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In vitro Charakterisierung poröser biofunktionalisierter Eisenschäume als KnochenimplantateFarack, Jana 21 April 2015 (has links)
Während Korrosionsbeständigkeit bisher ein wichtiges Kriterium bei der Materialentwicklung von metallischen Implantaten war, erlangen korrodierbare Metalle wie zumeist Magnesium aber auch Eisen zunehmend Bedeutung in der gegenwärtigen Forschung. Magnesium ist ein osteokonduktives Material und stimuliert die Knochenneubildung. Nachteil ist jedoch die geringe Korrosionsbeständigkeit, sodass Magnesium in der Regel in vivo schneller abgebaut wird, als neuer Knochen gebildet werden kann. Verglichen mit Magnesium ist die Korrosion von elementarem Eisen in vivo langsam und zeigt keine lokale oder systemische Zytotoxizität.
Während die meisten Forschungsarbeiten Eisen als degradierbares Implantatmaterial mit dem Ziel der kardiovaskulären Anwendung untersuchen, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit Eisenschäumen, die u.a. zur Heilung überkritisch großer und belasteter Knochendefekte eingesetzt werden sollen.
Die Herstellung der Eisenschäume (Fe) erfolgt durch Pulvermetallurgieprozesse an den Fraunhofer-Instituten IKTS und IFAM in Dresden. Polyurethanschäume werden mit einer Carbonyleisensuspension mit 3,8 % Fe3P beschichtet, getrocknet, erhitzt und anschließend der verbleibende Eisenschaum gesintert. Die Bioaktivierung der Eisenschäume mit verschiedenen Calciumphosphatphasen erfolgt durch die InnoTERE GmbH. Hierfür werden die Eisenschäume phosphatiert und mit Brushit (Fe-B) beschichtet. Durch anschließendes Kochen bei 95 – 100 °C in 0,1 M NaOH für 24 h kann eine Hydroxylapatitschicht (Fe-HA) erhalten werden. Eine weitere Methode der Bioaktivierung stellt die Befüllung mit Calciumphosphat-Zementen dar. Dabei handelt es sich um einen von InnoTERE entwickelten Ein-Pasten-Calciumphosphat-Zement (1P PCP) und um einen magnesiumhaltigen Calciumphosphat-Zement (MgCPC).
Die Eisenschäume werden mittels physikalisch-chemischer, biochemischer und zellbiologischer Methoden im Hinblick auf Degradierbarkeit und Biokompatibilität in vitro untersucht und charakterisiert. Wesentliche Ziele der vorliegenden Arbeit sind neben der Charakterisierung des Korrosionsverhaltens, vor allem die Analyse der Reaktionen knochentypischer Zellen auf Beschichtungen sowie Korrosionsprodukte der metallischen Grundstruktur. Für die zellbiologischen Untersuchungen dienen die Osteoblastenzelllinie SaOs-2 sowie humane mesenchymale Stammzellen (hMSC).
Es konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit der Beschichtung bzw. Füllung mit verschiedenen Calciumphosphatphasen die Eisenfreisetzung und damit das Korrosionsverhalten von Eisenschäumen variiert werden kann. Die höchsten Korrosionsraten sind bei unmodifizierten Eisenschäumen zu beobachten. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit erfolgt eine verminderte Eisenfreisetzung. Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. die Füllung mit Magnesium-Calciumphosphat Zement wird die Freisetzung von Korrosionsprodukten nahezu vollständig unterbunden.
Durch die Beschichtung mit Brushit bzw. HA wird neben dem Korrosionsverhalten auch die Bioaktivität der Proben beeinflusst. Während die unmodifizierten Fe in beiden untersuchten Zellkulturmedien sowie Fe-B in McCoys keinen Einfluss auf den Calcium- und Phosphatgehalt haben, ist bei Fe-B in DMEM über den gesamten Untersuchungszeitraum eine konstante Calcium- und Phosphatfreisetzung zu beobachten. Die bioaktiven Fe-HA zeigen den umgekehrten Effekt und entziehen dem Medium Calcium und Phosphat – in DMEM Calcium stärker als in McCoys und in McCoys Phosphat stärker als in DMEM.
Für das erfolgreiche Einwachsen von Implantaten bzw. die Heilung von Knochendefekten sollten Zellen, die am Knochenauf- und -umbau beteiligt sind, durch das Einbringen des Implantats nicht negativ beeinflusst werden. Ein Schlüsselereignis stellt dabei die Adhäsion dar. Die beste Adhäsion ist für die beide getestete Zelltypen auf Fe-B zu beobachten. Für Fe-HA werden die zweitbesten Adhäsionseffizienzen erzielt. Während für die Osteoblasten dabei das Zellkulturmedium keinen Einfluss hat, ist für die Stammzellen im Vergleich zu den SaOs-2 Zellen allerdings nur eine halb so gute Adhäsion zu beobachten. Die mit MgCPC bzw. mit 1P CPC gefüllten Schäume dagegen zeigen eine sehr schlechte Adhäsion sowohl von Osteoblasten als auch von Stammzellen. Für Fe-B+1MgCPC kann jedoch durch eine Erhöhung der Inkubationszeit von 4 h auf 24 h der Anteil an adhärenten Zellen deutlich gesteigert werden. Entsprechend des Korrosionsverhaltens adhärieren auf den unmodifizierten Eisenschäumen die Zellen am schlechtesten.
