Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que a melatonina (MLT) age em monócitos aumentando sua sensibilidade à IL-4 e, consequentemente, levando estas células a se diferenciarem em células dendríticas - quando in vitro e estimulados com IL-4 e GM-CSF (mo-DCs) com um perfil fenotípico e funcional mais ativado. Outros estudos do nosso grupo mostraram que mo-DCs de pacientes portadoras de câncer apresentam desvios funcionais capazes de comprometer a ativação de linfócitos por este tipo celular. Um outro apontamento de nosso grupo foi para o fato de que, muito provavelmente relacionado a estes desvios, está um comprometimento da via IL-4/STAT-6/SOCS-5, que se mostrou alterada em pacientes com leucemia linfóide crônica. Baseado nestes resultados, o presente trabalho objetivou investigar os efeitos da MLT na diferenciação in vitro de mo-DCs de doadoras saudáveis e de pacientes portadoras de câncer de mama, sob a hipótese de que este hormônio poderia agir na via IL-4/STAT-6/SOCS-5 de modo a gerar mo-DCs com fenótipo e função relacionados à maior ativação. Para tanto, monócitos provenientes do sangue periférico de indivíduos saudáveis e de pacientes foram tratados com MLT (2,5 nM 2 horas) e induzidos à diferenciação em mo-DCs; no quinto dia as células foram ativadas com LPS (100 ng/ml 24 horas). As análises, por citometria de fluxo, do fenótipo e das citocinas ao longo da diferenciação de mo-DCs não apontou efeitos consistentes acerca do tratamento com MLT, mas indicou maior expressão de CD83+ nos monócitos das pacientes (p=0,014) e maior concentração da citocina IL-12p70 no sobrenadante das culturas de mo-DCs destes indivíduos, ao final da diferenciação (p=0,02). Para a análise da capacidade linfoestimuladora das mo-DCs foi realizada co-cultura destas células com linfócitos T (LT) alogeneicos (1 DC: 30 LT) por 5 dias. Não houve diferença na indução de proliferação de LT estimulados por mo-DCs de saudáveis nem de pacientes. A MLT mostrou efeito apenas nas co-culturas com células saudáveis aumentando as concentrações de TNF, IFN-γ e IL-2 nos sobrenadantes. Nas co-culturas com células de pacientes sem tratamento, houve maior nível de IL-2 e IL-10, se comparadas com saudáveis. Os monócitos foram também tratados com MLT (2.5 nM) ou IL-4 (50 ng/mL) por 15 minutos, para avaliação da expressão de STAT-6, pSTAT-6 e SOCS-5. Não foi constatado efeito da MLT nesse caso, mas os monócitos de pacientes apresentaram maior expressão de STAT-6, porém menor de pSTAT-6, comparados com saudáveis. Tomados em conjunto, os resultados globais indicam algumas diferenças fenotípicas e funcionais entre monócitos de pacientes e controles, mas não entre suas mo-DCs. Quanto à MLT, os resultados apontam para o fato de que o hormônio gera alterações apenas em células provenientes de indivíduos saudáveis e somente com relação às citocinas encontradas nos sobrenadantes das co-culturas. / Previous studies at our lab have shown that melatonin (MLT) acts on monocytes increasing their sensitivity to Interleukin-4 (IL-4) and, consequently, generating dendritic cells (DCs) when in vitro and treated with IL-4 and GM-CSF (mo-DCs) phenotically and functionally more activated. Other studies from our group have shown that mo-DCs obtained from cancer patients have functional biases capable of compromising the activation of T lymphocytes. Another result from our group pointed to the fact that part of the mo-DCs\' functional bias in cancer patients could be attributed to the decrease in STAT-6 signaling, a pathway that is activated by IL-4 and down regulated by SOCS-5, whose levels, in turn, were found elevated in cancer patients\' monocytes. Based on these results, the present work aimed to investigate the effects of MLT on the in vitro differentiation of healthy donors and breast cancer patients mo-DCs, under the hypothesis that this hormone could act on the IL-4/STAT-6/SOCS-5 axis generating better activated mo-DCs. Peripheral blood monocytes from healthy donors and breast cancer patients were treated with MLT (2,5 nM 2 hours) and induced to differentiate into mo-DCs; on the fifth day cells were activated with LPS (100 ng/ml 24 hours). Flow cytometry analysis of phenotype and cytokines in supernatants during mo-DCs differentiation didnt show MLT effects, but indicated higher frequency of CD83+ (p=0,014) monocytes among mononuclear cells of the patients, when compared with healthy donors. In addition, higher concentration of IL-12p70 was found in mo-DCs cultures (sixth day - p=0,02). The capacity to stimulate allogeneic T lymphocytes was assessed by co-cultures (1DC : 30LT), maintained for 5 days. Results indicate an effect of MLT only in order to increase the TNF, IFN-γ and IL-2 concentrations in supernatants of co-cultures with healthy donors mo-DCs. Patients cells showed differences only when there was no hormone treatment, showing higher levels of IL-10 in the co-culture supernatants, when compared to healthy controls. Monocytes were also treated with MLT (2,5 nM) or IL-4 (50 ng/mL) for 15 minutes to evaluate STAT-6, pSTAT-6 and SOCS-5 expression. Results showed an increase of STAT-6 in patients monocytes and a lower capacity of these cells to phosphorylate this molecule, even when in presence of IL-4. Together, the results point to some phenotypic and functional differences between patients and healthy donors monocytes, but it was not shown in their mo-DCs. Results also point to the fact that MLT generates changes only in healthy donors cells and those effects were only seen with cytokines found in cultures supernatants.

