Le but de ce projet était d'identifier de manière méthodique et standardisée les partenaires interagissant avec la protéine dystrophine dans les cellules musculaires squelettiques humaines différenciées et découvrir de nouveaux rôles de la dystrophine. Des cellules immortalisées ont été obtenue en sur-exprimant de manière stable hTERT / CDK4. Nous avons réalisé une analyse transcriptomique comparant des lignées immortalisées avec leurs populations primaires correspondantes, à l’état de prolifération et de différentiation. Nous avons constaté que l'immortalisation n'a pas d'effet mesurable sur le programme myogénique ou sur tout autre processus cellulaires, et qu'elle avait un effet protecteur contre le processus de sénescence. Les lignées de cellules musculaires humaines constituent donc de bon model in vitro pour l’étude de l’interactome de la dystrophine. Nous avons déterminé l’interactome de la dystrophine en utilisant l’approche proteomique ‘QUICK’. Nous avons identifié 18 nouveaux partenaires directs de la dystrophine, partenaires étant impliqués dans le transport vésiculaire ou étant des protéines d'adhésion. Ces résultats renforcent les données précédemment publiées suggérant un lien entre la dystrophine et le trafic vésiculaire, ainsi que dystrophine et adhesion cellulaire. Ces nouveaux partenaires ont été ajoutés à l’interactome de la dystrophine, interactome accessible sur le Web: sys-myo.rhcloud.com/dystrophin-interactome. Ce site web est dédié à être un outil facile d’utilisation permettant d’explorer et de visualiser l’interactome de la dystrophine du muscle squelettique. / The aim of this project was to systematically identify new interaction partners of the dystrophin protein within differentiated human skeletal muscle cells in order to uncover new roles in which dystrophin is involved, and to better understand how the global interactome is affected by the absence of dystrophin. hTERT/cdk4 immortalized myogenic human cell lines represent an important tool for skeletal muscle research however, disruption of the cell cycle has the potential to affect many other cellular processes to which it also linked. A transcriptome-wide analysis of healthy and diseased lines comparing immortalized lines with their parent primary populations in both differentiated and undifferentiated states testing their myogenic character by comparison with non-myogenic cells found that immortalization has no measurable effect on the myogenic cascade or on any other cellular processes, and that it was protective against the senescence. In this context the human muscle cell lines are a good in vitro model to study the dystrophin interactome. We investigated dystrophin’s interactors using the high-sensitivity proteomics ‘QUICK’ approach. We identified 18 new physical interactors of dystrophin which displayed a high proportion of vesicle transport related proteins and adhesion proteins, strengthening the link between dystrophin and these roles. The proteins determined through previously published data together with the newly identified interactors were incorporated into a web-based data exploration tool: sys-myo.rhcloud.com/dystrophin-interactome, intended to provide an easily accessible and informative view of dystrophins interactions in skeletal muscle.

Chaque jour de nouveaux produits synthétiques sont produits et se retrouvent plus tard dans l’environnement. À l’heure actuelle, des normes sont mises en place pour la régulation d’émission de nombreux contaminants, mais nombre d’entre eux ne sont encore soumis à aucune loi. De par leurs faibles présences dans la nature, la mise en place de règlementations est une tache rigoureuse. En effet, les règlementations sont majoritairement basées sur des essais de toxicité aigüe car la prise en compte des effets dus aux concentrations traces ainsi que la complexité des molécules présentes nécessitent une instrumentation analytique très spécifique. Les effets au long terme ne sont donc que rarement pris en compte dans la législation. Cependant de nombreuses études ont prouvées que des concentrations traces peuvent avoir des impacts importants sur la croissance de nouveaux nés pour de nombreuses espèces. C’est par exemple le cas des composés biphényls polychlorés qui ont été prouvés comme retardant la croissance des nouveaux nés humains soumis à une contamination