Abstract Mammalian female sex development was considered a default developmental pathway. However, the deletion of the Wnt4 gene, a member of the Wnt family of secreted signals, was shown to reverse the sex of XX female mouse embryo and caused exhibition of certain male characteristics. This indicated that the female sexual development cannot be default but depends on active signaling and cell-cell interaction. The aim of the current study was to reveal the functional role of the Wnt4 gene in the control of sex determination, ovariogenesis and female sex duct formation. This study demonstrates that testosterone is produced by the ovary of Wnt4-deficient female embryos. The inhibition of androgen action by an antiandrogen, flutamide, during gestation leads to complete degeneration of the Wolffian ducts in 80% of the Wnt4 mutant females. This suggests that testosterone is the possible mediator of the masculinization phenotype in Wnt4-deficient females. Wnt4 is expressed by ovarian somatic cells, which are vital for the control of female germline development. This work has shown that Wnt4 is the factor maintaining germ cell cysts, cell-cell interaction and early follicular gene expression. In addition, the findings indicate a critical role for Wnt4/5a signaling in meiosis. Our research has proven that Wnt4 has roles during postnatal ovary development as its defective signaling leads to premature ovarian failure associated with diminished Amh levels, defective basement membrane and cell polarization. The Mullerian duct, the anlagen of oviduct, uterus and upper part of vagina, does not form in Wnt4-deficient females. This study indicates that Wnt4 is needed for migration initiation and maintenance during Mullerian duct formation prenatally. During the postnatal uterine differentiation Wnt4 is essential for endometrial gland formation. The present study provides new evidence for Wnt4 function during embryonic and adult female sexual differentiation. / Tiivistelmä Nisäkkäiden naaraspuolista kehitystä pidettiin aiemmin sukupuolisen erilaistumiskehityksen oletusarvona. Signaloivien proteiinien Wnt-perheeseen kuuluvan Wnt4-geenin puutteen todettiin kuitenkin johtavan XX naarasalkion sukupuolen kääntymisen koiraaksi sekä aiheuttavan tiettyjä koiraille ominaisia piirteitä. Tämä osoitti, ettei naaraspuolinen kehitys ole oletusarvo, vaan se riippuu aktiivisesta signaloinnista ja solujen välisestä interaktiosta. Tämän väitöstutkimuksen tarkoitus oli selvittää Wnt4-geenin roolia sukupuolen määräytymisessä, munasarjojen kehittymisessä sekä naaraan sukupuolitiehyitten muodostumisessa. Tutkimuksessa osoitettiin, että munasarjat tuottavat testosteronia niillä naaraspuolisilla alkioilla, joilta puuttuu Wnt4-geeni. 80 prosentilla naaraista, joilla on Wnt4-geenin puute, androgeenivaikutuksen esto raskauden aikana annettavalla antiandrogeenilla, flutamidilla, estää sukupuolen vaihtumisen fenotyypin. Tämä viittaa siihen, että testosteroni toimii mahdollisena koiraan fenotyypin välittäjänä naarailla, joilta puuttuu Wnt4-geeni. Wnt4 ilmentyy munasarjojen somaattisissa soluissa, jotka ovat tärkeitä naaraspuolisen ituradan kehityksen säätelyn kannalta. Väitöstutkimus osoittaa, että Wnt4 on itusoluryppäitä, solujen välistä interaktiota sekä varhaista follikkeligeeni-ilmentymistä ylläpitävä tekijä. Tulokset osoittavat myös, että Wnt4/5a -signaloinnilla on tärkeä rooli meioosissa. Tutkimus osoittaa lisäksi, että Wnt4 vaikuttaa munasarjojen kehitykseen myös syntymän jälkeen. Puutteellinen signalointi alentaa Anti-Müllerian hormonin tasoa, heikentää tyvikalvoa ja vähentää solujen polarisaatiota, joka johtaa ennenaikaiseen munasarjojen toiminnan hiipumiseen. Müllerin tiehyet, joista myöhemmin kehittyvät munanjohtimet, kohtu ja vaginan yläosa, jäävät kokonaan muodostumatta naarailla, joilta puuttuu Wnt4-geeni. Tulokset viittaavat siihen, että Wnt4 on tarpeen alkioaikaiseen Müllerin tiehyen muodostavien solujen liikkeellelähtöön ja ylläpitoon. Wnt4:llä on myös keskeinen rooli kohturauhasten muodostumisessa sukukypsyyden saavuttamisen aikana ja sen jälkeen.

