The class I myosins are an ubiquitous family of non-filamentous, single-headed actin-binding motor proteins. The objective of this study was to identify the light chain composition of the short-tailed Dictyostelium class I myosins, MyoIA and MyoIE. Flag-tagged MyoIA head-neck and MyoIE head-neck constructs were generated and expressed in Dicyostelium discoidem. The MyoIA and MyoIE head-neck constructs both co-purified with a 17-kDa protein that reacted with an anti-calmodulin antibody and exhibited a mobility shift on SDS gels in the presence of calcium. Mass spectrometry analysis confirmed that the light chain bound to MyoIA and MyoIE was calmodulin. The finding that the short-tailed class I Dictyostelium myosins use the generic calcium-binding protein calmodulin as a light chain contrasts with previous work showing that the long-tailed Dictyostelium class I myosins MyoIB, MyoIC, and MyoID each bind a unique, specialized light chain called MlcB, MlcC, and MlcD, respectively. Despite having a calmodulin light chain, calcium did not affect the actin-activated Mg-ATPase activities of MyoIA or MyoIE. The p21-activated kinases (PAKs) are serine-threonine protein kinases that are activated by the small GTPases Cdc42 and Rac. PAKs phosphorylate a site in the motor domain of Dictyostelium class I myosins that is required for myosin activity. Studies were carried out to determine whether Dictyostelium RacB, which is known to bind to and activate Dictyostelium PAKs, promotes the phosphorylation of MyoID in vivo. A vector that expresses a constitutively active RacB under the control of a doxycycline-inducible promoter was created and transformed into Dictyostelium cells. Immunostaining demonstrated that the constitutively active RacB increased actin filament formation in AX3 cells by ~3-fold but by only ~1.5-fold in PakB-null cells. A rabbit polyclonal antibody against the MyoID tail was made. An anti-phospho antibody raised against a phosphorylated peptide corresponding to the MyoID TEDS site was tested and found to specifically recognize purified phosphorylation MyoIA and MyoID. The anti-phospho antibody did not detect phosphorylated MyoIA or MyoID in crude Dictyostelium cell extracts or in immunoprecipitates prepared using the anti-MyoID antibody. Further work is needed to improve the specificity of the anti-phospho MyoID antibody. / Thesis (Master, Biochemistry) -- Queen's University, 2009-09-24 19:51:55.032

A presente pesquisa teve como objetivos identificar as principais especificidades das Organizações da Sociedade Civil e conhecer como essas particularidades (pontos que facilitam ou dificultam) influenciam o desenvolvimento de um planejamento estratégico nessas organizações. Para cumprir os propósitos desta pesquisa, a metodologia estruturou-se na natureza exploratório-descritiva com uma abordagem qualitativa. A coleta de dados foi realizada através de um questionário respondido pela Coordenadora da Casa Ronald McDonald de São Paulo, questionários estes que identificavam a instituição conforme a tabela de classificação internacional de organizações sem fins lucrativos (ICNPO), receita anual, número de colaboradores, nível de importância e influência das especificidades na elaboração do plano, dados sobre o planejamento já existente e o quanto este planejamento contribuiu com a organização (se houve ou não melhorias nos pontos estratégicos trabalhados). Observou-se que o planejamento estratégico no que se refere a empenho dos colaboradores é elevado na instituição, desde que não tenha que disputar o tempo de investimento das estratégias com a operação da organização, neste momento ele ficará em um segundo plano. Os efeitos observados são positivos principalmente nos aspectos de gestão. As especificidades influenciaram de acordo com o nível de maturidade da instituição ou o momento pelo qual ela passou, a Casa Ronald McDonald é uma organização que apresenta muito bom nível de maturidade e vem contribuindo de forma significativa nas ações a que esta destinada. As especificidades mais presentes nessas análises foram classificadas em temas: Gestão do Conhecimento; Formação de Parcerias; Gestão de Projetos; Captação de Recursos; Sustentabilidade; Gestão Financeira; Legitimidade; Recursos Humanos; Gerenciamento do Voluntariado. Em seguida buscou-se compreender, por meio da realização de entrevistas, de que forma as especificidades mais frequentes identificadas na coleta de dados influenciavam facilitando ou dificultando o desenvolvimento do planejamento estratégico da instituição. O estudo conclui que as especificidades mais frequentes no desenvolvimento do planejamento estratégico variam de acordo com o momento vivido pela organização, o orçamento existente à época do desenvolvimento e dos projetos que a instituição tem para realizar. Na Casa Ronald McDonald em seu primeiro momento, a legitimidade, manter o apoio das instituições mantenedoras e ter uma gestão financeira impecável foram as mais presentes. Na etapa seguinte o foco do planejamento foi influenciado nos aspectos de gestão de Recurso Humanos e do Voluntariado, pois a instituição apresenta um quadro enxuto de funcionários que necessita de um contínuo desenvolvimento técnico e a demanda por voluntários para a realização dos projetos é ininterrupta. Com a expansão de atividades da instituição, a gestão de projetos foi mapeada para o próximo planejamento como especificidade que mais deve