La famille des lipases pancréatiques est constituée de trois sous-familles : la lipase pancréatique classique (PL) et les lipases pancréatiques apparentées de type 1 et 2 (PLRP1 et PLRP2). Contrairement à la PL, qui est active seulement sur les triglycérides, la PLRP2 possède trois types d’activités enzymatiques : lipase, phospholipase de type A1 et surtout galactolipase. Cette dernière activité est particulièrement intéressante car les galactolipides, principalement les monogalactosyldiacylglycérols (MGDG) et les digalactosyldiacylglycérols (DGDG) sont les lipides les plus abondants dans la nature. Un test continu, spécifique et fiable de dosage de l’activité galactolipase à été mis au point en utilisant la technique du pH-stat et un galactolipide synthétique à chaîne moyenne comme substrat, le MGDG en C8. Ce nouveau test de dosage nous a permis de mesurer pour la première fois des activités spécifiques importantes avec les PLRP2 humaine (HPLRP2) et du cobaye (GPLRP2) (1786±100 et 5420±85 U/mg, respectivement). Nous avons par la suite utilisé cette même technique pour étudier l’hydrolyse par les PLRP2 des galactolipides naturels à chaînes longues purifiés à partir de feuilles d’épinard. Les activités spécifiques mesurées sont du même ordre de grandeur que celles mesurées avec le MGDG en C8 mais aussi le DGDG en C8 synthétique, montrant ainsi que l’activité galactolipase n’est affectée ni par la longueur de la chaîne acyle ni par la présence d’un ou de deux résidus galactoses. Grâce à ce test nous avons pu réaliser un criblage de lipases microbiennes de différentes origines à la recherche d’activités galactolipase. Dans une deuxième partie, nous avons étudié les propriétés physico-chimiques du bis-monoacylglycérol-phopshate (BMP). Nous avons montré que non seulement ce phospholipide rare est hydrolysé par la PLRP2, mais le BMP et la PLRP2 humaine peuvent être trouvés dans la même cellule, le monocyte, suggérant un nouveau rôle physiologique pour la PLRP2. / The pancreatic lipase family consists of three sub-families : the classical pancreatic lipase (PL) and the pancreatic lipase-related proteins 1 and 2 (PLRP1 and PLRP2). On the contrary to PL, which is active only on triglycerides, the PLRP2 possesses three types of enzymatic activities: lipase activity, phospholipase A1 activity and especially galactolipase activity. This latter activity is particularly interesting because monogalactosyl-diacylglycerol (MGDG) and digalactosyldiacyl-glycerol (DGDG) are the most abundant lipids in nature. A specific, continuous and robust galactolipase assay using the pH-stat technique and a synthetic medium chain MGDG as substrate was developed, and recombinant human (rHPLRP2) and guinea pig (rGPLRP2) pancreatic lipase-related proteins 2 were tested as model enzymes. This new assay allowed us to measure for the first time high specific activities with both PLRP2 (1786±100 and 5420±85 U/mg, respectively). We then used this technique to study the hydrolysis by PLRP2 of natural long chain galactolipids purified from spinach leaves. The length of acyl chains and the nature of the galactosyl polar head of the galactolipid did not have major effects on the specific activities of PLRP2, which were found to be very high on both medium chain and long chain galactolipids. We also used the pH-stat technique and medium chain MGDG and DGDG for screening several microbial lipases for their galactolipase activity.In a separate study, we investigated the physico-chemical properties of bis-monoacylglycorol-phopshate (BMP) and found that this rare phospholipid was hydrolyzed by PLRP2. Moreover, BMP and human PLRP2 could be found in the same cell, the monocyte, suggesting a new physiological role for PLRP2.

