Cette recherche est une approche sur les processus transfrontaliers dans la Triple FrontièreBrésil-Argentine-Paraguay. Initialement nous avons cherché à identifier les acteurs et les nouveaux usages du territoire, ainsi que le rôle des régions transfrontalières au sein des blocs commerciaux régionaux en Amérique du Sud et en Europe. Afin de utiliser l'expérience européenne dans les politiques pour les régions frontalières, on a analysés les initiatives d'intégration dans l’Union européenne et un travail de terrain dans la Grande Région a été réalisé, dont les résultats ont été utilisés pour la composition d'un chapitre de la recherche. Au cours du present étude l'importance de l'infrastructure routière, l'énergie et les télécommunications, le rôle du tourisme, les diverses initiatives de coopération et d'interaction dans le Triple Frontière, ainsi que les effets négatifs desprocessus transfrontaliersont été également analysé. Dans la recherche, les acteurs et les processus transfrontaliers ont été signalées par des coremas et des cartes. Les éléments énumérés ont servi à soutenir l'idée que actuellement une régiontransfrontalière se dessine au coeur du bassin de La Plata. / A presente pesquisa constitui uma abordagem acerca dos processos de transfronteirização na Tríplice Fronteira Brasil-Argentina-Paraguai. Inicialmente buscou-se identificar os atores e os novos usos do território, bem como o papel das regiões transfronteiriças dentro dos blocos regionais de comércio na América do Sul e na Europa. Com o intuito de aproveitar a experiência europeia no âmbito das políticas para regiões transfronteiriças, foram analisadas as iniciativas de integração e foi realizado um trabalho de campo na Grande Région, cujos resultados serviram para a composição de um capítulo da pesquisa. No decorrer da pesquisa também foram analisados a importância das infraestruturas viárias, energéticas e de telecomunicações, o papel do turismo, as diferentes iniciativas de cooperação e interação na Tríplice Fronteira, bem como os efeitos negativos da transfronteirização. Os atores e os processos de transfronteirização foram relatados através de coremas e mapas elaborados para a pesquisa. Os elementos elencados serviram para embasar a ideia de que está surgindo uma região transfronteiriça no coração da Bacia do Prata. / This research is an approach to cross-border processes in the Tri-Border Area, between Brazil, Argentina and Paraguay. Initially we sought to identify the actors, the new land uses and the role of cross-border regions within regional trading blocs in South America and Europe. To take advantage of the European experience in policies for border regions, we analyzed the integration initiatives in the European Union and a fieldwork in the Grande Région was conducted. The results of the fieldwork were used to compose a chapter of the research. In the present study the importance of road infrastructure, energy and telecommunications, the role of tourism, initiatives of cooperation and interaction in Tri-Border Area, as well as the negative effects of cross-border processes were also analyzed. In the present research, actors and border processes have been reported by graphic schemes and maps. The items listed were used to support the idea that, presently, a cross-border region is emerging in the heart of La Plata Basin.

Cette recherche est une approche sur les processus transfrontaliers dans la Triple FrontièreBrésil-Argentine-Paraguay. Initialement nous avons cherché à identifier les acteurs et les nouveaux usages du territoire, ainsi que le rôle des régions transfrontalières au sein des blocs commerciaux régionaux en Amérique du Sud et en Europe. Afin de utiliser l'expérience européenne dans les politiques pour les régions frontalières, on a analysés les initiatives d'intégration dans l’Union européenne et un travail de terrain dans la Grande Région a été réalisé, dont les résultats ont été utilisés pour la composition d'un chapitre de la recherche. Au cours du present étude l'importance de l'infrastructure routière, l'énergie et les télécommunications, le rôle du tourisme, les diverses initiatives de coopération et d'interaction dans le Triple Frontière, ainsi que les effets négatifs desprocessus transfrontaliersont été également analysé. Dans la recherche, les acteurs et les processus transfrontaliers ont été signalées par des coremas et des cartes. Les éléments énumérés ont servi à soutenir l'idée que actuellement une régiontransfrontalière se dessine au coeur du bassin de La Plata. / A presente pesquisa constitui uma abordagem acerca dos processos de transfronteirização na Tríplice Fronteira Brasil-Argentina-Paraguai. Inicialmente buscou-se identificar os atores e os novos usos do território, bem como o papel das regiões transfronteiriças dentro dos blocos regionais de comércio na América do Sul e na Europa. Com o intuito de aproveitar a experiência europeia no âmbito das políticas para regiões transfronteiriças, foram analisadas as iniciativas de integração e foi realizado um trabalho de campo na Grande Région, cujos resultados serviram para a composição de um capítulo da pesquisa. No decorrer da pesquisa também foram analisados a importância das infraestruturas viárias, energéticas e de telecomunicações, o papel do turismo, as diferentes iniciativas de cooperação e interação na Tríplice Fronteira, bem como os efeitos negativos da transfronteirização. Os atores e os processos de transfronteirização foram relatados através de coremas e mapas elaborados para a pesquisa. Os elementos elencados serviram para embasar a ideia de que está surgindo uma região transfronteiriça no coração da Bacia do Prata. / This research is an approach to cross-border processes in the Tri-Border Area, between Brazil, Argentina and Paraguay. Initially we sought to identify the actors, the new land uses and the role of cross-border regions within regional trading blocs in South America and Europe. To take advantage of the European experience in policies for border regions, we analyzed the integration initiatives in the European Union and a fieldwork in the Grande Région was conducted. The results of the fieldwork were used to compose a chapter of the research. In the present study the importance of road infrastructure, energy and telecommunications, the role of tourism, initiatives of cooperation and interaction in Tri-Border Area, as well as the negative effects of cross-border processes were also analyzed. In the present research, actors and border processes have been reported by graphic schemes and maps. The items listed were used to support the idea that, presently, a cross-border region is emerging in the heart of La Plata Basin.