Darüber hinaus können sowohl SaOs-2 als auch hMSCs auf den CPP-beschichteten Fe nicht nur adhärieren, sondern auch proliferieren. Die eine wesentlich höhere Proliferationsrate aufweisenden SaOs-2 zeigen sowohl auf Fe-B als auch auf Fe-HA eine sehr gute Proliferation. Die langsamer proliferierenden Stammzellen dagegen zeigen ein etwas anderes Zellverhalten. Während auf Fe-B ebenfalls eine gute Proliferation zu beobachten ist, nimmt die Zellzahl auf Fe-HA zu Beginn der Inkubation zunächst ab. Mit der Zeit sinken Eisenfreisetzung und Calciumbindung, sodass ab Tag 14 auch hier eine Zunahme der Zellzahl zu beobachten ist. Die Perfusionskultur stellt ein Kultursystem dar, das den in vivo Bedingungen näher ist, als eine statische Kultivierung in Zellkulturwellplatten, sodass die Proliferation von SaOs-2 und hMSCs auf Fe-HA signifikant verbessert werden kann. Während für die unmodifzierten Fe bereits bei den SaOs-2 Zellen weder statisch noch dynamisch eine Zellzahlzunahme zu beobachten ist, kann für Fe-B+MgCPC die Proliferation durch die Perfusion verbessert werden. Für Fe-HA kann durch die Verwendung in vivo naher Zellkulturbedingungen die Proliferation beider Zelltypen entscheidend verbessert werden. Für die Fe-B zeigen die Zellen bereits in der statischen Kultur eine gute Proliferation, die durch die Perfusion nicht wesentlich gesteigert werden kann.
Die Untersuchungen zum osteogenen Differenzierungsverhalten zeigen sowohl bei indirekter Inkubation in Fe-B und Fe-HA Extrakten als auch im direkten Materialkontakt auf den CPP-bioaktivierten Fe, dass die untersuchten hMSCs in der Lage sind osteogen zu differenzieren und mineralisieren. Die Genexpressionsergebnisse bestätigen die Beobachtungen der biochemischen Analyse. Im Fall der alkalischen Phosphatase (ALP) wird der Effekt bei den Fe-HA Extrakten sogar noch deutlicher. Sowohl im Basis- als auch im Differenzierungsmedium zeigen die Zellen eine erhöhte ALP-Genaktivität. Durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit kann auf den Fe-HA eine zeitigere Aktivierung der osteoblastären Differenzierung im Vergleich zur Plastikoberfläche beobachtet werden. Durch die Perfusionskultur ist aufgrund des Zusammenspiels von Stofftransport und Scherkräften eine gesteigerte Differenzierung der hMSCs auf den mit CPP beschichteten Fe zu beobachten – auf Fe-HA stärker als auf Fe-B.
Durch die korrosionsbedingte Eisenfreisetzung reagieren die hMSCs mit erhöhter Genexpression des Eisenspeicherproteins Ferritin bei gleichzeitig sinkender Genexpression für den Transferrinrezeptor CD71. Reaktive Sauerstoffspezies und der damit verbundene oxidative Stress bewirken eine erhöhte Genexpression von Enzymen der oxidativen Stressabwehr. Es handelt sich dabei um die im Zytoplasma vorkommende Superoxiddismutase SOD1 und die in den Mitochondrien lokalisierte SOD2 als primäre Enzyme und um die Glutathion-Reduktase als sekundäres Enzym. Die Genregulierung von Katalase, Glutathion-Peroxidase und Glutathion-Synthetase wird ebenfalls teilweise durch die Anwesenheit von Fe beeinflusst.
