L’analyse protéomique consiste à caractériser l’ensemble des protéines exprimées dans une cellule, dans un état et à un temps donné (le protéome). L’analyse protéomique tend aujourd’hui à fournir des informations quantitatives, cependant, pour pouvoir générer des données fiables et sensibles, des optimisations méthodologiques doivent être apportées à chaque problématique biologique. L’objectif de cette thèse a été d’adapter les stratégies protéomiques quantitatives existantes à diverses problématiques biologiques. Ce travail de thèse a ainsi contribué à apporter des résultats originaux concernant l’étude de désordres métaboliques. Il a également permis la mise au point d’une méthode de suivi du statut reproducteur de la tortue Luth. Finalement, il a permis d’évaluer la réponse d’une lignée cellulaire hépatique à une intoxication chronique à l’acide valproique. Ces données alimenteront des algorithmes de prédiction de toxicité hépatique chronique au travers du consortium NOTOX (EU). / Proteomics consists in the characterization of all the proteins expressed in a physiological state and at a given time (the proteome). Today, proteomics tends to bring quantitative information. However, in order to generate reliable, sensitive and robust data, whatever the biological question, methodological improvements need to be done. The aim of this PhD thesis was to apply and adapt quantitative proteomics strategies to specific biological issues as there is no universal quantifying method. This PhD thesis contributed to bringing original results concerning the study of metabolic disorders. It has also contributed to setting-up a targeted approach in order to quantify the level of reproductive effort of Leatherback Turtles. Finally, this PhD thesis also contributed, through the consortium NOTOX (EU), to the evaluation of physiological answers of hepatic cell lines exposed to valproic acid. These data will be used in order to generate hepatotoxicity prediction algorithms.

La présence de contaminants métalliques dans les produits pétroliers engendre des effets indésirables, comme la dégradation de leur stabilité au stockage. Pour limiter ces perturbations, des additifs sont incorporés aux produits pétroliers dans le but de complexer les cations métalliques en solution. Le sujet de la thèse porte sur le développement d’une méthodologie pour étudier les interactions non covalentes dans une matrice hydrocarburée par spectrométrie de masse électrospray (ESI-MS). Plusieurs approches ont été utilisées pour comparer le pouvoir complexant de différentes molécules vis-à-vis des métaux ciblés, puis identifier les structures chimiques les plus efficaces pour inhiber l’action catalytique des contaminants. Ces travaux mettent en évidence l’apport de l’ESI-MS comme outil de présélection d’additifs, moins coûteux et chronophage que les méthodes actuelles de screening. / The contamination of petroleum products by metallic compounds leads to adverse effects, as the degradation of their stability under storage. To prevent these phenomena, specific molecules are added to petroleum products in order to complex metallic cations in solution. This work focus on the development of an electrospray mass spectrometry (ESI-MS) method to study non covalent interactions in a hydrocarbon medium. Several approaches were employed to compare the complexing ability of different molecules towards targeted metals, then to identify the most efficient chemical structures to inhibit the catalytic action of contaminants. Results highlight the contribution of ESI-MS as a screening tool, less expensive and time-consuming than the methods currently used.

L'extrême complexité des échantillons biologiques, la variabilité technique et la dépendance de la protéomique envers les banques protéiques empêchent l'analyse complète d'un protéome. Ce travail de thèse s'est focalisé sur le développement de méthodes pour la protéomique quantitative et la protéogénomique afin d'améliorer la caractérisation du protéome. Premièrement mon travail s'est centré sur le développement de méthodes quantitatives globales et ciblées. La mise en place de standards pour évaluer les performances de tous les niveaux de la stratégie analytique est aussi décrite. Ces méthodes ont été optimisées pour répondre à diverses questions biologiques. Mon doctorat s'est focalisé aussi autour de la protéogénomique. Une méthode d'analyse N-terminomique à haut débit a été développée et appliquée à l'étude de la mitochondrie humaine. Enfin, ce manuscrit présente une approche multi-omique visant à améliorer l'analyse du protéome avec la création de banques de données personnalisées . / The high intrinsic complexity of biological samples, the technical variability and the dependency of Bottom-up Proteomics to consensus protein sequence databases handicap the comprehensive analysis of an entire Proteome. My doctoral work was focused on method development in quantitative Proteomics and Proteogenomics in order to achieve a better proteome characterization. First, I focused on the development of global and targeted quantitative methods. The introduction and development of standard samples to assess the performances at any level of the analytical workflow is also described. These methods were applied to answer different biological questions. My PhD also focused on Proteogenomic method development. A high throughput N-terminomic analysis approach was developed and applied to the analysis of the human mitochondria. Finally, this manuscript presents a personalized multi-omics profiling strategy to improve the proteome analysis with the use of personalized databases.

