1/2s exibiram um mecanismo antioxidativo compensatório mediado principalmente pelas isoformas de GPX citosólica e cloroplástica juntamente com antioxidantes não enzimáticos. Além disso, as APx1/2s submetidas a inibição irreversível de CAT apresentaram melhor desempenho fotossintético e menores danos oxidativos que plantas que continham a APX citosólica, CAT ou ambas indicando que outros mecanismos compensatórios foram ativados para mitigar os possíveis efeitos negativos do acúmulo de H2O2. Tomados em conjunto, os dados indicam que as isoformas citosólicas de APX não são as enzimas mais importantes no controle dos níveis de H2O2, visto que plantas com ausência destas isoformas completam o ciclo de vida e são capazes de enfrentar situações de estresse. Além disso, é possível afirmar que a ação coordenada das isoformas de GPX, juntamente com ascorbato e glutationa reduzidos, podem ser os responsáveis pela manutenção do equilíbrio redox celular em condições estressantes em plantas de arroz, diferente do que é noticiado para a planta-modelo Arabdopsis.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T18:35:05Z No. of bitstreams: 1 juliana_f_lopes_ioc_bcm_0034_2010.pdf: 2515209 bytes, checksum: 7753044e364addb6c4a32fb5a7c5b298 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-26T18:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juliana_f_lopes_ioc_bcm_0034_2010.pdf: 2515209 bytes, checksum: 7753044e364addb6c4a32fb5a7c5b298 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O vírus da hepatite A (HAV) possui genoma RNA de fita simples de 7,5 Kb e polaridade positiva. Este vírus pertence à família Picornaviridae, gênero Hepatovirus, com propriedades biológicas únicas, em particular, o crescimento lento em cultura celular com ausência de efeito citopático. O HAV causa uma infecção autolimitada normalmente com pouco ou nenhum sintoma em pacientes jovens (abaixo de 5 anos). Já em pacientes adultos, sintomas graves podem aparecer com 1% dos casos podendo evoluir para uma hepatite fulminante. A inibição da replicação viral pode retardar a infecção pelo vírus prevenindo uma hepatite fulminante. Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) que agem com base na degradação seqüência-específica do genoma, pode constituir uma nova estratégia para a inibição específica de vários tipos de vírus. A interferência por siRNA é um processo onde fitas duplas de RNA (dsRNA) são capazes de silenciar as funções específicas de um gene alvo. A via de siRNA pode ser induzida em células por transfecção de oligômeros sintéticos de 21-23 nucleotídeos. O objetivo deste estudo foi avaliar o silenciamento produzido por três seqüências específicas de siRNAs, uma para região 2C (helicase), e duas para 3D (protease) do genoma do HAV. Vinte e quatro horas antes da transfecção, células FRHK-4 foram cultivadas em placas de 24 poços, com meio 199 e densidade de 10 5 células por poço. Em seguida, as células foram transfectadas por 4 horas com cada siRNA e suas combinações. Após isto, as células foram infectadas com o HAV (10 5 cópias/ml) e cultivadas por cinco dias consecutivos à 37°C. Seqüências não-específicas foram utilizadas como controle negativo. O RNA total foi extraído e a análise foi realizada por RT-PCR, sendo o silenciamento confirmado por imunofluorescência. Todas as seqüências mostraram-se com capacidade inibitória. A melhor taxa de silenciamento ocorreu no segundo dia com as três sequências em conjunto, atingindo 85% de inibição da replicação viral. Tal resultado foi confirmado pela diminuição da intensidade da fluorescência para o HAV. As combinações foram mais eficazes do que cada sequência utilizada isoladamente. Os siRNAs foram eficazes na diminuição da expressão da helicase e protease do HAV / Hepatitis A virus (HAV) has a single-stranded RNA genome of 7.5 kb with positive polarity.This virus belongs the Picornaviridae family, genus Hepatovirus with unique biological properties, in particular, slow growth in cell culture without cytopathic effect. HAV causes a self-limiting liver infection with usually mild or no symptoms in young patients. Whereas adult patients might suffer from severe symptoms and 1% of cases can evolue to fulminant hepatitis. Inhibition of viral replication can improve viral infection and thus prevent fulminant failure. Small interference RNA (siRNA) based on specific sequence may present a novel and specific approach strategy for inhibit of various types of virus. RNA interference is a process by double-stranded (dsRNA) is able to silence specific gene functions. The siRNA pathway