Les cellules épithéliales changent en forme et en nombre au cours de divers processus morphogénétiques pendant le développement. La dynamique du réseau d’acto-myosine en interaction directe avec les jonctions adhérentes (JA) est à la base de ces mouvements cellulaires. Cependant, les mécanismes qui régulent cette dynamique cellulaire et moléculaire dans l’espace et le temps sont peu étudiés. Durant les stades précoces de l’ovogenèse chez la drosophile, le follicule ovarien est une sphère composée d'un cyste germinal recouvert d'un épithélium folliculaire monocouche d'origine somatique. Aux pôles de cette structure, un groupe de cellules, les Cellules Polaires (CP), sont produites en excès (3-6 cellules) au début de l'ovogenèse, et ensuite subissent une mort cellulaire programmée apoptotique entre les stades 2 et 4 de l’ovogenèse. De cette façon, à partir du stade 5 tous les pôles contiendront 2CP. Les CP sont l’unique source de sécrétion du ligand de la voie de signalisation JAK/STAT, Unpaired. Notre équipe a démontré que l’activation autonome et non-autonome cellulaire de la voie JAK/STAT est nécessaire pour l'apoptose développementale des CP. Grâce à l’utilisation de l’imagerie confocale en temps réel ainsi que sur des tissus fixés, j’ai établi une séquence d’évènements stéréotypés qui a lieu pendant l’élimination des CP surnuméraires. Trois phases ont été identifiées dans cette séquence: 1) une phase lente de remodelage cellulaire dépendante de la voie de signalisation JAK/STAT au cours de laquelle chaque CP à être éliminée est totalement enveloppée par les CP voisines (plus de 7h) ; 2) une phase d’activation de la cascade canonique de l’apoptose, commençant lorsque la PC est entièrement enveloppée, suivie d’un détachement puis d’une extrusion latérale des corps apoptotiques (1h) ; et 3) une phase de phagocytose des corps apoptotiques par les Cellules Folliculaires (CF) voisines (plus de 5h). Ensuite, en utilisant une approche gènes candidats, j’ai effectué des perturbations génétiques de la Myosine, de la Cadhérine et de différents régulateurs de l’Actine dans les CF et/ou dans les CP, ainsi que des analyses de la dynamique de certaines de ces molécules. Ces expériences m’ont permis de déterminer que la fonction de ces molécules est nécessaire dans les CF pour le processus d’élimination des CP surnuméraires. Finalement un lien entre la signalisation JAK/STAT et la dynamique de la Myosine a été mis en évidence. / Epithelial cells change in shape and number over the various morphogenetic processes occurring during development. The dynamics of the acto-myosin network in direct interaction with adherens junctions is the basis of these cell movements. However, the mechanisms regulating these cellular and molecular dynamics in space and time have not been much studied. During the early stages of oogenesis in Drosophila, the ovarian follicle is a sphere composed of a germline cyst surrounded by a mono-layered follicular epithelium of somatic origin. At the poles of this structure, a group of cells, the Polar Cells (PCs), which are produced in excess (3-6 cells) during early oogoenesis, undergo apoptotic programmed cell death between stages 2-4 of oogenesis, thus that as of stage 5 all poles contain exactly 2 PCs. PCs are the only source of the secreted ligand of the JAK/STAT signaling pathway, Unpaired. Our group has demonstrated that cell autonomous and cell non-autonomous activation of the JAK/STAT pathway is necessary for this developmental apoptosis. Through the use of confocal imaging in real time and on fixed tissues, I established a stereotyped sequence of events that occurs during the elimination of supernumerary PCs. Three phases were identified in this sequence: 1) a slow phase of cellular remodeling dependent on JAK/STAT signaling in which the PC to be eliminated is completely enveloped by its PC neighbors (more than 7 hours); 2) activation of the canonical apoptosis cascade, occurring when the PC is fully enveloped, followed by cell detachment and lateral extrusion of apoptotic corpses (1h); and 3) phagocytosis of apoptotic corpses by the surrounding Follicular Cells (FCs) (over 5 hours). Then, using a candidate gene approach, I conducted genetic perturbation of Myosin, Cadherin and actin regulators in the FCs and/or PCs, and the analysis of the dynamics of some of these molecules. These experiences allowed me to determine that the function of these molecules is required in FCs for the process of elimination of supernumerary PCs. Finally, evidence obtained suggests a link between JAK/STAT signaling and Myosin dynamics.

