abstract: The viscous lung mucus of cystic fibrosis (CF) patients is characterized by oxygen gradients, which creates a unique niche for bacterial growth. Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, two predominant microorganisms chronically infecting the airways of CF patients, typically localize in hypoxic regions of the mucus. While interspecies interactions between P. aeruginosa and S. aureus have been reported, little is known about the role of low oxygen in regulating these interactions. Studying interspecies interactions in CF lung disease is important as evidence suggests that microbial community composition governs disease progression. In this study, P. aeruginosa lab strain PAO1 and two primary clinical isolates from hypoxic tissues were cultured alone, or in combination, with methicillin resistant S. aureus (MRSA) strain N315 under hypoxic or normoxic conditions. Herein, it is shown for the first time that low oxygen conditions relevant to the CF lung affect the competitive behavior between P. aeruginosa and S. aureus. Specifically, S. aureus was able to better survive competition in hypoxic versus normoxic conditions. Competition data from different oxygen concentrations were consistent using PAO1 and clinical isolates even though differences in the level of competition were observed. PAO1 strains carrying mutations in virulence factors known to contribute to S. aureus competition (pyocyanin/phzS, elastase/lasA and lasI quorum sensing/lasI) were used to determine which genes play a role in the differential growth inhibition. The lasA and lasI mutants competed less effectively with S. aureus regardless of the oxygen level present in the culture compared to the isogenic wild type strain. These results are consistent with previous findings that elastase and lasI quorum sensing play a role in competitive behavior of P. aeruginosa and S. aureus. Interestingly, the phzS mutant competed less effectively in hypoxic conditions suggesting that pyocyanin may be important in microaerophilic conditions. This study demonstrates that oxygen plays a role in competition between P. aeruginosa and S. aureus and contributes to understanding CF environmental factors that may regulate microbial community dynamics important for disease progression with potential for development of therapeutic avenues. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Biology 2014

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias . / La mastitis es la principal enfermedad que afecta a vacas productoras de leche a nivel mundial, con costos de tratamiento de hasta US$ 200/vaca/año. Así mismo, las perdidas en producción de leche fluctúan entre 1.335 y 1.539 kg/lactancia/vaca en casos de mastitis sub clínica y clínica respectivamente. En Chile, dentro de los principales patógenos causantes de esta enfermedad se encuentra el Staphylococcus aureus (S. aureus) que es responsable del 22 al 68,6% de los cuadros sub clínicos. Recientemente, se ha reportado la existencia de un alto riesgo de resistencia bacteriana producto del uso inadecuado de antibacterianos para el tratamiento de mastitis causadas por S. aureus. Alternativamente en el último tiempo se ha establecido el uso de células madre mesenquimáticas (MSCs) para el tratamiento de múltiples enfermedades en medicina humana y veterinaria incluyendo infecciones bacterianas. En consecuencia, el objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial antibacteriano in vitro contra S. aureus del medio condicionado de MSCs derivadas de médula ósea y tejido adiposo fetal bovino. Se utilizaron las cepas ATCC 25923 y SAU 1S de S. aureus con el fin de determinar su sobrevivencia en medio condicionado de MSCs no concentrado, concentrado, activado y activado concentrado mediante pre-exposición a S. aureus. En estos mismos cultivos de MSCs se cuantificaron los niveles de mRNA de los péptidos antimicrobianos β-defensina 4A (bBD4A), NK-lisina 1 (NK1), catelicidina 2 (CATHL2), hepcidina e indoleamina 2,3 dioxigenasa (IDO) mediante Q-PCR y de bBD4A mediante ELISA. La sobrevivencia de la cepa ATCC 25923 no fue diferente (P>0,05) cuando fue tratada con medio condicionado no concentrado de MSCs en comparación con los controles de fibroblastos y DMEM. Sin embargo, el porcentaje de sobrevivencia de la cepa SAU 1S disminuyó (P<0,05) al ser tratada con medio condicionado no concentrado de MSCs en comparación con el control DMEM. Adicionalmente, el medio condicionado concentrado de MSCs indujo una disminución (P<0,05) en la supervivencia de la cepa SAU 1S con respecto a los medios condicionados concentrados control de fibroblastos y DMEM. El medio condicionado