Fazit
Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Eisenschäume korrodieren in Abhängigkeit ihrer CPP-Modifizierung mit unterschiedlicher Intensität sowie Geschwindigkeit und beeinflussen so das Zellverhalten von hMSC und Osteoblasten. Die Eisenfreisetzung, die für die unmodifizierten Schäume am höchsten ist, wirkt sich negativ auf Adhäsion und Proliferation aus. Sowohl statisch als auch dynamisch ist eine Abnahme der Zellzahl zu beobachten. Ohne Modifikation sind die Eisenschäume daher für eine Anwendung als Knochenersatzmaterial in vivo eher ungeeignet. Im Gegensatz dazu stellen die mit Brushit und mit Hydroxylapatit beschichteten Fe-Schäume interessante Knochenersatzmaterialien dar. Es konnte gezeigt werden, dass sie aufgrund ihrer Calciumbindungs- bzw. -freisetzungskapazität die am Knochenaufbau beteiligten Zellen und deren Differenzierungsverhalten in Richtung Osteoblasten positiv beeinflussen können. Die mit mit MgCPC und mit Einpastenzement gefüllten Eisenschäume konnten nur ansatzweise untersucht werden. Eine endgültige Einschätzung zur Eignung für eine in vivo Anwendung ist daher im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich. Dennoch sind sie vor allem im lasttragenden Bereich aufgrund guter mechanischer Eigenschaften innovative Knochenersatzmaterialien.
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Scaffold dimensionality and confinement determine single cell morphology and migrationKoch, Britta 15 January 2016 (has links)
This thesis describes a highly interdisciplinary approach to discern the differing impact of scaffold dimensionality and physical space restrictions on the behavior of single cells. Rolled-up nanotechnology is employed to fabricate three-dimensional (3D) SiO/SiO2 microtube geometries of varied diameter, that after a biofunctionalization step are shown to support the growth of U2OS and six different types of stem cells. Cell confinement quantifiable through the given microtube diameter is tolerated by U2OS cells through a remarkable elongation of the cell body and nucleus down to a certain threshold, while the integrity of the DNA is maintained.
This confinement for NSPCs also leads to the approaching of the in vivo morphology, underlining the space-restrictive property of live tissue. The dimensionality of the cell culture scaffold however is identified as the major determiner of NSPC migration characteristics and leads to a morphologically distinct mesenchymal to amoeboid migration mode transition. The 3D microtube migration is characterized by exclusively filopodia protrusion formation, a higher dependence on actin polymerization and adopts aspects of in vivo-reported saltatory movement. The reported findings contribute to the determination of biomaterial scaffold design principles and advance our current understanding of how physical properties of the extracellular environment affect cell migration characteristics.
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Modeling of FUS- and C9ORF72-associated cortical neuropathology using patient-specific induced pluripotent stem cellsJaptok, Julia 07 October 2020 (has links)
Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine neurodegenerative Erkrankung, bei welcher speziell erste (kortikospinal) und zweite (spinal) Motorneurone (MN) von Neurodegeneration betroffen sind. Gegenwärtig bleibt ALS eine unheilbare Erkrankung. Der Tod tritt durchschnittlich 2 bis 5 Jahre nach Auftreten der Symptome ein. Circa 90% der Fälle treten sporadisch auf (sALS), während 10% familiär sind (fALS). Es ist von großem Interesse monogenetische Formen der fALS zu untersuchen um zugrundeliegende Pathologien und Mechanismen zu verstehen. Bislang wurden über 20 Gene mit ALS in Verbindung gebracht, einschließlich Fused in sarcoma (FUS) und Chromsosome 9 open reading frame (C9ORF72). Circa 4% der fALS Fälle sind durch dominante Mutationen in FUS verursacht und repräsentieren damit die dritthäufigste Form der fALS in Deutschland. Die G4C2 hexanucleotide repeat expansion (HRE) in C9ORF72 ist die häufigste Ursache für ALS und Frontotemporale Demenz (FTD). ALS Patienten unterscheiden sich erheblich in der Präsentation ihrer klinischen Symptome wie Ausbruchsort, Progressionsrate und Auftreten kognitiver Störungen. Diese Faktoren sind auch stark abhängig von der zugrundeliegenden Mutation in fALS. Ziel dieser Doktorarbeit ist die Modellierung von FUS- und C9ORF72-assozierter ALS in einem krankheits-relevanten in vitro Model von speziell kortikaler Neuropathologie mit Hilfe von Patienten-spezifischen iPSZs. Die Hypothese der vorliegenden Arbeit ist das in einer Zelltyp-abhängigen Art und Weise zugrundeliegende Erkrankungsmechanismen in kortikalen vs. spinalen Neuronen unterschiedlich betroffen sind. Humane iPSZ, generiert von gesunden Kontrollen und ALS Patienten mit FUS oder C9ORF72 Mutation, wurden für die gerichtete kortikale und spinale Differenzierung genutzt. Zusätzlich wurden zwei neue FUS-WT- und FUS-P525L-EGFP-markierte isogene Linien mittels CRISPR/Cas9n Technik generiert. Methoden basierend auf Immunfluoreszenz Färbungen und Lebendzell-Mikroskopie wurden angewendet um Krankheits-relevante