in-utéro. De même une exposition aux néonicotinoïdes est corrélée avec une augmentation de l’infertilité de plusieurs espèces aviaires. Les concentrations retrouvées dans ces cas sont en dessous des normes existantes mais des effets subléthaux importants sont observés. Ces effets dépendent de beaucoup trop de facteurs pour pouvoir être quantifiés de façon suffisamment rigoureuse pour les incorporer dans des règlementations officielles. Bien que certains organismes considèrent ces effets dans des lignes directives, tel que l’EPA, elles ne peuvent pas être appliquées dans des lois de par leurs dépendances à des conditions précises. La présence d’un contaminant peut s’avérer dangereuse pour l’environnement mais une dynamique différente peut avoir lieu si plusieurs d’entre eux sont présents. La toxicité individuelle de chaque composé peut être accrue ou diminuée en la présence d’autres contaminants, ceci est appelé l’effet cocktail (effet synergique, antagoniste, agoniste, etc). Ainsi ces effets obtenus en laboratoire ne reflètent pas la réalité environnementale de ces contaminations. La quantification simultanée de nombreux composés est un domaine qui se développe de plus en plus. Son utilité est bien réelle car elle permet d’augmenter le nombre de méthodes robustes et ainsi améliorer la qualité des normes actuelles pour l’analyse multirésiduelle de contaminants organiques. Le développement de méthodes simples, robustes et efficaces est un domaine très important en chimie analytique. Cependant la plupart des méthodes multirésiduelles sont réalisées sur des composés ayant des propriétés physico chimiques très proches. Pour ce mémoire, les études sont faites sur des composés appartenant à différentes familles et couvrant une vaste gamme de propriétés physico chimiques afin d’avoir une meilleure représentation des contaminations environnementales réelles. L’un des principaux obstacles de ce genre de travaux est la nature de la matrice étudiée. Plus la matrice va être complexe, plus les interactions avec les analytes et ou le solvant vont variées, rendant l’extraction de composés ayant des propriétés différentes plus délicate. Les travaux présentés dans ce mémoire consistent en le développement de méthodes d’analyse de contaminants dans des matrices biologique dans le but de les utiliser comme outils de marqueurs de contamination environnementale (projets parallèles). Le premier projet s’incruste dans l’étude GESTE (Grossesse et Enfant en Santé – étude sur la Thyroïde et l’Environnement) qui a pour but, entre autres, d’étudier l’effet de stress in-utéro sur le développement des enfants. Les contaminants ont pu être détectés par analyse de méconiums récupérés à la naissance de l’enfant. La méthode d’extraction utilisée consiste en une étape d’extraction solide-liquide, suivie d’une purification par dispersion de phase solide et analyse par UPLC-MS/MS Xevo TQ (Waters) pour les contaminants organiques. La séparation est faite à l’aide d’une colonne 100 mm x 2.1 mm, 1.8 µm équipé d’un pré filtre de 0.2 µm (Waters). Les contaminants inorganiques sont minéralisés dans de l’acide nitrique puis dilués pour analyse par ICP-MS Xserie II (Thermo Scientifique). Ces méthodes ont été appliquées sur 500 échantillons provenant principalement de la région de l’Estrie au Québec (Canada). Les résultats montrent des concentrations inférieures à celles rapportées dans la littérature pour l’analyse de contaminants organiques ainsi qu’inorganiques. Ceci montre que l’Estrie est une région ou l’exposition à ces contaminants est faible. Les seules exceptions sont la caféine et l’acétaminophène. Leurs taux de détections sont de 20 à 30% plus élevés que ceux reportés dans la littérature et leurs concentrations moyennes sont 5 à 10 fois plus importantes. Le second projet est le développement d’une méthode d’analyse de perturbateurs endocriniens dans des eaux usées. Ce projet est fait en collaboration avec le groupe SMi dans le but d’accroitre leurs prestations analytiques en développant une méthode performante d’analyse des nonylphenoles. La méthode consiste à une extraction sur phase solide (Strata X) d’échantillon d’eau et une élution au méthanol puis une analyse par UPLC-MS/MS. Les composés sont séparés sur une colonne BEH C18 1.7 µm; 2.1x50 mm (Waters). Cette méthode a pu être validée avec les critères imposés par la compagnie.

