Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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In den vorliegenden Studien wurden verschiedene diagnostische Verfahren zum Nachweis von Protozoen und Nematoden im Hinblick auf Sensitivität, Arbeitsaufwand und Kosten miteinander verglichen. Zudem wurde die Eignung der PCR zur molekularen Charakterisierung der Cryptosporidium spp. exemplarisch an Igelkotproben getestet. Bei der Untersuchung von 90 Ferkelkotproben auf I. suis war die Sensitivität eines Kotausstriches mit nachfolgender Autofluoreszenzmikroskopie (AM) signifikant höher als bei einem Flotationsverfahren (FV) mit NaCl-Zucker-Lösung und bei dem kombinierten Sedimentations-Flotations-Verfahren (KSFV) mit verschiedenen Flotationslösungen (NaCl, ZnSO4, NaCl-Zucker-Lösung) mit nachfolgender Lichtmikroskopie. Zudem ist der Arbeitsaufwand für die AM deutlich geringer als bei dem FV und KSFV. Die höheren apparativen Kosten für die AM sind bei hohem Probendurchsatz durch den geringeren Zeitaufwand und der höheren Sensitivität gerechtfertigt. Die Anzahl Kryptosporidien-positiver Proben war bei der Untersuchung von 103 Kälberkotproben auf Cryptosporidium sp. mittels Enzymimmunoassays (EIA; ProSpecT® Cryptosporidium Microplate Assay) im Vergleich zur Karbolfuchsin-Färbung (CF) nach HEINE (1981) und der modifizierten-Ziehl-Neelsen-Färbung (MZN) nach HENRIKSEN u. POHLENZ (1982) am höchsten und signifikant höher als bei der Anwendung der MZN, wenn 10 Blickfelder durchmustert wurden. Bei der Untersuchung von 74 Igelkotproben auf Cryptosporidium sp. mittels EIA (ProSpecT®), einem immunochromatographischen Verfahren (FASTest® CRYPTO Strip), der MZN nach HENRIKSEN u. POHLENZ (1981) und einem direkten Immunfluoreszenz-Test (IFA; MERIFLUOR Cryptosporidium/Giardia) wurden in 9 (EIA), 10 (FASTest®), 11 (MZN) und 12 (IFA) Proben Cryptosporidium sp. nachgewiesen. Der Arbeitsaufwand des FASTest® und der CF ist mit dem EIA vergleichbar, während der IFA und die MZN mehr Zeit benötigen. Die Anwendung des FASTest®, des IFA und des EIA ist mit höheren Kosten verbunden als bei den Färbemethoden, können aber gut in den Arbeitsablauf eines diagnostischen Labors eingefügt werden und sind einfach auszuwerten. Darüber hinaus wurden 45 Kotproben, welche bis zu 27 Tage bei verschiedenen Temperaturen (+6 °C, +16 °C, +30 °C, +40 °C) gelagert wurden, untersucht, um einen Einfluss der Temperatur auf das Untersuchungsergebnis von EIA, CF und MZN zu ermitteln. Während sich die Anzahl positiver Proben bei der Untersuchung mit den Färbemethoden temperatur- und zeitabhängig reduzierte, wurde das Untersuchungsergebnis mittels EIA von der Lagerungstemperatur nicht beeinflusst, so dass ungekühlt transportierte Proben vorzugsweise mit dem EIA untersucht werden sollten. Dagegen ist die CF aufgrund ihrer einfachen und preiswerten Durchführung zur Untersuchung einer hohen Anzahl an Proben geeignet, sofern eine ununterbrochene Kühlung der Proben gewährleistet ist und diese innerhalb von drei Tagen untersucht werden. Der FASTest® ist zur Anwendung in Tierarztpraxen und Ställen geeignet, da zur Untersuchung kein Mikroskop benötigt wird und die Resultate schnell vorliegen. Die Verwendung des IFA, der Kryptosporidien-Oozysten und Giardien-Zysten nachweist, bietet sich vor allem bei Proben an, die auf beide Protozoen untersucht werden sollen. Das Vorkommen der Kryptosporidiose bei unterentwickelten und geschwächten Igeln, welche zum Überwintern in Igelstationen aufgenommen werden, ist hoch. Von 188 untersuchten Igelkotproben konnten in 29,8 % der Proben Cryptosporidium spp. nachgewiesen werden. Durch die Genotypisierung der Kryptosporidien aus 15 positiven Igelkotproben mittels RFLP-PCR basierend auf dem 18S rRNA-Gen konnte in allen untersuchten Proben die Präsenz von C. parvum gezeigt werden. Mit Hilfe der Multilocus-Sequenz-Typisierung der Fragmente des 60kDa Glycoprotein-Gens, des 18S rRNA-Gens, des Actin-Gens und des 70 kDa Hitzeschockprotein-Gens