La 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) est une base modifiée de l'ADN. Chez le mammifère, cette base était considérée jusqu'à récemment comme une espèce mineure produite par des dommages oxydatifs. Cependant, des travaux publiés en 2009 ont profondément changé cette vision. En effet, d'une part, la 5hmC est abondante dans certains types cellulaires, d'autre part la formation de 5hmC est un processus actif, dirigé par des enzymes spécialisées (TET1-3) à partir d'une autre base modifiée de l'ADN, la 5-méthylcytosine. Ces découvertes récentes posent naturellement la question du rôle biologique de la 5hmC. En effet, le rôle biologique de la 5hmC est en cours d'exploration et nécessite donc le développement de méthodes dédiées à son étude. Nous avons pris part au développement de méthodes pour l'étude de l'hydroxyméthylation de l'ADN et des protéines partenaires de cette base en proposant des outils chimiques, biochimiques et analytiques. Nous avons adapté une méthode utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à l'étude de l'hydroxyméthylation. Nous avons également participé au développement de méthodes de marquage spécifique des 5hmC selon deux stratégies : (i) une stratégie enzymatique basée sur l'utilisation d'une glucosyltransférase et d'un donneur de glucose (uridine diphosphate glucose) modifié chimiquement; (ii) une stratégie chimique basée sur l'oxydation sélective de l'alcool allylique de la 5hmC. Enfin, nous avons conçu, synthétisé et étudié les propriétés de différentes sondes oligonucléotidiques photoactivables destinées à l'identification de protéines interagissant spécifiquement avec la 5hmC. / 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) is a modified DNA base, who was until recently believed be a minor modification, resulting of oxidative damage. However, results published in 2009 have challenged this understanding. Indeed, 5hmC is abundant in some cell types and its formation is an active process, mediated by specific enzymes (TET1-3) using another modified DNA base, 5-methylcytosine (5mC). These recent discoveries raise the question of the biological role of 5hmC. Indeed, if the role of 5mC in gene expression regulation is established, the biological role of 5hmC is still in study and require the development of specific methods. We participated in the development of methods to study 5hmC and its partner proteins using chemical, biochemical and analytical tools. We showed that mass spectrometry is a powerful tool to quantify global methylation levels and adapted a method, using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry to study hydroxymethylation. We have also taken part in the development of two 5hmC specific labeling methods: (i) an enzymatic strategy, using a glucosyltransferase and a chemically modified glucose donor, allowing the introduction of a probe by a bio-orthogonal reaction; (ii) a chemical strategy based on the selective oxidation of the 5hmC allylic alcohol. Finally, we have designed, synthesized and assessed the properties of photoactivable oligonucleotidic probes in order to identify proteins interacting with 5hmC.