ser levada em consideração, pois a estrutura existente é restrita. Entre os achados da pesquisa, destaca-se no desenvolvimento do planejamento estratégico da instituição, uma gestão financeira austera, uma tendência de desenvolver projetos com a comunidade local e continuar o processo de formação de novas parcerias. Recomendam-se para estudos futuros, trabalhos que considerem a comparação entre OSCs de diferentes portes dentro do mesmo segmento, possibilitando a verificação de possíveis diferenças. / This study seeks to identify the main specificities of Civil Society Organizations and how such specificities (aspects that facilitate or difficult) affect the strategic planning process within those organizations. The purpose of the research is exploratory, descriptive, with a qualitative approach. Data were collected through the use of questionnaires answered by the Coordinator of the Ronald McDonald House São Paulo. The questionnaires identified the institution according to the international classification of nonprofit organizations (ICNPO). The matters addressed in the questionnaires included the annual revenue, the number of collaborators, how the identified specificities of nonprofit organizations have influenced the planning process, information on previous planning, and to what extent, if any, the strategic plan implemented contributed to improve any of the institution\'s strategic issues. Collaborators show high willingness to engage in the strategic planning provided that it does not interfere with their daily work; otherwise, the planning process will be put aside. Positive results are attained mostly in respect of management issues. Relevant specificities influenced the planning process according to the institution\'s organizational maturity or due to some specific circumstance. The Ronald McDonald House has a good level of maturity and excellently fulfills its purpose. The main specificities influencing the planning refer to: Knowledge Management, Partnerships; Project Management; Fundraising; Sustainability; Financial Management; Legitimacy; Human Resources; Volunteer Management. Interviews were used to determine how the specificities most referred to during the data collection process influenced (by facilitating or complicating) the development of the institution\'s strategic planning. The study concluded that such specificities vary according to changes in circumstances, projects and budgetary availability at the time of developing the planning documents. The Ronald McDonald House initially focused on Legitimacy, securing financial support from sponsor institutions, and implementing sound financial management. At a subsequent stage, the planning focus was influenced by Human Resources and Volunteer issues, as the institution has an adequate number of employees who need continuous technical training and there is an unending demand for volunteer work for the projects. Upon an increase in the institution\'s activities, the needs of project management have been marked as most important because of the institution\'s limited manpower. A sound financial management, a tendency to develop projects with the local community and to further the process of establishing partnerships stand out from among the key findings of the research. Future studies seeking to compare CSOs of varying size operating within the same segment as the institution are recommended.

Les 3-mercaptopyruvate sulfurtransférases (3-MST) et les thiosulfate sulfurtransférases (TST) sont des enzymes ubiquitaires de la famille des thioltransférases à domaine rhodanèse qui catalysent le transfert d’un atome de soufre d’un substrat donneur vers un substrat accepteur via un intermédiaire Cys-persulfure. Les 3-MST sont impliquées dans la formation de sulfure d’hydrogène (H2S), un gazotransmetteur toxique à forte concentration, alors que les TST interviendraient dans son élimination. L’objectif de mon projet était de décrypter les mécanismes moléculaires impliquant ces thioltransférases afin de mieux comprendre leurs rôles physiologiques. Pour cela, le mécanisme catalytique et les spécificités de substrats des enzymes humaines (3-MST, TSTD1 et Rhodanèse) et d’Escherichia coli (3-MST et GlpE) ont été caractérisés grâce à la mise au point de méthodes spécifiques permettant l’étude de chacune des étapes du mécanisme (fluorescence, stopped-flow, sonde H2S) et par une étude des relations structure-fonction menée en collaboration pour les aspects chimie théorique et cristallographie RX. J’ai montré que le site actif de ces enzymes est adapté à la catalyse d’un transfert de S0 à partir de composés soufrés non activés. De plus, le mécanisme de formation de l’intermédiaire persulfure ne dépend pas de l’enzyme mais du substrat donneur. En effet, la rupture de la liaison C-S du 3-mercaptopyruvate requiert la déprotonation des fonctions thiols du substrat et de la Cys essentielle, fonction assurée par la boucle catalytique CysX5 qui constitue un véritable site de reconnaissance thiolate, et l’intervention concomitante d’une molécule d’eau comme catalyseur acide. En présence de thiosulfate, hormis l’activation de la Cys seule la neutralisation des charges négatives du substrat est indispensable à la réaction de transfert de soufre. Enfin, et de façon inattendue, la 3-MST humaine pourrait être impliquée dans l’élimination cytosolique du sulfite, un composé toxique pour les cellules. Quant