La cirrosi és una malaltia crònica, difusa i considerada irreversible, caracteritzada per l’alteració de l’arquitectura vascular hepàtica provocada pel reemplaçament del teixit parenquimàtic per teixit fibròtic, així com per l’aparició de nòduls de regeneració. Aquesta destrucció del teixit hepàtic i la seva substitució per teixit fibrós provoca un augment marcat de la resistència al flux de la vena porta, així com una greu alteració de la funció hepàtica. A més d’un risc augmentat d’aparició de càncer hepàtic, les complicacions més freqüents i potencialment mortals de la cirrosi, associades a la hipertensió portal, són l’hemorràgia digestiva, l’ascites i trastorns de la funció renal, les infeccions bacterianes i l’encefalopatia hepàtica. S’han utilitzat diverses estratègies terapèutiques per evitar o disminuir la gravetat de les complicacions de la cirrosi, tot i que en la majoria de casos la seva eficàcia és escassa o presenten contraindicacions. És important doncs desenvolupar altres estratègies dirigides a evitar o revertir el dany hepàtic. Considerem, en aquesta línia, que el sistema endocannabinoide de senyalització podria ser una bona diana terapèutica. Aquest sistema està format per cannabinoides endògens, així com pels seus receptors específics (CB1, CB2 i altres) i els seus enzims de síntesi i degradació. El desenvolupament de molècules agonistes i antagonistes selectives d’aquests mediadors ha permès conèixer la seva acció biològica i assajar possibles tractaments de diverses malalties, entre elles les complicacions associades a la cirrosi. Concretament el bloqueig del receptor CB1 mitjançant l’antagonista rimonabant ha mostrat, en diversos estudis, efectes beneficiosos en la progressió de la fibrosi, alteracions hemodinàmiques i formació d’ascites, sobretot en administració aguda o pretractament a llarg termini. A més, en estudis experimentals d’encefalopatia hepàtica per dany hepàtic fulminant, s’han observat millores a les funcions neurològiques, dosi-depenents de l’administració d’antagonistes del receptor CB1. Tot i que l’expressió de CB1 de cèl·lules de Kupffer i estelades està augmentada en fetges cirròtics, podria ser que els hepatòcits també estiguessin implicats de manera rellevant a través de l’activació dels seus receptors CB1 a la progressió de la fibrosi. Així doncs, l’objectiu principal d’aquesta tesi fou investigar l’efecte del tractament a llarg termini amb rimonabant en un model de cirrosi avançada, sobre la fibrosi i la cirrosi, avaluar el seu efecte sobre l’incidència de translocació bacteriana, l’hemodinàmica sistèmica i en el desenvolupament d’encefalopatia hepàtica en rates cirròtiques ascítiques, així com establir el paper del receptor CB1 dels hepatòcits sobre la progressió de la fibrosi. Per aquest motiu es va dissenyar un primer estudi experimental in vivo en el que es va administrar rimonabant a llarg termini a rates cirròtiques amb ascites per tal de valorar l’efecte sobre la progressió de la cirrosi, i sobre les complicacions associades, com les alteracions hemodinàmiques, la translocació bacteriana i l’encefalopatia hepàtica. Un segon estudi in vitro amb cultius primaris de hepatòcits de rates cirròtiques ens va permetre avaluar el paper dels hepatòcits i la seva relació amb el sistema endocannabinoide de senyalització en la progressió de la cirrosi. D’acord amb els resultats obtinguts d’aquests dos estudis vam poder concloure que el tractament a llarg termini amb rimonabant disminueix la fibrosi i millora l’hemodinàmica esplàcnica i sistèmica així com alguns paràmetres de funció hepàtica. Això s’associa amb una reducció de la translocació bacteriana. A més, redueix l’amoni cerebral i l’edema cerebral de baix grau. Rimonabant podria ser útil per algunes de les complicacions associades a la cirrosi com les infeccions bacterianes i l’encefalopatia hepàtica. Pel que fa al paper dels hepatòcits a la cirrosi experimental per tetraclorur de carboni, sembla que aquest seria limitat. / Cirrhosis is a chronic disease characterized for the alteration of hepatic vascular architecture due to the replacement of parenchymal tissue with fibrotic tissue. This hepatic tissue destruction and its substitution with fibrotic tissue leads to the increased resistance to portal vein flow and to serious alteration of hepatic function. Aside from development of hepatic cancer, the most common complications of cirrhosis, associated to portal hypertension, are gastrointestinal bleeding, ascites and renal malfunction, bacterial infections and hepatic encephalopathy. Several therapeutic strategies had been used to avoid or decrease severity of cirrhosis complications, although its effectiveness is low or they present contraindications. Therefore, there is a need of new strategies than avoid or revert hepatic damage. Considering this, the endocannabinoid system of signaling could represent a new therapeutic target. This system is composed by