can be induced in mammalian cells by transfection of short synthetic sequence-specific oligomers with 21-23 nucleotides. The aim of this study was to evaluate the silencing produced by three specific sequences of siRNAs, one for region 2C (helicase), and two for 3D (protease) of the HAV. Twenty-four hours before transfection, FRHK-4 cells were cultivated in 24-well plate in 199 medium with density of 10 5 cells per well. After that, cells were transfected for 4 hours with each siRNA and its combinations following by infection with HAV (10 5 cópies/ml) and grown for five consecutive days. Non-specific sequences were used as negative control. The total RNA was extracted (with commercial kit) and analysis was performed by RT-PCR and silencing was confirmed by immunofluorescence. All sequences showed inhibitory capacity. The best silencing occurred in the second day using the three sequences together reaching 85% of inhibition viral replication. This result was confirmed with the decrease in fluorescence intensity for HAV. The combination of the sequences was more effective than the sequences used alone. The siRNAs could knockdown the expression of helicase and protease of HAV

Orientador: Jayme Augusto de Souza Neto / Resumo: Aedes aegypti é a espécie de mosquito emergente em áreas urbanas com maior impacto na saúde pública, sendo o principal vetor dos arbovírus dengue, Zika e chikungunya. Por esse motivo, se faz indispensável a compreensão de mecanismos moleculares associados a processos fisiológicos em A. aegypti, como resposta imune, comportamento e homeostase intestinal. Conforme observado em outros organismos, a via PI3K/AKT tem papéis importantes no metabolismo, na reprodução, na tolerância ao estresse e na imunidade. A quinase AKT atua como um regulador negativo da via PI3K/AKT, fosforilando o fator de transcrição FOXO e impedindo sua translocação nuclear. Nosso objetivo foi avaliar o perfil transcricional em A. aegypti com o gene akt silenciado e avaliar as consequências deste silenciamento sobre a microbiota bacteriana. Além disso, investigamos uma provável ativação mitocondrial quando do silenciamento de akt. Mostramos que o silenciamento de akt resultou na ativação de genes essenciais para a manutenção da homeostase intestinal do mosquito, como peptídeos antimicrobianos (AMPs) e genes codificadores de enzimas associadas à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Notavelmente, observou-se uma forte repressão de 11 profenoloxidases (PPOs), além de uma potente indução de genes codificadores de subunidades da enzima NADH desidrogenase, em comparação com o respectivo grupo controle, sugerindo que tal indução esteja associada a um provável aumento da atividade mitocondrial. No context... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Aedes aegypti is the emerging mosquito species in urban areas with the greatest impact on public health, being the main vector of arboviruses dengue, Zika and chikungunya. For this reason, it is essential to understand the molecular mechanisms associated with physiological processes in A. aegypti, such as immune response, behavior and intestinal homeostasis. As observed in other organisms, the PI3K / AKT pathway has important roles in metabolism, reproduction, stress tolerance and immunity. AKT kinase acts as a negative regulator of the PI3K / AKT pathway, phosphorylating the FOXO transcription factor and preventing its nuclear translocation. Our objective was to evaluate the transcriptional profile in A. aegypti with the silenced akt gene and to evaluate the consequences of this silencing on the bacterial microbiota. In addition, we investigated a possible mitochondrial activation during the akt silencing. We have shown that akt silencing resulted in the activation of essential genes for the maintenance of mosquito intestinal homeostasis, such as antimicrobial peptides (AMPs) and genes encoding enzymes associated with the production of reactive oxygen species (ROS). Notably, a strong repression of 11 profenoloxidases (PPOs) was observed, as well as a potent induction of genes encoding subunits of the NADH dehydrogenase enzyme, in comparison with the respective control group, suggesting that such induction is associated with a possible increase in mitochondrial activity. In t... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: capítulos I, II e III. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-29T16:49:59Z No. of bitstreams: 1 2015_RayssaAlmeidaGarcia_Parcial.pdf: 404317 bytes, checksum: 9c6cd5a3cdd519dad13504c7fdb4b4e4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-07-20T12:06:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_RayssaAlmeidaGarcia_Parcial.pdf: 404317 bytes, checksum: 9c6cd5a3cdd519dad13504c7fdb4b4e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-20T12:06:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_RayssaAlmeidaGarcia_Parcial.pdf: 404317 bytes, checksum: 9c6cd5a3cdd519dad13504c7fdb4b4e4 (MD5) / O algodão é uma das principais commodities da economia brasileira, alavancando o País ao posto de quinto maior produtor mundial. Entre as diferentes pragas da cotonicultura, o bicudo-do-algodoeiro é o inseto-praga mais destrutivo. Pela biotecnologia, um dos métodos alternativos de controle de insetos-praga é o silenciamento gênico, por meio do RNA interferente. Contudo, em insetos, absorção do RNA fita dupla (dsRNA) produzidos por plantas é dificultada, principalmente em decorrência da clivagem do dsRNA na planta e da ação de nucleases presentes no intestino dos insetos. Assim, os objetivos do presente estudo foram estudar o papel de nucleases intestinais de Anthonomus grandis na degradação do dsRNA e aumentar a estabilidade das moléculas de dsRNA. Primeiramente, a atividade nucleásica ácida foi detectada no homogenato intestinal de A. grandis. Por meio da busca no transcritoma de A. grandis foram encontradas três contigs codificadores de nucleases, denominados AgNuc1, AgNuc2 e AgNuc3, cujas sequências foram caracterizadas e validadas por RNAi. As três sequências apresentaram similaridade acima de 50 % em relação às outras nucleases de insetos. A análise por qPCR demonstrou que AgNuc2 e AgNuc3 foram altamente expressas no intestino de A. grandis. O silenciamento específico de AgNuc2 culminou na redução da degradação do dsRNA; demonstrando ser a principal nuclease associada à degradação de dsRNA no lúmen intestinal de A. grandis. Além disso, visando aumentar a estabilidade do dsRNA, foram desenhados dsRNAs, baseados na arquitetura de viróide, que são resistentes à ação de nucleases. A análise do movimento de dsRNA-viróide marcado com Cy3 no sistema vascular de Arabidopsis thaliana demonstrou uma localização celular específica para a estrutura do dsRNA. O dsRNA baseado na arquitetura da família Pospiviroidae, foi localizado no núcleo das células, enquanto que o dsRNA, baseado na arquitetura da família Avsunviroidae, foi localizado nos cloroplastos das células. Os dsRNAs estabilizados mostraram uma capacidade de silenciamento gênico 8 vezes superior, quando comparado ao dsRNA linear não estruturado Os dados aqui gerados contribuem para o conhecimento do mecanismo de RNAi em insetos e demonstram que as moléculas de dsRNA estabilizados apresentam grande potencial para a aplicabilidade da tecnologia do RNAi visando o controle de insetos-praga. / Cotton is one of the most important Brazilian commodities and Brazil is the fifth largest world producer. Nonetheless, productivity is constantly crippled by a variety of agricultural pests. Among the different cotton insect pests, cotton boll weevil is the most destructive. By using biotechnology strategies, one of the alternative methods for controlling crop pests is gene silencing through RNA interference. However, in insects, the absorption of double stranded RNA produced by plants is hampered due to dsRNA cleavage in plants tissues and due to the presence of insect gut nucleases. In this context, the objects of this study were to investigate the dsRNA degradation by Anthonomus grandis gut nucleases and improve the stability of dsRNA. Nucleasic activity was detected in A. grandis intestinal homogenate. After searching in A. grandis transcriptome, three contigs codifying nucleases were found, called AgNuc1, AgNuc2 and AgNuc3, whose sequences were characterized and validated by RNAi. The three sequences showed similarity above 50% when compared to other insect nucleases. qPCR analysis showed that AgNuc2 and AgNuc3 are highly expressed in A. grandis midgut. AgNuc2 gene silencing resulted on reduction of dsRNA degradation; thereby, we concluded that AgNuc2 is the main nuclease associated with dsRNA degradation in A. grandis gut lumen. Additionally, in order to increase dsRNA stability, dsRNA with viroid architecture were designed, wich are resistant to plant nucleases. Viroid-dsRNA were marked with Cy3 and analysed regarding their movement in A. thaliana vascular system, wich showed that they are adressed to a specif cellular localization. dsRNA based on Pospiviroidae family architecture was located on cell nuclei while dsRNA based on Avsunviroidae family was located in chloroplasts. Moreover, these stabilized dsRNAs showed high gene silencing activity, eight times higher than linear dsRNA. The data here generated contribute to our understandings of RNAi mechanisms in insects and show that stabilized dsRNAs exhibit great pontential in RNAi applicability aiming crop insect pest control.