aux deux TST mitochondriales humaines, elles pourraient intervenir à la fois dans la signalisation cellulaire H2S-dépendante, via la production d’espèces polysulfure, et dans l’élimination d’H2S / 3-mercaptopyruvate sulfurtransferases (3-MSTs) and thiosulfate sulfurtransferases (TSTs) are ubiquitous enzymes that belong to the rhodanese sulfurtransferase family and catalyze the transfer of a sulfur atom from a donor to an acceptor substrate via a cysteine-persulfide intermediate. While 3-MSTs are involved in the biogenesis of hydrogen sulfide (H2S), a gasotransmitter known to be toxic at high concentration, TSTs are likely responsible of its degradation. My project mainly focused on deciphering the sulfurtransferase-dependent molecular mechanisms to better define their physiological functions. To address these questions, their catalytic mechanisms and substrate specificities were investigated. This was achieved through the development of kinetic approaches (fluorescence, stopped-flow, H2S specific probe) to study each step of the reaction catalyzed by human (3-MST, TSTD1 and Rhodanese) and Escherichia coli (3-MST, GlpE) enzymes and structure-function relationship studies performed in collaboration for the theoretical chemistry and the X-ray crystallography parts. Here, I show that the active site of these enzymes is optimized to perform an efficient S0 transfer from non-activated sulfur compounds. Moreover, the mechanisms leading to formation of the persulfide intermediate do not depend on the enzyme but rather on the donor substrate. Indeed, the cleavage of the carbon-sulfur bond of 3-mercaptopyruvate critically depends on the CysX5 catalytic loop acting as a thiolate hole to favor the deprotonation of the essential Cys and the substrate, and on a water-mediated protonation step. In the presence of thiosulfate, the Cys activation mode remains unchanged and the reaction of sulfur transfer is only driven by the neutralization of the negative charges of the substrate. In addition, we propose a new physiological function for the human 3-MST in the cytoplasmic elimination of sulfite, a toxic compound for the cells. Finally, the two human mitochondrial TSTs are likely to be involved in the H2S-mediated cellular signaling, through the formation of polysulfide entities, but also in H2S catabolism

A presente pesquisa teve como objetivos identificar as principais especificidades das Organizações da Sociedade Civil e conhecer como essas particularidades (pontos que facilitam ou dificultam) influenciam o desenvolvimento de um planejamento estratégico nessas organizações. Para cumprir os propósitos desta pesquisa, a metodologia estruturou-se na natureza exploratório-descritiva com uma abordagem qualitativa. A coleta de dados foi realizada através de um questionário respondido pela Coordenadora da Casa Ronald McDonald de São Paulo, questionários estes que identificavam a instituição conforme a tabela de classificação internacional de organizações sem fins lucrativos (ICNPO), receita anual, número de colaboradores, nível de importância e influência das especificidades na elaboração do plano, dados sobre o planejamento já existente e o quanto este planejamento contribuiu com a organização (se houve ou não melhorias nos pontos estratégicos trabalhados). Observou-se que o planejamento estratégico no que se refere a empenho dos colaboradores é elevado na instituição, desde que não tenha que disputar o tempo de investimento das estratégias com a operação da organização, neste momento ele ficará em um segundo plano. Os efeitos observados são positivos principalmente nos aspectos de gestão. As especificidades influenciaram de acordo com o nível de maturidade da instituição ou o momento pelo qual ela passou, a Casa Ronald McDonald é uma organização que apresenta muito bom nível de maturidade e vem contribuindo de forma significativa nas ações a que esta destinada. As especificidades mais presentes nessas análises foram classificadas em temas: Gestão do Conhecimento; Formação de Parcerias; Gestão de Projetos; Captação de Recursos; Sustentabilidade; Gestão Financeira; Legitimidade; Recursos Humanos; Gerenciamento do Voluntariado. Em seguida buscou-se compreender, por meio da realização de entrevistas, de que forma as especificidades mais frequentes identificadas na coleta de dados influenciavam facilitando ou dificultando o desenvolvimento do planejamento estratégico da instituição. O estudo conclui que as especificidades mais frequentes no desenvolvimento do planejamento estratégico variam de acordo com o momento vivido pela organização, o orçamento existente à época do desenvolvimento e dos projetos que a instituição tem para realizar. Na Casa Ronald McDonald em seu primeiro momento, a legitimidade, manter o apoio das instituições mantenedoras e ter uma gestão financeira impecável foram as mais presentes. Na etapa seguinte o foco do planejamento foi influenciado nos aspectos de gestão de Recurso Humanos e do Voluntariado, pois a instituição apresenta um quadro enxuto de funcionários que necessita de um contínuo desenvolvimento técnico e a demanda por voluntários para a realização dos projetos é ininterrupta. Com a expansão de atividades da instituição, a gestão de projetos foi mapeada para o próximo planejamento como especificidade que mais deve ser levada em consideração, pois a estrutura existente é restrita. Entre os achados da pesquisa, destaca-se no