Proteine, DNA Schäden und axonale Organell-Mobilität zu analysieren. In diesem Projekt konnte ein deutlicher Zelltyp-abhängiger Effekt auf analysierte Phänotypen beobachtet werden, während ALS-assoziierte Mutationen scheinbar nur geringfügige Effekte zeigten. Dementsprechend wurde ein Zelltyp-abhängiger Anstieg des basalen DNA Schadens in kortikalen Astrozyten vs. Neuronen und spinalen vs. kortikalen Neuronen detektiert. Jedoch konnte in FUS oder C9ORF72 mutierten kortikalen Zellen kein erhöhter DNA Schaden nachgewiesen werden, wie es zuvor in spinalen MN beobachtet wurde. Des Weiteren beeinflussen FUS Mutationen die Rekrutierung von FUS zu DNA-geschädigten Stellen, die Organell-Mobilität und die zytoplasmatische Fehllokalisation des Proteins in Abhängigkeit vom Zelltyp. In kortikalen Neuronen wurde in Bezug auf die Rekrutierung von mutiertem FUS und Organell-Mobilität nur leichte Mutations-abhängige und wesentlich schwächer ausgeprägte Effekte beobachtet als in spinalen MN. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Patienten-spezifische Zellmodelle ein wichtiges Instrument in der ALS Forschung sind und das vor allem Unterschiede zwischen kortikalen und spinalen MN weiter untersucht werden müssen, um zugrundeliegende Krankheits-relevante Mechanismen zu entschlüsseln und wie diese zum Fortschreiten der Erkrankung beitragen / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a of neurodegenerative diseases, in which neurodegeneration specifically affects upper (corticospinal) and lower (spinal) motor neurons (MNs). At present, ALS remains an incurable disease. Death occurs on average 2 to 5 years after symptom onset. About 90% are sporadic cases (sALS) and 10% are familial cases (fALS). It is of great interest to investigate monogenetic forms causing fALS to understand its underlying disease pathologies and mechanisms. Over 20 genes have been linked to ALS until now, including Fused in sarcoma (FUS) and Chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72). About 4% of fALS cases are caused by dominant mutations within FUS, representing the third most common fALS form in Germany. The G4C2 hexanucleotide repeat expansion (HRE) in the C9ORF72 gene is the most common cause for ALS and Frontotemporal dementia (FTD). ALS patients differ significantly in their presentation of clinical symptoms, including site of onset, rate of progression, and presence of cognitive dysfunction. Those factors were also shown to highly depend on the underlying mutation in fALS cases. Aim of this thesis work is the modeling of FUS- and C9ORF72-associated ALS in a disease-related in vitro model of particularly cortical neuropathology using patient-derived iPSCs. The hypothesis of the current work is that underlying disease mechanisms do differentially affect cortical vs. spinal neurons and act in a cell type-dependent manner. Human iPSCs derived from healthy controls and ALS patients carrying mutations within FUS or C9ORF72 were used for directed cortical and spinal differentiation. Additionally, two new FUS-WT- and FUS-P525L-EGFP-tagged isogenic iPSC lines were generated by CRISPR/Cas9n gene editing. Immunofluorescence staining and live cell imaging approaches were implemented to analyze disease-associated proteins, DNA damage, and axonal trafficking. Within this project, a clear cell type-dependent effect on analyzed phenotypes was observed, while ALS-associated mutations seemed to have only minor effects. Accordingly, cell type-dependent increased basal DNA damage levels in cortical astrocytes vs. neurons and spinal vs. cortical neurons were detected. However, FUS or C9ORF72 mutant cortical cells do not recapitulate increased DNA damage levels as they have been observed in spinal MNs. Furthermore, FUS mutation affected recruitment to DNA damage sites, axonal trafficking, and cytoplasmic mislocalization differentially, depending on the analyzed cell type. In cortical neurons, recruitment and trafficking of mutant FUS showed only slight mutation-dependent effects and also less pronounced phenotypes than observed in spinal MNs. In conclusion, patient-specific cellular models are an important tool in ALS research and particularly differences between cortical and spinal MNs need to be further investigated to decipher underlying disease mechanisms, the interplay of cell types affected by the disease, and how they participate in disease progression.
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Biologische Charakterisierung neuartiger nanokristalliner Calciumphosphatzemente für die KnochenregenerationVater, Corina 26 March 2010 (has links)
Ziel der vorliegenden Arbeit war die biologische Charakterisierung neuartiger nanostrukturierter und für die Knochenregeneration geeigneter Calciumphosphatzemente (CPC). Hierzu wurde ein aus α-Tricalciumphosphat, Calciumhydrogenphosphat, gefälltem Hydroxylapatit und Calciumcarbonat bestehender CPC verwendet, der mit den Biomolekülen Cocarboxylase, Glucuronsäure, Weinsäure, Glucose-1-phosphat, Arginin, Lysin und Asparaginsäure-Natriumsalz modifiziert wurde. Ermittelt wurde dabei der Einfluss der Modifikationen auf die Proteinadsorption und die Biokompatibilität.