Abstract Biology and medicine rely heavily on images to understand how the body functions, for diagnosing diseases and to test the effects of treatments. In recent decades, microscopy has experienced rapid improvements, enabling imaging of fixed and living cells at higher resolutions and frame rates, and deeper inside the biological samples. This has led to rapid growth in the image data. Automated methods are needed to quantitatively analyze these huge datasets and find statistically valid patterns. Cell segmentation and tracking is critical for automated analysis, yet it is a challenging problem due to large variations in cell shapes and appearances caused by various factors, including cell type, sample preparation and imaging setup. This thesis proposes novel methods for segmentation and tracking of cells, which rely on machine learning based approaches to improve the performance, generalization and reusability of automated methods. Cell proposals are used to efficiently exploit spatial and temporal context for resolving detection ambiguities in high-cell-density regions, caused by weak boundaries and deformable shapes of cells. This thesis presents two cell proposal methods: the first method uses multiple blob-like filter banks for detecting candidates for round cells, while the second method, Cell Proposal Network (CPN), uses convolutional neural networks to learn the cell shapes and appearances, and can propose candidates for cells in a wide variety of microscopy images. CPN first regresses cell candidate bounding boxes and their scores, then, it segments the regions inside the top ranked boxes to obtain cell candidate masks. CPN can be used as a general cell detector, as is demonstrated by training a single model to segment images from histology, fluorescence and phase-contrast microscopy. This work poses segmentation and tracking as proposal selection problems, which are solved optimally using integer linear programming or approximately using iterative shortest cost path search and non-maximum suppression. Additionally, this thesis presents a method which utilizes graph-cuts and an off-the-shelf edge detector to accurately segment highly deformable cells. The main contribution of this thesis is a cell tracking method which uses CPN to propose cell candidates, represents alternative tracking hypotheses using a graphical model, and selects the globally optimal sub-graph providing cell tracks. It achieves state-of-the-art tracking performance on multiple public benchmark datasets from both phase-contrast and fluorescence microscopy containing cells of various shapes and appearances. / Tiivistelmä Biologia ja lääketiede nojaavat vahvasti kuvatietoon solujen ja kehon toimintojen ymmärtämiseksi sairauksien diagnostiikassa ja hoitojen vaikutusten seuraamisessa. Viime vuosikymmeninä mikroskopiassa on tapahtunut nopeaa teknistä kehitystä, mikä on mahdollistanut elävien solujen kuvantamisen tarkemmin, nopeammin sekä syvemmältä automatisoidusti useasta näytteestä. Tämä taas on johtanut kuvadatan nopeaan kasvuun ja suurempaan määrään biologisia kysymyksiä, joihin voidaan vastata. Kuvadatan räjähdysmäisen kasvun vuoksi kaikkia tuloksia ei voida enää tulkita pelkästään ihmistyövoimaa käyttämällä, mikä on johtanut tarpeeseen kehittää automaattisia menetelmiä analysoimaan kvantitatiivisesti suuria datajoukkoja ja löytämään tilastollisesti kelvollisia malleja. Solujen erottaminen niiden ympäristöstä ja toisista soluista (segmentointi) ja solujen seuranta ovat kriittisiä alkuvaiheen osia onnistuneessa automaattisessa analyysissä. Automaattisten menetelmien kehittämisessä solusegmentointi on kuitenkin osoittautunut hyvin haastavaksi ongelmaksi solujen muodon ja ulkonäön suurten muutosten vuoksi solutyypistä, näytteen valmistelusta ja kuvantamisjärjestelmästä johtuen. Tämä väitöskirja esittää uusia menetelmiä solujen segmentointiin ja seurantaan keskittyen koneoppimiseen perustuviin lähestymistapoihin, jotka parantavat automaattisten menetelmien suorituskykyä ja uudelleenkäytettävyyttä. Spatiaalista ja ajallista kontekstia tehokkaasti hyödyntäviä soluehdotelmia käytetään ratkaisemaan solujen heikosti erottuvista reunoista ja joustavista muodoista johtuvaa solujen muodon monitulkintaisuutta erityisesti silloin kun tutkittava solutiheys on suuri. Tämä väitöskirja esittää kaksi menetelmää soluehdotelmille; ensimmäinen menetelmä käyttää useita läikkätyyppisiä suodatinpankkeja ilmaisemaan kandidaatteja pyöreänmuotoisille soluille, kun taas toinen menetelmä nimeltään soluehdotelmaverkko (Cell Proposal Network, CPN) käyttää konvoluutionaalisia neuroverkkoja oppiakseen tunnistamaan solut niiden muodon sekä ulkonäön perusteella erityyppisissä mikroskooppikuvissa. CPN regressoi ensin solukandidaatteja ympäröivät suorakaiteet ja niiden pistemäärän, jonka jälkeen se segmentoi alueet parhaiten sijoittuneiden suorakaiteiden joukosta tuottaen solukandidaattimaskit. CPN:ää voidaan mahdollisesti käyttää yleisenä soluilmaisimena erityyppisilla kuvantamistekniikoilla tuotetuissa kuvissa mukaan lukien histologisen valo-, fluoresenssi- ja vaihekontrastimikroskooppian. Väitöskirja esittää solujen segmentoinnin ja seurannan soluehdotelmien valintaongelmina, mitkä ratkaistaan joko optimaalisesti käyttämällä kokonaislukuoptimointia tai likimääräisesti käyttämällä iteratiivista lyhimmän kustannuspolun hakua sekä ei-maksimien vaimennusta. Tämä väitöskirja esittää myös verkon leikkaukseen (graph cut) perustuvan menetelmän, mikä hyödyntää valmiiksi saatavilla olevaa reunanilmaisinta segmentoimaan tarkasti muotoaan voimakkaasti muuttavia soluja. Väitöskirjatutkimuksen keskeinen tulos on uusi solujen seurantamenetelmä, mikä käyttää CPN:ää solukandidaattien ehdottamiseen, esittää vaihtoehtoiset seurantahypoteesit verkkomallia hyödyntämällä, ja valitsee globaalisti optimaalisen aliverkon solujen kulkemille reitille. Verrattuna useisiin muihin julkisesti saatavilla oleviin kuva-analyysiohjelmistoihin tässä väitöskirjassa kehitetyt menetelmät olivat suorituskyvyltään parhaita vaihekontrasti- ja fluoresenssimikroskopialla tuotettujen kuva-aineistojen analyyseissa, joissa solujen ulkomuoto oli hyvin vaihteleva.