Submitted by BRUNO TINOCO NUNES (croookes@gmail.com) on 2018-09-25T16:26:37Z No. of bitstreams: 1 Tese_Bruno_Tinoco_25_09_2018.pdf: 4179397 bytes, checksum: eb771bc06b406e51cb4c11fd78aa1814 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-09-25T16:43:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_bt_dr_bot.pdf: 4179397 bytes, checksum: eb771bc06b406e51cb4c11fd78aa1814 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-25T16:43:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_bt_dr_bot.pdf: 4179397 bytes, checksum: eb771bc06b406e51cb4c11fd78aa1814 (MD5) Previous issue date: 2018-07-23 / Outra / Aedes aegypti é a espécie de mosquito emergente em áreas urbanas com maior impacto na saúde pública, sendo o principal vetor dos arbovírus dengue, Zika e chikungunya. Por esse motivo, se faz indispensável a compreensão de mecanismos moleculares associados a processos fisiológicos em A. aegypti, como resposta imune, comportamento e homeostase intestinal. Conforme observado em outros organismos, a via PI3K/AKT tem papéis importantes no metabolismo, na reprodução, na tolerância ao estresse e na imunidade. A quinase AKT atua como um regulador negativo da via PI3K/AKT, fosforilando o fator de transcrição FOXO e impedindo sua translocação nuclear. Nosso objetivo foi avaliar o perfil transcricional em A. aegypti com o gene akt silenciado e avaliar as consequências deste silenciamento sobre a microbiota bacteriana. Além disso, investigamos uma provável ativação mitocondrial quando do silenciamento de akt. Mostramos que o silenciamento de akt resultou na ativação de genes essenciais para a manutenção da homeostase intestinal do mosquito, como peptídeos antimicrobianos (AMPs) e genes codificadores de enzimas associadas à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Notavelmente, observou-se uma forte repressão de 11 profenoloxidases (PPOs), além de uma potente indução de genes codificadores de subunidades da enzima NADH desidrogenase, em comparação com o respectivo grupo controle, sugerindo que tal indução esteja associada a um provável aumento da atividade mitocondrial. No contexto comportamental, o transcriptoma de A. aegypti com o gene akt silenciado revelou a modulação de 5 odorant binding proteins (OBPs), das quais todas foram reprimidas no quarto dia após o silenciamento de akt. Além das OBPs, identificamos duas long wavelengh sensitive opsins, ambas reprimidas após dois e quatro dias. Interessantemente, observamos que, dos 345 genes modulados, a grande maioria foi regulada negativamente. O silenciamento de akt, além de modular a carga da microbiota bacteriana de A. aegypti, também modulou táxons específicos após quatro dias de silenciamento, como as Classes Gammaproteobacteria e Betaproteobacteria. Nosso conjunto de dados coloca a via PI3K/AKT no cerce de importantes processos fisiológicos, contribuindo para elucidar mecanismos moleculares até então pouco compreendidos do mosquito. / Aedes aegypti is the emerging mosquito species in urban areas with the greatest impact on public health, being the main vector of arboviruses dengue, Zika and chikungunya. For this reason, it is essential to understand the molecular mechanisms associated with physiological processes in A. aegypti, such as immune response, behavior and intestinal homeostasis. As observed in other organisms, the PI3K / AKT pathway has important roles in metabolism, reproduction, stress tolerance and immunity. AKT kinase acts as a negative regulator of the PI3K / AKT pathway, phosphorylating the FOXO transcription factor and preventing its nuclear translocation. Our objective was to evaluate the transcriptional profile in A. aegypti with the silenced akt gene and to evaluate the consequences of this silencing on the bacterial microbiota. In addition, we investigated a possible mitochondrial activation during the akt silencing. We have shown that akt silencing resulted in the activation of essential genes for the maintenance of mosquito intestinal homeostasis, such as antimicrobial peptides (AMPs) and genes encoding enzymes associated with the production of reactive oxygen species (ROS). Notably, a strong repression of 11 profenoloxidases (PPOs) was observed, as well as a potent induction of genes encoding subunits