In Vorversuchen wurden die Zementmodifikationen hinsichtlich ihrer Bindungskapazität für humane Serumproteine und für das knochenspezifische Protein Osteocalcin (OC) sowie hinsichtlich ihrer Eignung für die Adhäsion, Proliferation und osteogene Differenzierung von humanen fötalen Osteoblasten (hFOB 1.19) und humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) untersucht. Dabei erwiesen sich die Modifikationen mit Cocarboxylase, Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz als besonders günstig. Mit diesen „Favoriten“ erfolgte eine detailliertere Analyse der Adsorption humaner und boviner Serumproteine sowie der knochen-spezifischen Proteine Osteocalcin, BMP-2 und VEGF. Dabei führte sowohl der Zusatz von Cocarboxylase, als auch der von Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz zu einer erhöhten Adsorption von Serumproteinen. Die Bindungsaffinität des Basiszements gegenüber Osteocalcin, BMP-2 und VEGF konnte durch Funktionalisierung mit Arginin gesteigert werden. Während die Modifizierung mit Cocarboxylase nur die VEGF-Adsorption förderte, bewirkte der Zusatz von Asparaginsäure-Natriumsalz eine Erhöhung der Osteocalcin- und BMP-2-Adsorption. Bedingt durch die größere spezifische Oberfläche der noch nicht abgebundenen Zemente, war die Menge adsorbierter Proteine auf frisch hergestellten Zementproben im Vergleich zu abgebundenen und ausgehärteten Zementen signifikant höher.
Die Eignung der ausgewählten Zementvarianten als Knochenersatzmaterialien wurde mithilfe humaner mesenchymaler Stammzellen zweier verschiedener Spender getestet. Bei Verwendung abgebundener und ausgehärteter Zemente waren die hMSC in der Lage, auf allen Modifikationen zu adhärieren, zu proliferieren und in die osteogene Richtung zu differenzieren. Eine vorherige Inkubation der Zementproben mit humanem Serum förderte dabei vor allem die Zelladhäsion. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass hMSC im Gegensatz zu anderen Studien auch auf frisch hergestellten Zementproben adhärieren, proliferieren und differenzieren können. Die Modifizierung des Basiszements mit Cocarboxylase führte hierbei zu einer gegenüber den anderen Modifikationen signifikant erhöhten Zelladhäsion und -vitalität.
Neben den verschieden modifizierten Pulver/Flüssigkeitszementen wurden im Rahmen dieser Arbeit neuartige ready-to-use Zementpasten untersucht. Diese zeigten allerdings im Vergleich zu den herkömmlichen Zementen eine geringere Proteinbindungsaffinität. HMSC, die auf den Pastenzementen kultiviert wurden, war es wiederum möglich zu adhärieren, zu proliferieren und den osteoblastenspezifischen Marker Alkalische Phosphatase zu exprimieren. Hinsichtlich ihrer Biokompatibilität sind sie damit vergleichbar zu den herkömmlichen Pulver/Flüssigkeitszementen.
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Proliferations- und Differenzierungspotential oviner und equiner mesenchymaler Stammzellen nach Markierung mit superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln sowie deren Nachverfolgbarkeit mittels MagnetresonanztomographieVeit, Christin 30 August 2011 (has links)
Mesenchymale Stammzellen (MSC) werden bereits in klinischen Studien zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt. Über deren Wirkmechanismus und Verbleib nach Applikation ist jedoch noch wenig bekannt. Die in vivo-Nachverfolgung markierter MSC mittels Magnetresonanztomographie stellt eine mögliche Methode zur Erlangung weiterer Erkenntnisse dar. Zu diesem Zweck können die MSC mittels superparamagnetischen Eisenoxid (SPIO)-Partikeln markiert werden.