Abstract Acute myocardial infarction is a life-threatening condition that occurs as a result of reduced blood flow in the cardiac muscle, eventually leading to tissue damage. In infarcted areas, cardiomyocytes have insufficient ability to proliferate and replace the injured cells, which is associated with a deficient pumping capacity. A strictly regulated combinatorial interplay of transcription factors, e.g., GATA4, NKX2-5, TBX5, and MEF2C, orchestrates cardiac type gene expression during the cardiomyocyte differentiation and maturation processes. The aim of the present study was to (i) characterize the protein-protein interaction of the cardiac transcription factors GATA4-NKX2-5, (ii) evaluate the chemical agents that modify the synergy of GATA4-NKX2-5 in vitro, (iii) examine the capacity of the lead compound to promote myocardial repair in vivo after myocardial infarction and other cardiac injuries and (iv) study the structural features of the compound important for metabolism and cytotoxicity. Integration of the experimental mutagenic data with computational modeling suggests that the structural architecture of the GATA4-NKX2-5 interaction resembles the protein structure of the conserved DNA binding domain of nuclear receptors. Fragment-based screening, reporter gene-based optimization and pharmacophore searching were utilized to identify the most potent lead compound targeting the GATA4-NKX2-5 interaction: N-[4-(diethylamino)phenyl]-5-methyl-3-phenylisoxazole-4-carboxamide. This compound presented anti-hypertrophic effects in vitro and cardioprotective effects in vivo. In addition, structural analysis of the lead compound revealed the signature molecular features for metabolism and cytotoxicity. Current drug treatments are able to delay, but not prevent the progress of the heart failure; therefore, modulators of protein-protein interactions of key transcription factors may represent a novel class of pharmaceuticals for cardiac remodeling and repair. / Tiivistelmä Sydäninfarkti on henkeä uhkaava verenkierron häiriö, joka syntyy veren virtauksen äkillisen vähentymisen seurauksena sydänlihaksessa aiheuttaen kudosvaurion. Vaurioituneen sydänlihaskudoksen kyky uusiutua tai korvata kuolleet sydänlihassolut uusilla on puutteellinen, ja tämän seurauksena sydämen pumppauskyky heikkenee. Transkriptiotekijöiden GATA4, NKX2-5, TBX5 ja MEF2C muodostamat ja koordinoimat proteiinikompleksit säätelevät sydänsolujen geenien ilmenemistä solujen elinkaaren aikana. Väitöskirjatyön tavoitteena oli (i) karakterisoida geeninsäätelytekijöiden GATA4-NKX2-5 molekyylirakenteet ja niiden keskinäinen vuorovaikutus, (ii) seuloa kemiallisia yhdisteitä, jotka muokkaavat GATA4-NKX2-5 proteiinikompleksin aikaansaamaa geeniaktivaatiota, (iii) tutkia johtoyhdisteen vaikutuksia in vivo sydäninfarktia ja painekuormitusta kuvaavissa eläinmalleissa, ja (iv) tutkia johtoyhdisteen molekyylirakenteen yhteyttä yhdisteen metaboliaan ja sytotoksisuuteen. Väitöskirjatyö osoittaa molekyylimallinuksen ja kokeellisten tulosten perusteella, että geeninsäätelytekijöiden GATA4-NKX2-5 proteiinikompleksin orientaatio matkii tumareseptoriperheen DNA domeenin tertiäärirakennetta. Molekyylifragmenttien, lusiferaasi-reportterikokeen ja farmakoforimallin avulla seulottiin ja optimoitiin sitoutumisvoimakkuudeltaan lupaavin GATA4-NKX2-5 proteiinikompleksin toimintaan vaikuttava johtoyhdiste: N-[4-(dietyyliamino)fenyyli]-5-metyyli-3-fenyyli-isoksatsoli-4-karboksamidi. Johtoyhdisteellä havaittiin solu- ja eläinmalleissa hypertrofiaa estäviä vaikutuksia in vitro ja sydäntä suojaavia vaikutuksia in vivo. Väitöskirjatyö osoitti lisäksi aktiivisten molekyylien rakenneominaisuuksia, jotka keskeisesti vaikuttavat yhdisteiden metaboliaan ja sytotoksisuuteen. Nykyinen lääkehoito hidastaa, mutta ei pysäytä sydänlihasvaurioon liittyvän kroonisen sydämen vajaatoiminnan etenemistä. Lääkevaikutuksen kohdentaminen sydämen keskeisten transkriptiotekijöiden yhteisvaikutukseen avaa uuden mahdollisen tutkimuslinjan sydänlihasvaurion estossa ja korjauksessa.

Abstract The epithelial cells form barriers that compartmentalize the organs. Carcinomas are cancers stemming from epithelial cells and are the most common cancer type. The aim of this study was to understand the differentiation and malignant transformation of epithelial Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells and to analyse the electrophysiological parameters which regulate their transport capacity. Emphasis was placed on comparing different culture environments, both in 2D and 3D. First, the effects of drugs or basal extracellular fluid composition on MDCK cell, cyst and lumen volumes were analysed using time-lapse microscopy. The results showed that MDCK cells were capable of both water secretion and reabsorption. The cells were able to perform these functions in a hyperpolarizing or depolarizing environment; change in osmolality of basal fluid was not required. Taken together, these results validate MDCK cells as a good basic model for studying kidney function. Next, the aim was to analyse the effect of 2D and 3D culture environments on the gene expression of untransformed MDCK and temperature sensitive ts-Src -transformed MDCK cells and the changes a single oncogene can induce. Microarray analysis revealed a decrease in the expression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein, when switching the untransformed cells from 2D environment to 3D. This downregulation of survivin occurs in adult tissues as well, indicating that the cells grown in 3D are closer to the in vivo state than 2D cells. Src oncogene induced disintegration of cell junctions, but did not downregulate E-cadherin expression. The last part was to study further the factors controlling survivin expression and its significance to cell survival. MDCK cells grown in 3D did not suffer apoptosis if the cells remained in contact with the extracellular matrix. If MDCK cells were denied of ECM contacts they were more susceptible to apoptosis than survivin-expressing ts-Src MDCK cells. Finally, if cells were denied of cell-cell junctions, cells lacking survivin suffered apoptosis even though they had proper cell-matrix contacts. Taken together, these results highlighted the importance of cellular contacts to the cells: MDCK cells needed ECM contacts to differentiate and cell-cell contacts to avoid apoptosis. / Tiivistelmä Epiteelisolut ovat erikoistuneet toimimaan rajapintana elimen ja ympäristön välillä. Ihmisten yleisin syöpä on epiteelisoluista alkunsa saanut karsinooma. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli ymmärtää Madin-Darby-koiran munuaisen solujen (MDCK) erilaistumista ja pahanlaatuistumista sekä analysoida sähköfysiologisia tekijöitä, jotka säätelevät näiden solujen kuljetustoimintaa. Erityisenä kiinnostuksen kohteena oli erilaisten kasvuympäristöjen vertailu. Farmakologisten aineiden tai basaalisen, solunulkopuolisen nesteen koostumuksen vaikutusta MDCK-solujen, -kystan sekä luumenin kokoon tutkittiin valomikroskooppisten aikasarjojen avulla. Tulokset osoittivat MDCK-solujen olevan kykeneviä sekä veden eritykseen että absorptioon, niin hyperpolarisoivassa kuin depolarisoivassakin ympäristössä. Basaalisen nesteen osmolaliteetin muutosta ei tarvittu. Nämä tulokset osoittavat MDCK-solujen olevan hyvä munuaisen tutkimuksen perusmalli. Seuraavaksi analysoitiin kaksi- ja kolmiulotteisten (2D ja 3D) viljely-ympäristöjen vaikutusta ei-transformoitujen MDCK-solujen ja lämpötilaherkkien ts-Src-transformoitujen MDCK-solujen geenien ilmentymiseen sekä yhden onkogeenin aktivoimisen aikaansaamia muutoksia. Microarray-analyysi osoitti apoptoosin estäjän, surviviinin, ilmentymisen vähenemisen, kun kasvuympäristö vaihdettiin 2D-ympäristöstä 3D-ympäristöön. Koska surviviinin väheneminen on normaali tapahtuma aikuisissa kudoksissa, voitiin todeta, että 3D-ympäristössä kasvatetut solut ovat lähempänä luonnonmukaista olotilaa kuin 2D-ympäristössä kasvaneet. Src-onkogeeni sai aikaan soluliitosten hajoamisen, mutta ei vähentänyt E-kadheriinin ilmentymistä. Tutkimuksen viimeinen osa keskittyi surviviinin ilmentymistä säätelevien tekijöiden analysoimiseen ja surviviinin merkitykseen solujen eloonjäämiselle. 3D-ympäristössä kasvaneet MDCK-solut eivät kärsineet apoptoosista edellyttäen, että solut pysyivät kosketuksissa soluväliaineeseen. Jos solut irtautuivat soluväliaineesta, ne päätyivät herkemmin apoptoosiin kuin surviviinia ilmentävät ts-Src MDCK-solut. Mikäli solujen väliset liitokset pakotettiin avautumaan, solut joutuivat apoptoosiin, vaikka ne olivat kosketuksissa soluväliaineeseen. Yhteenvetona nämä tulokset korostavat solujen kontaktien merkitystä: MDCK-solut tarvitsevat soluväliainekontakteja erilaistumiseen ja solujen välisiä kontakteja välttyäkseen apoptoosilta.

Abstract Ischemic heart disease is one of the leading cause of death in the Western world. There is convincing evidence that stem cell therapy improves cardiac function and reduces the scar formation following an acute myocardial infarction (AMI). The mechanisms involved in the recovery remain partly unknown. Direct injection of stem cells into myocardium is a widely used transplantation technique though there are few details available about the behavior of cells after transplantation. A cardiac explant culture model simulating tissue stress was developed in this study to examine in detail the properties of the stem cells after their transplantation. The migration range in myocardium and the number of adherent stem cells increased with time. In vitro and in vivo studies revealed that after their administration, the stem cells became localized in the slit-like spaces, such as in the capillaries. Even though the study outcomes regarding the impact of stem cell therapy in recovery after AMI have been largely promising, the results of the clinical studies have proved to be more controversial. If one wishes to evaluate the true contribution of the stem cell therapy to the recovery, it is essential to devise a reliable study method for cell targeting. Here, iron labeled stem cells in combination with magnetic resonance imaging (MRI) were used. The MRI data corresponded to the histological results. Thus, it is concluded that MRI is a feasible method for monitoring the effectiveness of cell targeting. Stem cell treatment was shown to increase cardiac function at three weeks after AMI. If there was a high number of stem cells in cardiac tissue after transplantation, this predicted a greater improvement in cardiac function. Improper stem cell injection may lead to leakage of the stem cells out of the myocardium, leading to unreproducible study results. Inflammation modulating factors secreted by the stem cells are considered as key mechanisms in the recovery after AMI. There were differences in the cytokine levels between the stem cell treated and control groups in a clinical and in vivo animal study i.e. stem cell therapy exerted a balancing effect on the inflammatory process, a crucial component in the optimal recovery after AMI. The present study reveals many properties of stem cells, importance of cell targeting and the influence of stem cell therapy on cytokine levels after AMI. / Tiivistelmä Iskeeminen sydänsairaus on yksi yleisimmistä kuolinsyistä länsimaissa. Tutkimusten mukaan kantasoluterapia parantaa sydämen toimintakykyä ja pienentää akuutin sydäninfarktin jälkeen sydämeen muodostuvan arpikudoksen määrää. Paranemiseen liittyvät mekanismit ovat edelleen osittain tuntemattomia. Kantasolujen ruiskutus suoraan sydämeen on paljon käytetty menetelmä, vaikka solujen käyttäytymistä ei tunneta tarkkaan.Tutkimuksessa kehitetyn kudoksen stressitilaa simuloivan sydänkudoksen kasvatusmenetelmän avulla tutkittiin siirrettyjen kantasolujen toimintaa yksityiskohtaisesti. Kantasolujen vaeltaman matkan sydänkudoksessa ja kiinnittyneiden kantasolujen lukumäärä havaittiin kasvavan ajan kuluessa. In vitro ja in vivo tutkimuksissa havaittiin kantasolujen sijaitsevan ruiskutuksen jälkeen rakomaisissa paikoissa kuten pienissä verisuonissa. Vaikka tutkimustulokset kantasoluterapian hyödyistä paranemisen suhteen ovat pääosin lupaavia, kliinisten tutkimusten tulokset ovat ristiriitaisia. Todellisen kantasoluhoidon vaikutuksen arvioimiseksi tarvitaan luotettava menetelmä varmistamaan kantasolujen hakeutuminen vaurioalueelle. Tässä tutkimuksessa rautaleimattujen kantasolujen paikantamisessa käytetty magneettikuvantaminen vastasi histologisia löydöksiä. Magneettikuvantaminen todettiin käyttökelpoiseksi menetelmäksi solujen paikallistamisessa. Kantasoluhoidon osoitettiin parantavan sydämen toimintakykyä kolme viikkoa akuutin sydäninfarktin jälkeen. Suuri kantasolumäärä sydänkudoksessa siirron jälkeen ennusti parempaa toipumista. Puutteellisesti suoritettu kantasoluruiskutus voi johtaa kantasolujen vuotamiseen pois sydänkudoksesta aiheuttaen vaihtelevuutta tutkimustuloksiin. Kantasolujen erittämiä tulehdusta sääteleviä tekijöitä pidetään tärkeimpänä mekanismina paranemisprosessissa. Tutkimus osoitti eroavaisuuksia kantasoluhoidetun ja kontrolliryhmän välillä. Kliinisessä ja koe-eläintutkimuksessa kantasolusiirrolla todettiin tulehdusreaktiota tasapainottava vaikutus, mikä on tärkeää optimaalisen sydänlihaskudoksen paranemisen kannalta akuutin sydäninfarktin jälkeen. Tutkimus toi esiin monia kantasolujen ominaisuuksia, solujen paikantamisen tärkeyden ja kantasoluhoidon vaikutuksen sytokiinipitoisuuksiin akuutin sydäninfarktin jälkeen.