konnten drei verschiedene Subtypen-Familien (IIa, IIc und eine neue als VIIa vorgeschlagene Subtypen-Familie) erkannt werden. Die von den Igeln ausgeschiedenen Kryptosporidien-Oozysten mit zum Teil nachgewiesenem zoonotischen Potential (IIa Subtypen-Familie) könnten eine Infektionsquelle für den Menschen sein, aber auch ein antropozoonotisches Potential (IIc Subtypen-Familie) sollte in Betracht gezogen werden, so dass die Hygiene in den Igelstationen einen hohen Stellenwert einnehmen sollte. Die Untersuchungsergebnisse zum Nachweis von Eimeria-Arten beim Kalb von 70 Sammelkotproben, hergestellt aus 10 Einzelkotproben (SKP10), bzw. von 30 Sammelkotproben, zusammengesetzt aus 5 Einzelkotproben (SKP5), wurden mit denen der zugehörigen Einzelkotproben (EKP) verglichen. Die Resultate der EKP (arithmetischer Mittelwert) und der zugehörigen SKP weisen mit den signifikant häufigeren Abweichungen im Bereich von bis zu 100 Oozysten pro Gramm Kot (OpG) eine geringe Differenz zwischen den beiden Verfahren auf. Durch den sicheren Nachweis von Eimeria-Oozysten bei einem erwarteten Oozystengehalt von nur 202 OpG (SKP10) und 122 OpG (SKP5) ist die Untersuchung von Kälbersammelkotproben, eine Methode mit geringem Arbeitsaufwand und geringen Untersuchungskosten, zum Nachweis einer klinischen oder subklinischen Kokzidiose geeignet. Bei 51 Pferdekotproben wurde jeweils dreimal das kombinierte Sedimentations-Flotations-Verfahren (KSFV), wobei die Entnahme von verschiedenen Lokalisationen der Kotprobe (aus der Randregion, dem Inneren oder aus beiden Lokalisationen) erfolgte, und jeweils dreimal das KSFV mit vorheriger Homogenisierung einer größeren Kotmenge zum Nachweis von Nematodeneier durchgeführt. Eine Anhäufung der Strongyliden- und Ascarideneier in einem bestimmten Bereich der Proben konnte durch die Untersuchungen der verschiedenen Lokalisationen (á 10 g Kot) nicht nachgewiesen werden, so dass eine weitgehend homogene Verteilung dieser Nematodeneier in einer Pferdekotprobe wahrscheinlich ist. Zudem konnten die Untersuchungsergebnisse des KSFV, bei welchem 10 g Kot untersucht werden, durch die vorherige Homogenisierung einer größeren Probenmenge nicht verbessert werden. Zum Nachweis von Nematoden beim Pferd sollte dem Labor eine ausreichende Probenmenge (ca. 50 g) zugesandt werden. Die Homogenisierung einer größeren Probenmenge vor der Durchführung einer diagnostischen Methode, bei der Aliquote von mindestens 10 g Kot Verwendung finden, ist unnötig. / The studies presented were carried out to compare different diagnostic methods for detection of protozoa and nematodes regarding sensitivity, expenditure of human labour and costs. Besides, the ability of the PCR for the molecular characterization of the Cryptosporidium spp. was tested exemplarily in faecal samples of hegdehogs. The examination of ninety faecal samples of suckling piglets showed a significantly higher sensitivity of faecal smears examined by autofluorescence microscopy (AM) compared to the flotation method (FV) using NaCl-sucrose solution and the combined sedimentation-flotation method (KSFV) using different flotation solutions (NaCl, ZnSO4, NaCl-sucrose) scanned by bright field microscopy. Moreover the expenditure of human labour by AM is considerably lower than FV and KSFV. The costs related to equipment for AM is justified in case of high sample throughput and by superior sensitivity. The enzyme immunoassay (EIA; ProSpecT® Cryptosporidium Microplate Assay) was the most sensitive method for diagnosis of cryptosporidiosis in calves (n = 103) compared to the carbol fuchsin (CF; HEINE 1981) and modified Ziehl-Neelsen (MZN; HENRIKSEN a. POHLENZ 1982) staining techniques. The sensitivity of the EIA was significantly higher than the MZN, if ten fields of view were scanned. 