of the NADH dehydrogenase enzyme, in comparison with the respective control group, suggesting that such induction is associated with a possible increase in mitochondrial activity. In the behavioral context, the A. aegypti transcriptome with the mutated akt gene revealed the modulation of 5 odorant binding proteins (OBPs), all of which were repressed on the fourth day after akt silencing. In addition to the OBPs, we identified two long wavelengh sensitive opsins, both repressed after two and four days. Interestingly, we observed that of the 345 modulated genes, most were down-regulated. The silencing of akt, besides modulating the bacterial microbiota load of A. aegypti, also modulated specific taxa after four days of silencing, such as the Gammaproteobacteria and Betaproteobacteria classes. Our data set puts the PI3K / AKT pathway in the vicinity of important physiological processes, contributing to elucidate the mosquito's poorly understood molecular mechanisms.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2011-06-13T18:57:55Z No. of bitstreams: 1 2010_MariaLainePenhaTinoco.pdf: 5054232 bytes, checksum: 30658ac8cfaf7157c5a40d4216ab99ed (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-20T13:58:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_MariaLainePenhaTinoco.pdf: 5054232 bytes, checksum: 30658ac8cfaf7157c5a40d4216ab99ed (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-20T13:58:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_MariaLainePenhaTinoco.pdf: 5054232 bytes, checksum: 30658ac8cfaf7157c5a40d4216ab99ed (MD5) / Transcritos de RNA auto complementar formam um RNA dupla fita (dsRNA) que aciona uma degradação de uma seqüência específica de RNA mensageiro (mRNA), em um processo conhecido como RNA (RNAi) interferente levando ao silenciamento gênico. Em plantas vasculares, o tráfico de moléculas de RNAi ocorre entre células e sistemicamente por toda a planta. Sinais de RNAi pode espalhar sistematicamente ao longo de uma planta, mesmo em enxertos transgênicos sobre cavalos não-transgênicos. Há também um grande interesse na aplicação do RNAi para fungos patogênicos. A inibição específica da expressão gênica por RNAi tem se mostrado adequado para uma grande variedade de fungos filamentosos fitopatogênicos, no entanto, o silenciamento por dsRNA / siRNA não foi observado in vivo. Este estudo demonstra pela primeira vez o fenômeno de interferência in vivo no fungo patogênico Fusarium verticillioides, em que a expressão de um transgene foi especificamente silenciado pela inoculação de células do micélio em plantas transgênicas de fumo transformadas geneticamente para expressar pequenos RNAs de interferência (siRNA) a partir de um dsRNA correspondente ao transgene. Estas resultados fornecem uma poderosa ferramenta para estudos sobre a interação molecular plantapatógenos, e interações simbióticas. Do ponto de vista biotecnológico, silenciamento de genes de fungos por geração de siRNAs no hospedeiro fornece uma nova ferrameta para o desenvolvimento de estratégias de resistência de fungos nas plantas e outros organismos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Self-complementary RNA transcripts form a double-stranded RNA (dsRNA) that triggers a sequence-specific mRNA degradation, in a process known as RNAinterference (RNAi), leading to gene silencing. In vascular plants, RNAi molecules trafficking occur between cells and systemically throughout the plant. RNAi signals can spread systemically throughout a plant, even across graft junctions from transgenic to non-transgenic stocks. There is also a great interest in applying RNAi to pathogenic fungi. Specific inhibition of gene expression by RNAi has been shown to be suitable for a multitude of phytopathogenic filamentous fungi; however, dsRNA/siRNA silencing effect has not been observed in vivo. This study demonstrates for the first time the in vivo interference phenomenon in the pathogenic fungus Fusarium verticillioides, in which expression of an individual fungal transgene was specifically abolished by inoculating mycelial cells in transgenic tobacco plants engineered to express small interfering RNAs (siRNA) from a dsRNA corresponding to the particular transgene. The results provide a powerful tool for further studies on molecular plant-microbe and symbiotic interactions. From a biotechnological perspective, silencing of fungal genes by generating siRNAs in the host provides a novel strategy for the development of broad fungi-resistance strategies in plants and other organisms.