La maladie de Fabry est une maladie de surcharge lysosomale liée au chromosome X. Elle est causée par une mutation au niveau du gène GLA qui provoque un déficit de l’enzyme α-galactosidase A. Elle entraîne une accumulation de glycosphingolipides tels le globotriaosylcéramide (Gb3), le globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) et galabiosylcéramide (Ga2) ainsi que leurs isoformes/analogues respectifs au niveau des tissus et des liquides biologiques des patients. Les symptômes peuvent se présenter de manière très variable soit par de l’acroparesthésie, des troubles ophtalmologiques, des angiokératomes, des troubles cardiaques, rénaux ou encore neurologiques. Les connaissances au niveau physiopathologique de la maladie de Fabry sont à ce jour, toujours déficientes. Les biomarqueurs analysés ne permettent pas de prédire la sévérité et la progression de la maladie. Afin d’apporter des connaissances plus approfondies à ce niveau, l’objectif principal de cette étude était d’analyser les biomarqueurs au niveau cellulaire pour des patients atteints de la maladie. Les objectifs secondaires étaient: 1) de développer et de valider une méthode en spectrométrie de masse en tandem pour la quantification relative et simultanée de certains biomarqueurs susmentionnés dans les leucocytes, les lymphocytes B et les monocytes de patients Fabry et contrôles sains; 2) d’évaluer les biomarqueurs dans le total des leucocytes, les lymphocytes B, les monocytes, le plasma et l’urine chez les patients Fabry et les contrôles sains appariés selon le sexe et l’âge; et 3) d’établir des corrélations entre la quantité relative de ces biomarqueurs et le génotype des patients traités et non traités. Les résultats de cette étude démontrent qu’il n’y a pas de changements significatifs dans la distribution des groupes d’isoformes/analogues du Gb3 selon le type cellulaire pour les patients et les contrôles. La découverte d’isoformes/analogues méthylés du Gb3 suggère un processus de méthylation qui se produit directement au niveau des cellules sanguines et particulièrement pour les lymphocytes B et les monocytes. Des corrélations face à la quantité de biomarqueurs et le génotype ont été établies. Ces résultats pourraient permettre une meilleure compréhension des processus biochimiques reliés à l’accumulation du Gb3 dans les cellules sanguines.

Depuis plusieurs années, des mortalités anormalement élevées sont observées chez les abeilles, au niveau mondial. Plusieurs facteurs peuvent être à l’origine de ces phénomènes, dont l’utilisation de pesticides. Parmi ceux-ci, les insecticides de la famille des neonicotinoides et des pyrethrinoides ainsi que certains fongicides de la famille des carboxamides sont mis en cause. Les travaux présentés dans ce manuscrit sont consacrés au développement de méthodes analytiques pour l’identification, la détection et la quantification de 13 pesticides et leurs métabolites dans les abeilles et les produits de la ruche tels que le pain d’abeille et la cire d’abeille. Dans un premier temps, une méthode originale par dSPE a été développée pour l’extraction des pesticides cibles dans la cire d’abeille. Combinée à une méthode d’analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse triple quadripole (UPLC-MS/MS), elle permet d’atteindre des limites de quantification jamais atteintes auparavant en multi-familles sur cette matrice complexe, comprises entre 1 et 40 ng.g-1. L’application de cette méthode sur des cires ainsi que l’analyse d’autres matrices apicoles fournis par des apiculteurs (au total 488 échantillons dont 125 abeilles, 87 cires et 276 pains d’abeille) ont montré une large présence de ces pesticides dans les ruchers français. Globalement, la cire d’abeille est la matrice présentant les plus fortes concentrations et le pain d’abeille est la matrice la plus contaminée en termes de nombre de pesticides présents. Une seconde partie des travaux est dédiée à la détection et à l’identification des métabolites de pesticides générés par des expérimentations in vitro et in vivo. Pour cela, une stratégie analytique, basée sur la complémentarité entre la spectrométrie de masse à temps de vol et triple quadripole, a été mise en place. La première permet l’identification des métabolites par la combinaison de la recherche de métabolites connus et de profils isotopiques spécifiques (Cl, Br, S). La seconde permet leur détection et leur quantification dans des échantillons d’abeille. Cette double approche a notamment permis d’identifier 9 métabolites de pesticides et 5 marqueurs d’exposition. Des métabolites et marqueurs d’exposition au boscalide (carboxamide), principalement issus de réactions d’hydroxylation, deshalogenation et substitution, ont été synthétisés. Ces derniers ont ensuite été détectés et quantifiés dans des échantillons d’abeilles issus de ruchers symptomatiques. Les développements analytiques et résultats permettent, d’une part, de faire un état des lieux de la présence de pesticides jugés préoccupants dans les ruchers français. D’autre part, ils fournissent