74 faecal samples of hedgehogs were examined with the EIA (ProSpecT®), an immunochromatographic method (FASTest® CRYPTO Strip), the MZN (HENRIKSEN u. POHLENZ (1981)) and a direct immunofluorescent assay (IFA; MERIFLUOR Cryptosporidium/Giardia). Cryptosporidium sp. were detected in 9 (EIA), 10 (FASTest®), 11 (MZN) und 12 (IFA) faecal samples. The hands on time of the FASTest® and CF is comparable to EIA while the IFA and MZN are more time-consuming. The examination of the FASTest®, IFA and EIA is combined with higher costs than the staining techniques, but they can be integrated in the work flow of a routine diagnostic laboratory easily and evaluation is simple. Moreover 45 faecal samples stored up to 27 days at different temperature (+6 °C, +16 °C, +30 °C, +40 °C) were examined to evaluate the influence of temperature on the results of EIA, CF and MZN. While the number of the positive samples of stained smears decreased in a temperature and time-dependent manner, the results of the EIA were not influenced by sample storage at any temperature, so that samples transported without cooling should be examined preferably by EIA. Nevertheless the CF due to its simplicity and low costs is suited for scanning of a high number of samples, if they were cooled continuously and examined within three days. The FASTest® is qualified for use in veterinary practice and stables, because the examination requires no microscope and the results are obtained immediately. The IFA, which can detect Crypotsporidium oocysts as well as Giardia cysts, is suited especially for faecal samples suspected to contain both protozoa. Cryptosporidial infections are very frequent in hedgehogs which are admitted for hibernation to hedgehog rehabilitation centres because of their insufficient body weight and weakness. Cryptosporidium spp. were detected in 29.8 % of 188 faecal samples of hedgehogs. The genotyping of Cryptosporidium spp. by PCR and RFLP-PCR based on the 18S ribosomal RNA gene were performed on 15 faecal samples of hedgehogs positive for Cryptosporidium spp. and suggested the presence of C. parvum in all samples. Multilocus sequence typing on partial 60 kDa glycoprotein gene, 18S rRNA gene, actine gene, 70 kDa heat shock protein gene sequences revealed 3 different subtype families: IIa, IIc and a new proposed as VIIa subtype family. Some of the Cryptosporidium oocysts excreted from hedgehogs are zoonotical (IIa subtype family) or anthropozoonotic(IIc subtype family). Thus hygienic measurements to avoid transmission are essential in hedgehog rehabilitation centres. The results of examination of 70 pooled faecal samples originating from 10 calves (SKP10) and 30 pooled faecal samples originating from 5 calves (SKP5) for detection of Eimeria spp. were compared with the arithmetic means of opg (oocysts per gram of faeces) counts of the respective single 10 or 5 samples. A low difference between both methods of less than 100 opg was significantly more frequently observed than higher differences. Low values of 202 opg and 122 opg were reliably detected in SKP10 und SKP5, respectively, and thus examination of pooled faecal samples appears to be suitably sensitive and cost effective to detect clinical and subclinical coccidiosis in calves. 51 faecal samples of horses were examined three times by KSFV for nematode eggs by taking aliquots from different locations of the same faecal samples (from the margin, from inside and from both locations). Thereafter the KSFV with the homogenisation of a larger amount of faeces was also carried out three times. The examination of samples from the different locations (each 10 g of faeces) delivered no evidence for accumulation of nematode eggs (strongyles and Parascaris equorum) in the faeces and thus the distribution of the nematode eggs appears sufficiently homogeneous in faecal samples of horses. Homogenisation of a larger amount of faeces did not improve the results of coproscopy. For diagnostic purposes 50 g faeces per sample should be shipped to the laboratory. The homogenisation of a larger amount of faeces before using a diagnostic method is dispensable, if aliquots of 10 g faeces are examined.