La régulation des protéines par les modifications post-traductionnelles (PTMs) est un événement clé dans le maintien des fonctions biologiques de la cellule. Parmi elles, on retrouve les modifications causées par une famille de molécules appelées Ubiquitin Like Modifiers (UBls), incluant l’ubiquitination, la neddylation ou encore la SUMOylation. Au contraire des modifications classiques faisant intervenir des petits groupements chimiques, telles que la phosphorylation ou l’acétylation, les UBls sont eux-mêmes des protéines se greffant sur le groupement amine en position e des lysines des protéines ciblées, générant des protéines ramifiées. Alors que la principale fonction de l’ubiquitination est la dégradation des protéines par le protéasome, les autres UBls sont encore mal caractérisées. Dans ce contexte, le but de cette thèse était de développer de nouvelles approches protéomiques afin de définir le rôle de la SUMOylation dans des cellules humaines. En effet, l’identification des sites de SUMOylation par spectrométrie de masse (MS) est un défi. Ceci s’explique par la très faible abondance des protéines SUMOylées dans la cellule ainsi que par la longue chaine de 19 à 34 acides aminés laissés sur la protéine ciblée après digestion à la trypsine. Afin de pallier à ces deux problèmes, un mutant de la protéine SUMO a été généré au sein du laboratoire. La première altération sur ce mutant est l’insertion d’une séquence 6xHis à l’extrémité N-terminale de la protéine afin de faciliter l’enrichissement des protéines SUMOylés. La seconde altération de la protéine SUMO est la mutation d’une glutamine en arginine en position 6 à partir du C-terminal. Cette mutation a pour effet de libérer des peptides trypsiques ramifiés contenant seulement 5 acides aminés provenant de SUMO sur le peptide ciblé. Le premier but de cette thèse était de développer une méthode permettant de cibler spécifiquement les peptides SUMOylés lors d’une analyse par LC-MS. Cette méthode repose sur le patron de fragmentation propre de la chaine de 5 acides aminés commune à tous les peptides SUMOylés et utilise la technologie Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra (SWATH). Lors d’une telle analyse, l’échantillon est injecté une première fois en fragmentant de larges fenêtres de masses. Ceci permet d’obtenir des spectres MS/MS pour tous les peptides présents dans l’échantillon. Un algorithme est ensuite utilisé afin de détecter les fenêtres de masses contenant des peptides SUMOylés et de recalculer le rapport masse sur charge des peptides candidats. Les injections subséquentes permettent ensuite de fragmenter uniquement les peptides candidats. Cette méthode s’est avérée être complémentaire aux méthodes conventionnelles et a permis l’identification d’un total de 54 peptides SUMOylés à partir d’extraits protéiques enrichis sur billes NiNTA. La seconde approche envisagée était d’ajouter une étape d’enrichissement supplémentaire au niveau peptidique. Pour cela, un anticorps reconnaissant la chaine de 5 acides aminés laissée après digestion tryptique a été produit. Cette étape d’immuno-purification supplémentaire a permis l’identification d’un total de 954 sites de SUMOylation dans des cellules humaines lors d’une analyse à grande échelle. Afin de valider les nouvelles cibles identifiées, une étude fonctionnelle de la SUMOylation de la protéine CDC73 a été réalisée. Cette étude a montré que la SUMOylation de CDC73 était requise pour sa rétention nucléaire, confirmant ainsi un rôle important pour la SUMOylation de cette protéine. Cependant, le principal défaut de la précédente approche était la nécessité de cultiver 500 millions de cellules par condition étudiée. Cette approche a donc été optimisée afin de pouvoir réduire le nombre de cellules utilisées dans une analyse. L’optimisation de chacun des paramètres analytiques nous a permis de réduire ce nombre de 50 fois, permettant ainsi d’identifier plus de 1000 sites de SUMOylation à partir de seulement 10 millions de cellules. De plus, nous avons montré que cette approche permet l’identification concomitante des sites de SUMOylation et d’ubiquitination dans un seul échantillon biologique. Ceci a permis d’identifier un nouveau mécanisme de régulation des deubiquitinases par les UBls, ainsi que d’élucider les mécanismes de translocation du protéasome dans la cellule. Dans l’ensemble, nous avons développé des méthodes permettant de mieux caractériser la SUMOylation des protéines et avons prouvé que ces méthodes sont applicables à l’étude de plusieurs UBls en parallèle. Nous sommes certains que l’approche par immuno-purification permettra à l’avenir d’identifier la SUMOylation à un niveau endogène. / Protein regulation by post-translational modification (PTMs) is a key event in regulating cellular function. These modifications include a group termed Ubiquitin-Like modifiers (UBLs) that contain, but is not limited to, ubiquitylation, neddylation and SUMOylation. While conventional