desenvolvimento do planejamento estratégico da instituição, uma gestão financeira austera, uma tendência de desenvolver projetos com a comunidade local e continuar o processo de formação de novas parcerias. Recomendam-se para estudos futuros, trabalhos que considerem a comparação entre OSCs de diferentes portes dentro do mesmo segmento, possibilitando a verificação de possíveis diferenças. / This study seeks to identify the main specificities of Civil Society Organizations and how such specificities (aspects that facilitate or difficult) affect the strategic planning process within those organizations. The purpose of the research is exploratory, descriptive, with a qualitative approach. Data were collected through the use of questionnaires answered by the Coordinator of the Ronald McDonald House São Paulo. The questionnaires identified the institution according to the international classification of nonprofit organizations (ICNPO). The matters addressed in the questionnaires included the annual revenue, the number of collaborators, how the identified specificities of nonprofit organizations have influenced the planning process, information on previous planning, and to what extent, if any, the strategic plan implemented contributed to improve any of the institution\'s strategic issues. Collaborators show high willingness to engage in the strategic planning provided that it does not interfere with their daily work; otherwise, the planning process will be put aside. Positive results are attained mostly in respect of management issues. Relevant specificities influenced the planning process according to the institution\'s organizational maturity or due to some specific circumstance. The Ronald McDonald House has a good level of maturity and excellently fulfills its purpose. The main specificities influencing the planning refer to: Knowledge Management, Partnerships; Project Management; Fundraising; Sustainability; Financial Management; Legitimacy; Human Resources; Volunteer Management. Interviews were used to determine how the specificities most referred to during the data collection process influenced (by facilitating or complicating) the development of the institution\'s strategic planning. The study concluded that such specificities vary according to changes in circumstances, projects and budgetary availability at the time of developing the planning documents. The Ronald McDonald House initially focused on Legitimacy, securing financial support from sponsor institutions, and implementing sound financial management. At a subsequent stage, the planning focus was influenced by Human Resources and Volunteer issues, as the institution has an adequate number of employees who need continuous technical training and there is an unending demand for volunteer work for the projects. Upon an increase in the institution\'s activities, the needs of project management have been marked as most important because of the institution\'s limited manpower. A sound financial management, a tendency to develop projects with the local community and to further the process of establishing partnerships stand out from among the key findings of the research. Future studies seeking to compare CSOs of varying size operating within the same segment as the institution are recommended.

L’intervention des tierces parties dans le règlement des différends à l’OMC présente des spécificités par rapport à l’intervention devant d’autres juridictions internationales. La première spécificité consiste en l’accès très fréquent des tierces parties aux consultations, aux travaux des groupes spéciaux et de l’Organe d’appel. Cette fréquence résulte de règles procédurales plutôt favorables et de la politique judiciaire ouverte du juge de l’OMC. En revanche, les droits procéduraux des tierces parties restent encore très restreints. Ils sont imprécis dans la phase de consultations et limités dans la phase des groupes spéciaux. En outre, l’absence d’effet obligatoire des rapports à leur égard a pour conséquence que les tierces parties sont privées de certains droits, tel celui de faire appel. Dans l’ensemble, ces spécificités leur permettent de jouer un rôle important. Leur intervention peut répondre aux besoins d’information du juge et contribuer à la multilatéralisation et à la légitimité du système. Elle peut aider à défendre des intérêts à différents niveaux et surtout elle devient un moyen de renforcer les capacités des pays en développement. Elle comporte parfois des risques et limites pour la mise en œuvre des garanties de la régularité de la procédure, pour certaines évolutions du système et pour la protection des droits et intérêts légitimes des parties principales. Toutefois, ces répercussions demeurent minimes ou sont atténuées grâce aux stratégies mises en place par les parties principales et au contrôle du juge de l’OMC. Dès lors, le bilan de l’intervention qui apparaît globalement positif plaide en faveur du renforcement des droits des tierces parties / The third party intervention in the WTO dispute settlement has specificities compared to that existing in other international jurisdictions. The first one include very frequent access of third parties in the consultations, in the panel and the Appellate Body proceedings. This frequency results from rather favorable procedural rules and an open judicial policy developed by WTO judge in favor of the third parties presence. Contrary