aux écotoxicologues des données permettant de mieux comprendre les modes d’action des pesticides chez les abeilles / For several years, abnormally high mortalities have been observed in bees worldwide. Several factors may be responsible for these phenomena, including the use of pesti-cides. Among these, insecticides of the family of neonicotinoids and pyrethroids as well as some fungicides of the carboxamide family are implicated. The work presented is devoted to the development of analytical methods for the identification, detection and quantification of 13 pesticides and their metabolites in bees and hive products such as beebread and beeswax.Initially, an original dSPE method was developed for the extraction of targeted pesti-cides in beeswax. Combined with a liquid chromatographic analysis method coupled to triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS), it allows to reach limits of quantification never reached before in multi-families analysis on this complex matrix, between 1 and 40 ng.g-1.The application of this method to beeswaxes and the analysis of other beekeeping matrices provided by beekeepers (a total of 488 samples including 125 bees, 87 bees-waxes and 276 honeybees) showed a wide presence of these pesticides in french apiar-ies. Overall, beeswax is the matrix with the highest concentrations and beebread is the most contaminated matrix in terms of number of pesticides present.A second part of the work is devoted to the detection and identification of pesticide metabolites generated by in vitro and in vivo experiments. For this, an analytical strategy, based on the complementarity between time-of-flight and triple-quadrupole mass spectrometry, has been put in place. The first allows the identification of me-tabolites by combining the search for known metabolites and specific isotopic profiles (Cl, Br, S). The second allows their detection and quantification in bee samples.This dual approach has identified 9 pesticide metabolites and 5 markers of exposure. Metabolites and markers of exposure to boscalid (carboxamide), mainly derived from hydroxylation, dehalogenation and substitution reactions, have been synthesized. These were then detected and quantified in bee samples from symptomatic apiaries.These analytical developments and results make it possible, on the one hand, to make an inventory of the presence of pesticides of concern in french apiaries. On the other hand, they provide ecotoxicologists with data to better understand the behavior of pesticides in bees

Des techniques de séquençage existent pour les biopolymères comme les protéines et l'ADN et ont permis de révolutionner la biologie moderne. Toutefois, des techniques similaires dédiées au séquençage des carbohydrates n'ont pas encore été développées à cause de la complexité de cette classe de biomolécules. Dans ce contexte, nous avons construit un instrument couplant spectroscopie vibrationnelle et spectrométrie de masse (MS/IR) afin de caractériser la structure des carbohydrates grâce à leur signature infrarouge.Dans cette thèse, nous avons démontré que cette métrique permet de différencier les différentes isoméries présentes dans la classe des carbohydrates : la nature des monosaccharides, la position des modifications fonctionnelles ainsi que la régio- et la stéréochimie de la liaison glycosidique. Ensuite la conservation de la structure moléculaire des ions après fragmentation a été démontrée sur des fragments de disaccharides permettant ainsi d'établir les règles du séquençage de carbohydrates par MS/IR. Cette méthode a ensuite été appliquée sur différents oligosaccharides.Enfin dans la dernière partie de ce manuscrit, le potentiel de la spectroscopie IRMPD dans l'infrarouge lointain est exploré pour la résolution des anomères, des isomères et des conformations. Finalement deux approches permettant une séparation en masse et en isomère en amont de l'analyse spectroscopique sont proposées : spectroscopie IRMPD 2 couleurs ou couplage avec la chromatographie liquide / Sequencing techniques have been established for proteins and DNA and have revolutionised modern biology but similar technique do not exist for carbohydrates due to their unique complexity. In this context, we have built an instrument coupling vibrational spectroscopy and mass spectrometry (MS/IR) dedicated to the structural characterization of carbohydrates.In this thesis, we have shown that the IR signature is a powerful metric which is able to resolve simultaneously all carbohydrate isomerisms: the monosaccharide content, the position of functional modifications, the regiochemistry and the stereochemistry of the glycosidic linkage. Then the conservation of the molecular structure of MS fragments has been revealed on disaccharide fragments. Following this demonstration we have established the carbohydrate sequencing rules using MS/IR and applied them for the determination of the sequence of different oligosaccharides.Finally the potential of the IRMPD spectroscopy in the Far-IR range is explored for anomers, isomers and conformations resolution as well as the utilisation of a two colors infrared spectroscopy or the coupling with an HPLC instrument