The switch to unleaded fuels in the 1970s and the high air pollution in areas of high population density due to traffic particularly since the 1990s required the use of alternative fuel additives to achieve an improvement of the combustion. The utilization of oxygenated hydrocarbons as antiknock additives and so-called oxygenates provided a more complete and efficient combustion with simultaneously less harmful and polluting emissions. These include the synthetic ethers methyl tert-butyl ether (MTBE), ethyl tert-butyl ether (ETBE), tert-amyl methyl ether (TAME) and tert-amyl ethyl ether (TAEE). MTBE has a particular position as within some years it became the dominant oxygenate worldwide. Since then, over 100.000 leakages, most often in close proximity to gas stations, resulted in just as many oxygenate-contaminated sites of soil and groundwater within few years. The high water solubility of these ethers leads to an especially fast and extensive spread of the contamination plumes. Ether-contaminated groundwater has a turpentine-like taste that is noticed already in really low concentrations. Thus, such water can no longer serve as drinking water and requires a counter-measure. The chemical parameters of oxygenates decrease the efficiency of otherwise successfully applied techniques such as adsorption or aeration. In addition the ethers proved recalcitrant against microbial attack. The search for microorganisms that could degrade these synthetic oxygenates indeed resulted in the enrichment of many isolates. The majority of these isolates oxidize the ethers in a cometabolic manner either partially or completely to CO2. However, only few cultures are capable of independent growth on these oxygenates. These include the beta-proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 and Aquincola tertiaricarbonis L108, of which the latter is of particular interest for the present work. Strain L108 is characterized by good growth on MTBE and is presently the only known isolate which is able to mineralize ETBE, TAME and TAEE at similar rates. This work examined the seemingly particularly well adapted oxygenate ether metabolism of strain L108, that was formerly isolated from an aquifer highly contaminated with MTBE. Via diverse deletion studies key enzymes of the degradative metabolism and their genetic background were clearly identified. Hence, the results of this work contribute to verify so far just hypothesized metabolic steps by detailed enzymatic and genetic studies. Based on detected metabolites, first studies on MTBE biodegradation already postulated an oxidative pathway via TBA, 2-methyl-1,2-propane-diol (MPD) and 2-HIBA. In case of a monoxygenatic hydroxylation of the methoxy group of MTBE a hemiacetale results as reaction product, from which the tertiary alcohol TBA can be formed easily in subsequent reactions. By comparing wild type strain L108 with the spontaneous mutant strain L10, we were now able to clearly show that the cytochrome P-450 monoxygenase system EthABCD accounts solely for this MTBE-oxidizing activity. It is also the only enzyme catalyzing the corresponding hydroxylation of ETBE, TAME and TAEE. In strain L108 this enzyme complex is expressed constitutively. TBA, which is also generated from hydroxylation of ETBE, is, as postulated and verified by this study, degraded by a different monoxygenase resulting in MPD. Via Tn5-mediated mutations this enzyme was confirmed as Rieske non-heme mononuclear iron monooxygenase MdpJ. MPD is further altered to the corresponding branched acid 2-HIBA, presumably by two dehydrogenation reactions. For the degradation of 2-HIBA, diverse hypotheses exist on the basis of known enzymatic reactions. Another Tn5 mutation now gave evidence, that in the mentioned beta-proteobacteria the novel mutase HcmAB linearizes 2-HIBA to 3-hydroxybutyric acid (3-HB) dependent on cobalamin and coenzyme A (CoA). Sequence comparison revealed, that strain L108 acquired all three key enzyme complexes, EthABCD, MdpJ and HcmAB via horizontal gene transfer (HGT). For TAME and TAEE a completely new degradation pathway was found. In strain L108, the resulting degradation product tert-amyl alcohol (TAA) of these ethers is, like TBA, also specifically oxidized by MdpJ. In Tn5-deletion studies and metabolite analyzes, however, no hydroxylation could be detected. Instead, TAA is rather desaturated. Therefore within the metabolism no diols or acids analogue to MPD or 2-HIBA were formed. Instead, via MdpJ TAA is initially degraded to the unsaturated tertiary alcohol and hemiterpene 2-methyl-3-butene-2-ol. Prenol (3-methyl-2-buten-2-ol), prenal (3-methyl-2-buten-2-al) and 3-methyl crotonic acid were detected as additional metabolites. Hence, an isomerization of the branched acid by HcmAB is apparently irrelevant in TAA biodegradation. Accordingly it could be shown, that deletion mutants for HcmAB indeed could not grow on TBA, but are still able to grow on TAA, just as fast as the wild type, in fact. The tertiary alcohol 2-methyl-3-butene-2-ol is presumably transformed via another isomerase resulting in the primary alcohol prenol. Prenol is further oxidized by postulated dehydrogenases to 3-methyl crotonic acid. This would also be in correlation to the already observed degradation pathway of the monoterpene linalool in other bacteria. However, the responsible enzymes in strain L108 are not yet identified. Besides this principal gain of knowledge in the degradation of xenobiotic ether structures and the evolution of degradative microorganism, the now confirmed key enzymes EthB, MdpJ and HcmAB, respectively their coding genes, can be used as specific markers to monitor natural degradation