Abstract This thesis reports on studies of plasmonic nanoparticles and particularly gold nanostars as signal enhancers and contrast agents for biophotonic applications including visualisation, treatment of living cells and chemical sensing. In this thesis, the optical properties of nanoparticles of different size and morphology and their silica composites were compared. Because they are the most suitable plasmonic nanostructures, gold nanostars were utilised for optical imaging modalities such as confocal microscopy and Doppler optical coherence tomography. The ability of gold nanoparticles to enhance the signal in surface-enhanced vibrational spectroscopy, including Raman and Fourier transform infrared spectroscopy was additionally studied. Finally, various gold nanoparticles were applied for cell optoporation to increase the penetration ability of exogeneous substances. In summary, significant advantages of nanostars such as their low-toxicity, high scattering and contrast abilities, in addition to a broad, tunable, plasmon resonance wavelength range, as well as the capability to enhance the signal of analyte molecules in vibrational spectroscopy were demonstrated in this thesis. The results of this study on the effectiveness of nanostars have a broad scope of utility and open a wide perspective for their utilisation in nanobiophotonics and biomedicine. / Tiivistelmä Tämä opinnäytetyö kertoo tutkimuksista, joissa plasmoninanopartikkeleita ja erityisesti kultananotähtiä on käytetty signaalinvahvistimina biofotoniikan sovelluksissa, kuten visualisointi, elävien solujen käsittely ja kemiallinen tunnistus. Tässä työssä verrattiin eri kokoisten ja muotoisten nanopartikkeleiden ja niiden piioksidikomposiittien optisia ominaisuuksia. Sopivimpina plasmoninanorakenteina kultananotähtiä käytettiin optisiin kuvantamismenetelmiin, kuten konfokaalimikroskopiaan ja Doppler-optiseen koherenssitomografiaan. Lisäksi kuvattiin myös kultananopartikkelien kykyä parantaa pinta-aktivoidun värähtelevän spektroskopian signaalia, mukaan lukien Raman- ja Fourier-muunnos-infrapuna-spektroskopia. Lopuksi, eri kultananopartikkeleita käytettiin soluoptoporaatioon eksogeenisten aineiden läpäisevyyden lisäämiseksi. Yhteenvetona, työssä osoitettiin nanotähtien merkittävät edut, kuten matala-myrkyllisyys, suuret sironta- ja kontrastiominaisuudet, laaja plasmoniresonanssin aallonpituusalue ja sen viritettävyys, sekä kyky parantaa analyyttimolekyylien signaalia värähtelyspektroskopiassa. Niinpä tutkimustulokset nanotähtien tehokkuudesta ovat laajasti käyttökelpoisia ja ne avaavat laajan näkökulman niiden hyödyntämiseen nanobiofotoniikassa ja biolääketieteessä.

Abstract 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases (2-OGDDs) are an enzyme family that contains many enzymes that modify chromatin in extensive ways. These enzymes include several histone lysine demethylases (KDMs) and TET enzymes that convert methylated cytosine (5-mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) ultimately leading to DNA demethylation. Disturbed DNA and histone methylation are found in many cancers. However, the role of KDMs and TETs behind these oncogenic changes has so far not been fully investigated. This study focused on the role of these chromatin-modifying enzymes in cancers with special emphasis on enzyme kinetic studies. Cancers with inactivating fumarate hydratase (FH), succinate dehydrogenase (SDH) and isocitrate dehydrogenase (IDH) mutations accumulate fumarate, succinate and R-2-hydroxyglutarate, respectively. In this study we showed how these cancer-associated 2-oxoglutarate (2-OG) analogues can inhibit the TET enzymes and many of the KDMs leading to lower 5-hmC levels and increased H3K27 and H3K9 methylation on chromatin, respectively. We also characterized kinetic properties of acute myeloid leukaemia (AML)-associated TET2 mutants and found that their ability to bind 2-OG or iron was impaired leading to diminished catalytic activity. Tumours are often hypoxic due to inadequate vasculature and blood supply. The TET enzymes and KDMs require oxygen for the reactions they catalyse. We determined the oxygen affinity of TETs and many KDMs and found that a H3K27 demethylase KDM6A has a remarkably low affinity for oxygen indicating that it is inactivated in hypoxic tumours and tissues. H3K27 methylation was found to be increased in hypoxic cells and this blocked cell differentiation. Altogether, these studies shed light on the mechanisms behind the altered DNA and histone methylation found in several cancers with hypoxic conditions or FH, SDH and IDH mutations. Altered DNA and histone methylation has previously been associated with progression of cancer, such as epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). We now linked catalytic inhibition of 2-OGDDs to disturbed DNA and histone methylation that can account for altered cell differentiation, EMT and increased aggressiveness and invasiveness of cancers. / Tiivistelmä 2-oksoglutaraatista riippuvaiset dioksygenaasit ovat entsyymiperhe, johon kuuluu useita entsyymejä, jotka muokkaavat kromatiinin epigeneettisiä merkkejä monin tavoin. Näitä entsyymejä ovat mm. DNA:n demetylaatioon vaikuttavat TET-entsyymit sekä useat histonidemetylaasit. Vaikka muutoksia DNA:n ja histonien metylaatiotasoissa on havaittu useissa syövissä, ei näiden entsyymien roolia muutosten taustalla ole vielä tutkittu. Tämä tutkimus kohdistui näiden epigenetiikkaan vaikuttavien entsyymien roolin ymmärtämiseen syövissä keskittyen erityisesti kyseisten entsyymien kinetiikkaan. Useissa syövissä on havaittu fumaraattihydrataasin, sukkinaattidehydrogenaasin ja isositraattidehydrogenaasien aktiivisuuteen vaikuttavia mutaatioita, jotka johtavat fumaraatin, sukkinaatin ja R-2-hydroksiglutaraatin kertymiseen syöpäsoluihin. Tässä tutkimuksessa osoitimme, kuinka nämä karsinogeeniset 2-oksoglutaraattianalogit voivat inhiboida TET-entsyymejä ja histonidemetylaaseja, mikä alentaa 