No description available.

Evaluations of the Higher Education Sector are receiving increased attention, due to the rising expenditures and the absence of efficiency enhancing market pressure. To what extent universities are able to eliminate inefficiency is a question that has only partially been answered. This paper argues that heterogeneity among universities as well as persistent inefficiency hinder the institutions to achieve full efficiency - at least in the short run. Two standard and one novel specification of the Stochastic Frontier Analysis are applied to a new, comprehensive set of panel data to show how the standard efficiency evaluation changes when both aspects are taken into account. It is the first time that the idea of persistent inefficiency is considered in the analysis of the German Higher Education Sector. The comparison reveals that the disregard of heterogeneity distorts the estimation results towards lower efficiency values. The newly introduced specification improves the accuracy of the heterogeneity assumption and exposes that inefficiency tends to be long term and persistent rather than short term and residual. This implies that increasing efficiency requires a comprehensive change of the university structure.

Das kolorektale Karzinom (KRK) zählt zu den immunogenen Tumoren und zeichnet sich durch eine ausgeprägte Infiltration von verschiedenen Immunzell-Populationen aus. Dabei scheinen insbesondere CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen Typ 1 das Tumorwachstum zu beeinflussen und spielen somit eine zunehmende Rolle als prognostische Marker. Dementsprechend ergaben sich mehrere Hinweise, dass eine hohe Frequenz dieser beiden T-Zell-Populationen in KRK-Geweben mit einer erhöhten Überlebensrate assoziiert ist. Diese neuen Erkenntnisse könnten zukünftig in die Klassifikation des KRKs einfließen und therapeutische Entscheidungen beeinflussen. Im Gegensatz zu Tumor-infiltrierenden T-Zellen ist jedoch über die Frequenz und die Eigenschaften von nativen humanen dendritischen Zellen (DCs) in Kolonkarzinom-Geweben und deren mögliche Rolle in der immunologischen Abwehr von Tumoren nur sehr wenig bekannt. Als professionelle antigenpräsentierende Zellen spielen DCs eine Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung einer Tumor-gerichteten Immunantwort und können dadurch die Tumorentwicklung wesentlich beeinflussen. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertation erstmalig Frequenz, Verteilung, Reifestatus und Zytokinexpression von 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in Kolonkarzinom-Geweben sowie in korrespondierenden tumorfreien Kolon-Geweben untersucht. SlanDCs stellen eine große Subpopulation von humanen Blut-DCs dar, die nach Aktivierung hohe Konzentrationen von verschiedenen proinflammatorischen Zytokinen sezernieren. Darüber hinaus sind sie effizient in der Lage, die antitumoralen Eigenschaften von CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie von Natürlichen Killer-Zellen zu fördern. Ausgehend von diesen Eigenschaften könnten slanDCs einen Beitrag zur Immunabwehr des Kolonkarzinoms leisten und somit das Tumorwachstum beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen der Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben erbracht. In diesem Zusammenhang konnte eine höhere Frequenz von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) im Vergleich zu den korrespondierenden tumorfreien Geweben (Mittelwert: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) detektiert werden. Des Weiteren wurde eine höhere Dichte von infiltrierenden slanDCs in Kolonkarzinom-Gewebeproben (Mittelwert: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) im Vergleich zu plasmazytoiden DCs (Mittelwert: 4,86 pDCs/mm2, n=20), welche eine andere Subpopulation von humanen DCs im Blut repräsentieren, nachgewiesen. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten verschiedene Immunfluoreszenzfärbungen zur Untersuchung des Reifestatus und der Zytokinexpression der Kolonkarzinom-infiltrierenden slanDCs. Dabei konnten in allen zehn untersuchten Tumorgeweben CD83-exprimierende slanDCs detektiert werden (Mittelwert: 46,7 % CD83+ slanDCs), was auf einen reifen Phänotyp dieser DCs hinweist. Zudem erfolgte der Nachweis einer Interleukin (IL)-23-Expression in variabler Ausprägung durch infiltrierende slanDCs in zehn von elf analysierten Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 33,8 % IL-23+ slanDCs). Dabei stellte sich heraus, dass slanDCs einen wesentlichen Anteil der IL-23-exprimierenden Zellen in einigen untersuchten Gewebeproben darstellen. Eine Expression von Tumornekrosefaktor durch Kolonkarzinom-infiltrierende slanDCs wurde hingegen nur in einer geringen Frequenz