to this, the procedural rights of third parties are still very limited. They are imprecise in the consultation phase and limited in the panel phase. In addition, third parties do not have certain rights (for example, the right to appeal) because of the absence of the binding effects of adopted reports on themselves. On the whole, these specificities allow third parties to play really an important role in this system. Their intervention can meet the judge’s information needs and contribute to the multilateralization and legitimacy of the system at a whole. It can also help to defend interests at various levels and thus becomes a procedural mean to build and strengthen the capacity and skills of developing country Members. Their intervention can sometimes involve risks and limitations on the implementation of the guaranties of due process, on certain developments of the system and on the protection of legitimate rights and interests of the main parties. However, these effects are either minimal or mitigated through certain strategies implemented by the parties to dispute or through the control of the WTO judge. Therefore, the results of the intervention which appear generally positive advocates the strengthening of third party’s rights

Made available in DSpace on 2017-07-21T20:31:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarceleLeandro.pdf: 1702311 bytes, checksum: 7690ff333ac782b043b8e30c8c077996 (MD5) Previous issue date: 2011-05-27 / This research is the object of study of mathematics textbooks used for Distance Education (DE). This research was built having as theoretical studies on distance education and the teaching materials for distance education. The question that guides this study is defined as: what are the characteristics, needs and limitations inherent in the educational material focused on mathematics and Distance Education? Faced with this question, due the following objective: to explain the needs, limitations and specifics of Teaching Materials for Undergraduate courses in mathematics at a distance. This research was conducted in the city of Ponta Grossa / PR, with the fields of research, State University of Ponta Grossa (UEPG), characterized as a case study. In the investigation in question, this study referred to the description of the organization of the course textbook Instrumentation for the Teaching of Mathematics in Distance Education I UEPG, the activities of the platform MOODLE and files that complement the textbook, explaining what the specifics, limitations and needs of educational materials developed for distance education. As that investigation, the textbook analysis meets some needs inherent to a material written for this mode, but it shows with some limitations and resource constraints, compromising student learning. Use of MOODLE platform proved to be a necessity and an important tool for interaction and communication between teachers and students, allowing students a more active role in their education, more autonomy, promoting a more efficient construction of their learning and acquisition of their knowledge. / A presente investigação tem como objeto de estudo o material didático de matemática utilizado para a Educação a Distância (EaD). Essa pesquisa foi construída tendo como fundamentação teórica os estudos sobre EaD e sobre o Material Didático para a EaD. A questão que norteia esse estudo é definida como: quais são as especificidades, limitações e necessidades inerentes ao material didático de matemática voltado para e Educação a Distância? Diante dessa questão, decorre o seguinte objetivo: explicitar as necessidades, limitações e especificidades do Material Didático para Cursos de Licenciatura em Matemática a distância. Essa investigação foi realizada no município de Ponta Grossa/PR, tendo como campos de pesquisa a Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG), caracterizando-se como um estudo de caso. Na investigação em questão, esse estudo se referiu a descrição da organização do livro didático da disciplina Instrumentação para o Ensino de Matemática I em EaD da UEPG, das atividades da plataforma MOODLE e dos arquivos que complementam o livro didático, explicitando quais as especificidades, limitações e necessidades dos materiais didáticos elaborados para Educação a Distância. Como resultados dessa investigação, o livro didático analisado cumpre algumas necessidades inerentes a um material escrito para esta modalidade, mas se mostra com algumas limitações e restrições de recursos, comprometendo a aprendizagem dos alunos. A utilização da plataforma MOODLE mostrou-se como uma necessidade e um instrumento importante para a interação e comunicação entre professores e alunos, permitindo ao aluno um papel mais ativo na sua formação, maior autonomia, promovendo uma construção mais eficiente da sua aprendizagem e aquisição do seu conhecimento