5-hydroksimetyylisytosiinitasoja ja lisää histonien metylaatiota. Näytämme myös, kuinka tietyillä akuutissa myelooisessa leukemiassa esiintyvillä TET2-mutanteilla on heikentynyt kyky sitoa 2-oksoglutaraattia tai rautaa, mikä johtaa entsyymien aktiivisuuden laskuun. Kasvainkudoksissa happipitoisuudet ovat usein matalia nopean kasvun ja puutteellisen verisuonituksen vuoksi. TET-entsyymit ja histonidemetylaasit vaativat happea katalysoimissaan reaktioissa. Määritimme TET-entsyymien ja monien histonidemetylaasien riippuvuutta hapesta ja osoitimme, että H3K27-histonidemetylaasi KDM6A on erittäin riippuvainen hapesta, mikä osoittaa, ettei se pysty toimimaan kasvaimissa ja kudoksissa, joissa happipitoisuudet ovat matalia. Huomasimme, että vähähappisissa olosuhteissa solujen H3K27 metylaatio on lisääntynyt, mikä johti erilaistumisen estymiseen soluissa. Tämä tutkimus paljasti uusia mekanismeja useista syövistä löytyneiden muuntuneiden DNA:n ja histonien metylaatiotasojen taustalla. Häiriintynyt DNA:n ja histonien metylaatio on aiemmin yhdistetty syöpien etenemiseen, erityisesti solujen erilaistumisen häiriintymisen kannalta. Tässä tutkimuksessa yhdistimme 2-oksoglutaraatista riippuvaisten entsyymien inhibition häiriintyneeseen DNA:n ja histonien metylaatioon, joka voi johtaa muuntuneeseen solujen erilaistumiseen ja lopulta lisääntyneeseen syöpien aggressiivisuuteen ja invasiivisuuteen.

Abstract Hematopoietic cells, i.e., erythrocytes, platelets and white blood cells, differentiate from hematopoietic stem cells in a process that is similar in vertebrates. Hematopoiesis is regulated by molecules expressed by both the hematopoietic stem and progenitor cells and the surrounding microenvironments. Knowledge of these molecules is important since many of the genes involved in normal hematopoiesis are mutated in leukemia. Furthermore, this information can be utilized in more efficient isolation and expansion of hematopoietic cells in vitro. However, these molecules are not yet sufficiently characterized. Transmembrane immunoglobulin and mucin domain (TIM) genes form a known family of immunoregulators. In mammals, TIM-4 is expressed by antigen presenting cells, while TIM-1, TIM-2 and TIM-3 are expressed by T cells, in which they regulate differentiation of TH cells. The role of TIM molecules in hematopoiesis has not yet been investigated. The aim of this thesis work was to identify and analyze novel molecules involved in embryonic hematopoiesis using chicken and mouse as model organisms. This was carried out by generating a cDNA library of hematopoietic stem and progenitor cells from embryonic chicken para-aortic region. Both previously known and novel candidate genes were identified from the library. Among them, we found homologs to tim genes. Their expression and role in hematopoiesis was studied further. TIM-2 expression was shown to be tightly governed during B cell development. It is expressed by common lymphoid progenitors and highly proliferative large-pro and large pre-B cells during both fetal liver and adult bone marrow hematopoiesis. In mouse, tim-4 expression was restricted to fetal liver CD45+F4/80+ cells. Furthermore, two distinct populations were identified: F4/80hiTIM-4hi and F4/80loTIM-4lo. The results suggest that the F4/80hiTIM-4hi cells are yolk sac-derived macrophages and the F4/80loTIM-4lo cells myeloid progenitors. This work shows for the first time that TIM family molecules are expressed during hematopoiesis. TIM-2- and TIM-4 are expressed by specific cell types during hematopoietic cell development, and in the future they may be utilized as markers in isolation of hematopoietic progenitor cells. / Tiivistelmä Verisolut eli punasolut, verihiutaleet ja immuunipuolustuksessa tärkeät valkosolut kehittyvät alkion veren kantasoluista prosessissa, joka on kaikissa selkärankaisissa samankaltainen. Veren kanta- ja esisolujen sekä ympäröivän mikroympäristön tuottamat molekyylit säätelevät hematopoieesia eli verisolujen kehitystä. Näiden molekyylien tunteminen on tärkeää, sillä useat normaalia verisolujen kehitystä säätelevät geenit ovat osallisena myös verisyöpien synnyssä. Lisäksi tätä tietoa on mahdollista hyödyntää verisolujen tehokkaammassa eristämisessä ja kasvattamisessa hoitoja varten. Immuunipuolustuksen solut, kuten syöjäsolut eli makrofagit ja T-solut, ilmentävät TIM-molekyylejä (Transmembrane Immunoglobulin and Mucin). Ne toimivat immunologisen vasteen säätelyssä sekä solusyönnissä, mutta niiden roolia verisolujen kehittymisessä ei ole selvitetty aikaisemmin. Tässä väitöstutkimuksessa etsittiin uusia hematopoieesiin vaikuttavia geenejä käyttäen mallieläiminä sekä kanaa että hiirtä. Tutkimuksessa luotiin geenikirjasto kanan alkion para-aortaalisen alueen veren kanta- ja esisoluista. Kirjastosta tunnistettiin useita ennalta tiedettyjä sekä uusia verisolujen kehitykseen vaikuttavia geenejä. Tutkimuksessa analysoitiin tarkemmin kirjastosta löytyneiden TIM-geeniperheen jäsenten ilmentymistä ja roolia verisolujen kehityksessä. Tutkimuksessa osoitettiin, että TIM-2 proteiinin ilmentymistä säädellään tarkasti B-solujen kehityksen aikana. Lymfosyyttien yhteiset esisolut sekä suuret pro-B- ja pre-B-solut ilmentävät TIM-2 proteiinia B-solukehityksen aikana sekä alkion maksassa että aikuisen luuytimessä. Hiiren alkiossa tim-4 geenin ilmentyminen oli rajoittunut maksaan, jossa erottui kaksi erillistä solupopulaatiota: F4/80hiTIM-4hi ja F4/80loTIM-4lo. Tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että maksan F4/80hiTIM-4hi solut ovat ruskuaispussista lähtöisin olevia syöjäsoluja ja F4/80loTIM-4lo solut myeloidisen linjan esisoluja. Tämä tutkimus on ensimmäinen osoitus TIM-molekyylien ilmentymisestä kehittyvissä verisoluissa. Havaitsimme, että TIM-2 ja TIM-4-molekyylejä ekspressoidaan tietyissä soluissa verisolujen erilaistumisen aikana, joten tulevaisuudessa niitä on mahdollista käyttää merkkiproteiineina hematopoieettisten solujen esiasteita eristettäessä.