Dans le cadre d’une action préventive, la mesure de la dose interne pulmonaire est plus pertinenteque la mesure de l’exposition atmosphérique car la dose interne est la quantité de toxique pouvantinteragir avec les cellules de l’épithélium respiratoire. En santé-travail, le dosage urinaire est fréquemmentutilisé mais il ne représente que le résultat final de l’épuration de multiples organes. Lecondensat d’air exhalé (EBC) est le liquide obtenu de façon non invasive après refroidissement del’air expiré d’un sujet au repos. Ce liquide est constitué de l’aérosolisation du liquide recouvrantl’épithélium respiratoire du compartiment alvéolaire et aussi du compartiment trachéobronchique oubronchique. Nous proposons d’utiliser l’EBC comme une approche alternative pour la surveillancebiologique des salariés. Les modèles cinétiques d’épuration pulmonaire actuels montrent que lesparticules déposées dans le compartiment alvéolaire ont une épuration très lente. Nous avons doncvoulu savoir si l’EBC était une matrice reflétant l’exposition pulmonaire en particules inhalées.Objectifs : 1) évaluer la faisabilité de la détection de particules minérales ou métalliques dans l’EBCde salariés exposés, 2) corréler la concentration de ces particules dans l’EBC avec les concentrations atmosphériques de ces particules obtenues pendant le poste de travail et avec les dosages urinaires.Matériel et Méthode : Nous avons analysé les EBC de salariés issus de trois secteurs d’activité professionnelle. La 1ère étude concernait un salarié d’une unité de broyage de muscovite atteint d’une infiltration pulmonaire diffuse. La 2ème étude était une étude « exposé/non-exposé »concernant un groupe de soudeurs utilisant la technique « metal inert gaz » (MIG). La 3ème étudeétait une étude « exposé/non-exposé » de salariés exposés à des composés solubles de bérylliumdans le secteur de l’aluminerie dans 2 entreprises différentes.Résultats Etude n°1 : L’analyse minéralogique de l’EBC a retrouvé des particules ayant le même profil spectral en spectrométrie Raman que les particules prélevées dans l’atmosphère de l’entreprise. L’analyse minéralogique du parenchyme pulmonaire a montré la présence d’une concentration élevée de particules compatibles avec des particules de muscovite.Etude n°2 : Les concentrations de manganèse et de nickel dans l’EBC (Mn-EBC, Ni-EBC) dosées par ICP-MS étaient significativement plus élevées chez les soudeurs que chez les témoins alors que cette différence n'était pas significative pour le Mn urinaire (Mn-U). Les concentrations de Mn-EBC et de Ni-EBC ne sont pas corrélées avec leur concentration respective dans l'urine. Les régressions linéaires ont trouvé des coefficients significativement positifs entre les concentrations de Mn-EBC,Ni-EBC, Ni-U et Cr-U et les indices d’exposition cumulée.Etude n°3 : Les concentrations de béryllium et d’aluminium dans l’EBC (Be-EBC, Al-EBC) étaient significativement plus élevées chez les sujets de l’entreprise n°1 que chez les témoins alors que leurs concentrations dans les urines ne l’étaient pas. Les régressions linéaires ont trouvé des coefficients significativement positifs entre les concentrations de Be-EBC et celle d’Al-EBC mais aussi entre les concentrations de Be-EBC et l’indice d’exposition cumulée. Les concentrations d’Al-EBC et Al-U étaient significativement plus élevées chez les sujets de l’entreprise n°2 que chez les témoins. [...] / Medical follow-up of employees in occupational medicine requires the use of biological exposure indices that are frequently measured in urine or blood and thus reflect the result of purification by multiple organs. It seems appropriate to evaluate the internal pulmonary dose of occupational toxins to detect their potential early impact. This internal dose could previously only be known after performing invasive techniques such as bronchoalveolar lavage. The exhaled breath condensate (EBC) is a liquid obtained non-invasively after cooling the exhaled air of a subject at rest. It consists of the aerosolization of the liquid that covers the respiratory epithelium of the alveolar compartment and the tracheobronchial or bronchial compartment. Many studies have investigated the markers of inflammation in this matrix but very few have studied the markers of exposure. The current clearance lung models show that the clearance of inhaled particles is variable depending on the region (tracheobronchial , bronchiolar or alveolar region) and a significant proportion of these particles has a slow clearance. Therefore, we hypothesize that EBC could be a matrix that should reflect the pulmonary exposure of inhaled particles during occupational exposure.AimsThe first aim of our study was to assess the feasibility to detect mineral or metallic particles in the EBC of exposed workers. The second objective was to correlate the EBC concentration of these particles with their atmospheric concentrations measured during