In dieser Arbeit wurden 3 verschiedene SPIO-Produkte zur Markierung oviner und equiner MSC verwendet: Endorem™, Resovist® und Molday ION Rhodamine B™. Die Produkte wurden hinsichtlich ihrer Einflüsse auf die biologischen Eigenschaften der MSC, ihrer Markierungseffizienz und –selektivität verglichen. Desweiteren wurde die produktspezifische magnetresonanztomographische Nachverfolgbarkeit der SPIO-markierten MSC untersucht. Weiterführendes Ziel war die Selektion des am besten geeigneten SPIO-Produktes für die Verwendung in einem in vivo-Großtierversuch zur magnetresonanztomographischen Nachverfolgung SPIO-markierter MSC nach Applikation in arthrotische Gelenke. Die MSC wurden dazu aus dem Knochenmark von je 5 gesunden Schafen und Pferden isoliert, bis zur Passage 4 (P4) expandiert und schließlich mit den verschiedenen SPIO-Produkten markiert. Unmarkierte MSC der gleichen Tiere dienten zur Kontrolle. Proliferationsvermögen sowie tripotentes Differenzierungspotential wurden in vitro untersucht. Zur Evaluierung von Markierungsselektivität und -effizienz der SPIO-Produkte wurden die MSC ab der P4 bis zur P7 wöchentlich passagiert. Ein semiquantitatives histologisches Auswertungssystem basierend auf der Preußisch Blau-Färbung sowie T2*w-GRE-Sequenzen an einem 0,5T-MRT-System wurden zur Evaluierung genutzt. Markierungsselektivität bezeichnete die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der SPIO-Partikel. Markierungseffizienz beschrieb die Menge intrazellulär vorhandener SPIO-Partikel. Es wurde gezeigt, dass sich ovine und equine MSC mit allen 3 untersuchten SPIO-Produkten erfolgreich markieren ließen. Die Ergebnisse der in vitro-Untersuchungen ergaben keine Unterschiede zwischen SPIO-markierten und unmarkierten MSC hinsichtlich des Proliferationsvermögens, der adipogenen oder osteogenen Differenzierungsfähigkeit. Jedoch wurde eine deutliche Verminderung des chondrogenen Differenzierungspotentials SPIO-markierter MSC beobachtet, welche von der Menge intrazellulär vorhandener SPIO-Partikel und somit von der Markierungseffizienz abhängig war. Zum Zeitpunkt der initialen Markierung konnte nur Molday ION Rhodamine B™ eine selektive und effiziente Zellmarkierung gewährleisten. Mit Endorem™ konnte eine selektive, jedoch keine ausreichend effiziente Zellmarkierung erreicht werden. Resovist® dagegen bewirkte zwar eine effiziente, aber sehr unselektive initiale Zellmarkierung: Mittels Preußisch Blau-Färbung wurde gezeigt, dass große Mengen von SPIO-Partikeln nur extrazellulär anhefteten. Die 3 verschiedenen SPIO-Produkte führten weiterhin zu unterschiedlich starken hypointensen MRT-Signalen der markierten MSC, welche im Verlauf der 3-wöchigen Versuchsdauer bei allen 3 Produkten stetig abnahmen. Unmarkierte MSC waren isointens, also mittels MRT nicht darstellbar und daher nicht nachverfolgbar. Stets verursachten Resovist®-markierte MSC das stärkste hypointense MRT-Signal, gefolgt von Molday ION Rhodamine B™ und Endorem™. Resovist®-markierte MSC konnten mittels MRT bei beiden Spezies über den längsten Zeitraum nachverfolgt werden (ovine MSC bis 16 Tage, equine MSC bis 23 Tage nach Markierung).
Aufgrund der exzellenten initialen Markierungseigenschaften (hohe Markierungsselektivität und –effizienz sowie gute Nachverfolgbarkeit) eignet sich Molday ION Rhodamine B™ besonders gut für die SPIO-Markierung von MSC zur Nachverfolgung mittels MRT. Molday ION Rhodamine B™ verspricht somit eine erfolgreiche Anwendung in einem in vivo-Versuch zur magnetresonsztomographischen Nachverfolgung von MSC nach Applikation in arthrotische Gelenke. / Mesenchymal stem cells (MSC) are already used in clinical studies for treatment of different diseases. However, their mechanism of action and fate after application are still not fully understood. In vivo tracking of labeled MSC via magnetic resonance imaging (MRI) is a possible method to achive further knowledge. For this purpose MSC can be labelled with superparamagnetic iron oxide (SPIO) particles.
For this study 3 different SPIO products were employed for labelling of ovine and equine MSC: Endorem™, Resovist®,, and Molday ION Rhodamine B™. The products were compared in terms of their influence on biologic behaviour of the MSC, their labelling efficiency, and selectivity. Furthermore, product specific magnetic resonance traceability of SPIO labelled MSC was evaluated. Final aim was the selection of the most suitable SPIO product to be used in an in vivo large animal study employing MRI tracking of SPIO labelled MSC after application into osteoarthritic joints. MSC therefore, were isolated from bone marrow of each 5 healthy sheep and horses, expanded up to passage 4 (p4), and labelled by the different SPIO products. Unlabelled MSC from the same animals served as control. Proliferation potential and tripotent differentiation capacities were assessed in vitro. For evaluation of labelling selectivity and efficiency of the SPIO products MSC were passaged weekly from p4 up to p7. Semiquantitative histological scoring based on Prussian blue staining and images using T2*w GRE sequences in a 0.5T MRI system were used. Labelling selectivity describes the intra- or extracellular localisation of the SPIO particles. Labelling efficiency describes the amount of intracellular SPIO particles. It was shown that ovine and equine MSC could be successfully labelled by all 3 evaluated SPIO products. The results of the in vitro experiments did not show differences between labelled and unlabelled MSC in terms of proliferation potential, adipogenic or osteogenic differentiation capacities. However, an inhibited chondrogenic differentiation capacity of SPIO labelled MSC was observed, which was dependend on the amount of intracellular SPIO particles and therefore, also on labelling efficiency. At the time of initial labelling, only Molday ION Rhodamine B™ showed selective and efficient cell labelling. With Endorem™ selective, but not efficient cell labelling was achieved. Resovist®, in contrast, caused efficient but very unselective initial cell labelling: By Prussian blue staining it was shown that large amounts of SPIO particles were attached extracellularly. These 3 different SPIO products led to variable hypointense MRI signals of the labelled MSC which decreased in all 3 products during the 3 week study period. Unlabelled MSC were isointense, thus not visible, and therefore, not traceable using MRI. At every point of time, Resovist® labelled MSC resulted in the most hypointense MR signals, followed by Molday ION Rhodamine B™ and Endorem™. Resovist® labelled MSC were traced over the longest time span (ovine MSC until 16 days, equine MSC until 23 days post labelling).