activado, así como el medio condicionado activado concentrado de MSCs disminuyeron (P<0,05) la supervivencia de la cepa SAU-1S con respecto a los medios controles de MSCs no activados, de fibroblastos y DMEM. La activación indujo un aumento (P<0,01) de 3,5 veces en los niveles de mRNA de bBD4A en las MSCs de tejido adiposo y de 1,17 veces en MSCs de médula ósea. Además, la activación aumentó (P<0,05) en 1,66 y 1,37 veces el nivel de mRNA de NK1 en fibroblastos y MSCs de tejido adiposo, respectivamente. Los niveles de proteína bBD4A también aumentaron (P<0,05) en los medios condicionados de MSCs y de fibroblastos por efecto de la concentración. La activación solo aumenta (P<0,05) los niveles de bBD4A en los medios condicionados de MSCs derivadas de médula ósea. En conclusión, los medios condicionados de MSCs derivadas de médula ósea y tejido adiposo fetal bovino poseen efecto antibacteriano contra S. aureus en un sistema de cultivo in vitro. Este potencial antibacteriano se ve aumentado al concentrar por filtración y activar el medio condicionado mediante pre-exposición de MSCs a S. aureus. Estos resultados sugieren que el efecto antibacteriano de MSCs es mediado por la expresión de péptidos antimicrobianos NK1 y bBD4A. / Mastitis is the main disease affecting dairy cows worldwide with treatment costs reaching up to US $ 200/cow/year. Moreover, milk production losses fluctuate between 1,335 and 1,539 kg/lactation/cow in cases of clinical and clinical sub mastitis respectively. In Chile, one of the main pathogens causing mastitis Staphylococcus aureus (S. aureus), which is responsible for 22 to 68.6% of subclinical cases. Recently a high risk of bacterial resistance has been reported due to inappropriate use of antibacterial agents in the treatment of mastitis caused by S. aureus. Alternatively, the use of mesenchymal stem cells (MSCs) has been described for the treatment of multiple diseases in human and veterinary medicine including bacterial infections. Consequently, the aim of the present study was to evaluate the in vitro antibacterial potential against S. aureus of conditioned medium from MSCs derived from bone marrow and fetal bovine adipose tissue. S. aureus trains ATCC 25923 and SAU 1S were used in order to determine their survival in conditioned medium from non-concentrated, concentrated, activated and activated concentrated MSCs by exposure to S. aureus. mRNA levels from antibacterial peptides β-defensin 4A (bBD-4A), NK-lysine 1 (NK1), catelicidin 2 (CATHL2), hepcidin and Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) were quantified by quantitative-PCR (Q-PCR) and bBD-4A by ELISA. The survival percentage of ATCC strain 25923 was not different (P>0.05) when it was treated with non-concentrated conditioned medium of MSCs compared to controls of fibroblasts and DMEM. In contrast, the survival percentage of SAU-1S strain decreased (P<0.05) when it was treated with nonconcentrated conditioned medium of MSCs compared to the DMEM control. Additionally, the concentrated conditioned medium of MSCs induced a decrease (P<0.05) in the survival percentage of the SAU 1S strain in comparison to the conditioned medium control fibroblasts and DMEM. The activated conditioned medium as well as the conditioned and activated conditioned medium of MSCs decreased (P<0.05) survival percentage of the SAU 1S strain with respect to non-activated MSCs control media, fibroblasts and DMEM. Activation induced a 3.5-fold increase (P<0.01) in bBD4A mRNA levels in adipose tissue MSCs and 1.17-fold in bone marrow MSCs. In addition, activation increased (P<0.05) 1.66 and 1.37-fold levels of NK1 mRNA in fibroblasts and adipose tissue MSCs, respectively. Levels of bBD4A also increased (P<0,05) in the conditioned media of MSCs and fibroblasts by concentration effect. Moreover, activation increased levels of bBD4A in conditioned media of MSCs derived from bone marrow. In conclusion, conditioned medium of MSCs possess antibacterial effect against S. aureus in an in vitro culture system. The antibacterial property is increased when conditioned medium is concentrated by filtration and activated by pre-exposition to S. aureus. The antibacterial potential of MSCs may be exerted by expression of antimicrobial peptides bBD4A and NK1. / Financiamiento: Proyecto Fondef ID 15I10129.