Submitted by Andressa Lima (andressa@uepb.edu.br) on 2017-08-22T18:37:37Z No. of bitstreams: 1 PDFC-DISSERTAÇÃO - ANDRÉA MARQUES DA SILVA.pdf: 17209461 bytes, checksum: 8500ed2ff9ea225a0ccaeb56c8948d49 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Medeiros (luciana@uepb.edu.br) on 2017-08-25T16:18:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDFC-DISSERTAÇÃO - ANDRÉA MARQUES DA SILVA.pdf: 17209461 bytes, checksum: 8500ed2ff9ea225a0ccaeb56c8948d49 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-25T16:18:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDFC-DISSERTAÇÃO - ANDRÉA MARQUES DA SILVA.pdf: 17209461 bytes, checksum: 8500ed2ff9ea225a0ccaeb56c8948d49 (MD5) Previous issue date: 2016-11-30 / UEPB / Este trabajo tiene como objetivo analizar el silenciamiento de los personajes de la novela las víctimas verdugos: las imágenes de la esclavitud, de el escritor Joaquim Manuel de Macedo, una obra escrita en 1869. En el primer capítulo discutiremos sobre el contexto y con la condición de que la obra fue escrita, en seguida, con basado en los estudios del análisis del discurso francés propuesto por Pêcheux (1990), Orlandi (2007, 2012) y Maingueneau (2014) tratamos de analizar el ethos del narrador tratando de mostrar cómo se construye una imagen de sí mismo y del lector a enunciar las tres "historias" que componen la novela, a saber: Simeão el criollo; Pai Raiol, el brujo; Lucinda, la criada. En el segundo capítulo tomaremos un análisis de representación de los caracteres de cada novela, por acercarse a los rasgos característicos de la obra, sobre todo su carácter pre-naturalista y cómo las ideas científicas que circularon en la mitad del siglo XIX como el determinismo racial, el darwinismo social y la ideología de blanqueo contribuyó al silencio y los estereotipos caracteres negros esclavizados al trabajo. En el tercer capítulo se busca discutir el concepto de interdicción com base en los estudios desarrollados por el investigador Orlandi (1990) tratando de mostrar el análisis del corpus que da paso a un silenciamiento de caracteres negros y esclavizado en el trabajo. A continuación se analiza la posición del cuerpo de los personajes de la novela en el análisis en busca poner de relieve sus formas y estrategias de resistencia utilizados por una clase subalternizada que ser silenciado la creación de estrategias de resistencia de la posición del cuerpo. / Este trabalho tem como objetivo geral analisar o silenciamento dos personagens da obra As Vítimas Algozes: quadros da escravidão, do escritor Joaquim Manuel de Macedo, obra escrita em 1869. No primeiro capítulo, discorremos acerca do contexto e sob que condição a obra foi escrita. Em seguida, com base nos estudos da Análise do Discurso Francesa, difundida por Pêcheux (1990), Orlandi (2007, 2012) e Maingueneau (2014), procuramos analisar o ethos do narrador, tentando evidenciar de que maneira ele constrói uma imagem de si mesmo e do leitor, ao enunciar as três "estórias" que compõem o nosso corpus, a saber: “Simeão, o crioulo”; “Pai Raiol, o feiticeiro”; “Lucinda, a mucama”. No segundo capítulo, fizemos uma análise representacional dos personagens de cada novela, procurando abordar traços característicos da obra, sobretudo, o seu caráter pré-naturalista, e de que forma as ideias científicas, que circulavam em meados do século XIX, como o determinismo racial, o darwinismo social e a ideologia do branqueamento, contribuíram para silenciar e estereotipar os personagens negros escravizados da obra. No terceiro capítulo, discutimos o conceito de interdito, com base nos estudos desenvolvidos pela pesquisadora Orlandi (2007), tentando evidenciar, no corpus em análise, de que maneira se dá o silenciamento dos personagens negros e escravizados na obra. Em seguida, analisamos o posicionamento corporal dos personagens das três novelas que compõem o romance em análise, procurando evidenciar os modos e estratégias de resistência utilizada pelos negros escravizados e que, ao serem silenciados, criavam estratégias de resistência, a partir de seus posicionamentos corporais.