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Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA039.pdf: 1003613 bytes, checksum: 404c897431edca3b3b58de72b6b39864 (MD5) Previous issue date: 2012-05-25 / Swine Eperitrozoonosis, (ES) caused by Mycoplasma suis, is an infectious disease of the red blood cells and causing a variety of reproductive disorders, since, as the birth of weak piglets and stillborn, and productive as the occurrence of clinical disease, performance degradation, increase in feed conversion and immunosuppression. Some cases may even lead to death from anemia. In the farms, the disease can be asymptomatic or cause fever, anemia, jaundice and poor appetite. The ES control is accomplished with the use of tetracyclines, which are now restricted in use in accordance with European legislation. Currently, the diagnosis of ES is made by clinical suspicion and or by using blood smears that are less sensitive and less specific. The aim of this study was to evaluate de Mycoplasma suis presence through the use of a PCR with internal control (CIA) and a quantitative Real Time PCR in farms with reproductive disorders. The place of performance was Embrapa Swine and Poultry in Concordia, SC. The sample consisted of 80 sows and 230 fetal necropsies performed on 27 farms with reproductive disorders in the states of Santa Catarina and Paraná. Were collected from each sow blood and tissues of two piglets and they were aborted, stillborn, mummified or unfeasible. After necropsy tissues were stored in sterile plate at -70C for future DNA extraction. Had no detectable DNA of the infectious agent in the blood of neither the sows nor the fetal tissues analyzed by PCR. The CIA developed was amplified in all reactions. Real-time PCR has detected M. suis in 17% of the sows and 40, 74% of farms had at least one positive sow / A Eperitrozoonose Suína (ES), causada pelo Mycoplasma suis, é uma doença infecciosa das hemácias e que causa uma série de transtornos, desde reprodutivos, como o nascimento de leitões fracos e natimortos, e produtivos, como a ocorrência de doença clínica, queda de desempenho, aumento na conversão alimentar e imunossupressão. Alguns casos ainda podem levar à morte por anemia. Nas granjas a enfermidade pode ser assintomática ou ainda causar febre, anemia, icterícia e inapetência. O controle da ES é realizado com as tetraciclinas, as quais hoje se encontram em uso restrito de acordo com a legislação européia. Atualmente o diagnóstico da ES é realizado pela suspeita clínica eou pela utilização de esfregaços sanguíneos que são pouco sensíveis e pouco específicos. O objetivo do presente trabalho foi realizar estudo da ocorrência da ES em granjas com transtornos reprodutivos com o uso das técnicas de PCR com controle interno (CIA) e de PCR quantitativo em Tempo Real. O local de execução foi a Embrapa Suínos e Aves de Concórdia, SC. Foram avaliadas 80 porcas e 230 fetos de necropsias realizadas em 27 granjas com problemas reprodutivos no estado de SC e PR. De cada porca foram coletados sangue e tecidos de dois leitões abortados, natimortos, inviáveis ou mumificados. Após a necropsia os tecidos foram armazenados em placa estéril a -70 C para futura extração de DNA. Não foram detectados DNA do agente infeccioso no sangue das porcas, tampouco dos tecidos fetais analisados no PCR . O CIA desenvolvido foi amplificado em todas as reações. No PCR em Tempo Real houve 17% de porcas positivas e 40,74% das granjas tiveram ao menos uma porca reagente

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA14MA129.pdf: 560924 bytes, checksum: 728efdf249e90f0bd6744c133006c9a1 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / Streptococcus suis is a important pathogen associated to many production and economical losses in the swine industry, in addition to its zoonotic importance. The aims of this study was evaluate the occurrence of Streptococcus suis type 2 in tonsil samples of healthy pigs at slaughter, comparing the bacterial isolation with PCR assay and to determine the presence of the EF factor (extracellular protein factor). Tonsil samples from 302 slaughtered pigs were collected from three abattoir. Isolation of S. suis was made in Columbia Blood Agar Base, and then bacterial phenotypic characterization was made using biochemical