L’objectif de cette recherche est d’étudier la coopétition dans les petites entreprises. La coopétition est un sujet de recherche depuis vingt ans maintenant. Cette stratégie fait particulièrement l’objet d’un nombre croissant de publications depuis la fin des années 2000. La coopétition apparaît dans la littérature comme une stratégie paradoxale porteuse de performances mais également de risques pour les entreprises. Ces risques peuvent réduire la performance des entreprises ou bien conduire à l’échec de cette stratégie. Un management de la coopétition apparaît donc comme primordial pour bénéficier pleinement des avantanges de cette stratégie. Cependant, la plupart des études ont été conduites dans des grandes entreprises. Nous ne savons que très peu de choses sur la coopétition dans les petites entreprises. De par la spécificité des petites entreprises d’une part, et la multiplication des stratégies de coopétition dans les petites entreprises d’autre part, la recherche sur la coopétition dans ces entreprises présente de forts enjeux théoriques et empiriques. Cette étude cherche donc à expliquer comment fonctionne la coopétition dans les petites entreprises, c’est-à-dire à décrire ses modalités, à en définir un management efficace pour gérer les risques coopétitifs et à en évaluer l’impact sur la performance. Nous mobilisons une approche qualitative et une approche quantitative pour répondre à ces questions en étudiant le cas des agences immobilières en France. Les résultats de cette étude montrent que : (1) la coopétition dans les petites entreprises obéit drastiquement à la Loi proxémique ; (2) les principes d’intégration individuelle du paradoxe coopétitif, de séparation organisationnelle et de co-management des activités communes entre coopétiteurs sont nécessaires pour manager les risques coopétitifs ; (3) la coopétition impacte positivement la performance dans un contexte de petites entreprises. Les résultats montrent tout l’intérêt de la coopétition pour les petites entreprises et contribue à la connaissance de la théorie générale de la coopétition. / The objective of this research is to study coopetition in small businesses. Coopetition is a subject of research for twenty years now. This strategy is particularly the subject of a growing number of publications since the late 2000s. Coopetition appears in the literature as a paradoxical strategy bringing performance but also risks for companies. These risks may reduce the performance of companies or lead to the failure of this strategy. A particular management of coopetition appears as crucial to fully benefit from the avantanges of this strategy. However, most studies have been conducted in large companies. We know very little about coopetition in small businesses. On the one hand, because of the specificity of small businesses, and on the other hand, the proliferation of coopetition strategies in small businesses, research on coopetition in these companies has strong theoretical and empirical issues. This study seeks to explain how coopetition works in small businesses, that is to say, to describe its modalities, to define an effective management of coopetitive risks and to assess its impact on performance. We mobilize a qualitative approach and a quantitative approach to answer to these questions by studying the case of real estate agencies in France. The results of this study show that: (1) coopetition in small businesses to drastically obeys to the Proximity Law; (2) the management principles of individual integration of coopetitive paradox, of organizational separation, and of co-management of joint activities between coopetitors are necessary to manage coopetitive risks; (3) coopetition positively impacts the performance in a context of small business. The results show the advantage for small businesses to adopt coopetition strategies and contributes to the knowledge on the general theory of coopetition.

Nesse trabalho avaliamos a sensibilidade a drogas in vitro de alguns isolados obtidos de pacientes brasileiros com leishmaniose cutânea. O microteste de MTT modificado mostrou-se eficaz para avaliação da sensibilidade in vitro de promastigotas de Leishmania e macrófagos de medula como modelo de infecção por L. (V.) braziliensis. A atividade de tamoxifeno e anfotericina B foi similar entre os isolados de Leishmania avaliados. Foi observada uma variação maior da sensibilidade ao Glucantime®, sendo que os isolados de L. (V.) braziliensis apresentaram maior sensibilidade a essa droga. Não foi observada correlação da resposta clínica dos pacientes ao tratamento com a atividade in vitro. Avaliamos também a eficácia de tamoxifeno no tratamento de camundongos BALB/c infectados com L. (V.) braziliensis. Observamos que 20 ou 30 mg/kg/dia de tamoxifeno por 15 dias resultou em redução no tamanho das lesões e carga parasitária em comparação com animais controle.Um isolado apresentou morfologia flagelar distinta daquela observada em promastigotas típicos de Leishmania. / In this work we evaluated the in vitro sensitivity to drugs of some isolates from Brazilian patients with cutaneous leishmaniasis. The modified MTT microtest was effective for evaluation of in vitro sensitivity of Leishmania promastigotes and macrophages from bone marrow as a model of infection by L. (V.) braziliensis. The activity of tamoxifen and amphotericin B was similar among isolates of Leishmania evaluated. Sensitivity to Glucantime®, was more variable with isolates of L. (V.) braziliensis presenting higher sensitivity to the drug. There was no correlation between clinical response to treatment with in vitro activity. We have also evaluated the effectiveness of tamoxifen in the treatment of BALB/c mice infected with L. (V.) braziliensis and observed that 20 or 30 mg/kg/day of tamoxifen for 15 days resulted in reduction in the size of lesions and parasite load when compared with control animals. One of the isolates presented atypical flagellar morphology.