processes in in situ studies. On this basis, the presence of active microorganisms and additionally - derived from the confirmed single key enzymes - a potentially complete degradation can be concluded. In the long run, it might be possible to stimulate the natural microbiological activity, e.g. via bioaugmentation with degradation specialists. Furthermore, regarding the potential progress of remediation procedures, potentially limiting steps can be distinguished via respective markers and narrowed down as possible cause of deficient degradation activity. However, such function-based monitoring requires specific verification. Therefore, subsequent studies have to analyze, if there is a sequence diversity among these three key enzymes. Previous sequence comparisons hypothesize that up to 60% accordance in the protein sequence in homologues of MdpJ and HcmA they can still be assumed to possess the same enzymatic function. This diversity has to be considered in the development of specific probes. / Die Einführung bleifreien Benzins in den 1970er-Jahren und die hohe Emissionsbelastung von Ballungszentren durch den Straßenverkehr insbesondere seit den 1990er-Jahren erforderte den Einsatz alternativer Benzinadditive, um eine Verbesserung der Verbrennung zu erreichen. Die Nutzung sauerstoffhaltiger Kohlenwasserstoffe als Antiklopfmittel und als sogenannte Oxygenate bot sich an, da diese eine effizientere Verbrennung mit gleichzeitig niedrigeren gesundheits- und umweltschädigenden Emissionen fördern. Zu den Oxygenaten gehören die synthetischen Ether Methyl-tert-butylether (MTBE), Ethyl-tert-butylether (ETBE), tert-Amylmethylether (TAME) und tert-Amylethylether (TAEE). Eine herausragende Stellung nimmt MTBE ein. Innerhalb weniger Jahre wurde es zum hauptsächlich verwendeten Oxygenat weltweit. Seitdem führten jedoch über 100.000 Leckagen, zumeist in Tankstellennähe, innerhalb weniger Jahre zu ebenso zahlreichen Kontaminationen des Grundwassers mit Oxygenaten. Aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit kommt es dabei zu einer besonders schnellen und großflächigen Ausbreitung der Ether. Derart belastetes Grundwasser weist schon bei geringsten Etherkonzentrationen einen als terpentinartig wahrgenommenen Geruch und Geschmack auf und kann daher nicht mehr als Trinkwasserzufuhr genutzt werden. Es bedarf einer Lösung dieses Problems. Die chemischen Parameter der Ether senken allerdings die Effizienz anderweitig erfolgreich genutzter technischer Sanierungsverfahren auf Basis von z. B. Adsorption oder Aerisierung. Auch gegenüber mikrobiellen Abbau erweisen sie sich als rekalzitrant. Die Suche nach oxygenatabbauenden Mikroorganismen führte zwar zur Anreicherung vieler Isolate, welche die Oxygenate cometabolisch partiell oder sogar komplett oxidieren, nur sehr wenige Kulturen sind aber zu autarkem Wachstum auf diesen Ethern fähig. Dazu gehören die Beta-Proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 und der dieser Arbeit zugrunde liegende Aquincola tertiaricarbonis L108. Der Stamm L108 zeichnet sich durch ein vergleichsweise gutes Wachstum auf MTBE aus und ist als bisher einzig bekanntes Isolat in der Lage, auch ETBE, TAME und TAEE ähnlich schnell zu mineralisieren. Die vorliegende Arbeit handelt von dem scheinbar besonders gut an den Oxygenatabbau adaptierten Stoffwechsel des ursprünglich aus MTBE-kontaminiertem Grundwasser angereicherten Stammes L108. Durch verschiedene Deletionsstudien wurden Schlüsselenzyme des Abbaus und deren genetischer Hintergrund eindeutig identifiziert. Die Ergebnisse der genetischen, enzymatischen und physiologischen Studien des Wildtyps im Vergleich zu den erzeugten Deletionsstämmen tragen dazu bei, bisher nur postulierte Reaktionsschritte zu verifizieren. Schon seit den ersten Studien zum MTBE-Abbau wird anhand markanter Metabolite ein oxidativer Abbau via TBA, 2-Methyl-1,2-propandiol (MPD) und 2-Hydroxyisobuttersäure (2-HIBA) vermutet. Im Fall einer Hydroxylierung der Methoxygruppe von MTBE wird ein Hemiacetal als Reaktionsprodukt erzeugt, aus dem nachfolgend leicht der tertiäre Alkohol TBA entstehen kann. Durch den Vergleich des Wildtyps mit der Spontanmutante Stamm L10 konnte jetzt gezeigt werden, dass hierfür allein das Cytochrom-P450-Monooxygenasesystem EthABCD verantwortlich ist. Dieses katalysiert auch exklusiv die entsprechende Hydroxylierung von ETBE, TAME und TAEE. In Stamm L108 wird das Enzym konstitutiv exprimiert. TBA, das auch aus der Hydroxylierung von ETBE resultiert, wird, wie postuliert und in dieser Arbeit verifiziert, durch eine weitere Monooxygenase zu MPD abgebaut. Durch eine Tn5-Transposon-vermittelte Mutation konnte verifiziert werden, dass es sich bei diesem Enzym um die Rieske-nicht-Häm-Monooxygenase MdpJ handelt. MPD wird im weiteren Verlauf voraussichtlich durch zwei Dehydrogenierungen zur korrespondierenden, verzweigten Säure 2-HIBA gewandelt. Zum 2-HIBA-Abbau gibt es, basierend auf bekannten Enzymreaktionen, diverse Hypothesen. Anhand einer weiteren Tn5-Mutation konnte jetzt bestätigt werden, dass in den genannten beta-Proteobacteria die neuartige Mutase HcmAB wirksam ist, welche 2-HIBA abhängig von Cobalamin und Coenzym A (CoA) zu 3-Hydroxybuttersäure (3-HB) linearisiert. Sequenzvergleiche ergaben, dass Stamm L108 die Schlüsselenzyme des Etherabbaus, EthABCD, MdpJ und HcmAB, durch horizontalen Gentransfer erworben hat. Für TAME und TAEE wurde ein völlig neuer Abbauweg gefunden. In Stamm L108 wird der beim Abbau dieser Ether entstehende tert-Amylalkohol (TAA) wie TBA ebenfalls exklusiv durch MdpJ oxidiert. Durch die Tn5-Deletionsstudien und durch Analyse der Metabolite konnte allerdings keine Hydroxylierung nachgewiesen werden. TAA wird