assays. The typification genus and species of the isolates was performed with the PCR technique for confirmation, and the presence of the capsular gene (type 2). In the comparison between the techniques, PCR was made directly from the tonsil samples for the 16SrRNA gene (S. suis), capsular genes (type 2) and also the ef gene. The pathogen was detected in 100% of the samples with the PCR, whereas only 84.1% were positive on the isolation technique. Upon confirmation of the S. suis isolates, four of them were negative to the 16S rRNA gene. PCR demonstrated higher sensibility on detecting the type 2 S. Suis, having 89.7% of positive samples against 88% from the isolates. The ef gene was detected in 28.4% of the samples, three of them being detected as the ef variant. Significant difference was found between the PCR and bacterial isolation for S. suis, detection demons that the molecular assay has a higher detection capability than isolation / Streptococcus suis é um patógeno responsável por muitas perdas produtivas e econômicas à suinocultura, além da importância zoonótica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ocorrência de Streptococcus suis tipo 2 a partir de tonsilas de suínos sadios no abate, comparando a técnica de isolamento bacteriano com a PCR e determinar a presença do fator protéico extracelular (EF). Foram coletadas tonsilas de 302 suínos provenientes de três frigoríficos, o isolamento foi realizado em Agar Sangue Columbia, após foi realizada a caracterização fenotípica. Esses isolados foram tipificados através da PCR para confirmação do gênero e da espécie, além da presença do gene capsular (tipo 2). Na comparação das técnicas foi realizado PCR diretamente das tonsilas para o gene 16S rRNA (S. suis), capsular (tipo 2) e também foi realizada pesquisa do gene ef (EF). Utilizando PCR diretamente das tonsilas, S. suis foi detectado em 100% das amostras, diferindo do isolamento em que 84,1% das amostras foram positivas. Na confirmação dos isolados sugestivos de S. suis, quatro deles foram negativos na PCR para o gene 16S rRNA. Na comparação para o tipo 2 a PCR demonstrou maior sensibilidade, detectando em 89,7% das tonsilas superando o isolamento, que detectou em 88% dos isolados. O gene ef foi detectado em 28,4% das amostras, sendo que em três amostras foi detectado o ef variante. Houve diferença significativa entre a PCR e o isolamento bacteriano para S. suis, demonstrando que a técnica molecular tem uma maior capacidade de detecção do que o isolamento

L'accentuation des phénomènes de résistance aux antibiotiques augmente la difficulté d'enrayer les infections bactériennes. Afin de palier ce problème, la mise au point de nouvelles stratégies, telle la stratégie antivirulence, est essentielle. Ainsi, ce manuscrit propose une nouvelle approche thérapeutique contre les bactéries à développement intracellulaire. Les analyses génomiques ont permis de mettre en évidence l'histidinol déshydrogénase (HDH, EC 1.1.1.23), enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'histidine, comme cible biologique pour la conception de nouveaux agents antibactériens. L'étude de l'inhibition de cette dernière permet une validation de l'approche sur Brucella suis, agent responsable de la brucellose, et un élargissement du spectre d'action des composés mis au point est envisagé par l'inhibition de HDH de Mycobacterium tuberculosis. Les travaux préliminaires nécessaires a cet élargissement sont présentés dans ce manuscrit. / The raise of antibiotic resistances increases the difficulty to eradicate bacterial infections. The development of new therapeutic approaches, such as the antivirulence strategy, is essential to limitate the impact of this phenomenon. This manuscript details a new therapeutic approach against intracellular pathogens. Genomic analyses allowed to discover new targets. The histidinol dehydrogenase (HDH, EC 1.1.1.23), which is an enzyme involved in histidine biosynthesis, has therefore be chosen for the conception of new antibacterial compounds. Inhibition studies of HDH of Brucella suis allows a validation of the strategy. In order to confirm the width of the therapeutic spectrum of synthesised compounds, the inhibition of HDH from Mycobacterium tuberculosis is envisaged and preliminary experiments are presented.