detektiert. Weitere Untersuchungen identifizierten slanDCs als neue zelluläre Komponente der T-Zell-Zone von tertiären lymphoiden Strukturen (TLS) der Tumorumgebung des Kolonkarzinoms. Darüber hinaus wies ein deutlicher Anteil der dort lokalisierten slanDCs einen reifen Phänotyp oder eine Expression von IL-23 auf. Ausgehend von diesen neuen Ergebnissen könnten die infiltrierenden slanDCs an der Modulation einer adaptiven Immunantwort in der T-Zell-Zone Kolonkarzinom-assoziierter TLS beteiligt sein und einen Einfluss auf das Tumorwachstum ausüben. Weiterhin könnte die Expression des proinflammatorischen Zytokins IL-23 durch slanDCs im Tumor-umgebenden Stroma und in den TLS eine Induktion IL-17-produzierender Zellen fördern und damit auf eine Beteiligung der slanDCs an einem entzündungsbedingten Fortschreiten der Tumorerkrankung über die IL-23/IL-17-Achse hindeuten. Insgesamt leisten die gewonnenen Erkenntnisse einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von humanen nativen DCs im Kolonkarzinom und könnten die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien in der Behandlung dieser Tumorerkrankung fördern. / Colorectal cancer as an immunogenic tumor is characterized by a marked infiltration of different immune cell populations. Especially CD8+ T-lymphocytes and CD4+ T helper cells type 1 seem to influence tumor growth and therefore play an increasing role as prognostic markers. Thus, it has been shown that high densities of these T cell subsets are associated with improved survival of colorectal cancer patients. These new insights could become part of the classification of colorectal cancer and influence therapeutic decisions. Despite these studies, little is known about the frequency and properties of native human dendritic cells (DCs) in colon cancer tissues and their potential role in antitumor immunity. DCs as professional antigen-presenting cells are critical for the induction and maintenance of antitumor immunity and can essentially influence tumor progression. Thus, the frequency, distribution, maturation, and cytokine expression of 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in colon cancer tissues as well as in corresponding tumor-free colon specimens were investigated. SlanDCs represent a subset of human blood DCs that secrete large amounts of proinflammatory cytokines upon activation. Furthermore slanDCs are able to efficiently activate CD4+ T cells, tumor-reactive CD8 + T cells, and natural killer cells. Due to these functional properties, slanDCs may contribute to antitumor immunity and may influence tumor growth. Within this doctoral thesis the presence of slanDCs in primary colon cancer samples was immunohistochemically verified. In this context, a higher frequency of slanDCs in colon cancer tissues (mean: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) in comparison to the corresponding tumor-free specimens (mean: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) could be detected. Moreover, higher frequencies of infiltrating slanDCs in colon cancer tissues (mean: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) were detectable compared to plasmacytoid DCs (mean: 4,86 pDCs/mm2, n=20), representing another human blood DC-subset. Based on these results, various immunofluorescence stainings were performed to investigate maturation and cytokine expression of the infiltrating slanDCs. SlanDCs expressing the maturation marker CD83 were detected in all 10 analyzed colon cancer tissues (mean: 46,7% CD83+ slanDCs). In addition, IL-23-expressing slanDCs were present at varying percentages in 10 of 11 evaluated colon cancer samples (mean: 33,8% IL-23+ slanDCs). Interestingly, in several tissues slanDCs represented a marked proportion of all IL-23-expressing cells. However, slanDCs expressing tumor necrosis factor could only be detected in low frequencies in the analyzed colon cancer specimens. Further studies revealed that slanDCs are a novel component of the T-cell zone of colon cancer-associated tertiary lymphoid structures (TLS). A proportion of these TLS-associated slanDCs displays a mature phenotype or express IL-23. These novel findings indicate that slanDCs may modulate adaptive immune responses in the T-cell zone of colon cancer-associated TLS and may contribute to the regulation of tumor progression. Furthermore the IL-23-expressing slanDCs in the tumor-surrounding stroma and the TLS may promote the generation of IL-17-producing cells and may participate in inflammation-related cancer progression mediated by the IL-23/IL-17 axis. These novel observations can help to decipher the role of human native DCs in colon cancer and may have implications for the design of therapeutic strategies against this tumor entity.