durch MdpJ vielmehr desaturiert. Somit entstehen im Abbauweg keine zu MPD und 2-HIBA analogen Diole und Säuren, sondern TAA wird zunächst durch MdpJ zu einem ungesättigten tertiären Alkohol, dem Hemiterpen 2-Methyl-3-buten-2-ol, abgebaut. Prenol (3-Methyl-2-buten-2-ol), Prenal (3-Methyl-2-buten-2-al) und 3-Methylcrotonsäure wurden als weitere Metabolite des TAA-Stoffwechsels detektiert. Somit spielt eine Isomerisierung einer tertiär verzweigten Säure durch HcmAB im TAA-Abbauweg offensichtlich keine Rolle. Entsprechend konnte gezeigt werden, dass Deletionsmutanten für hcmAB zwar nicht mehr auf TBA, aber immer noch auf TAA wachsen können, und das genauso schnell, wie der Wildtyp. Der tertiäre Alkohol 2-Methyl-3-buten-2-ol wird wahrscheinlich durch eine andere Isomerase zum primären Alkohol Prenol umgewandelt und dieser dann durch Dehydrogenasen zur Methylcrotonsäure oxidiert. Dies würde dem bereits in anderen Bakterien beobachteten Abbauweg des Monoterpens Linalool entsprechen. Die in Stamm L108 dafür verantwortlichen Enzyme wurden aber noch nicht identifiziert. Neben diesem grundsätzlichen Erkenntnisgewinn zum Abbau der xenobiotischen Etherverbindungen und der Evolution degradativer Mikroorganismen, können die hier bestätigten Schlüssel-enzyme EthABCD, MdpJ und HcmAB bzw. deren codierende Gene als spezifische Marker zum Monitoring natürlicher Abbauprozesse für in-situ-Untersuchungen genutzt werden. Auf dieser Basis kann auf die Anwesenheit aktiver Mikroorganismen und zudem noch - abgeleitet aus der Präsenz der einzelnen Schlüsselenzyme - auf einen potenziell kompletten Abbau geschlossen werden. Darauf aufbauend kann die natürliche mikrobiologische Aktivität durch nachfolgende biotechnologische Maßnahmen stimuliert werden, zum Beispiel durch eine Bioaugmentation mit Abbauspezialisten. Des weiteren können mögliche limitierende Schritte hinsichtlich des potenziellen Verlaufs der Sanierungsmaßnahme über Präsenztiter der betreffenden Marker gezielter verfolgt und als etwaige Ursachen defizitärer Abbauleistungen eingegrenzt werden. Voraussetzung für dieses funktionsbasierte Monitoring ist allerdings der spezifische Nachweis. Somit sollte in nachfolgenden Studien analysiert werden, ob es bei den drei Schlüsselenzymen eine Sequenzdiversität gibt. Die bisherigen Sequenzvergleiche lassen zumindest vermuten, dass bis etwa 60% Übereinstimmung der Proteinsequenzen bei Homologen von MdpJ und HcmA noch mit der gleichen Enzymfunktion zu rechnen ist. Diese Diversität sollte bei der Entwicklung von spezifischen Sonden berücksichtigt werden.

The switch to unleaded fuels in the 1970s and the high air pollution in areas of high population density due to traffic particularly since the 1990s required the use of alternative fuel additives to achieve an improvement of the combustion. The utilization of oxygenated hydrocarbons as antiknock additives and so-called oxygenates provided a more complete and efficient combustion with simultaneously less harmful and polluting emissions. These include the synthetic ethers methyl tert-butyl ether (MTBE), ethyl tert-butyl ether (ETBE), tert-amyl methyl ether (TAME) and tert-amyl ethyl ether (TAEE). MTBE has a particular position as within some years it became the dominant oxygenate worldwide. Since then, over 100.000 leakages, most often in close proximity to gas stations, resulted in just as many oxygenate-contaminated sites of soil and groundwater within few years. The high water solubility of these ethers leads to an especially fast and extensive spread of the contamination plumes. Ether-contaminated groundwater has a turpentine-like taste that is noticed already in really low concentrations. Thus, such water can no longer serve as drinking water and requires a counter-measure. The chemical parameters of oxygenates decrease the efficiency of otherwise successfully applied techniques such as adsorption or aeration. In addition the ethers proved recalcitrant against microbial attack. The search for microorganisms that could degrade these synthetic oxygenates indeed resulted in the enrichment of many isolates. The majority of these isolates oxidize the ethers in a cometabolic manner either partially or completely to CO2. However, only few cultures are capable of independent growth on these oxygenates. These include the beta-proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 and Aquincola tertiaricarbonis L108, of which the latter is of particular interest for the present work. Strain L108 is characterized by good growth on MTBE and is presently the only known isolate which is able to mineralize ETBE, TAME and TAEE at similar rates. This work examined the seemingly particularly well adapted oxygenate ether metabolism of strain L108, that was formerly isolated from an aquifer highly contaminated with MTBE. Via diverse deletion studies key enzymes of the degradative metabolism and their genetic background were clearly identified. Hence, the results of this work contribute to verify so far just hypothesized metabolic steps by detailed enzymatic and genetic studies. Based on detected metabolites, first studies on MTBE biodegradation already postulated an oxidative pathway via TBA, 2-methyl-1,2-propane-diol (MPD) and 2-HIBA. In case of a monoxygenatic hydroxylation of the methoxy group of MTBE a hemiacetale results as reaction product, from which the tertiary alcohol TBA can be formed easily in subsequent reactions. By comparing wild type strain L108 with the spontaneous mutant strain L10, we were now able to clearly show that the cytochrome P-450 monoxygenase system EthABCD accounts solely for this MTBE-oxidizing activity. It is also the only enzyme catalyzing the corresponding hydroxylation