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L’infection par le virus de l’hépatite E (VHE) peut entraîner une hépatite aiguë chez l’homme évoluant en hépatite fulminante dans 1-4% des cas, voire 20% chez les femmes enceintes dans les régions endémiques. Le VHE, transmis par voie entérique, est responsable de grandes épidémies d’origine hydrique dans les pays en voie de développement et de nombreux cas sporadiques d’origine zoonotique dans des pays industrialisés. La description récente de cas d’hépatites E chroniques ou d’atteintes neurologiques graves souligne l’importance de caractériser les interactions du VHE avec son hôte. L’objectif de ce projet de thèse était de caractériser les interactions entre le VHE et la réponse immune innée de l’hôte et en particulier avec le système interféron de type I (IFN-I).La première partie de ce projet a consisté en l’étude de la modulation des voies de signalisation de l’IFN-I par la polyprotéine non-structurale ORF1 du VHE. Celle-ci est constituée de plusieurs domaines fonctionnels putatifs tels qu’une methyltransférase (Met) ou une protéase à cystéine de type papaïne (PCP) dont les fonctions sur la signalisation IFN-I restent encore peu connues. Les résultats obtenus ont montré que le domaine MetPCP de l’ORF1 est capable d’inhiber l’activation du promoteur de l’IFN-β et de celui des gènes sous le contrôle de l’IFN contenant des éléments de réponse à l’IFN (ISRE), ainsi que l’expression de certains des gènes induits par l’IFN (ISGs). En recherchant le mécanisme impliqué dans l’inhibition du promoteur ISRE, nous avons montré que le domaine MetPCP inhibe la phosphorylation de STAT1 et sa relocalisation nucléaire. Nous avons également montré que le domaine MetPCP n’inhibe pas la phosphorylation de STAT2. Le mécanisme d’action du domaine MetPCP reste encore à préciser. La deuxième partie de ce projet a été de déterminer si l’infection par le VHE entraîne la production d’IFN-I par les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs). En effet, les pDCs sont la principale source d’IFN-I et jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire innée et adaptative. Les résultats obtenus suggèrent que les pDCs ne produisent que modérément de l’IFN-I lorsqu’elles sont co-cultivées avec des cellules infectées par le VHE. L’ensemble des résultats obtenus pendant ce travail de thèse suggère que le VHE utilise plusieurs mécanismes pour moduler la signalisation IFN-I de l’hôte. / Hepatitis E virus (HEV) is the causative agent of acute hepatitis in humans that can lead to fulminant hepatitis in 1-4% of cases, and in 20% of pregnant women in endemic regions. HEV is an enterically-transmitted virus responsible for large waterborne epidemics in developing countries and numerous cases of zoonotic hepatitis E in industrialized countries. The recent description of cases of chronic hepatitis E and severe neurological disorders highlight the importance to characterize the interactions between HEV and the host. The objective of this PhD project was to characterize the interactions between HEV and the host innate immune response and particularly with the type I interferon system (IFN-I).The first part of this project aimed to study the ability of the ORF1 non-structural polyprotein of HEV to modulate the IFN-I signalling pathways. HEV ORF1 contains several putative functional domains including a methyltransferase (Met) and a papain-like cysteine protease (PCP) whose functions on the IFN-I signalling remain poorly understood. The results obtained showed that the MetPCP domain of ORF1 inhibits IFN-β and IFN-stimulated response element (ISRE) promoter activation and the expression of some IFN-stimulated genes (ISGs). We then investigated the mechanism involved in this inhibition of ISRE promoter activation. We showed that the MetPCP domain inhibits STAT1 phosphorylation and nuclear translocation. In contrast, we found that the MetPCP domain does not inhibit STAT2 phosphorylation. However, the mode of action of MetPCP remains to be fully characterised. The second part of this project aimed to determine the ability of plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to produce IFN-I in response to HEV infection. Indeed, pDCs are the main IFN-I source and play a crucial role in innate and adaptive responses. The results obtained suggest that pDCs produce IFN-I moderately when co-cultured with HEV-infected cells. Taken together, the results obtained during this PhD project suggest that HEV has evolved different mechanisms to modulate the IFN-I host response.