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-12-09Bitstream added on 2014-06-13T20:31:20Z : No. of bitstreams: 1 franchi_eplp_me_botfm.pdf: 4815496 bytes, checksum: 1dc26a3719261d8f1f4551fbb04a10f4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O gênero Staphylococcus está envolvido em infecções adquiridas tanto na comunidade como em hospitais, sobressaindo-se atualmente como um dos maiores problemas clínicos e epidemiológicos em infecções nosocomiais. Diante da importância do S.aureus como um dos microrganismos mais freqüentemente isolados de infecções de pele e tecidos moles e a crescente disseminação dos S. aureus resistentes a oxacilina (MRSA), este estudo objetiva identificar a presença de MRSA em feridas de pacientes atendidos em unidades básicas de saúde da cidade de Botucatu, caracterizar o cassete cromossômico mec e identificar fatores de risco para aquisição de S aureus e MRSA. Foram incluídas no estudo 126 amostras isoladas de 107 pacientes atendidos no período de março de 2010 à fevereiro de 2011. As amostras foram submetidas à identificação e detecção de resistência a oxacilina pelo método de difusão com disco de oxacilina e cefoxitina, penicilina, levofloxacina, clindamicina, eritromicina, gentamicina, sulfametazol/Trimetropim, tigeciclina, ácido fusídico, quinupristina/dalfopristina, linezolida e vancomicina. Foi realizada a caracterização do SCCmec por PCR multiplex nas amostras de S. aureus com gene mecA. Foi investigada a presença dos genes codificadores da Leucocidina Panton-Valentine (PVL). As amostras de Staphylococcus spp. também foram submetidas detecção de produção de -lactamase. Das 126 amostras estudadas, 73(58%) foram identificadas como genero Staphylococcus spp., sendo 49/73(67,1%) isolados S. aureus e 24/73(32,9%) estafilococos coagulase-negativa (ECN). A produção de -lactamase foi positiva em 65/73(89%) das amostras de Staphylococcus spp. Foi encontrado 7/49(14,2%) isolados de S. aureus e 13/24(54,1%) isolados de ECN com presença do gene mec A... / The genus Staphylococcus is involved in both community and hospital-acquired infections, currently standing out as major clinical and epidemiological problems in nosocomial infections. Given the importance of S. aureus as one of the most frequently microorganism isolated from skin and soft tissue infections and the increasing spread of methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the aims of this study were to identify the presence of MRSA in wounds of patients treated at basic health units in Botucatu, characterize the cassette chromosome mec (SCCmec) and identify risk factors for acquisition of S aureus and MRSA. The study included 126 isolates from 107 patients treated from March 2010 to February 2011. The samples were identified and the disk diffusion method with cefoxitin and oxacillin disks was carried out in order to detect the resistance to oxacillin. The disk diffusion method was also carried out to set the susceptibility profile for the following antibiotics: penicillin, levofloxacin, clindamycin, erythromycin, gentamicin, sulfamethoxazole/trimethoprim, tigecycline, fusidic acid, quinupristin/dalfopristin, linezolid and vancomycin. mecA positive samples were submitted to SCCmec characterization using multiplex PCR. We also investigated the presence of genes encoding Panton-Valentine Leukocidin (PVL) as far as the - lactamase production. From the 126 samples studied, 73 (58%) were identified as genus Staphylococcus spp., and 49/73 (67.1%) isolates were identified as S.aureus and 24/73 (32.9%) as coagulase-negative Staphylococcus (CoNS). The -lactamase production was positive in 65/73 (89%) samples of Staphylococcus spp. The mecA gene was detected in 7/49 (14.2%) isolates of S. aureus and 13/24 (54.1%) isolates of CoNS. Among MRSA, 4/7 (57.2%) isolates were SCCmec type... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Ana Claudia Pavarina / Banca: Ana Lúcia Machado / Banca: Francisco de Assis Nollo Junior / Banca: Helena de Freitas Oliveira Paranhos / Banca: Soraya Coelho Leal / Resumo: Esta investigação teve os seguintes objetivos: 1. avaliar in vitro o efeito da Terapia Fotodinâmica (PDT) utilizando diferentes concentrações de curcumina e doses de luz LED na inativação de suspensões planctônicas de S. aureus resistente (MRSA) e susceptível à meticilina (MSSA) e a citotoxicidade dos parâmetros antimicrobianos dessa terapia em cultura celular de fibroblastos; 2. o efeito fotodinâmico da cloro-alumínio ftalocianina (ClAlFt) veiculada em nano-emulsão catiônica e aniônica e comparar com ClAlFt diluída em solvente orgânico na inativação da C. albicans quando em suspensão planctônica e organizados em biofilmes; 3. o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica utilizando a cloroalumínio ftalocianina em sistema de nanoemulsão em culturas planctônicas e biofilmes de bactérias gram-positivas (MSSA e MRSA). No primeiro estudo, suspensões de MSSA e MRSA foram tratadas com diferentes