work.We analyzed EBC from employees engaged in three occupational activities.The first study involved an employee of a milling unit of muscovite suffering from diffuse infiltrative lung disease who underwent a collection of condensate, a lung biopsy, and a dual-source, dual-energy computed tomography. A mineralogical analysis was performed on the EBC, lung tissue, and atmospheric dust collected at the plant.The second study was an exposed-unexposed study on a group of welders using a technique called "metal inert gas" (MIG) welding for assembling steel structures during the production of rail transport (in collaboration with the Association Santé Travail de l’Arrondissement de Valenciennes - ASTAV). Metals of interest in this study were manganese (Mn), nickel (Ni), iron (Fe), and chromium (Cr). Air samples were performed at the plant in order to calculate a cumulative exposure index for the week and thence the welding history for each metal of interest.The third study was a national exposed-unexposed study of workers exposed to soluble beryllium compounds in an aluminum smelter (in collaboration with the Institut National de Recherche et de Sécurité - INRS). The recruitment of exposed subjects was carried out in the electrolysis area production (Area “A”) and in the area of anodes repair (area “B”). Metals of interest in this study were the beryllium (Be), and aluminum (Al). A task-exposure matrix allowed us to calculate a cumulative exposure index of beryllium.Groups (exposed and control) of the second and third study underwent a collection of condensate, a urine collection (U), and pulmonary function tests (PFT) including measurement of exhaled NO. Cumulative exposure indices were correlated with metal concentrations in EBC.The use of new techniques was necessary for the determination of particles in the EBC as Raman spectroscopy for mineral muscovite particles (collaboration with EA 4490 Faculty of Dental Surgery) and inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP- MS) for the metal particles in the EBC (in collaboration with the Ultra Trace Analyse Aquitaine - UT2A ) and urine (in collaboration with the Centre Universitaire de Mesures et d’Analyses – CUMA, Lille 2 ). [...]

Le tritium est un radioélément produit par fission ternaire ou activation neutronique au sein des réacteurs de fission et utilisé comme combustible dans les machines de fusion (comme, en autres, le JET en Angleterre ou le futur ITER à Cadarache). Des études sont actuellement en cours sur la gestion de cette ressource que ce soit en vue de son utilisation ou de son élimination d’effluents gazeux, liquides ou de déchets. Cette thèse se propose d’étudier la revalorisation du tritium en tant que combustible pour les machines de fusion par le biais d’un Réacteur Catalytique à Membrane (RCM). Celui-ci associe les phénomènes de conversion catalytique de l’eau tritiée, par échange isotopique avec le diprotium selon la réaction générique Q_2 O+H_2⇌H_2 O+Q_2 (Q=H,D ou T), et de perméation sélective, d’une membrane à base de palladium. Ce matériau présente une perméabilité exclusive aux isotopes de l’hydrogène H, D et T par formation respective d’hydrures, deutérures ou tritiures de palladium. Au sein du RCM, ces flux transmembranaires permettent, par retrait des produits de réactions, d’atteindre des taux de conversion plus élevés que dans un réacteur à lit fixe à parois imperméables (loi de Le Chatelier). Au CEA, un banc d’essais utilisant le deutérium comme simulant du tritium a été construit dans l’objectif d’étudier de manière séparée, à l’échelle du laboratoire, ces propriétés de conversion et de perméation ainsi que leur couplage. Grâce au développement d’une méthode permettant l’analyse simultanée des isotopologues de l’eau et du dihydrogène par spectrométrie de masse, il a été montré, d’une part, que le catalyseur à base de nickel utilisé présente une activité suffisante pour que l’état d’équilibre thermodynamique des réactions d’échange isotopique soit atteint très rapidement et d’autre part, que le flux de perméation des isotopologues du dihydrogène suit une loi de Richardson. Des analyses de sensibilités sur les paramètres opératoires montrent que les performances globales du RCM (i.e. facteur de dédeutération) croissent avec la température, la différence de pression transmembranaire, le débit de balayage et le temps de séjour dans le tube, mais passent par un maximum avec la variation de la teneur en vapeur d’eau lourde dans le gaz à traiter. Sur la base de ces observations, un modèle phénoménologique quantifiant les transferts de quantités de mouvement et de matière a été développé. Il rend compte du comportement global observé expérimentalement même si un effort reste à fournir sur la modélisation de la perméation des espèces hétéronucléaires. Grâce aux principes physiques sur lesquels il est basé et aux règles de similitudes existant entre les propriétés physico-chimiques des différents isotopologues (loi de Graham), ce modèle est aisément extrapolable au traitement d’espèces tritiées.