β-glicosidases da família 1 das glicosídeo hidrolases (GH 1) são um dos mais importantes grupos de enzimas, estando envolvidas em diversos processos biológicos. Neste trabalho o objetivo principal foi o estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato em β-glicosidases GH 1 utilizando como modelo experimental uma β-glicosidase pertencente a larva de Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Na primeira etapa procurou-se analisar através de mutagênese sítio-dirigida e cinética enzimática o papel na modulação da especificidade pelo substrato e na catálise dos resíduos E190, E194, K201 e M453 da Sfβgli50 , os quais correspondem aos encontrados no sítio de ligação do aglicone das β-glicosidases de milho e de sorgo. Os resultados mostraram que E190 favorece a ligação da porção inicial de aglicones do tipo alquil inicial e também da primeira unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos. E194 favorece a ligação de radicais alquil, enquanto K201 é mais relevante para a ligação de unidades de glicose em detrimento de radicais alquil. O balanço entre as interações com E194 e K201 determina a preferência entre unidades de glicose versus radicais alquil. M453 favorece a ligação da segunda unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos e também da porção inicial de aglicones do tipo alquil. Nenhum destes resíduos interage com a porção terminal de aglicones do tipo alquil. Demonstrou-se que todos estes resíduos contribuem de forma similar e individualmente fraca na estabilização do complexo ES‡ e suas interações com o aglicone não influenciam na ligação do glicone. Na segunda etapa, procurou-se identificar resíduos ou regiões da Sfβgli50 que participem do processo de modulação da especificidade pelo substrato e que ainda não tivessem sido descritos na literatura. Assim, selecionou-se 14 Sfβgli50 mutantes a partir de uma \"biblioteca\" de mutantes geradas por mutagênese aleatória in vivo. As análises de \"contatos\" e de ligações de hidrogênio envolvendo estes resíduos mutados possibilitaram a identificação de outros resíduos e, consequentemente, a construção de mais 32 Sfβgli50 mutantes. Estas 46 Sfβgli50 mutantes foram produzidas em sistema heterólogo de expressão em bactéria, purificadas e caracterizadas cineticamente. A análise dos resultados obtidos sugere que alguns resíduos mutados devem participar da modulação da especificidade pelo substrato formando \"vias de conexão\", de tal forma que mutações em resíduos que compõem uma \"via\" podem ter efeitos propagados através de suas conexões e, assim, atingirem outras porções da Sfβgli50, como o sítio ativo. Esta propagação pode se dar através de alterações no posicionamento espacial e no conjunto das interações não-covalentes entre os resíduos envolvidos. Finalmente um ponto em comum aos efeitos mutacionais analisados parece ser uma alteração na plataforma basal do glicone, W444, o que causaria modificações na preferência relativa pelos substratos fucosídeos e glucosídeos. / The β-glycosidases of family 1 of the glycoside hydrolases (GH 1) are one of the most important groups of enzymes. These enzymes are involved in a high diversity of physiological functions. The main objective of this study was the analysis of the molecular bases of the specificity for substrate of a β-glycosidase from the larvae of Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Initially the role of residues E190, E194, K201 and M453 of Sfβgli50 in modulation of the specificity for the substrate was investigated through site-directed mutagenesis experiments and enzyme kinetic analysis. These residues corresponds to the those found in the aglycone binding site of Zea mays and Sorghum bicolor β-glycosidases. The results showed that E190 favors the binding of the initial portion of alkyl-type aglycones (up to the sixth methylene group) and also the first glucose unit of oligosaccharidic aglycones, whereas a balance between interactions with E194 and K201 determines the preference for glucose units versus alkyl moieties. E194 favors the binding of alkyl moieties, while K201 is more relevant for the binding of glucose units, in detriment of its favorable interaction with alkyl moieties. In addition, M453 favors the binding of the second glucose unit of oligosaccharidic aglycones and also of the initial portion of alkyl-type aglycones. None of these residues interact with the terminal portion of alkyl-type aglycones. It was also demonstrated that E190, E194, K201 and M453 similarly contribute to stabilize ES‡. Their interactions with aglycone are individually weaker than those formed by residues interacting with glycone, but their joint catalytic effects are similar. Finally, these interactions with aglycone do not influence glycone binding. In the second part of this study, new Sfβgli50 residues or portions that participated in the modulation of the substrate specificity were identified. In order to reach this objective, 14 Sfβgli50 mutants were seleted from a \"library\" generated by random mutagenesis in vivo. Based on the \"contacts\" or hydrogen bounds involving these 14 mutated residues 32 additional mutant Sfβgli50 were constructed. These 46 Sfβgli50 mutant were produced in bacteria, purificated and characterized. The results suggest that these residues ways be grouped in \"connective pathways\", a set of residues that contact each other. Mutations in residues that compose a \"pathways\" may be propagated through its connections reaching the Sfβgli50 active site. This propagation may be mediated by alterations in the spatial positioning and the set of non covalent interactions of these residues. Finally, several of these \"connective pathways\" contact a common point in the active site, the basal platform of the glycone subsite, W444.