of ETBE, TAME and TAEE. In strain L108 this enzyme complex is expressed constitutively. TBA, which is also generated from hydroxylation of ETBE, is, as postulated and verified by this study, degraded by a different monoxygenase resulting in MPD. Via Tn5-mediated mutations this enzyme was confirmed as Rieske non-heme mononuclear iron monooxygenase MdpJ. MPD is further altered to the corresponding branched acid 2-HIBA, presumably by two dehydrogenation reactions. For the degradation of 2-HIBA, diverse hypotheses exist on the basis of known enzymatic reactions. Another Tn5 mutation now gave evidence, that in the mentioned beta-proteobacteria the novel mutase HcmAB linearizes 2-HIBA to 3-hydroxybutyric acid (3-HB) dependent on cobalamin and coenzyme A (CoA). Sequence comparison revealed, that strain L108 acquired all three key enzyme complexes, EthABCD, MdpJ and HcmAB via horizontal gene transfer (HGT). For TAME and TAEE a completely new degradation pathway was found. In strain L108, the resulting degradation product tert-amyl alcohol (TAA) of these ethers is, like TBA, also specifically oxidized by MdpJ. In Tn5-deletion studies and metabolite analyzes, however, no hydroxylation could be detected. Instead, TAA is rather desaturated. Therefore within the metabolism no diols or acids analogue to MPD or 2-HIBA were formed. Instead, via MdpJ TAA is initially degraded to the unsaturated tertiary alcohol and hemiterpene 2-methyl-3-butene-2-ol. Prenol (3-methyl-2-buten-2-ol), prenal (3-methyl-2-buten-2-al) and 3-methyl crotonic acid were detected as additional metabolites. Hence, an isomerization of the branched acid by HcmAB is apparently irrelevant in TAA biodegradation. Accordingly it could be shown, that deletion mutants for HcmAB indeed could not grow on TBA, but are still able to grow on TAA, just as fast as the wild type, in fact. The tertiary alcohol 2-methyl-3-butene-2-ol is presumably transformed via another isomerase resulting in the primary alcohol prenol. Prenol is further oxidized by postulated dehydrogenases to 3-methyl crotonic acid. This would also be in correlation to the already observed degradation pathway of the monoterpene linalool in other bacteria. However, the responsible enzymes in strain L108 are not yet identified. Besides this principal gain of knowledge in the degradation of xenobiotic ether structures and the evolution of degradative microorganism, the now confirmed key enzymes EthB, MdpJ and HcmAB, respectively their coding genes, can be used as specific markers to monitor natural degradation processes in in situ studies. On this basis, the presence of active microorganisms and additionally - derived from the confirmed single key enzymes - a potentially complete degradation can be concluded. In the long run, it might be possible to stimulate the natural microbiological activity, e.g. via bioaugmentation with degradation specialists. Furthermore, regarding the potential progress of remediation procedures, potentially limiting steps can be distinguished via respective markers and narrowed down as possible cause of deficient degradation activity. However, such function-based monitoring requires specific verification. Therefore, subsequent studies have to analyze, if there is a sequence diversity among these three key enzymes. Previous sequence comparisons hypothesize that up to 60% accordance in the protein sequence in homologues of MdpJ and HcmA they can still be assumed to possess the same enzymatic function. This diversity has to be considered in the development of specific probes.:Bibliographische Darstellung Eidesstattliche Erklärung Danksagung Abstract Kurzfassung Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Tertiäre Ether als Benzin-Oxygenate - Hintergrund und Umweltproblematik 1.2. Mikrobiologischer Abbau tertiärer Ether 1.3. Postulierter Abbauweg 1.4. Monitoring-Tools für biologischen Abbau 1.5. Ziel dieser Arbeit 1.6. Referenzen der Einleitung 2. Die initiale Etherspaltung des Stammes L108 2.1. Die Ethermonooxygenase EthB 2.2. Supplemental Material 3. Die spezifische Alkoholmonooxygenase MdpJ 3.1. Die Alkoholmonooxygenase MdpJ als Hydroxylase und Reduktase 3.2. Supplemental Material 4. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB des Stammes L108 4.1. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB 4.2. Supplemental Material 5. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.1. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.2. Supplemental Material 6. Diskussion 6.1. Nachweis der Schlüsselenzyme in Stamm L108 durch Mutation 6.2. Nutzen für den Nachweis natürlichen Abbaus 6.3. Der TAA-Metabolismus als neuartiger Abbauweg 6.4. Mikrobiologische Anpassung an Xenobiotika am Beispiel MTBE 6.5. Ausblick 6.6. Referenzen der Diskussion Anhang Curriculum Vitae Publikationsverzeichnis Tagungsbeiträge Nachweis über Anteile der Co-Autoren / Die Einführung bleifreien Benzins in den 1970er-Jahren und die hohe Emissionsbelastung von Ballungszentren durch den Straßenverkehr insbesondere seit den 1990er-Jahren erforderte den Einsatz alternativer Benzinadditive, um eine Verbesserung der Verbrennung zu erreichen. Die Nutzung sauerstoffhaltiger Kohlenwasserstoffe als Antiklopfmittel und als sogenannte Oxygenate bot sich an, da diese eine effizientere Verbrennung mit gleichzeitig niedrigeren gesundheits- und umweltschädigenden Emissionen fördern. Zu den Oxygenaten gehören die synthetischen Ether Methyl-tert-butylether (MTBE), Ethyl-tert-butylether (ETBE), tert-Amylmethylether (TAME) und tert-Amylethylether (TAEE). Eine herausragende Stellung nimmt MTBE ein. Innerhalb weniger Jahre wurde es zum hauptsächlich verwendeten Oxygenat weltweit. Seitdem führten