concentrações de curcumina (entre 0,1 a 20,0 μM) e expostas a diferentes fluências de LED azul (18; 25 e 37,5 J/cm2). Em seguida, diluições seriadas foram obtidas e alíquotas de 25 μl de cada diluição foram plaqueadas em meio de cultura Mannitol Salt Agar. Após o período de incubação de 48 horas a 37°C, as unidades formadoras de colônias foram determinadas (UFC/mL). Para as células L929, essas foram incubadas por 20 minutos com curcumina e irradiadas em seguida com LED (37,5 J/cm2). A viabilidade celular após a PDT foi avaliada utilizando o teste de MTT e as alterações morfológicas foram avaliadas pela microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados foram submetidos à análise descritiva, Análise de Variância (ANOVA) e post hoc de Tukey (α= 5%). As concentrações de 5, 10 e 20 μM resultaram em completa inativação do MSSA quando associadas a qualquer fluência de energia... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this investigation was to evaluate: 1. the Photodynamic Therapy (PDT) mediated by curcumin for in vitro inactivation of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and susceptible S. aureus (MSSA) and its citotoxic effects against L929 fibroblasts; 2. the photodynamic potential of aluminum-chloride-phthalocyanine (ClAlPc) entrapped in cationic and anionic nanoemulsions (NE) to inactivate C. albicans planktonic and biofilm cultures compared with free ClAlPc; 3. the photodynamic effect of ClAlPc encapsulated in NE on methicillin susceptible and resistant S. aureus suspensions and biofilms. In the first study, suspensions of MSSA and MRSA were treated with different concentrations of curcumin and exposed to LED. Serial dilutions were obtained from each sample, and colony counts were quantified. For fibroblasts, the cell viability subsequent to the curcumin-mediated photodynamic therapy was evaluated using the MTT assay and morphological changes were assessed by SEM analysis. Curcumin concentrations ranging from 5.0 to 20.0 μM in combination with any tested LED fluences resulted in photokilling of MSSA. However, only the 20.0 μM concentration in combination with highest fluence resulted in photokilling of MRSA. This combination also promoted an 80% reduction in fibroblast cell metabolism and morphological changes were present, indicating that cell membrane was the main target of this phototherapy. In the second study, fungal suspensions were treated with different types of delivery systems containing ClAlPc. After 30 minutes, the drug was washed-out and samples were illuminated with LED source (660 ± 3 nm). Negative control samples were not exposed to ClAlPc or light. For planktonic suspensions, colonies were counted (CFU/ml) and cell metabolism was evaluated by XTT assay. (Kruskal-Wallis and... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Valdecir Farias Ximenes / Coorientador: Luiz Marcos da Fonseca / Banca: Maria Luiza Zeraik / Banca: Iêda Maria Marinez Paino / Banca: Daniel Rinaldo / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Resumo: Inúmeras patologias têm a sua gênese e/ou progressão relacionadas à produção desregulada de intermediários oxidantes. O complexo multienzimático NADPH oxidase é um dos componentes de maior relevância neste contexto, pois é uma das principais fontes de ânion superóxido no organismo animal. Sendo expresso em inúmeros tecidos, incluindo leucócitos e células do tecido endotelial, o desenvolvimento de inibidores eficientes deste complexo enzimático poderá significar uma nova terapêutica para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas. Com objetivo de explorar a relação entre a estrutura molecular, as propriedades químicas e atividades biológicas, utilizamos o éster fenetílico do ácido cafeico (CAPE) como inibidor do complexo enzimático NADPH oxidase e comparamos sua eficácia com o seu precursor ácido cafeico e os derivados, éster fenetílico do ácido cinâmico e o ácido clorogênico, correlacionando-os a respeito a sua hidrofobicidade, propriedades redox e inibição do complexo NADPH oxidase em leucócitos ativados. A hipótese seria de que um aumento da hidrofobicidade provocado pela esterificação do ácido cafeico poderia facilitar o seu acesso à membrana celular e assim alterar seu efeito como possível inibidor de NADPH Oxidase. Os resultados, em ensaios in vitro, mostraram que as alterações na hidrofobicidade não provocaram alterações significativas no potencial de oxidação e potencial antioxidantes dos compostos testados. Quando testados em leucócitos ativados (modelos ex vivo),... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Several diseases have their genesis and / or progression related to unregulated production of oxidants intermediates. The multienzymatic complex NADPH oxidase is one of the most important components in this context because it is a major source of superoxide anion in animal organisms. It is expressed in numerous tissues, including leukocytes and endothelial tissue cells. Developing effective inhibitors of this enzyme complex may indicate a new therapy for the treatment of chronic inflammatory diseases. Several studies have described numerous anti-inflammatory properties attributed to caffeic acid phenethyl ester (CAPE), an active component found in propolis. In order to explore the relationship between the molecular structure, chemical properties and biological activities, we used CAPE to inhibit the enzyme complex NADPH oxidase and compare its efficacy with the its precursor caffeic acid and derivatives, phenethyl ester of cinnamic acid and chlorogenic acid, correlating them with regard to hydrophobicity, redox properties and inhibition of NADPH oxidase complex on activated leukocytes. The hypothesis was that an increase of hydrophobicity caused by the esterification of caffeic acid could facilitate access to cell membranes and thereby alter its effect as a possible inhibitor of NADPH oxidase. The results (in vitro), showed that the changes in hydrophobicity did not provoke significant changes in the oxidation potential and antiradical potency of the tested compounds. But whe... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Maria Stella Gonçalves Raddi / Banca: Mariza Landgraf / Banca: Karina Ferrazzoli Devienne / Resumo: Esse estudo foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito da concentração subinibitória de quercetina sobre alguns fatores relacionados à virulência de Staphylococcus aureus (ATCC 25923). A atividade antibacteriana foi determinada através do método de microdiluição em caldo e a concentração de 40μg/mL de quercetina foi utilizada como sub-inibitória. O sobrenadante de culturas de S. aureus em BHI contendo quercetina diminuiu a atividade hemolítica para hemácias de carneiro mas não alterou a atividade de citolisinas extracelulares para células de linhagem contínua (células McCoy B ATCC 1696) quando comparado com o sobrenadante da cultura na ausência do flavonol. O efeito da quercetina na fagocitose do S. aureus por polimorfonucleares neutrófilos (PMN) foi determinado através de técnica quimiluminescente. O burst oxidativo de PMN foi estatisticamente significativo para bactérias tratadas em relação às não tratadas, demonstrando que S. aureus crescidos na presença de quercetina tornam-se menos susceptíveis à fagocitose. A inibição da expressão de fatores relacionados à adesão bacteriana foi evidenciada através dos experimentos de fagocitose/adesão em microscopia óptica (1.000x). Mesmo que a quercetina, abaixo da concentração inibitória, tenha pouco efeito sobre a viabilidade de S. aureus, o conhecimento de que esse flavonol é capaz de alterar a adesão de estafilicocos à superfície celular parece ser atrativo para a sua utilização como profilático em processos infecciosos, visto que a adesão é o primeiro passo na patogênese da infecção bacteriana. Entretanto, deve-se considerar sua interferência com a atividade de células fagocíticas, uma importante função do sistema imune do hospedeiro. / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effects of quercetin at sub-inhibitory concentration on some Staphylococcus aureus (ATCC 25923) factors related to the virulence. The antibacterial activity of quercetin was evaluated by broth microdilution method and the concentration of 40 μg/mL was used as sub- inhibitory. S. aureus BHI culture supernatant containing quercetin reduced the hemolytic activity for sheep erythrocytes but did not exhibit a detectable change in cytolysin extracellular activity on continuous cell lines (McCoy B cells ATCC 1696) when compared with quercetin-free medium. The effect of quercetin-grown staphylococci phagocytosis by polymorphonuclear neutrophils (PMN) was compared with the effect on non-treated bacteria by chemiluminescence assay. The level of oxidative burst of PMN was statistically different in untreated versus quercetin-treated bacteria showing that druggrown cells became less susceptible to phagocytic uptake. The inhibition of expression of factors related bacterial adhesion was established though adesion/phagocytosis experiments by optical microscopy (1.000x). Even if quercetin at low level has little effect on S. aureus viability, the knowledge that this flavonol is able to affect the properties of staphylococci adherence to cell surfaces may be an attractive advance for its applications as prophylactic in infectious process, considering that bacterial adherence is the initial event in the pathogenesis of bacterial infection. Conversely, it also interferes with the activities of phagocytic cells, an important function of host immune system. / Mestre