Due to excellent initial labelling properties (high labelling efficiency and selectivity, good traceability) Molday ION Rhodamine B™ suits best for SPIO labelling of MSC to be tracked by MRI. Molday ION Rhodamine B™ therefore, promises a successful use in an in vivo study using MRI for MSC tracking after application into osteoarthritic joints.
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Investigating physical factors that regulate morphogenesis and fate of mouse embryonic midline suturesAlves Afonso, Diana 04 April 2022 (has links)
Stem cells are crucial players during development, homeostasis and tissue regeneration and their interactions with the surrounding microenvironment are key to regulate stem cell fate. The skull's stem cell niches reside in the fibrous joints that connect flat bones of the skull. In the embryo, bone and sutures develop in concert to form a complex, multi-facted structure that requires interaction with multiple differentiating cell types to maintain balance between growth and differentiation. Disruption of this balance drives changes in size and shape of skull bones and can severely impact quality of life. Cranial sutures, often seen as simple extracellular matrix-rich structures bridging the rigid plates of the skull, are major actors in craniofacial morphogenesis of as they harmonize bone growth with expansion of the developing brain and participate in providing osteoblasts during repair. The complexity of the extracellular environment and the important role for sutures in skeletal development makes these niches a compelling structure to investigate how interactions with the surrounding microenvironment can modulate stem cells fate. The key role of sutures in development is highlighted by the numerous severe dysmorphisms arising from failure to maintain suture patency. The ability of the suture to respond to brain growth or trauma and the dysmophisms presented by patients with defective sutures is mediated by both biochemical and mechanical cues but the cell biology of these niches remains elusive, especially during their development. In particular, few studies have shed light on the underlying cellular behaviors behind microenvironmental regulation of cranial suture stem cell fate and what role mechanical inputs play in the establishment of this niche. In my thesis, I addressed gaps in our understanding of suture biology by characterizing the suture stem cell niche microenvironment and exploring how cell-ECM interactions serve as regulators of suture stem cell fate. Making use of various microscopy and analytical techniques I first characterized the composition of the microenvironment in a developing suture niche, such as organization of ECM, cytoskeleton and nuclear morphologies. My work builds on an incomplete transcriptional understanding of suture cell development, such that specific genetic markers are rarely useful for identifying distinct suture cell populations during its morphogenesis. By applying shape description tools to parse suture cells and test whether shape correlates to cell identity, we concluded that suture nuclei are distinct and less spherical than those of other cranial tissues. Using 'global' markers such as nuclear stains, I have also identified physical distinctions between suture nuclei and neighboring tissues, indicating that cell shape is an integral part of midline suture identity and can be used to explore coordination of fate choice and morphogenesis in this enigmatic structure. In addition, I present evidence that supports that maturation of extracellular matrix begins during early stages of suture development. In particular, embryonic midline sutures express high levels of fibrillary collagen, which contributes to the formation of a complex extracellular environment that provides the suture with physical properties distinct from those of developing bones. My work shows the presence of cell-ECM and cell-cell adhesions in the developing midline sutures, as well as a complex actin cytoskeleton that is, in part, mediated by physical stresses resultant from underlying brain expansion. Secondly, I aimed to address how perturbations in ECM composition can affect cell specification. To investigate the importance of ECM maturation in regulating suture cell fate I inhibited the function of lysyl oxidase, a collagen crosslinker, during embryonic development. Disruption of collagen crosslinking altered expression of collagen and ECM receptor encoding genes. In addition, this inhibition induced changes in the shape and size of collagen fibers in the embryonic midline suture and decreased tissue bulk stiffness relative to WT. These abnormal properties of the ECM impact tissue delineation in the cranial mesenchyme through nuclear shape analyses. This might be explained by observed changes in the composition of the nuclear envelop of suture cells as we find altered lamin concentration and localization upon lysyl oxidase inhibition. The work developed during myPhD steps away from the traditional genetic approaches used to study the embryonic suture and provides the first in-depth analysis of the physical properties of the developing midline suture at stages preceding known establishment of the niche. The various methods and analyses applied reveal a complex organization of embryonic suture ECM and its tight relationship with shape and fate in this tissue. This work serves as a foundation for future studies that can explore the mechanisms through which ECM regulates fate and development of the suture niche, and potentially skeletal development more generally.