La spectrométrie de masse est un outil performant pour identifier des biomarqueurs protéines dans des fluides biologiques. Plusieurs modes sont accessibles dont le mode « Data Independent Acquisition » (DIA), qui permet une sélection et une fragmentation exhaustive de tous les peptides détectables par l'appareillage. Cependant, ce mode génère des spectres de (co)-fragmentation très complexes rendant l'étape d'identification délicate. Pour surmonter cette limitation, nous nous sommes tournés vers une méthode d'activation des ions spécifique. La photodissociation laser (LID) à 473 nm, longueur d'onde à laquelle les peptides n'absorbent pas naturellement, a été implémentée dans un appareil Qexactive. La spécificité de fragmentation est induite après dérivation spécifique des peptides à cystéine (acide aminé rare présent globalement à 2 % mais présent dans 89 % des protéines) à l'aide d'un chromophore absorbant à 473 nm. Dans un premier temps, une bibliothèque de 354 spectres LID de peptides à cystéine dérivés a été créée pour le développement de la méthode DIA-LID. Cette méthodologie DIA-LID a ensuite été utilisée pour identifier et quantifier des biomarqueurs protéines kinases humaines putatifs endogènes au sein d'un extrait cellulaire mammaire cancéreux humain. Les comportements de fragmentation de 401 peptides à cystéine dérivés en LID à 473 nm ont également été étudiés permettant l'optimisation des méthodes d'identification et de quantification. Pour finir, une nouvelle méthodologie, intitulée C-trap-LID, a été appliquée pour repérer et extraire rapidement tous les m/z des ions précurseurs détectables par l'appareillage ayant photo-fragmentés dans une matrice complexe / Mass spectrometry is a powerful tool to detect putative proteins biomarkers in biological samples. Several methods are accessible, including Data Independent Acquisition (DIA) which allows the fragmentation of all detectable peptides in high resolution mass spectrometer. However, DIA methods are not able to exhaustively identify compounds due to the excessive complexity of fragmentation spectra of multiple precursor ions. Thus, we developed an alternative technique that adds specificity during fragmentation step to detect only a subset of peptides. We replaced the classical gas-collision fragmentation by a highly specific laser-induced photodissociation (LID) at 473 nm, for which peptides do not naturally absorb, in a Q-exactive. The specific absorption and photofragmentation is induced by grafting an adequate quenching chromophore to the thiol group of cysteine-containing peptides (a rare amino acid with a frequency of 2 % but present in 89 % of all human proteins) through a chemically controlled route. First, to develop the DIA-LID method, a spectral library including LID spectra of 354 cysteine-containing peptides was built. Then, this methodology was used to identify and quantify putative human protein kinases biomarkers in human cancerous mammalian cells. Simultaneously the fragmentation behavior of 401 derivatized cysteine-containing peptides was studied to rationalize the choice of peptides to provide the maximum of information to identify them in LID for discovery approaches. In closing, a new methodology named C-trap-LID, was introduced and applied to spot and extract quickly m/z related to all detectable derivatized cysteine-containing compounds in complex medium

La technique d’ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI) est l’une des plus fréquemment utilisées lors des analyses de spectrométrie de masse. Découverte il y a 28 ans, elle est encore activement développée. Malgré son vaste domaine d’utilisation et de nombreux travaux menés à ce sujet, les mécanismes de formation des ions restent toutefois vivement discutés. La grande majorité de ces études, visant notamment à rationaliser les principes qui régissent la formation des ions, sont réalisés sur des peptides en mode ion positif. Le travail de cette thèse vise à combler cette lacune et s’attache à explorer le mode ion négatif par l’étude de l’ionisation de polyoxométallates hybrides, qui sont des oxydes métalliques assemblés et greffés de fonctions organiques. Les polyoxométallates