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A expressÃo heterÃloga de genes que codificam proteÃnas relacionadas à patogÃnse (PR-proteÃnas) representa uma alternativa promissora para o desenvolvimento de plantas resistentes ao ataque de fungos. Dentre as PR-proteÃnas com grande potencial biotecnolÃgico, estÃo as quitinases, hidrolases que catalisam a degradaÃÃo da quitina, que à um polÃmero constituinte da parede celular de muitas espÃcies de fungos fitopatogÃnicos. AlÃm da funÃÃo relacionada aos mecanismos de defesa, acredita-se que essas enzimas podem desempenhar outros papÃis, como a regulaÃÃo de processos de crescimento e desenvolvimento em plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de uma quitinase de classe I de feijÃo-caupi (VuChiI) na defesa e no desenvolvimento vegetal e para isso duas abordagens foram conduzidas. A primeira consistiu no silenciamento do gene que codifica esta proteÃna em plantas de feijÃo-caupi. Nos experimentos de silenciamento gÃnico foram utilizados meristemas apicais de plÃntulas de feijÃo-caupi, que foram entÃo bombardeados com micropartÃculas portando um vetor de silenciamento (pKANNIBAL), onde foi clonada uma construÃÃo em grampo (intron harpin) do gene de VuChiI. As plantas regeneradas em meio de cultura de Murashige e Skoog (MS) contendo o herbicida imazapyr, como agente de seleÃÃo, foram analisadas por PCR, o que resultou na confirmaÃÃo da transformaÃÃo genÃtica de cinco plantas, a partir de 1.092 meristemas apicais bombardeados. O RNA foi extraÃdo das plantas transformadas e utilizado em anÃlises de Northern blot que possibilitou a detecÃÃo de siRNAs no RNA total extraÃdo das plantas putativamente transgÃnicas. Apenas uma das plantas transformadas produziu uma vagem contendo seis sementes, das quais apenas uma germinou. As plantas transformadas apresentaram ciclo de vida de mais de 365 dias enquanto que o esperado à de 65-70 dias. Com base nos resultados sugere-se que o silenciamento da quitinase de classe I de feijÃo-caupi pode ter promovido alteraÃÃo no desenvolvimento da planta. A segunda estratÃgia de transformaÃÃo genÃtica consistiu no co-cultivo de discos foliares de tabaco com suspensÃo de Agrobacterium tumefaciens LB4404, com o intuito de expressar a proteÃna recombinante no espaÃo extracelular das plantas regeneradas. Essa estratÃgia tem como objetivo fazer com que a proteÃna entre em contato com o fungo antes mesmo que este agente patogÃnico penetre na cÃlula vegetal. Para tanto, o inserto referente à quitinase de feijÃo-caupi foi clonado no vetor binÃrio pCAMBIA1305.2 sob controle do promotor CaMV35S e fundido ao peptÃdeo sinal GRP (glycine-rich protein de Oryza sativa), que permite a secreÃÃo da proteÃna recombinante via apoplasto. Foram produzidas trÃs linhagens de plantas que tiveram a transformaÃÃo genÃtica confirmada por PCR. As sementes obtidas das plantas transformadas, geraÃÃo R1, foram semeadas em meio seletivo para a anÃlise da transmissÃo do transgene. O teste de X2 indicou que o transgene foi transmitido para a progÃnie em proporÃÃes Mendelianas. Os modelos experimentais desenvolvidos neste trabalho poderÃo contribuir para a elucidaÃÃo dos papÃis biolÃgicos da quitinase de classe I de feijÃo-caupi. / Heterologous expression of genes encoding pathogenesis related proteins (PR-proteins) represents a promising alternative for the development of plants resistant to fungi. Among the PR-proteins with great biotechnological potentials are the chitinases, a class of hydrolases which catalyze the degradation of chitin, a polymer constituent of cell wall of several species of pathogenic fungi. Besides their function related to defense mechanisms, it is believed that these enzymes may play other roles, such as regulation of growth and development processes in plants. Using two approaches, this study sought to investigate the role of a class I chitinase of cowpea (VuChiI) in defense and plant development. The first approach consisted of silencing of the gene encoding for VuChiI in cowpea. Apical meristems excised from cowpea seeds were bombarded with microparticles containing a silencing vector (pKANNIBAL), which was cloned with a construct harboring an intron harpin of the gene VuChiI. Plants regenerated in a Murashige and Skoog (MS) media containing imazapyr as a selection agent, were analyzed by PCR, resulting in confirmation of genetic transformation of five plants from the 1092 apical meristems bombarded. Northern blot analysis of total RNA extracted from the putative transgenic plants allowed for the detection of siRNAs. Upon regeneration and germination, only one of the five transformed plants produced a pod containing six seeds. Of these, only one germinated when further planted. The transformed plants exhibited a life cycle of over 365 days, as against the normal cycle of 65-70 days. Based on these results we posit that silencing of class I cowpea chitinase may have led to changes in plant development. The second strategy consisted of co-cultivation of tobacco leaf discs with Agrobacterium tumefaciens strain LB4404 suspension to express