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Etablierung und Validierung eines Meerschweinchenmodells für die (humane) kongenitale ToxoplasmoseGrochow, Thomas 27 October 2023 (has links)
Die kongenitale Toxoplasmose kann zu schwerwiegenden Folgen für einen Fötus führen. In dieser Dissertation wird erstmals ein geeignetes Tierversuchsmodell in Form des Meerschweinchens etabliert. Anhand dessen konnten die pathologischen Alterationen als eine Folge von einer durch den Parasiten verursachte Reduktion von Neuronen und neuralen Stammzellen zurückgeführt werden.
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Systems biology approaches to somatic cell reprogramming reveal new insights into the order of events, transcriptional and epigenetic control of the processScharp, Till 03 November 2014 (has links)
Die Reprogrammierung somatischer Zellen hat sich kürlich als leistungsfähige Technik für die Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) aus terminal differenzierten Zellen bewährt. Trotz der großen Hoffnung, die sie speziell im Bezug auf patientenspezifische Stammzelltherapie darstellt, gibt es viele Hindernisse auf dem Weg zur Anwendung in der Humanmedizin, die sich von niedrigen Effizienzen bei der technischen Umsetzung bis hin zur unerwünschten Integration von Onkogenen in das menschliche Genom erstrecken. Aus diesem Grund ist es unabdingbar, unser Verständnis der zugrundeliegenden Prozesse und Mechanismen zu vertiefen. Durch neue Datengewinnungsmethoden und stetig wachsende biologische Komplexität hat sich der Denkansatz der Systembiologie in den letzten Jahrzehnten stark etabliert und erfährt eine fortwährende Entwicklung seiner Anwendbarkeit auf komplexe biologische und biochemische Zusammenhänge. Verschiedene mathematische Modellierungsmethoden werden auf den Reprogrammierungsprozess angewendet um Engpässe und mögliche Effizienz-Optimierungen zu erforschen. Es werden topologische Merkmale eines Pluripotenznetzwerkes untersucht, um Unterschiede zu zufällig generierten Netzen und so topologische Einschränkungen des biologisch relevanten Netzwerkes zu finden. Die Optimierung eines Booleschen Modells aus einem selbst kuratierten Netzwerk in Bezug auf Genexpressionsdaten aus Reprogrammierungsexperimenten gewährt tiefgreifende Einblicke in die ersten Schritte und wichtigsten Faktoren des Prozesses. Der Transkriptionsfaktor SP1 spielt hierbei eine wichtige Rolle zur Induktion eines intermediären, transkriptionell inaktiven Zustands. Ein probabilistisches Boole''sches Modell verdeutlicht das Zusammenspiel epigenetischer und transkriptioneller Kontrollprozesse zusammen, um Pluripotenz- und Zelllinien-Entscheidungen in Reprogrammierung und Differenzierung zu treffen. Erklärungen für die geringe Effizienz werden versucht. / Somatic Cell Reprogramming has emerged as a powerful technique for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from terminally differentiated cells in recent years. Although holding great promises for future clinical development, especially in patient specific stem cell therapy, the barriers on the way to a human application are manifold ranging from low technical efficiencies to undesirable integration of oncogenes into the genome. It is thus indispensable to further our understanding of the underlying processes involved in this technique. With the advent of new data acquisition technologies and an ever-growing complexity of biological knowledge, the Systems Biology approach has seen an evolution of its applicability to the elaborate questions and problems of researchers. Using different mathematical modeling approaches the process of somatic cell reprogramming is examined to find out bottlenecks and possible enhancements of its efficiency. I analyze the topological characteristics of a pluripotency network in order to find differences to randomly generated networks and thus deduce constraints of the biologically relevant network. The optimization of a Boolean model from a curated network against early reprogramming gene expression profiles reveals profound insights into the first steps and most important factors of the process. The transcription factor SP1 emerges to play an important role in the induction of an intermediate, transcriptionally inactive state. A probabilistic Boolean network (PBN) illustrates the interplay of transcriptional and epigenetic regulatory processes in order to explain pluripotency and cell lineage decisions in reprogramming and differentiation. Explanations for the low reprogramming efficiencies are tried.
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microRNA expression profile of undifferentiated and differentiating pluripotent cells / microRNA Expressionsprofile in nicht differenzierten und differenzierten pluripotenten ZelllinienPantazi, Angeliki 29 September 2009 (has links)
No description available.
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Functional Characterization of Neurexophilins in the Central Nervous system / Funktionelle Charakterisierung von Neurexophilinen im ZentralnervensystemBenglopoulos, Vasileios 20 June 2002 (has links)
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