endogen cannabionids, their specific receptors (CB1, CB2 and others) as well as by the respective synthesis and degradation enzymes. The development of selectives agonists and antagonists for these molecules enabled to learn about their biological activity as well as to test their use as a treatment on different diseases, among them cirrhosis. Specifically the blockade of CB1 receptor by its antagonist rimonabant has show to be beneficial in the progression of fibrosis, hemodynamic alterations and ascites formation, mainly in acute administration or long term pretreatment experimental studies. Further, in hepatic encephalopathy experimental studies by means of fulminant liver damage, improvement on neurological functions when administering CB1 receptor antagonists has been reported. Even if CB1 expression on Kupffer cells and stellate cells is increased in cirrhotic livers, hepatocytes may as well be involved in fibrosis progression through CB1 receptor activation. So, the aim of the present thesis was assess the effect of Rimonabant long-term administration on fibrosis and cirrhosis, bacterial translocation, hemodynamic alterations and hepatic encephalopathy development in ascitic cirrhotic rats, as well as to establish the role of hepatocyte receptor CB1 on progression of fibrosis. To do so, firstly an in vivo experimental study was designed. In this study we administered rimonabant for a ten days to cirrhotic ascitic rats in order to assess its effect on cirrhosis progression and its associated complications. Secondly, an in vitro study with primary cultured hepatocytes from cirrhotic rats allowed as to assess the role of hepatocytes and their relations with the endocannabinoid system regarding progression of cirrhosis. According to our results, long-term rimonabant administration improves fibrosis, splachnic and systemic vasodilatation and some liver function parameters. This is associated with a reduction in bacterial translocation incidence. Moreover, long-term treatment reduces brain ammonia leading to a decrease of low grade brain edema. Rimonabant could be a useful therapy for some complications associated with cirrhosis such as bacterial infections and hepatic encephalopathy. In terms of the role of hepatocytes on experimental cirrhosis by carbon tetrachloride, it seems it is not relevant.

Con la finalidad de explorar con profundidad las bases neurobiológicas de la adicción a cannabinoides hemos llevado a cabo diferentes estudios farmacológicos y moleculares. El sustrato neuroanatómico de la dependencia física de cannabinoides ha sido investigado en ratones que recibieron un tratamiento crónico con el agonista WIN55,212-2. En este estudio, se observó que el cerebelo y en menor grado el hipocampo y la amígdala, participan en la manifestación comportamental del síndrome de abstinencia de cannabinoides. Estas tres áreas se caracterizan por presentar una alta densidad de receptores cannabinoides CB1. Además, hemos evaluado la participación de diversos sistemas de neurotransmisión como son los sistemas opioide y purinérgico endógenos, en las respuestas comportamentales inducidas tras la administración de cannabinoides. Especialmente, nos hemos interesado por aquellas respuestas que están estrechamente relacionadas con las propiedades adictivas de dichos compuestos, como son los efectos reforzantes y aversivos y el desarrollo de dependencia física. Para ello hemos utilizado ratones modificados genéticamente. El sistema opioide endógeno ha sido relacionado con la manifestación de las propiedades adictivas de los cannabinoides. En este trabajo, mediante la utilización de ratones dobles mutantes MOR/DOR, hemos demostrado que se requiere una acción cooperativa entre ambos tipos de receptores opioides para que el síndrome de abstinencia cannabinoide se exprese enteramente. Por otro lado, los ratones con una supresión del gen que codifica para el receptor de adenosina A2A no mostraron ni preferencia de plaza ni aversión de plaza condicionadas a la administración de THC. Además, estos ratones presentaron un síndrome de abstinencia de THC de menor severidad, lo que sugiere una participación específica de los receptores A2A en efectos de los cannabinoides relacionados con sus propiedades adictivas. Finalmente, teniendo en cuenta que el sistema cannabinoide parece estar implicado en la modulación de las propiedades adictivas de otras drogas de abuso como opiáceos, etanol, cocaína y MDMA, hemos investigado la posible implicación del sistema cannabinoide en las propiedades adictivas de la nicotina. Para ello, hemos evaluado las respuestas comportamentales inducidas tras la administración aguda y crónica de nicotina en ratones deficientes del receptor cannabinoide CB1. En este sentido, nuestro principal hallazgo ha sido que las propiedades gratificantes de la nicotina no se manifiestan en los ratones mutantes sin el receptor cannabinoide CB1. Este hecho resulta de