Abstract Transgenic mice were used to evaluate the roles of collagens XV and XVIII in retinal vessel development and to examine the roles of collagen XV and laminin α4 in peripheral nerve development and function. Also, in vitro methods were used to study the functions of recombinant, full-length human collagen XV produced in insect cells. The lack of collagen XVIII alone was found to result in overproliferation of astrocytes in the mouse retina and deficient vascularization of the retina, which was ultimately rescued by the persistent hyaloid vessels. VEGF mRNA expression was appropriately regulated in the retina of the collagen XVIII deficient mice, which also showed reduced susceptibility to oxygen-induced neovascularization. Lack of collagen XV alone had no obvious effect on the mouse eye, but an abnormal migration of astrocytes onto the persistent hyaloid vessels could be seen in mice lacking both collagens XVIII and XV. Recombinant full-length human collagen XV was seen in rotary shadowing EM as an extended protein with numerous kinks and a globular domain at its N-terminus. The mean length of the molecules was 241 nm and they had a tendency to form aggregates. Collagen XV attaches to the collagen binding region of fibronectin and to a lesser extent to vitronectin and laminin. It was rapidly bound to cultured cells with a staining pattern co-localizing with fibronectin. Collagen XV was also found to inhibit the adhesion and migration of cells in vitro. Lack of collagen XV in mice was found to result in ultrastructural abnormalities in the sciatic nerves, such as polyaxonal myelination and more loosely packed C-fibres, mild impairment of BM assembly and mild motor dysfunction with a lower sensory nerve conduction velocity. Polyaxonal myelination and a failure in the segregation of axons were evident in laminin α4 null mice, which also had diminished amounts of C-fibres, BM abnormalities, diminished myelin and a greater myelin period compared with wild-type mice. They performed poorly in the round beam test and showed diminished compound muscle action potentials. A simultaneous lack of collagen XV and laminin α4 resulted in a permanent defect in the segregation of axons and C-fibre development. The performance of the double null mice on the round beam was poor relative to the other genotypes. / Tiivistelmä Tässä väitöskirjatyössä on tutkittu kollageenien XV ja XVIII merkitystä silmän verkkokalvon verisuonituksen kehittymiselle sekä kollageeni XV:n ja laminiini α4:n merkitystä ääreishermon kehittymiselle ja toiminnalle käyttäen hyväksi muuntogeenisiä hiiriä. Lisäksi tässä työssä on käytetty in vitro –menetelmiä hyönteissoluissa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotetun kollageeni XV:n toiminnan tutkimiseksi. Kollageeni XVIII:n puutteen todettiin johtavan verkkokalvon astrosyyttien määrän lisääntymiseen sekä verkkokalvon suonituksen kehittymiseen epänormaalilla tavalla lasiaissuonista, jotka eivät olleetkaan hävinneet kehityksen aikana. VEGF:n lähetti-RNA:n ilmentyminen oli asianmukaisesti säädelty eri verkkokalvon alueilla kollageeni XVIII:n suhteen poistogeenisillä hiirillä, joilla kehittyi myös vähemmän uudissuonia matalalle hapen osapaineelle altistamisen jälkeen. Kollageeni XV:n puute ei johtanut havaittaviin muutoksiin silmässä, mutta molempien kollageenien XV ja XVIII puuttuessa havaittiin silmässä epänormaalia astrosyyttien soluvaellusta lasiaissuonten päälle. Tässä väitöskirjatyössä osoitetaan, että yhdistelmä-DNA-tekniikalla tuotettu kokopitkä ihmisen kollageeni XV näytti elektronimikroskopiassa pitkältä molekyyliltä, jonka pituus oli keskimäärin 241 nm ja joka sitoutui helposti toisiin kollageeni XV -molekyyleihin. Kollageeni XV sitoutuu fibronektiinin kollageenia sitovaan osaan sekä vitronektiiniin ja laminiiniin. Viljeltyihin soluihin kollageeni XV sitoutui siten, että vasta-ainevärjäyksellä todettiin sen paikallistuvan samoille alueille fibronektiinin kanssa. Kollageeni XV:n todettiin myös vähentävän solujen kiinnittymistä ja liikkumista. Hiirissä kollageeni XV:n puutoksen todettiin johtavan iskiahermoissa polyaksonaaliseen myelinisaatioon, C-säikeiden lievään kehityshäiriöön, tyvikalvon koostumuksen häiriöön, lieviin motorisiin vaikeuksiin ja matalampaan tuntohermojen johtonopeuteen. Laminiini α4 –puutteisilla hiirillä oli todettavissa myös polyaksonaalista myelinisaatiota ja lisäksi häiriö aksonien erottelussa. Niiden hermoista löytyi myös tyvikalvon epämuodostumia, vähemmän myeliiniä ja C-säikeitä sekä suuremmat myeliinijaksot verrattuna villityypin hiiriin. Ne selviytyivät huonosti kävelytestissä ja niiden lihasten aktiopotentiaalit olivat pienemmät kuin kontrollihiirillä. Samanaikainen kollageeni XV:n ja laminiini α4:n puutos johti pysyvään aksonien erottelun ja C-säikeiden kehittymisen häiriöön. Kävelytestissä tuplapoistogeeniset hiiret selviytyivät huonoiten muihin genotyyppeihin verrattuna.