modifications, such as phosphorylation or acetylation, involve a small chemical group, UBLs are proteins attached from their C-terminus to the epsilon amine group of a lysine contained in the targeted protein, thus generating branched proteins. While the main function of ubiquitylation is protein degradation by the proteasome, other UBLs remain mostly unexplored. In this context, the aim of this thesis was to develop new proteomics strategies to characterize SUMOylation in human cells. Indeed, identification of SUMOylation sites by mass spectrometry (MS) is a challenge. This is due to the low abundance of SUMOylated proteins in the cells as well as the long 19 to 34 amino acid SUMO remnant left of the target after trypsin digestion. In this context, our research group has developed a mutant of SUMO containing two mutations. The first mutation consists of a 6xHis tag at the N-terminus of SUMO in order to facilitate SUMOylated substrates enrichment at the protein level. A second mutation was also introduced at the 6th position from the C-terminus and consists in a glutamine to arginine substitution in order to release shorter SUMOylated peptides after trypsin digestion. The first goal of this thesis was to develop a targeted approach to specifically fragment SUMOylated peptides during an LC-MS run. This was enabled by the common fragmentation pattern of all SUMOylated peptides arising from the five amino acid SUMO remnant. Digested peptides were first analyzed using SequentialWindow Acquisition of all THeoretical Mass Spectra (SWATH). In this experiment, large mass windows are fragmented. A custom algorithm is then used that detects mass windows in which candidates are located and determine their intact mass. In subsequent injections these peptides were then specifically targeted. This method was complementary to data dependent acquisition and enabled the identification of 54 SUMOylated peptides. In a second approach, we wanted to enrich for SUMOylated substrates at the peptide level. An antibody was raised against the five amino acid SUMO remnant and used for immunopurification of SUMOylated peptides. In total, we identified 954 SUMOylation sites in human cells. Moreover, functional analysis of the newly identified substrate CDC73 revealed that SUMOylation on K136 is required for its nuclear retention, thus showing a new role for the SUMOylation of this protein. Although this approach gave new insights into the characterization of SUMOylated substrates, high amounts of material were still required to obtain such results. The last goal of this thesis was to optimize the previously developed immunopurification. Systematic optimization of every analytical parameter was done and enabled the reduction of the number of cells required by a factor of 50, without affecting the number of SUMOylation sites identified. Moreover, we used this approach to profile for SUMOylation and ubiquitylation dynamics in human cells upon proteasomal inhibition with MG132. This revealed an unexpected regulation mechanism of deubiquitinating enzymes by UBLs and unraveled translocation mechanisms of the proteasome in the cell. Our SUMO proteomic approach demonstrates capability for the concomitant analysis of SUMOylation and ubiquitylation. In the future, we hope to extend this approach to endogenous SUMOylation.

Ces travaux mettent en avant le développement de méthodes analytiques afin d'évaluer l'Exposome selon différentes stratégies. Une méthode multirésidus sélective permettant l'analyse d'additifs plastiques et de leurs produits de dégradation pouvant être relargués par des emballages plastiques dans les boissons et les aliments, et ainsi être ingérés par l'Homme, a tout d'abord été mise au point. Cette méthode consiste en une extraction de type Stir Bar Sorptive Extraction sur des barreaux à base de dérivés de polydiméthylsiloxane des additifs plastiques ciblés, suivie d'une analyse par chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à un spectromètre de masse en tandem de type triple quadripôle. Afin de détecter et quantifier une plus large gamme de contaminants entrant en contact avec l'Homme, une méthode de screening a été développée par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution avec un instrument de type QqToF, à partir d'une matrice urinaire. La méthode de screening ciblé, validée selon les recommandations FDA, a permis de quantifier des contaminants appartenant à diverses familles dans l'urine, sans préparation préalable de l'échantillon, à des concentrations de l'ordre du ng/mL. Appliquée à des urines de volontaires, la méthode de screening non ciblé a permis d'émettre de nombreuses hypothèses d'identification de composés après fragmentation MS/MS. La mise en place de tels outils pour caractériser l'Exposome, associée à des études statistiques et bio-informatiques, contribueront grandement à la compréhension des relations de causalité entre les maladies humaines et les facteurs environnementaux / These research works highlight the development of analytical methods, based on mass spectrometry, to assess the Exposome according to different strategies. A selective multiresidue method for the analysis of plastic additives and their degradation products that may be released by plastic packaging in food and beverages and thus ingested by man was developed. This method consists of a Stir Bar Sorptive Extraction with bars covered by polydimethylsiloxane derivatives, followed by an analysis by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry with a triple quadrupole instrument. To detect and quantify a wide range of contaminants in contact with man in daily routine, a screening method was developed by liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry with a quadrupole-time-of-flight instrument from urinary matrix. The targeted screening method validated according to FDA guidelines allows the quantification of contaminants classified according to different families, in urine without sample preparation, at concentrations of the order of ng.mL-1. This method was applied to volunteers’ urine samples. The non-targeted screening method allows issuing numerous assumptions of compound identification after MS/MS fragmentation. The implementation of this tool to measure the Exposome associated with statistical studies, contribute greatly to the understanding of the causal relationships between diseases and environmental factors

L'amylose une maladie rare, caractérisée par des agrégats insolubles de protéines extracellulaires. Trente types d'amyloses sont répertoriés et différenciés par la protéine amyloïdogène associée. Leur identification repose sur l'analyse immunohistochimique du tissu malade. Cependant, l'interprétation peut être ambigüe. La micro-dissection laser (LCM) et la spectrométrie de masse sont une alternative prometteuse. Nous avons développé une approche protéomique ciblée à partir de tissus traités par ultrasons. Nous avons montré que les biopsies prélevées chez des patients atteints de différents types d'amyloses peuvent être protéolysées sous ultrasons, ce qui augmente l'efficacité et réduit le temps de la digestion (90s au lieu de 15h), tout en minimisant la quantité de matériel nécessaire. Après une première étape de protéomique sans a priori pour le diagnostic clinique des patients présentant une amylose dans différents organes/tissus (reins, poumons, glandes salivaires, testicule, humeur vitrée et rate), nous avons optimisé une méthode de criblage dédiée à un transfert technologique vers les départements cliniques français. Pour cela, deux méthodes montrent des résultats très encourageants : la SRM (selected reaction monitoring) sur un spectromètre de masse à basse résolution, disponible dans certains laboratoires cliniques et la PRM (parallel reaction monitoring) accessible sur les instruments de dernière génération à très haute résolution, qui fournit rapidement des résultats. En conclusion, nous proposons ici un protocole spécifique pour le diagnostic robuste et la classification rapide des amyloïdoses. / Amyloidosis is rare disease that appears as an insoluble deposition of specific extracellular proteins. Thirty classes of amyloidosis have been reported and their diagnosis relies on the identification of the associated proteins by immunohistochemistry analysis of the affected tissues. However, its interpretation is highly dependent on the pathologist and can be ambiguous. Laser capture micro-dissection (LCM) and mass spectrometry are a promising alternative. We have developed a targeted proteomics approach from raw tissues treated with ultrasound. We showed that the biopsies taken from patients presenting different classes of amyloidosis can be proteolysed by ultrasonic treatment. This technique increases the efficiency and reduces the time of digestion (90s instead of 15h), while minimizing the amount of material needed. After a first unbiased proteomics study for clinical diagnosis of patients with amyloidosis in various organs/tissues (kidney, lung, salivary glands, testicle, vitreous humor and spleen), we have optimized a dedicated screening method for a technological transfer to the French clinical departments. For this, two methods show very promising results: SRM (selected reaction monitoring) on a low-resolution mass spectrometer, available in some clinical laboratories, and PRM (parallel reaction monitoring) available on the latest generation of high-resolution instruments which provide fast results. In conclusion, we propose here a specific protocol for a robust diagnosis and rapid classification of amyloidoses.