jedoch über 100.000 Leckagen, zumeist in Tankstellennähe, innerhalb weniger Jahre zu ebenso zahlreichen Kontaminationen des Grundwassers mit Oxygenaten. Aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit kommt es dabei zu einer besonders schnellen und großflächigen Ausbreitung der Ether. Derart belastetes Grundwasser weist schon bei geringsten Etherkonzentrationen einen als terpentinartig wahrgenommenen Geruch und Geschmack auf und kann daher nicht mehr als Trinkwasserzufuhr genutzt werden. Es bedarf einer Lösung dieses Problems. Die chemischen Parameter der Ether senken allerdings die Effizienz anderweitig erfolgreich genutzter technischer Sanierungsverfahren auf Basis von z. B. Adsorption oder Aerisierung. Auch gegenüber mikrobiellen Abbau erweisen sie sich als rekalzitrant. Die Suche nach oxygenatabbauenden Mikroorganismen führte zwar zur Anreicherung vieler Isolate, welche die Oxygenate cometabolisch partiell oder sogar komplett oxidieren, nur sehr wenige Kulturen sind aber zu autarkem Wachstum auf diesen Ethern fähig. Dazu gehören die Beta-Proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 und der dieser Arbeit zugrunde liegende Aquincola tertiaricarbonis L108. Der Stamm L108 zeichnet sich durch ein vergleichsweise gutes Wachstum auf MTBE aus und ist als bisher einzig bekanntes Isolat in der Lage, auch ETBE, TAME und TAEE ähnlich schnell zu mineralisieren. Die vorliegende Arbeit handelt von dem scheinbar besonders gut an den Oxygenatabbau adaptierten Stoffwechsel des ursprünglich aus MTBE-kontaminiertem Grundwasser angereicherten Stammes L108. Durch verschiedene Deletionsstudien wurden Schlüsselenzyme des Abbaus und deren genetischer Hintergrund eindeutig identifiziert. Die Ergebnisse der genetischen, enzymatischen und physiologischen Studien des Wildtyps im Vergleich zu den erzeugten Deletionsstämmen tragen dazu bei, bisher nur postulierte Reaktionsschritte zu verifizieren. Schon seit den ersten Studien zum MTBE-Abbau wird anhand markanter Metabolite ein oxidativer Abbau via TBA, 2-Methyl-1,2-propandiol (MPD) und 2-Hydroxyisobuttersäure (2-HIBA) vermutet. Im Fall einer Hydroxylierung der Methoxygruppe von MTBE wird ein Hemiacetal als Reaktionsprodukt erzeugt, aus dem nachfolgend leicht der tertiäre Alkohol TBA entstehen kann. Durch den Vergleich des Wildtyps mit der Spontanmutante Stamm L10 konnte jetzt gezeigt werden, dass hierfür allein das Cytochrom-P450-Monooxygenasesystem EthABCD verantwortlich ist. Dieses katalysiert auch exklusiv die entsprechende Hydroxylierung von ETBE, TAME und TAEE. In Stamm L108 wird das Enzym konstitutiv exprimiert. TBA, das auch aus der Hydroxylierung von ETBE resultiert, wird, wie postuliert und in dieser Arbeit verifiziert, durch eine weitere Monooxygenase zu MPD abgebaut. Durch eine Tn5-Transposon-vermittelte Mutation konnte verifiziert werden, dass es sich bei diesem Enzym um die Rieske-nicht-Häm-Monooxygenase MdpJ handelt. MPD wird im weiteren Verlauf voraussichtlich durch zwei Dehydrogenierungen zur korrespondierenden, verzweigten Säure 2-HIBA gewandelt. Zum 2-HIBA-Abbau gibt es, basierend auf bekannten Enzymreaktionen, diverse Hypothesen. Anhand einer weiteren Tn5-Mutation konnte jetzt bestätigt werden, dass in den genannten beta-Proteobacteria die neuartige Mutase HcmAB wirksam ist, welche 2-HIBA abhängig von Cobalamin und Coenzym A (CoA) zu 3-Hydroxybuttersäure (3-HB) linearisiert. Sequenzvergleiche ergaben, dass Stamm L108 die Schlüsselenzyme des Etherabbaus, EthABCD, MdpJ und HcmAB, durch horizontalen Gentransfer erworben hat. Für TAME und TAEE wurde ein völlig neuer Abbauweg gefunden. In Stamm L108 wird der beim Abbau dieser Ether entstehende tert-Amylalkohol (TAA) wie TBA ebenfalls exklusiv durch MdpJ oxidiert. Durch die Tn5-Deletionsstudien und durch Analyse der Metabolite konnte allerdings keine Hydroxylierung nachgewiesen werden. TAA wird durch MdpJ vielmehr desaturiert. Somit entstehen im Abbauweg keine zu MPD und 2-HIBA analogen Diole und Säuren, sondern TAA wird zunächst durch MdpJ zu einem ungesättigten tertiären Alkohol, dem Hemiterpen 2-Methyl-3-buten-2-ol, abgebaut. Prenol (3-Methyl-2-buten-2-ol), Prenal (3-Methyl-2-buten-2-al) und 3-Methylcrotonsäure wurden als weitere Metabolite des TAA-Stoffwechsels detektiert. Somit spielt eine Isomerisierung einer tertiär verzweigten Säure durch HcmAB im TAA-Abbauweg offensichtlich keine Rolle. Entsprechend konnte gezeigt werden, dass Deletionsmutanten für hcmAB zwar nicht mehr auf TBA, aber immer noch auf TAA wachsen können, und das genauso schnell, wie der Wildtyp. Der tertiäre Alkohol 2-Methyl-3-buten-2-ol wird wahrscheinlich durch eine andere Isomerase zum primären Alkohol Prenol umgewandelt und dieser dann durch Dehydrogenasen zur Methylcrotonsäure oxidiert. Dies würde dem bereits in anderen Bakterien beobachteten Abbauweg des Monoterpens Linalool entsprechen. Die in Stamm L108 dafür verantwortlichen Enzyme wurden aber noch nicht identifiziert. Neben diesem grundsätzlichen Erkenntnisgewinn zum Abbau der xenobiotischen Etherverbindungen und der Evolution degradativer Mikroorganismen, können die hier bestätigten Schlüssel-enzyme EthABCD, MdpJ und HcmAB bzw. deren codierende Gene als spezifische Marker zum Monitoring natürlicher Abbauprozesse für in-situ-Untersuchungen genutzt werden. Auf dieser Basis kann auf die Anwesenheit aktiver Mikroorganismen und zudem noch - abgeleitet aus der Präsenz der einzelnen Schlüsselenzyme - auf einen potenziell kompletten Abbau geschlossen werden. Darauf aufbauend kann die natürliche mikrobiologische Aktivität durch nachfolgende biotechnologische Maßnahmen stimuliert werden, zum Beispiel durch eine Bioaugmentation mit Abbauspezialisten. Des weiteren können