portent plusieurs charges négatives en solution et, à la suite de l’ionisation MALDI, ont été détectés sous forme d’ions mono-chargés, donc comme des adduits avec divers cations. En se basant sur les deux principaux modèles décrivant les mécanismes de formation des ions, nous avons proposé un modèle pour l’ionisation de nos composés fondé sur nos observations expérimentales. Le grand nombre de cations utilisés a permis d’établir une classification relative de l’affinité cationique en phase gazeuse pour nos composés, à travers des expériences MALDI. Enfin, l’étonnante capacité des polyoxométallates testés à s’ioniser dans douze matrices très diverses, alliée à la possibilité d’observer des fragmentations en source de manière variable, a permis d’effectuer une classification fine de sept matrices en fonction des taux de fragmentation mesurés. / The matrix assisted laser desorption ionization technique (MALDI) is one of the most used for mass spectrometry analyses. Discovered over 28 years ago, MALDI is still actively developed. However, in spite of its wide utilization and several researches works describing the ion formation mechanisms, it does not exist an unequivocal and clear description of the whole process yet. The majority of those studies destined to rationalize ion formation were carried out in positive ion mode using peptides. Our work is aimed at bridging the gap, performing the MALDI technique in negative ion mode and testing the ionization of hybrid polyoxometalates, i.e. structured metallic oxides functionalized by organic moieties.Based on the two main ion formation mechanisms models, we suggested a model for the ionization of our compounds based on our experimental observations. In fact, polyoxometalic species present in solution several negative charges and have been detected in MALDI as singly charged species under cationic adducts. The numerous cations tested proved the possibility to use MALDI to build a relative gaseous cationic affinity classification. The astonishing capacity of polyoxometalates to be ionized through a wide variety of matrixes allowed to finely classify seven matrices, according to their different ability to induce in source fragmentation.

Chez les vertébrés, le foie est un des organes majeurs du métabolisme en étant le siège de la régulation de différentes voies du métabolisme qui contrôlent l’homéostasie du glucose et des lipides. En se basant sur des travaux de recherche récents suggérant que le système de conjugaison de l'ubiquitine est engagé en réponse à différents signaux métaboliques, nous avons réalisé une analyse protéomique globale dans le but d’identifier des protéines ubiquitylées dans le foie de souris soumises á un protocole de jeûne – re-nourrissage. Parmi les 117 protéines différemment ubiquitylé sur le jeûne ou le re-nourrissage, nous avons identifié complément 3 (C3) dans le foie de souris réalimentées. Nous avons observé qu'un produit d'activation de C3, C3a, est ubiquitylé dans les hépatocytes primaires traités avec les médias riches en nutriments. Ainsi, nous proposons que l'ubiquitination de C3 joue un rôle dans la régulation des fonctions inflammatoires ou métaboliques de C3 dans le foie. / In vertebrates, the liver has developed to be a major metabolic organ able to control glucose and lipid homeostasis. It activates or inhibits specific pathways in a regulated manner, depending on the metabolic state of our organism. Based on the emerging experimental evidence suggesting that the ubiquitin conjugation system is engaged in response to different metabolic cues, we conducted a global proteomic analysis to identify metabolic pathways modified by ubiquitylation. To this end, we used livers of mice subjected to a fasting – refeeding protocol. Amongst the 117 proteins differentially ubiquitylated upon fasting or refeeding conditions, we identified complement 3 (C3) to be ubiquitinated in livers of refed mice. We observed that an activation product of C3, C3a, is ubiquitylated in primary hepatocytes treated with nutrient-rich media. Thus, we suggest that the ubiquitylation of C3 plays a role in the regulation of inflammatory or metabolic functions of C3 in the liver.