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Der JAK/STAT-Signalübertragungsweg ist im Tierreich evolutionär konserviert und spielt eine Rolle in der Entwicklung eines Organismus, sowie beim Erhalt von Stammzellen. Desweiteren verursacht eine erhöhte Signalaktivität in Blutzellen Leukämie. Mit Hilfe der genetischen und molekularen Methoden, die in der Taufliege Drosophila melanogaster verfügbar sind, wurden die Hauptkomponenten der JAK/STAT-Signalkaskade identifiziert.Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Effektoren, die durch die JAK/STAT-Signalkaskade in Drosophila angeschaltet werden und die Bildung von Bluttumoren verursachen. Die Untersuchung des Geneexpressionsmusters ergab, dass 1197 Gen-Loci direkt oder indirekt durch den Liganden der Signalkaskade namens UPD zu unterschiedlichen Zeitenpunkten reguliert werden. Mit Hilfe von bioinformatischen Methoden konnten diese 1197 Gene zu immunologisch relevanten Kategorien (auch Gene Ontology genannt) zugewiesen werden, welche ebenfalls eine zeitlich dynamische Verteilung aufweisen. Weiterhin identifizierte die Promotoranalyse von hoch-regulierten Genen DNA-Bindungsstellen, an die der Transkriptionsfaktor der JAK/STAT-Signalkaskade mit hoher oder niedriger Affinität bindet. Die Rolle von zehn der 1197 Gene wurde in der Taufliege bezüglich der Tumorentwicklung untersucht. Darunter befinden sich Gene, die für die Zellpolarität verantwortlich sind; eine Funktion, die kürzlich mit der Aktivierung der JAK/STAT-Signalkaskade im Epithelgewebe in Verbindung gebracht wurde.

L’objectif de notre travail était d’étudier les bascules métaboliques chez Yarrowia li-polytica d’un métabolisme purement oxydatif vers l’accumulation de lipides puis à l’excretion d’acide citrique.Le développement d’un procédé D-stat et d’un mode de conduite fed-batch nous a permis, dans un premier temps, de quantifier les ratios N/C caractéristiques pour chacune des bascules étudiées. Nos résultats montrent que les ratios rN/rC critiques aux bascules métaboliques sont de 0,085 molN.Cmol-1 et de 0,018-0,022 molN.Cmol-1 pour l’accumulation de lipides et production de citrate, respectivement.L’analyse systémique des cultures réalisées nous a permis de mettre en évidence des mécanismes de co-régulation de certaines enzymes du métabolisme lipidique ainsi qu’une prépondérance de mécanismes post-transcriptionnels dans l’établissement des bascules étudiées.Enfin, l’utilisation de souches génétiquement modifiées au niveau de l’ATP citrate lyase, la malate déshydrogénase et de la glycérol-3-phosphate déshydogénase a permis d’évaluer l’impact de ces enzymes sur le métabolisme lipidique / This thesis aimed at studying the metabolic shifts in Yarrowia lipolytica from the pure oxidative metabolism to lipid accumulation and citric acid excretion.The development of a D-stat culture and of a monitoring fed-batch strategy allowed us to determine the N/C ratio characteristic for each of metabolic shifts. rN/rC ratio were determined equal to 0,085 molN.Cmol-1 and 0,018-0,022 molN.Cmol-1 for the lipid accumu-lation and the citric acid production, respectively.Systemic analysis of the cultivations showed coregulation phenomena among some enzymes of the lipidic metabolism and post-transcriptional modifications in the onset of the metabolic shifts.Finally, the impact of enzymes (ATP citrate lyase, malate dehydrogenase and gly-cérol-3-phosphate dehydrogenase) on the lipidic metabolism was evaluated through systemic analysis of 3 genetically modified strains

JAK/STAT signaling pathway is one of the most studied intracellular cascades transmitting signals from the extracellular environment to the cell nucleus in order to affect expression of target genes. Circadian clocks localized in the suprachiasmatic nuclei (SCN) of the hypothalamus are sensitive especially to light but they can respond to non-photic stimuli such as growth factors, opioids, leptin and cytokines that have been demonstrated to perform its function via the JAK/STAT signaling pathway. The recent findings of our laboratory demonstrated that STAT3 protein is highly produced by SCN of rat. Primary aim of our experiments was to test the circadian regulation of STAT3 production in SCN and describe the effect of exogenously administered leptin on STAT3 phosphorylation in the SCN, pineal gland and hypothalamic structures responsible for regulated feeding behavior and energy metabolism. Because activation of leptin receptors may stimulate a number of other signaling cascades, we chose phosphorylated forms of kinase ERK1/2 and GSK-3β as other markers of intracellular changes after administration of leptin in the studied structures. Our results proved rhythmic production of STAT3 protein in SCN of rat and indicated circadian regulation of sensitivity to leptin in hypothalamic structures. The data...