mögliche limitierende Schritte hinsichtlich des potenziellen Verlaufs der Sanierungsmaßnahme über Präsenztiter der betreffenden Marker gezielter verfolgt und als etwaige Ursachen defizitärer Abbauleistungen eingegrenzt werden. Voraussetzung für dieses funktionsbasierte Monitoring ist allerdings der spezifische Nachweis. Somit sollte in nachfolgenden Studien analysiert werden, ob es bei den drei Schlüsselenzymen eine Sequenzdiversität gibt. Die bisherigen Sequenzvergleiche lassen zumindest vermuten, dass bis etwa 60% Übereinstimmung der Proteinsequenzen bei Homologen von MdpJ und HcmA noch mit der gleichen Enzymfunktion zu rechnen ist. Diese Diversität sollte bei der Entwicklung von spezifischen Sonden berücksichtigt werden.:Bibliographische Darstellung Eidesstattliche Erklärung Danksagung Abstract Kurzfassung Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Tertiäre Ether als Benzin-Oxygenate - Hintergrund und Umweltproblematik 1.2. Mikrobiologischer Abbau tertiärer Ether 1.3. Postulierter Abbauweg 1.4. Monitoring-Tools für biologischen Abbau 1.5. Ziel dieser Arbeit 1.6. Referenzen der Einleitung 2. Die initiale Etherspaltung des Stammes L108 2.1. Die Ethermonooxygenase EthB 2.2. Supplemental Material 3. Die spezifische Alkoholmonooxygenase MdpJ 3.1. Die Alkoholmonooxygenase MdpJ als Hydroxylase und Reduktase 3.2. Supplemental Material 4. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB des Stammes L108 4.1. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB 4.2. Supplemental Material 5. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.1. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.2. Supplemental Material 6. Diskussion 6.1. Nachweis der Schlüsselenzyme in Stamm L108 durch Mutation 6.2. Nutzen für den Nachweis natürlichen Abbaus 6.3. Der TAA-Metabolismus als neuartiger Abbauweg 6.4. Mikrobiologische Anpassung an Xenobiotika am Beispiel MTBE 6.5. Ausblick 6.6. Referenzen der Diskussion Anhang Curriculum Vitae Publikationsverzeichnis Tagungsbeiträge Nachweis über Anteile der Co-Autoren

Thesis (PhD)--Macquarie University. Macquarie Graduate School of Management. / Bibliography: p. 286-324. / The contribution of this thesis is to present a framework to analyse firms controlled by more than one board. The literature survey of Chapter 2 revealed that there is little recognition of this phenomenon and no accepted way to investigate firms governed by multiple control centres described as a "compound board". The framework is developed in Chapter 3. The historical emergence of compound boards is outlined in Chapter 4 with examples of their architecture described in Chapters 5 and 6. Chapter 7 shows how the framework provides insights not available from other theories of the firm and how selfyes governance can be furthered by utilising contrary human attributes of competition/co-operation, trust/suspicion and self-interest/altruism. / The framework is described as transaction byte analysis (TBA) as it is based on the limited and inconsistent ability of humans to transact units of information described as "bytes". TBA identifies cybernetic principles and strategies that can mitigate human limitations in processing bytes. These provide organisational design criteria for firms to obtain operating advantages. As information is a common element in varies theories of the firm, TBA relates and subsumes them while allowing any type of organisation to be analysed. / Propositions are presented in Chapter 7 for illustrating how TBA provides insights into explaining: (i) why non-trivial employee owned industrial firms have more than one board; (ii) why self-regulation and self-governance of non-trivial firms cannot be assured without a compound board; (iii) how compound boards can simplify the role, knowledge, duties and liabilities of directors; (iv) the competitive advantages of appropriate compound boards in relation to unitary control systems; (v) how to compare and evaluate the relative advantages and disadvantages of firms with different ownership and control structures; (vi) how to compare the relative efficacy of hierarchical and non-hierarchical firms be they in the private or public sector. / Mode of access: World Wide Web. / x, 324 p. ill

Traditional Birth Attendants (TBAs) are the primary health care providers for women at the time of childbirth in many parts of the world. In India, particularly in remote areas such as Garhwal, these women play a key role in maternal health. Training programmes for TBAs can lead to dramatic reductions in neonatal mortality as well as in maternal morbidity and mortality, due to improved hygienic practices at the time of delivery. Yet training programmes for TBAs often lack sociocultural relevance, and fail to incorporate an understanding of the TBAs' perceptions of the process of pregnancy and delivery. Understanding more about the role of the TBA as a diagnostician and a decision-maker within a given sociocultural context can make such training programmes more culturally congruent. This research report describes the way in which TBAs (dais) in Garhwal interpret obstetrical complications, and how they make decisions regarding the need for cosmopolitan medical care. TBAs in Garhwal interpret obstetrical complications using a variety of explanatory models, arising from an understanding of health and illness which shows influences of Vedic, Ayurvedic, folk and cosmopolitan medical models. These explanatory models often led to a perception of "danger” and the "dangerous case" which is widely divergent from the cosmopolitan medical model. Specific areas are identified where the dais' interpretation of "danger" was particularly divergent from the cosmopolitan medical model. These areas of conceptual conflict result in diagnoses and treatment procedures which can lead to significant delays in the woman receiving needed cosmopolitan medical care. The third stage of action-research process is the development of a participatory training programme, in which the TBA is an active participant. The aim of the training programme is to move towards a shared perception of risk regarding major obstetrical complications. / Thesis / Master of Arts (MA)