As interações que ocorrem entre as bactérias e amebas podem dar-se através de relações mútuas, onde ambos os organismos se beneficiam da associação ou parasitárias, em que um organismo se beneficia em detrimento do outro. Quando esses organismos compartilham o mesmo ambiente, pode resultar em algumas alterações, seja no crescimento dos organismos, nos padrões de adaptação, na morfologia, no seu desenvolvimento ou até mesmo na sua capacidade para sintetizar proteínas e outras substâncias. No presente estudo, avaliou-se a interação entre Acanthamoeba polyphaga e Staphylococcus aureus (MRSA) através de um modelo de cocultivo em diferentes tempos de incubação. A partir deste, 89% das células amebianas permaneceram viáveis após contato com a bactéria. O isolado bacteriano foi visualizado no interior da ameba através de microscopia confocal e de fluorescência em até 216 horas de cocultivo, sendo considerado um microrganismo resistente à ameba. O contato de A. polyphaga com S. aureus (MRSA) não demonstrou alteração fenotípica da ameba através dos testes fisiológicos de osmo e termotolerância. O lisado da cultura amebiana aumentou o crescimento de S. aureus (MRSA) nos diferentes tempos de incubação, porém houve diferença significativa apenas entre o controle e 96 horas de cocultivo. O crescimento de S. aureus (MRSA) foi inibido ao longo dos tempos de incubação pelo efeito do sobrenadante da cultura amebiana apresentando diferença significativa entre o controle e 96 horas de cocultivo, sugerindo-se que A polyphaga tenha secretado algum tipo de metabólito, que inibiu o crescimento da bactéria. A interação dos microrganismos não apresentou alterações significativas no perfil de susceptibilidade aos antibióticos testados. S. aureus (MRSA) permaneceu viável em cistos de A. polyphaga, reforçando a hipótese de que Acanthamoeba pode desempenhar um papel crucial na propagação de S. aureus (MRSA) na comunidade e ambiente hospitalar. O maior percentual de amebas encistadas deu-se em 96 horas de incubação quando cocultivadas com o isolado de S. aureus (MRSA), apresentando um aumento progressivo deste percentual a cada período de incubação. A partir disso, estudos devem intensificar-se para melhor compreender os mecanismos de virulência envolvidos na interação entre ambos os microrganismos. / The interactions that occur between bacteria and amoebae can give through mutual relations, where both organisms benefit from the association or parasitic in which one organism benefits at the expense of the other. When these organisms share the same environment, can result in some changes in the growth of organisms, in adaptation patterns, in morphology, development or even in their ability to synthesize proteins and other substances. In the present study, we evaluated the interaction between Acanthamoeba polyphaga and Staphylococcus aureus (MRSA) using a coculture model at different incubation times. From this, 89% of amoebic cells remain viable after contact with the bacteria. The bacterial isolate was visualized inside the amoeba through confocal microscopy and fluorescence for up to 216 hours of cocultivation, being considered a resistant microorganism to the amoeba. The contact of A. polyphaga with S. aureus (MRSA) showed no phenotypic changes of amoeba through physiologic osmo or thermotolerance tests. The lysate of amoebic culture increased the growth of S. aureus (MRSA) in the different incubation times, but there was a significant difference only between the control and 96 hours of cocultivation. The growth of S. aureus (MRSA) has been inhibited over the incubation times for the effect of amoebic culture supernatant showing a significant difference between the control and 96 hours of coculture, suggesting tha A. polyphaga has some kind of secreted metabolites inhibiting the growth of bacteria. The interaction of microorganisms showed no significant changes in the susceptibility profile of the tested antibiotics. S. aureus (MRSA) remained viable cysts of A. polyphaga, reinforcing the hypothesis that Acanthamoeba can play a crucial role in the spread of S. aureus (MRSA) in the community and hospital. The highest percentage of encysted amoebae occurred in 96 hours of incubation when cocultured with the isolate of S. aureus (MRSA), with a progressive increase in this percentage to each incubation period. From this, studies should be intensified to better understand the virulence mechanisms involved in the interaction between these two organisms.