recombinant protein in the extracellular space of the regenerated plants in order to expose the protein fungus even before its penetration into the plant cell. To achieve this, a sequence of cowpea chitinase insert was cloned into the binary vector pCAMBIA1305.2 under the control of CaMV35S promoter and signal peptide fused to glycine-rich protein of Oryza sativa (GRP), which allowed the secretion of recombinant protein via apoplast. This led to the generation of three strains as confirmed by PCR. Seeds obtained from transformed R1 generation of the plants were germinated and analyzed for transmission of the transgene using X2 test, which confirmed its transmission to the progeny in a Mendelian fashion. The experimental models developed in this work may serve to further assess the biological roles of class I chitinase from cowpea.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O H2O2 à tido como molÃcula sinalizadora de vÃrios eventos celulares e seu nÃvel endÃgeno à controlado pelas diferentes isoformas de APX e CAT que estÃo distribuÃdas na cÃlula vegetal. No presente estudo, foram utilizadas diferentes abordagens visando um melhor entendimento do papel das isoformas citosÃlicas de APX, consideradas por muitos autores as isoformas mais importantes dentre as APXs, e sua sincronia com CAT, tendo em vista que estas sÃo as principais removedoras do H2O2 intracelular. Inicialmente, foi observado que plantas de arroz submetido à combinaÃÃo de estresse salino e alta temperatura apresentaram modulaÃÃo positiva da atividade de APX associada com menor acÃmulo de H2O2. Intrigantemente, plantas duplamente silenciadas nas isoformas de APX citosÃlica (APx1/2s) apresentaram desenvolvimento normal em condiÃÃes controle. Em condiÃÃes estressantes, as APx1/2s exibiram um mecanismo antioxidativo compensatÃrio mediado principalmente pelas isoformas de GPX citosÃlica e cloroplÃstica juntamente com antioxidantes nÃo enzimÃticos. AlÃm disso, as APx1/2s submetidas a inibiÃÃo irreversÃvel de CAT apresentaram melhor desempenho fotossintÃtico e menores danos oxidativos que plantas que continham a APX citosÃlica, CAT ou ambas indicando que outros mecanismos compensatÃrios foram ativados para mitigar os possÃveis efeitos negativos do acÃmulo de H2O2. Tomados em conjunto, os dados indicam que as isoformas citosÃlicas de APX nÃo sÃo as enzimas mais importantes no controle dos nÃveis de H2O2, visto que plantas com ausÃncia destas isoformas completam o ciclo de vida e sÃo capazes de enfrentar situaÃÃes de estresse. AlÃm disso, à possÃvel afirmar que a aÃÃo coordenada das isoformas de GPX, juntamente com ascorbato e glutationa reduzidos, podem ser os responsÃveis pela manutenÃÃo do equilÃbrio redox celular em condiÃÃes estressantes em plantas de arroz, diferente do que à noticiado para a planta-modelo Arabdopsis. / Plants in the field are exposed to multiple stresses, such as salinity, drought, high light, heat/cold and others, resulting in different physiological responses. T o evaluate the consequences of some of these stresses to the photosynthetic apparatus and an tioxidative metabolism, 30 day old rice plants , were submitted to the following treatments: control (without NaCl and at 27 ÂC), heat stress (without NaCl and at 42 ÂC), salt stress (with 100 mM NaCl and at 27 ÂC) and combined stress (salt+heat). The contr ol and salt stress treatments lasted 8 days and the heat and combined stress treatments lasted 6 hours. At the end of the experimental period, gas exchange, chlorophyll fluorescence and electrolyte leakage were measured and the leaves were collected for bi ochemical determinations. I solated salt and heat stress es were not sufficient to cause damage in the photochemical apparatus and heat stress only modifie d stomatal aperture. In combined heat and salt stress , the results indicate that photosynthetic process es were affected at the level of CO 2 assimilation and quantum efficiency. E lectrolyte leakage, TBARS and H 2 O 2 content were elevated in sal t +heat treatment, but in isolate d heat stress the TBARS was decreased. Reduced ascorbate and glutathione were similarly decrease d in plants exposed to the combination of salt and heat. A ll enzymes examin ed here were differently modulated in experimental treatment s . Taken together, the data indicates more intense impairment of photosynthesis in rice plants in the c ombination of the salt and heat, however the effective modulation of the antioxidative system was eff ective in establishing a new redox homeostasis and providing tolerance to abiotic stress.