especial interés para la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas que faciliten el abandono del hábito tabáquico. / Cannabinoid addiction includes complex neurobiological and behavioural processes. Recently, several animal models allowing the exploration of the neurobiological basis of cannabinoid addiction have been developed. Acute cannabinoid reinforcing effects play a major role in the initiation of cannabinoid addiction, whereas the negative consequences of drug abstinence have a crucial motivational significance for relapse and maintenance of the addictive process. To further explore the neurobiological basis of cannabinoid addiction, we have conducted several pharmacological and molecular studies. The neuroanatomical substrate of cannabinoid physical dependence has been investigated in mice chronically receiving the cannabinoid agonist WIN 55,212-2. Interestingly, the cerebellum and in a lesser extent the hippocampus and the amygdala are shown to participate in the behavioural expression of cannabinoid withdrawal. All these brain areas have a high density of CB1 cannabinoid receptors. Moreover, we have evaluated the involvement of various neurotransmitter systems, such as the purinergic and opioid systems, in the behavioural responses of cannabinoids related to their addictive properties, including rewarding effects and the development of physical dependence. For this purpose, we have used genetically modified mice. Mice lacking A2A adenosine receptors reveal lower motivational responses to cannabinoids and a decreased cannabinoid withdrawal syndrome, suggesting a specific involvement of these receptors in the addictive-related properties of cannabinoids. On the other hand, the opioid system has also been implicated in the addictive properties of cannabinoids. Here, by using double mutants for mu- and delta-opioid receptors, we show that a cooperative action of both receptors is required for the entire expression of cannabinoid dependence. Finally, taking into account that the cannabinoid system has been reported to participate in the addictive properties of other drugs of abuse, such as ethanol, cocaine and MDMA, we have investigated the possible role of the cannabinoid system in the addictive properties of nicotine. We have evaluated nicotine behavioural responses in mice lacking CB1 cannabinoid receptors. In this regard, our main findings are that some acute effects and motivational responses of nicotine can be modulated by the endogenous cannabinoid system which could be of interest in order to find new therapies to facilitate tobacco smoking cessation.

La adicción es un trastorno crónico de la conducta caracterizado por la búsqueda y el consumo compulsivos de la droga, la pérdida de control para limitar dicho consumo, a aparición de un estado emocional negativo cuando el acceso a la droga está impedido y la recaída en el proceso incluso tras largos períodos de abstinencia. El sistema dopaminérgico mesolímbico cortical ha sido propuesto como la principal base neurobiológica de la adicción, sin embargo existen otros sistemas de neurotransmision que participan en la consolidación del proceso adictivo.El sistema endocannabinoide, a traves del receptor CB1, participa en las propiedades adictivas de diferentes drogas de abuso como el delta9-tetrahidrocannabinol, la nicotina y la morfina. Sin embargo, hasta el momento de iniciar este trabajo, pocos estudios han demostrado una clara implicación del sistema endocannabinoide en las propiedades reforzantes de los psicoestimulantes. Mediante el uso de ratones CB1 knockout, hemos demostrado que el receptor CB1 participa en la eficacia reforzante de la cocaína. Además, la presencia de dicho receptor es necesaria para los procesos de consolidación de una conducta operante mantenida por la autoadministración de cocaína. Este estudio demuestra la importancia de dicho receptor CB1 en las propiedades adictivas de la cocaína, confirmando que el sistema endocannabinoide es un sustrato común para la adicción de drogas de abuso. Por otra parte, el sistema purinérgico modula numerosos sistemas de neurotransmisión en el SNC. La estrecha relación a nivel celular y funcional entre los receptores de adenosina y los receptores dopaminérgicos proporciona evidencias de que el sistema purinérgico podría modular los sistemas de recompensa. Utilizando diferentes modelos animales, hemos demostrado que los receptores de adenosina A2A son necesarios para que las propiedades adictivas de las drogas de abuso como los cannabinoides, los opioides, la nicotina y los psicoestimulantes se produzcan de un modo completo.Nuestros estudios nos permiten afirmar que ambos sistemas, el cannabinoide y el purinérgico podría suponer la existencia de nuevos sistemas de modulación común de los procesos adictivos. Asi, sería de gran interés desarrollar nuevas estrategias de bloqueo de los receptores A2A y CB1 para atenuar e incluso