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) é um dos principais patógenos responsáveis pela infecção nosocomial e recentemente tem sido isolada fora do ambiente hospitalar, trazendo uma grande preocupação a médicos e pesquisadores. Esta resistência à meticilina é devida à presença do gene mecA, o qual codifica a PLP2a, uma proteína ligadora de penicilina, que tem baixa afinidade pelos antibióticos β-Lactâmicos. A vancomicina, até recentemente, era o tratamento de escolha para pacientes acometidos pela SARM; porém o isolamento de cepas com resistência intermediária e S. aureus totalmente resistentes à vancomicina, gerou uma grande mobilização da comunidade científica na busca de alternativas para o tratamento destas cepas multirresistentes, através do desenvolvimento de vacinas e soroterapia. A vacina de DNA é uma técnica recente que, entre outras vantagens, não necessita da purificação do antígeno protéico para induzir uma resposta imune, diminuindo o custo de produção, quando comparada às vacinas protéicas. Neste trabalho, demonstramos que a utilização de uma vacina de DNA com um fragmento do gene mecA produz uma resposta imune humoral, com a produção de anticorpos específicos anti-PLP2a em eqüinos imunizados com esta vacina, e que estes anticorpos, após sua purificação, permanecem ativos. Como ainda não existe informação suficiente em relação à segurança do uso das vacinas de DNA diretamente em humanos, o uso desta técnica em eqüinos, com o objetivo de gerar um soro hiperimune, para utilizá-lo após sua purificação no tratamento de pacientes acometidos com infecção provocada por SARM, poderia ser uma alternativa viável e segura no combate a esta bactéria resistente a quase todos agentes antimicrobianos. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the major pathogens responsible for nosocomial infection and has been recently isolated outside the hospital environment, causing a great concern to physicians and researchers. This methicillinresistance is due to the presence of the mecA gene, which codes for PBP2a, a penicillinbinding protein, which has low affinity for β-Lactamic antibiotics. The treatment of choice for patients afflicted by MRSA was, until recently, vancomicyn; however the isolation of vancomycin-intermediate and resistant S. aureus strains generated a great mobilization of the scientific community for the search of alternatives for the treatment of these multiresistant strains, such as, for example vaccines and soroterapy. The DNA vaccine is a recent method that, among others, does not require the purification of the of the proteic antigen to induce a immune response, reducing production costs as compared to protein vaccines. In the present study we demonstrated that the use of a DNA vaccine with a fragment of the mecA gene produces an humoral immune response, with the production of anti-PBP2a specific antibodies in horses immunized with this vaccine, and these antibodies, once purified, maintain their activity. Since there is not sufficient information about the safety of DNA vaccines used directly to humans, the use of this vaccine in horses, with the intent of generating an hyperimmune serum to be used after its purification in the treatment of patients afflicted with infection caused by MRSA could be a possible and safe alternative to fight this bacteria resistant to almost all antimicrobial agents.

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-11T19:21:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Natália Gomes de Morais.pdf: 3697171 bytes, checksum: 7270910fb7622716567ee3d66510cabf (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T19:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Natália Gomes de Morais.pdf: 3697171 bytes, checksum: 7270910fb7622716567ee3d66510cabf (MD5) Previous issue date: 2014-10-24 / CAPES e CNPq / Agressões nutricionais, no período neonatal, interferem com a programação de mecanismos funcionais dos macrófagos, provocando alterações duradouras, detectáveis no organismo adulto mesmo após reposição nutricional. Sabe-se que a desnutrição e infecção por Staphylococcus aureus (S. aureus) multirresistentes estão associadas a altas taxas de mortalidade, porém poucas são as pesquisas que avaliam a sua interação. Em virtude disto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre sinalização intracelular, função microbicida e viabilidade de macrófagos alveolares infectados, in vitro, com S. aureus meticilina sensível (MSSA) e meticilina resistente (MRSA). Metodologia: Ratos machos Wistar (n=48) foram divididos em dois grupos distintos: Nutrido (dieta com 17% de caseína) e Desnutrido (à dieta com 8% de caseína), seguidos de reposição nutricional. Aos 90-120 dias de vida, os animais foram submetidos a um procedimento cirúrgico de traqueostomia para coleta de macrófagos (MØ). Após o isolamento dos MØ, foram padronizados 4 sistemas: controle negativo, composto apenas por MØ em cultura; controle positivo, MØ adicionados a 10μL Lipopolissacarídeo (LPS); e dois sistemas teste, MØ mais S. aureus sensível e resistente a meticilina. As células foram incubadas por 24h à 37ºC, com atmosfera úmida e 5% de CO2. Transcorrido este período, foram realizados ensaios para análise da expressão gênica dos receptores TLR-2, TLR-4, NLRP-3, das enzimas iNOS e caspase-1, produção de radicais livres e viabilidade dos macrófagos infectados in vitro. Na análise estatística, utilizou-se teste t Student e análise de variância (ANOVA), admitindo-se p<0,05. O modelo de desnutrição neonatal adotado promoveu redução do crescimento ponderal dos animais, da expressão dos receptores TLR-2, TLR-4, NLRP3, das enzimas iNOS e caspase -1, do estresse nitrosativo e da taxa de macrófagos viáveis. Entretanto, a interação Staphylococcus aureus versus macrófagos promoveu maior expressão dos receptores, das enzimas analisadas e do ânion superóxido. Pode-se concluir que a desnutrição neonatal comprometeu a expressão dos receptores de reconhecimento padrão, produção de óxido nítrico e o percentual de células viáveis. Entretanto, a exacerbação da resposta oxidativa, do receptor NLRP3 e da enzima caspase-1, após infecção por MRSA, pode favorecer o surgimento de lesões teciduais que permitam a permanência e a disseminação destas bactérias. Desta forma, há um maior risco para aquisição de quadros inflamatórios desregulados em infecções por S. aureus multirresistentes em indivíduos desnutridos no período neonatal.

Submitted by Lucelia Lucena (lucelia.lucena@ufpe.br) on 2015-03-13T19:07:33Z No. of bitstreams: 2 dissertaçaofinalAndréa- COMPLETA.pdf: 1298422 bytes, checksum: 5c25bfcc0731b18f44f5b7703e5e752c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T19:07:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertaçaofinalAndréa- COMPLETA.pdf: 1298422 bytes, checksum: 5c25bfcc0731b18f44f5b7703e5e752c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / Introdução: Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) são atualmente um grave problema de saúde pública. Este micro-organismo além de produzir diversos fatores de virulência tornando-o altamente patogênico, é resistente à quase todos os antimicrobianos utilizados na clínica médica, restando poucas alternativas terapêuticas. Diante deste fato, torna-se urgente a busca por novos agentes antimicrobianos e nesta perspectiva, os compostos de origem vegetal têm sido alvo de várias pesquisas em todo o mundo. Objetivos: Avaliar a atividade antimicrobiana da β-lapachona e sua ação inibitória sobre a biossíntese de catalase, hemolisinas e biofilme por 12 cepas MRSA. Métodos: A concentração inibitória mínima (CIM) da β-lapachona foi determinada frente às cepas MRSA através da técnica de microdiluição em caldo. A biossíntese de catalase foi avaliada semi-quantitativamente através do teste em tubo, colocando em contato o inóculo bacteriano exposto ou não exposto à β-lapachona com o peróxido de hidrogênio a 3% e em seguida foi realizada a aferição da altura da efervescência gerada pela liberação de oxigênio gasoso. Para determinação das hemolisinas extracelulares, foi realizado um teste utilizando hemácias de carneiro para avaliação da atividade hemolítica do sobrenadante das culturas expostas ou não expostas à β-lapachona. A formação de biofilme foi determinada em placas de microtitulação de poliestireno utilizando cristal violeta para coloração do biofilme formado e procedendo-se à leitura espectofotométrica da densidade óptica no comprimento de onda de 595nm. Resultados: A CIM de β-lapachona para as cepas MRSA avaliadas variou de 8μg/mL a 32μg/mL. A biossíntese dos fatores de virulência avaliados foi reduzida significativamente em todas as cepas MRSA. Conclusão: a β-lapachona possui atividade antiestafilocócica e que foi capaz de reduzir a biossíntese de fatores de virulência nas cepas MRSA avaliadas. Assim este composto pode ser incluído no arsenal de substâncias naturais bioativas com potencial de serem utilizadas como alternativa na terapêutica antimicrobiana contra MRSA após estudos de compatibilidade in vivo e toxicidade. Pode servir também como protótipo para produção de novas moléculas mais ativas e menos tóxicas.