Der zu den bedeutendsten Ektoparasiten des Schweines gehörende Erreger der Schweineräude, Sarcoptes scabiei var. suis, ist weltweit verbreitet und von wirtschaftlichen Interesse für Schweinezucht- und Mastbetriebe. Ziel dieser seroepidemiologischen Studie war die Gewinnung neuer Erkenntnisse über die Bestandsdynamik klinischer Räudeerscheinungen und dem Titerverlauf von IgG-Antikörpern gegen Sarcoptes scabiei var. suis im Serum von Sauen in Abhängigkeit vom Reproduktionszyklus (Trächtigkeit, Laktation, Besamung) und von Saugferkeln während der Säugeperiode sowie Aufzucht. Schlussfolgernd aufgrund der Ergebnisse dieser Studie eignen sich für die Kontrolle und Überwachung sowie Diagnostik der Sarcoptes-Räude von Beständen serologische Untersuchungen von Ferkeln bis zur zweiten Lebenswoche von räudeverdächtigen Sauen, „Jungsauen erster und zweiter Wurf“ sowie Sauen während der Trächtigkeit (vor allem letztes Drittel) und Deckeber. Eine Vorselektion auf räudeverdächtige Hautveränderungen sowie gesteigerte Kratzaktivitäten erhöht die Wahrscheinlichkeit serologisch positive Tiere zu identifizieren.

Streptococcus suis, l'une des principales bactéries pathogènes présentes chez les porcelets sevrés, est responsable d’importantes pertes économiques dans l'industrie porcine. Aujourd'hui, les vaccins autogènes composés de bactéries tuées (bactérines) sont principalement utilisés mais les études ayant mesuré leur effet chez les porcs sont rares et controversées. Cette étude a évalué la réponse immunitaire induite par ces vaccins sur le terrain en comparant la vaccination des truies (immunité passive transférée aux porcelets) et des porcelets (immunité active). L’étude utilisait une ferme ayant des problèmes récurrents à S. suis et était divisée en deux parties : I) Les porcelets de truies non vaccinées ont reçu 2 doses d'une bactérine autogène. II) Les truies ont reçu 2 doses du même vaccin durant la gestation. Les réponses en anticorps ont été analysées par ELISA et leur effet protecteur par un test d'opsonophagocytose (OPA). La vaccination des porcelets n'a pas induit de réponse immunitaire active même après deux doses. Dans la deuxième partie, des taux élevés d'anticorps (principalement d'origine maternelle) avec une importante activité OPA ont été observés chez les porcelets âgés d’environ 1 semaine, indépendamment de la vaccination des truies. Ils diminuaient à 3 semaines d’âge, période la plus à risque. Malgré une légère augmentation des anticorps chez les truies vaccinées, le transfert d'immunité maternelle aux porcelets restait identique. Globalement, un programme de vaccination actif ou passif de porcelet avec la bactérine autogène utilisée ici n'a pas induit de protection durable chez les porcelets post-sevrés. Une amélioration de la formulation du vaccin est requise. / Streptococcus suis, one of the most important bacterial pathogen in weaned piglets, is responsible for serious economic losses in the swine industry. Today, mostly autogenous vaccines composed of killed bacteria (bacterins) are used but studies that assessed their protective effect on pigs are missing and their ability to protect is controversial. This comparative field study evaluated the immunological response induced by these vaccines comparing vaccination of sows (passive immunity transferred to piglets) or piglets (active immunity). Using a sow herd with recurrent S. suis problems, the study was divided in two parts: I) Piglets from non-vaccinated sows received 2 doses of an autogenous bacterin. II) Sows received 2 doses of the same vaccine during gestation. Antibody responses were analyzed by ELISA and their protective effect was evaluated by an opsonophagocytosis assay (OPA). Piglet vaccination failed to induce an active immune response even after two vaccine doses. In the 2nd part of the study, high levels of antibodies (mainly maternal-derived) with marked OPA activity were observed in piglets at 1 week old approximately, independently of sow vaccination. These antibodies decreased at 3 weeks of age, in the post-weaning high-risk period. In spite of a slight increase of antibodies in vaccinated sows, maternal immunity transfer to piglets did not increase. Overall, an active or passive piglet vaccination program with the autogenous bacterin used herein failed to induce lasting protection in post-weaned piglets. An improvement of vaccine formulation may be required.