Les protéines fibreuses (kératine, élastine, collagène, fibroïne…) représentent 1/3 des protéinesconstitutives des mammifères et des oiseaux. Ce sont des protéines qui ont une fonction de protection et/oumécanique. La soie apparait comme le système le plus « simple » car elle est principalement constituée demotifs de répétition à base d’alanine et de glycine, deux petits acides aminés. Certaines soies présentent despropriétés mécaniques comparables ou supérieures à celles des fibres synthétiques et seraient susceptiblesd’être de nouveau largement utilisées dans des applications techniques (par exemple biomédicales) si lavariabilité de leurs propriétés était maîtrisée. Ce travail porte sur la structure des soies grèges ou décreuséesde Bombyx mori (ver à soie domestique), de Nephila madagascariensis (araignée sauvage, fibre sansenveloppe de séricine), de Bombyx mori génétiquement modifié (incluant un gène de Nephila) et sur unesoie recombinante 4RepCT (Escherichia coli). La soie est analysée par spectrométrie Raman (et IRTF) ettraction uni-axiale, ainsi que par le couplage de ces méthodes. L’analyse de la région des bas nombresd’onde en spectroscopie Raman a permis de caractériser des régions ordonnées de 2 à 3 μm de long etdistantes d’environ 60 μm. Il s’agit de la première mise en évidence d’une hétérogénéité de structure de lasoie. Le couplage avec la traction uni-axiale montre une sollicitation de ces régions ordonnées sousdéformation, suggérant une organisation de la soie selon le modèle de Prevorsek, c’est à dire qu’une mêmechaîne macromoléculaire appartient à la fois à des régions amorphes et à des régions ordonnées. L’étudestatistique des propriétés mécaniques de la soie de ver et d’araignée montre une grande distribution, maisune bonne stabilité dans le temps (dizaines d’années). La modification génétique ne procure pasd’amélioration des propriétés mécaniques de la fibre, seulement une légère diminution de la variabilité.Diverses stratégies sont mises en oeuvre pour tenter d’échapper à cette variabilité : production bactérienne,solubilisation de la soie et régénération sous forme de films. Le rôle de l’eau lors de la biosynthèse de lasoie, ainsi que l’effet de divers paramètres (filtration, pH, séchage…) lors de la préparation des films ont étéétudiés. Nous avons pu confirmer que la présence d’agrégats de protéines favorise l’organisation dans lesfilms et 2 types de films ont donc été préparés. Les films les plus amorphes présentent les propriétésmécaniques les plus intéressantes, même si elles n’atteignent de quelques % de celles des fibres. Lafabrication de composites à matrice de soie régénérée renforcée par des fibres de soie permet d’augmenterla résistance et la déformation à rupture. Ces premiers résultats sont encourageants pour le développementde matériaux composites fibres de soie/matrice de soie régénérée. / Fibrous proteins (keratin, elastin, collagen, fibroin ...) make up to one third of the proteins ofmammals and birds. They are structural proteins with a protective and/or mechanical function. Silk appearsto be the ‘simplest’ model because it mainly consists of two small amino acids residues (alanine andglycine). Some silks have comparable or superior mechanical properties compared to those of syntheticfibres and could be used in technical applications (e.g. biomedical) if the variability of their properties canbe controlled. This work focuses on the structure of silks from: Bombyx mori (domestic silkworm)degummed or not, Nephila madagascariensis (wild spider, no sericin coating), GM Bombyx mori (includinga gene of Nephila) a recombinant spider silk 4RepCT (Escherichia Coli). Silk is analyzed by Ramanspectroscopy (and FTIR), uni-axial tensile testing, and also by the coupling of these methods. The analysisof the low wavenumbers region in Raman spectroscopy allowed the characterization of ordered regions of 2to 3 microns separated by about 60 microns. This is the first evidence of the heterogeneous structure ofsilk. Coupling with the uni-axial tensile test shows that these ordered regions are stressed under macroscopicdeformation, suggesting silk organization according to Prevorsek’s model, i.e. that the samemacromolecular chain belongs to both amorphous and ordered regions. The statistical study of themechanical properties of silkworm and spider silks shows great dispersion, but a good stability over time(decades). Genetic modification does not improve the fibres mechanical properties but a slight decrease intheir variability. Various strategies have been investigated to control the variability: bacterial production,solubilization of silk and films regeneration. The role of water in silk biosynthesis, as well as the effect ofvarious parameters (filtration, pH, drying ...) during the preparation of the films were studied. It wasconfirmed that the presence of protein aggregates promotes the organization in film and two types of filmswere prepared. The most amorphous ones have the most interesting mechanical properties, though only afew percent of those from the starting fibres. The fabrication of regenerated silk matrix compositesreinforced by silk fibres increases the strength and strain to failure. These initial results are encouraging forthe development of silk fibres/regenerated silk matrix composite materials.