En la presente Tesis Doctoral se estudió el efecto de la incorporación de aceites poliinsaturados, α-tocoferol y minerales en piensos sobre la composición en ácidos grasos, el contenido en α-tocoferol, la oxidación (índice del ATB) y la susceptibilidad a la oxidación (método inducido del naranja de xylenol) de plasma, hígado y carne de conejo. También se estudiarion los efectos de la cocción y la conservación a refrigeración de la carne cocida sobre estos parámetros. En un primer estudio se ensayaron diferentes dosis y tipos (girasol y linaza) de grasas en pienso, y la suplementación de la dieta con AT (100 mg/kg). Dosis y tipo de aceite, así como la suplementación con AT modificaron la composición en AG de plasma, hígado y carne, tanto por incorporación de AG de la dieta, como por modificación de la biosíntesis de ciertos AG. También alteraron la oxidación (índice del ATB) y la susceptibilidad a la oxidación (índice del naranja de xilenol o FOX) de plasma, hígado y carne de conejo. Cocción y refrigeración produjeron incrementos en la oxidación de la carne, que fueron menores tras suplementar las dietas con AT, siendo esto menos efectivo cuando los piensos contenían un 3% de linaza. El contenido en α-tocoferol del plasma fue indictivo del contenido en α-tocoferol de hígado y carne, y de su estado oxidativo. La cocción y la refrigeración de la carne cocida implicaron una pérdida de α-tocoferol y un incremento en la oxidación de la carne. La evaluación de la susceptibilidad a la oxidación mediante el método inducido del naranja de xilenol fue un buen predictor de la oxidación alcanzada tras la cocción. Entre los tratamientos estudiados, el que ofreció una composición en AG nutricionalmente más favorable y una mejor estabilidad oxidativa fue el que contenía 1,5% de linaza y 100 mg/kg de AT. En el segundo estudio se ensayaron diferentes niveles de oxidación en el aceite añadido a los piensos (sin oxidar, alto contenido en compuestos de oxidación primaria, y alto contenido en compuestos de oxidación secundaria), y la suplementación con AT y con Zn. La incorporación de aceites oxidados a los piensos no modificó de forma sustancial la composición en AG de plasma, hígado y carne de conejo, ni su oxidación. Sin embargo, cuando el aceite presentaba un alto contenido en compuestos de oxidación primaria, se redujo el contenido en αT en ellos, y aumentó la oxidabilidad en carne de conejo. Ésta fue reducida por la suplementación con AT, pero de forma menos efectiva cuando el aceite del pienso presentaba un alto contenido en compuestos de oxidación primaria. El contenido en Zn, Fe o Se en la carne no se modificó por los factores estudiados, pero la suplementación con Zn redujo en contenido en Cu en la carne, aunque esto no afectó a su oxidación. Tal como sucedió en el primer estudio, la cocción y la refrigeración aumentaron la oxidación en la carne, pero los valores de ATB alcanzados fueron menores que en el primer estudio. La evaluación de la susceptibilidad a la oxidación en carne cruda mediante el método inducido del naranja de xilenol fue indicativa de la oxidación alcanzada en la carne tras la cocción. / The effects of the addition of different doses and sources (sunflower and linseed oil) of polyunsaturated oils to rabbit feeds, as well as the dietary supplementation with α-tocopheryl acetate (TA) on the fatty acid composition, the α-tocopherol content, the oxidation (TBA value) and the susceptibility to oxidation (FOX value) of rabbit plasma, liver and meat were assessed. The fatty acid composition of rabbit plasma, liver and meat was modified by the dose and source of oil added to feeds, and the dietary supplementation with TA, both by direct incorporation of fatty acids from diets and by the modification of some biosynthetic pathways. Also, liver and meat oxidation and susceptibility to oxidation were altered. Cooking and refrigeration of cooked meat decreased its α-tocoferol content and increased its TBA value. This increase was lower in meats from TA supplemented diets. From the studied diets, the 1.5% linseed oil (plus 1.5% animal fat) and 100 mg/kg of TA was the diet that produced meat with a more nutritionally favorable fatty acid composition and a better oxidative stability. In a second study, the effects of the addition of oils with a different oxidation level (not oxidized, high content of primary oxidation compounds or high content of secondary oxidation compounds) to rabbit feeds on the fatty acid composition, α-tocopherol content, oxidation (TBA value) and susceptibility to oxidation (FOX value) were assessed. Also, the effects of the dietary supplementation with TA and zinc were assessed. The incorporation of oxidized oils to feeds did not substantially alter the fatty acid composition of rabbit plasma, liver and meat, but when oil presented a high content of primary oxidation compounds it led to a reduced α-tocopherol content in rabbit plasma, liver and meat, as well as to an increase in meat susceptibility to oxidation. This was reduced by the dietary supplementation with TA, but it was less effective than when the oil added to feeds was not oxidized or contained a high content of secondary oxidation compounds.