prevenir el desarrollo de la adicción. / Drug addiction is a chronically relapsing disorder that is defined by a compulsion to take the drug intake, a loss of control in limiting intake and a withdrawal-negative affect state when the access to the drug is interrupted. Mesolimbic dopaminergic system has been proposed as a fundamental neurobiological substrate for drug addiction. However, there is evidence for other neurotransmitter systems involved in the consolidation of the addictive process. The endocannabinoid system, through the activation of CB1 receptor, participates in the addictive properties of different drugs of abuse such as delta9-tetrahydrocannabinol, morphine and nicotine. Nevertheless, few studies have revealed an important implication of CB1 receptor in the reinforcing properties of psychostimulants. By using CB1 knockout mice, we have demonstrated that CB1 receptor participates in the reinforcing efficacy of cocaine. Moreover, this receptor is necessary for the consolidation processes involved in cocaine maintained intravenous self-administration. Therefore, this study reveals an essential role of CB1 receptor in cocaine addictive properties, confirming that the endocannabinoid system is a common substrate of addiction to drugs of abuse.On the other hand, the purinergic system modulates different neurotransmitter systems in the CNS. Adenosine receptors are closely related to dopaminergic receptors at both cellular and functional levels, suggesting that purinergic system could modulate the reward systems. By using different animal models, we have demonstrated that A2A adenosine receptors are necessary for the development of the addictive properties of drugs of abuse such as opioids, cannabinoids, nicotine and cocaine. Our studies suggest that both cannabinoid and purinergic systems could represent new and common modulatory systems of addictive processes. Thus, it would be of interest to develop new therapeutic targets blocking CB1 and A2A receptors to attenuate the development of addiction.

Los trastornos emocionales de tipo depresivo y la ansiedad son las formas más prevalentes de enfermedad mental y suponen un serio problema de salud en la sociedad occidental. Recientemente, se ha postulado que el sistema endocannabinoide pueda ser un importante sustrato en el desarrollo de estos trastornos dada su participación en el control de las emociones. Nuestros resultados demuestran que los animales carentes del receptor cannabinoide CB1 manifiestan un fenotipo de tipo depresivo asociado a una deficiencia del factor neurotrófico BDNF en el hipocampo, que podría estar causada por los elevados niveles de glucocorticoides liberados en respuesta al estrés en estos mutantes. Por otra parte, el sistema endocannabinoide participa en los efectos inducidos por la nicotina sobre la ansiedad y en la expresión del síndrome de abstinencia de esta droga. Así, la actividad del receptor CB1 alivia los efectos ansiogénicos de dosis elevadas de nicotina y facilita los efectos ansiolíticos de dosis bajas. Además, la administración del agonista cannabinoide 9-THC atenúa las manifestaciones somáticas y emocionales negativas de la abstinencia de nicotina. En general, considerando los resultados presentados en esta Tesis Doctoral, podemos afirmar que el receptor CB1 participa de forma determinante en la recuperación del balance homeostático del organismo tras la exposición a un estímulo emocional negativo, bien sea una situación estresante aguda o sostenida, o bien una droga que incrementa los niveles de ansiedad o cuya retirada produce abstinencia. / Mood disorders such as depression and anxiety are the most common mental diseases and they suppose a serious health problem in our society. Recently, endocannabinoid system has been postulated to be an important substrate in the development of such disorders taking into account the role exerted by this neuromodulatory system in mood and emotions. Our results demonstrate that CB1 knockout mice exhibit a depressive-like phenotype associated to a deficiency in the neurotrophic factor BDNF in the hippocampus, which could be a consequence of the increased glucocorticoid release in response to stress exposure. On the other hand, the endocannabinoid system participates in nicotine induced effects on anxiety and in the expression of nicotine withdrawal. Thus, CB1 receptor activity attenuates anxiogenic-like effects and facilitates anxiolytic-like responses induced by high or low doses of nicotine, respectively. Moreover, 9-THC administration ameliorates somatic and negative motivational signs of nicotine withdrawal. In summary, the results presented in this Doctoral Thesis indicate that CB1 receptor participates in the recovery of the homeostatic balance after the exposure to negative emotional stimuli, either acute or sustained stress or a drug which induced anxiety-like effects or withdrawal signs after the end of the exposure.