La détection de molécules biologiques dans les environnements physiologiques est essentielle aux soins de santé et la surveillance de l'environnement. Dans ces travaux de thèse, nous étudions et utilisons des surfaces d'or pour la détection de biomolécules, avec l'inclusion de composants nanométriques-spécifiquement, des monocouches auto assemblées (SAMs) d'alcane-thiol et des coquilles d'or nanostructurées-dans l'intention d'améliorer les méthodes de détection biomoléculaire. La fonctionnalisation des surfaces d'or avec des SAMs permet un contrôle de la densité et de l'orientation des biomolécules immobilisées. En utilisant la spectroscopie infrarouge de surface, la spectroscopie de photoelectrons X (XPS) ainsi que la modélisation, utilisant la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT), nous avons trouvé que les SAMs à base de chaînes courtes et de chaînes longues des alcane-thiols ont eu des environnements de l'accroche des atomes de soufre différents. De plus, nous avons trouvé que l'immobilisation et la reconnaissance de protéines varie avec la longueur de la chaîne de SAMs ainsi qu'avec la présence d'un réticulant. Dans la seconde partie des travaux, nous avons synthétisé des coquilles d'or nanostructurées sur des particules magnétiques afin de combiner la séparation magnétique et la détection de biomolécules. Nous avons montré qu'elles pouvaient être utilisés comme substrats pour la spectrométrie Raman exaltée de surface (SERS). Afin d'établir une preuve de concept, nous avons réalisé des tests dans lesquels ces particules ont été utilisées pour détecter l'immobilisation d'oligonucléotides et l'hybridation avec SERS. / Detecting biomolecules in physiological environments is critical to health care and environmental monitoring. In this work, we study and use gold surfaces for biomolecule detection while incorporating nanoscale components—specifically, self-assembled monolayers (SAMs) of alkanethiols and gold nanostructured shells—with the goal of improving biomolecule detection methods. Using SAMs to functionalize gold surfaces can offer control over biomolecule binding density and orientation while still keeping the biomolecules near the sensing surface. Using surface IR spectroscopy, x-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and density functional theory (DFT) modeling, we found that SAMs of short-chain and long-chain amine-terminated alkanethiols on gold had different sulphur binding environments. We also found that protein binding and recognition on the two different SAMs varied with SAM chain length and was also influenced by the presence of a cross-linker. In the second part of this work, we synthesized gold nanostructured shells on magnetic particles for combined separation and detection of biomolecules. We demonstrated their use as substrates for surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) As a proof-of-concept, we demonstrated the use of these particles to detect oligonucleotide binding and hybridization with SERS using a Raman-tagged oligonucleotide hairpin probe.

La spectrométrie de masse en tandem est désormais une technique de choix pour l'analyse du protéome humain ou de micro-organismes. Typiquement, les protéines sont tout d'abord digérées en peptides protéotypiques, ceux-ci étant ensuite séparés par chromatographie liquide avant d'être analysés par MS/MS. L'identification et la quantification de ces peptides rapporteurs de protéines permet la mise en évidence d'un phénotype ou d'un mécanisme cellulaire particulier, dans un organisme complexe. Des approches par spectrométrie de masse ciblée et non ciblée coexistent et sont complémentaires dans l'analyse protéomique. Les travaux présentés ici se sont focalisés sur le développement de méthodes ciblées, et plus particulièrement en mode SRM, à travers deux applications chez des micro-organismes modèles. Ainsi, une première étude s'est portée sur la quantification absolue des protéines du virus chimère dengue – fièvre jaune candidat vaccin. Par l'utilisation d'une stratégie de quantification de type AQUA, nous avons pu développer, valider et transférer le dosage des quatre sérotypes du virus chimère candidat vaccin. Les problématiques soulevées à travers ce projet nous ont amené à proposer des étapes à contrôler lors du développement d'un dosage par la stratégie AQUA.Dans une seconde partie, nous nous sommes attachés à développer une analyse quantitative sans marquage de 445 protéines afin d'étudier l'infection d'un phytopathogène, Dickeya dadantii, sur une plante modèle. Afin d'assurer un transfert simple et rapide de cette analyse multiplexée, nous proposons un nouvel outil d'acquisition indépendant des temps de rétention. Cet outil développé en partenariat avec la R&D Sciex à Toronto est appelé « Scout-MRM » / Tandem mass spectrometry is now a technique of choice for human or micro-organisms proteome analysis. Typically, proteins are first digested into surrogates’ peptides, separated by liquid chromatography before being analyzed by MS/MS. The ultimate goal is the identification and the quantification of these peptides, belonging to proteins and highlighting a phenotype or a cellular mechanism in a complex organism. Both targeted and untargeted approaches are used and are complementary in proteomic analysis. The work presented here is focused on the development of targeted methods, and more particularly in the SRM mode, through two applications involving micro-organisms. So, the first study concerned to absolute quantification of viral proteins of the chimeric yellow-dengue fever, vaccine candidate against dengue. By using the AQUA quantification strategy, we were able to develop, to validate and to transfer the method for the four chimeric virus serotypes. Then, problems met during development process, lead us to suggest check points to verify when using AQUA strategy. In a second part, we attempted to develop a quantitative label free analysis of 445 proteins to study the infection of the phytopathogen Dickeya dadantii, on a model plant. To ensure a simple and fast transfer of this multiplex, we purpose a new acquisition tool, independent from retention time. This tool was developed in a partnership with the R&D Sciex, Toronto and is called “Scout-SRM”