β-glicosidases da família 1 das glicosídeo hidrolases (GH 1) são um dos mais importantes grupos de enzimas, estando envolvidas em diversos processos biológicos. Neste trabalho o objetivo principal foi o estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato em β-glicosidases GH 1 utilizando como modelo experimental uma β-glicosidase pertencente a larva de Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Na primeira etapa procurou-se analisar através de mutagênese sítio-dirigida e cinética enzimática o papel na modulação da especificidade pelo substrato e na catálise dos resíduos E190, E194, K201 e M453 da Sfβgli50 , os quais correspondem aos encontrados no sítio de ligação do aglicone das β-glicosidases de milho e de sorgo. Os resultados mostraram que E190 favorece a ligação da porção inicial de aglicones do tipo alquil inicial e também da primeira unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos. E194 favorece a ligação de radicais alquil, enquanto K201 é mais relevante para a ligação de unidades de glicose em detrimento de radicais alquil. O balanço entre as interações com E194 e K201 determina a preferência entre unidades de glicose versus radicais alquil. M453 favorece a ligação da segunda unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos e também da porção inicial de aglicones do tipo alquil. Nenhum destes resíduos interage com a porção terminal de aglicones do tipo alquil. Demonstrou-se que todos estes resíduos contribuem de forma similar e individualmente fraca na estabilização do complexo ES‡ e suas interações com o aglicone não influenciam na ligação do glicone. Na segunda etapa, procurou-se identificar resíduos ou regiões da Sfβgli50 que participem do processo de modulação da especificidade pelo substrato e que ainda não tivessem sido descritos na literatura. Assim, selecionou-se 14 Sfβgli50 mutantes a partir de uma \"biblioteca\" de mutantes geradas por mutagênese aleatória in vivo. As análises de \"contatos\" e de ligações de hidrogênio envolvendo estes resíduos mutados possibilitaram a identificação de outros resíduos e, consequentemente, a construção de mais 32 Sfβgli50 mutantes. Estas 46 Sfβgli50 mutantes foram produzidas em sistema heterólogo de expressão em bactéria, purificadas e caracterizadas cineticamente. A análise dos resultados obtidos sugere que alguns resíduos mutados devem participar da modulação da especificidade pelo substrato formando \"vias de conexão\", de tal forma que mutações em resíduos que compõem uma \"via\" podem ter efeitos propagados através de suas conexões e, assim, atingirem outras porções da Sfβgli50, como o sítio ativo. Esta propagação pode se dar através de alterações no posicionamento espacial e no conjunto das interações não-covalentes entre os resíduos envolvidos. Finalmente um ponto em comum aos efeitos mutacionais analisados parece ser uma alteração na plataforma basal do glicone, W444, o que causaria modificações na preferência relativa pelos substratos fucosídeos e glucosídeos. / The β-glycosidases of family 1 of the glycoside hydrolases (GH 1) are one of the most important groups of enzymes. These enzymes are involved in a high diversity of physiological functions. The main objective of this study was the analysis of the molecular bases of the specificity for substrate of a β-glycosidase from the larvae of Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Initially the role of residues E190, E194, K201 and M453 of Sfβgli50 in modulation of the specificity for the substrate was investigated through site-directed mutagenesis experiments and enzyme kinetic analysis. These residues corresponds to the those found in the aglycone binding site of Zea mays and Sorghum bicolor β-glycosidases. The results showed that E190 favors the binding of the initial portion of alkyl-type aglycones (up to the sixth methylene group) and also the first glucose unit of oligosaccharidic aglycones, whereas a balance between interactions with E194 and K201 determines the preference for glucose units versus alkyl moieties. E194 favors the binding of alkyl moieties, while K201 is more relevant for the binding of glucose units, in detriment of its favorable interaction with alkyl moieties. In addition, M453 favors the binding of the second glucose unit of oligosaccharidic aglycones and also of the initial portion of alkyl-type aglycones. None of these residues interact with the terminal portion of alkyl-type aglycones. It was also demonstrated that E190, E194, K201 and M453 similarly contribute to stabilize ES‡. Their interactions with aglycone are individually weaker than those formed by residues interacting with glycone, but their joint catalytic effects are similar. Finally, these interactions with aglycone do not influence glycone binding. In the second part of this study, new Sfβgli50 residues or portions that participated in the modulation of the substrate specificity were identified. In order to reach this objective, 14 Sfβgli50 mutants were seleted from a \"library\" generated by random mutagenesis in vivo. Based on the \"contacts\" or hydrogen bounds involving these 14 mutated residues 32 additional mutant Sfβgli50 were constructed. These 46 Sfβgli50 mutant were produced in bacteria, purificated and characterized. The results suggest that these residues ways be grouped in \"connective pathways\", a set of residues that contact each other. Mutations in residues that compose a \"pathways\" may be propagated through its connections reaching the Sfβgli50 active site. This propagation may be mediated by alterations in the spatial positioning and the set of non covalent interactions of these residues. Finally, several of these \"connective pathways\" contact a common point in the active site, the basal platform of the glycone subsite, W444.