Abstract Desmoglein 3 (Dsg3) is an adhesion receptor in desmosomes, but relatively little is known about its role in cancer. In this study, the function of Dsg3 was investigated in oral squamous cell carcinoma (SCC) cell lines in vitro using locally established human leiomyoma tumor microenvironment (TME) matrices. Since Dsg3 has been identified as a key regulator in cell adhesion, we hypothesized that it may play a role in oral SCC cells adhesion and motility. Thus, one aim of the study was to explore this hypothesis by both gain and loss of function methods in four human buccal mucosa SCC SqCC/Y1 cell lines: transduction of vector control (Ct), full-length (FL) or two different C-terminally truncated Dsg3 mutants (Δ238 and Δ560). Live cell imaging was performed for 2D migration and 3D sandwich, alongside other assays. In 3D sandwich, we tested the effects of the monoclonal antibody, AK23, targeting the extracellular domain of Dsg3 in SqCC/Y1 cells. Our results showed that loss of Dsg3 disrupted cell adhesion and protein expression. In 2D assays, FL and Dsg3 mutants migrated faster with higher accumulated distances than Ct. In contrast with 2D, mutants showed accelerated invasion over the Ct in 3D models. The AK23 antibody inhibited only the invasion of FL cells. The TME in vivo consists of cellular and matrix elements playing a leading role in carcinoma progression. To study carcinoma cells invasion in vitro, mouse Matrigel® and rat type 1 collagen are the most commonly used matrices in 3D models. Since they are non-human in origin, they do not perfectly mimic human TME. To address this, we have developed a solid organotypic myoma disc model derived from human uterus leiomyoma tumor. Here, we introduce a novel Myogel, prepared from leiomyoma similar to Matrigel®. We validated Myogel for cell-TME interactions in 3D models, using SqCC/Y1 and HSC-3 cell lines. Compared with Matrigel® and type I collagen, oral SCC cell lines invaded more efficiently in Myogel containing matrices. This study describes promising 3D models using human TME mimicking Myogel which is suitable to analyze oral SCC cells both in carcinoma monocultures and in co-cultures, such as with TME fibroblasts. We also introduce a possible novel therapeutic target against Dsg3 to suppress cancer cell invasion. / Tiivistelmä Desmogleiini 3 (Dsg3) on desmosomien adheesioreseptori, jonka merkityksestä syövässä tiedetään vähän. Koska Dsg3 on tärkeä epiteelisolujen välisissä liitoksissa, oletimme sillä olevan vaikutusta myös suun karsinoomasolujen tarttumisessa ja niiden liikkuvuudessa. Testasimme hypoteesiamme muuttamalla Dsg3:n toimintaa ihmisen posken karsinoomasolulinjassa SqCC/Y1, josta oli aiemmin valmistettu neljä erilaista muunnosta: tyhjän vektorin sisältävä kontrollisolulinja (Ct), kokopitkää Dsg3 tuottava solulinja (FL), sekä kaksi Dsg3 C-päästä lyhennettyä mutanttisolulinjaa (Δ238 ja Δ560). Immunofluoresenssi-menetelmää käyttäen analysoimme solulinjoissamme solujen välisiä liitoksia. Lisäksi mittasimme solujen liikkeitä 2D-migraatio- ja 3D-sandwich-kokeissa. Testasimme myös Dsg3:n solunulkoista osaa tunnistavan monoklonaalisen vasta-aineen (AK23) vaikutusta solujen invaasioon. Osoitimme, että Dsg3:n rakenteen muuttaminen ja toiminnan estyminen häiritsi solujen tarttumista. 2D-kokeissa sekä FL että mutanttilinjat (Δ238 ja Δ560) migroivat kontrollisoluja nopeammin ja pidemmälle, mutta 3D-kokeissa vain mutanttilinjat invasoituivat kontrollisoluja tehokkaammin. AK23-vasta-aine esti vain FL-solujen invaasiota. Syöpäsolujen 3D-invaasiota mittaavissa kokeissa käytetään yleensä hiiren kasvaimesta valmistettua kaupallista Matrigeeliä® tai rotan kudoksista eristettyä tyypin I kollageenia. Tutkimusryhmämme on jo aiemmin kehittänyt organotyyppisen myoomamallin, jossa valmistamme myoomakudosnapit ihmisen kohdun leiomyoomakasvaimista. Tässä työssä valmistimme leiomyoomasta Myogeelia, vertasimme sitä Matrigeeliin®, sekä tutkimme tarkemmin Myogeeli-valmisteen soveltuvuutta 3D-tutkimuksiin. Totesimme, että kielen (HSC-3) ja posken (SqCC/Y1) karsinoomasolut invasoituivat tehokkaimmin Myogeeli-pitoisissa matrikseissa kuin Matrigeeliä® tai kollageeniä sisältävissä kasvatusalustoissa. Tutkimustulostemme perusteella Myogeeli-pohjaiset 3D-mallit soveltuvat hyvin sekä syöpäsolulinjojen invaasiotutkimuksiin että yhteisviljelmiin, joissa syöpäsoluja viljellään yhdessä syöpäkasvaimen ympärillä olevien solujen, kuten fibroblastien, kanssa.