No description available.

Evaluations of the Higher Education Sector are receiving increased attention, due to the rising expenditures and the absence of efficiency enhancing market pressure. To what extent universities are able to eliminate inefficiency is a question that has only partially been answered. This paper argues that heterogeneity among universities as well as persistent inefficiency hinder the institutions to achieve full efficiency - at least in the short run. Two standard and one novel specification of the Stochastic Frontier Analysis are applied to a new, comprehensive set of panel data to show how the standard efficiency evaluation changes when both aspects are taken into account. It is the first time that the idea of persistent inefficiency is considered in the analysis of the German Higher Education Sector. The comparison reveals that the disregard of heterogeneity distorts the estimation results towards lower efficiency values. The newly introduced specification improves the accuracy of the heterogeneity assumption and exposes that inefficiency tends to be long term and persistent rather than short term and residual. This implies that increasing efficiency requires a comprehensive change of the university structure.

Das kolorektale Karzinom (KRK) zählt zu den immunogenen Tumoren und zeichnet sich durch eine ausgeprägte Infiltration von verschiedenen Immunzell-Populationen aus. Dabei scheinen insbesondere CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen Typ 1 das Tumorwachstum zu beeinflussen und spielen somit eine zunehmende Rolle als prognostische Marker. Dementsprechend ergaben sich mehrere Hinweise, dass eine hohe Frequenz dieser beiden T-Zell-Populationen in KRK-Geweben mit einer erhöhten Überlebensrate assoziiert ist. Diese neuen Erkenntnisse könnten zukünftig in die Klassifikation des KRKs einfließen und therapeutische Entscheidungen beeinflussen. Im Gegensatz zu Tumor-infiltrierenden T-Zellen ist jedoch über die Frequenz und die Eigenschaften von nativen humanen dendritischen Zellen (DCs) in Kolonkarzinom-Geweben und deren mögliche Rolle in der immunologischen Abwehr von Tumoren nur sehr wenig bekannt. Als professionelle antigenpräsentierende Zellen spielen DCs eine Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung einer Tumor-gerichteten Immunantwort und können dadurch die Tumorentwicklung wesentlich beeinflussen. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertation erstmalig Frequenz, Verteilung, Reifestatus und Zytokinexpression von 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in Kolonkarzinom-Geweben sowie in korrespondierenden tumorfreien Kolon-Geweben untersucht. SlanDCs stellen eine große Subpopulation von humanen Blut-DCs dar, die nach Aktivierung hohe Konzentrationen von verschiedenen proinflammatorischen Zytokinen sezernieren. Darüber hinaus sind sie effizient in der Lage, die antitumoralen Eigenschaften von CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie von Natürlichen Killer-Zellen zu fördern. Ausgehend von diesen Eigenschaften könnten slanDCs einen Beitrag zur Immunabwehr des Kolonkarzinoms leisten und somit das Tumorwachstum beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen der Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben erbracht. In diesem Zusammenhang konnte eine höhere Frequenz von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) im Vergleich zu den korrespondierenden tumorfreien Geweben (Mittelwert: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) detektiert werden. Des Weiteren wurde eine höhere Dichte von infiltrierenden slanDCs in Kolonkarzinom-Gewebeproben (Mittelwert: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) im Vergleich zu plasmazytoiden DCs (Mittelwert: 4,86 pDCs/mm2, n=20), welche eine andere Subpopulation von humanen DCs im Blut repräsentieren, nachgewiesen. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten verschiedene Immunfluoreszenzfärbungen zur Untersuchung des Reifestatus und der Zytokinexpression der Kolonkarzinom-infiltrierenden slanDCs. Dabei konnten in allen zehn untersuchten Tumorgeweben CD83-exprimierende slanDCs detektiert werden (Mittelwert: 46,7 % CD83+ slanDCs), was auf einen reifen Phänotyp dieser DCs hinweist. Zudem erfolgte der Nachweis einer Interleukin (IL)-23-Expression in variabler Ausprägung durch infiltrierende slanDCs in zehn von elf analysierten Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 33,8 % IL-23+ slanDCs). Dabei stellte sich heraus, dass slanDCs einen wesentlichen Anteil der IL-23-exprimierenden Zellen in einigen untersuchten Gewebeproben darstellen. Eine Expression von Tumornekrosefaktor durch Kolonkarzinom-infiltrierende slanDCs wurde hingegen nur in einer geringen Frequenz detektiert. Weitere Untersuchungen identifizierten slanDCs als neue zelluläre Komponente der T-Zell-Zone von tertiären lymphoiden Strukturen (TLS) der Tumorumgebung des Kolonkarzinoms. Darüber hinaus wies ein deutlicher Anteil der dort lokalisierten slanDCs einen reifen Phänotyp oder eine Expression von IL-23 auf. Ausgehend von diesen neuen Ergebnissen könnten die infiltrierenden slanDCs an der Modulation einer adaptiven Immunantwort in der T-Zell-Zone Kolonkarzinom-assoziierter TLS beteiligt sein und einen Einfluss auf das Tumorwachstum ausüben. Weiterhin könnte die Expression des proinflammatorischen Zytokins IL-23 durch slanDCs im Tumor-umgebenden Stroma und in den TLS eine Induktion IL-17-produzierender Zellen fördern und damit auf eine Beteiligung der slanDCs an einem entzündungsbedingten Fortschreiten der Tumorerkrankung über die IL-23/IL-17-Achse hindeuten. Insgesamt leisten die gewonnenen Erkenntnisse einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von humanen nativen DCs im Kolonkarzinom und könnten die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien in der Behandlung dieser Tumorerkrankung fördern.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das humane Immunsystem 1 1.2 Dendritische Zellen 2 1.2.1 Phänotyp und Funktion dendritischer Zellen 3 1.2.2 Aktivierung von T-Lymphozyten durch dendritische Zellen 4 1.2.3 Subpopulationen humaner dendritischer Zellen 6 1.3 Interaktion von Immunsystem und Tumor 8 1.4 Infiltration von Tumoren durch Immunzellen 10 1.5 Kolonkarzinome 11 1.5.1 Entwicklung, Charakteristika und Klassifikation kolorektaler Karzinome 12 1.5.2 Therapieansätze des Kolonkarzinoms 14 1.6 Zielstellung 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Material 19 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 19 2.1.2 Lösungen und Puffer 19 2.1.3 Testkitsysteme 19 2.1.4 Antikörper zur Detektion von Oberflächenmolekülen 20 2.1.5 Seren 20 2.1.6 Geräte 21 2.1.7 Sonstige Materialien 21 2.1.8 Gewebeproben 21 2.2 Methoden 23 2.2.1 Vorbereitung der Gewebeproben zur Immunmarkierung 23 2.2.2 Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben 24 2.2.3 Untersuchung der Zytokinexpression von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben mit Fluoreszenzfärbungen 25 2.2.4 Nachweis der Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben mit einer Fluoreszenzfärbung 26 2.2.5 Analyse einer Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.6 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.7 Nachweis der Expression von CD83 und Interleukin-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 28 2.2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und in tumorfreien Kolon-Geweben 29 2.2.9 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 31 3.2 Assoziation der ermittelten Frequenz infiltrierender slanDCs mit der TNM-Klassifikation des Kolonkarzinoms 37 3.3 Nachweis von pDCs in Kolonkarzinom-Geweben 39 3.4 Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 42 3.5 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 44 3.6 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 47 3.7 Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 50 3.8 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 51 3.9 Expression von CD83 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 54 3.10 Expression von IL-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 56 4 Diskussion 57 4.1 DCs als zentrale Mediatoren einer Tumor-gerichteten Immunantwort 57 4.2 DCs als Komponente des Immunzellinfiltrats im Kolonkarzinom 58 4.2.1 Immunhistochemischer Nachweis von DCs in Kolonkarzinom-Geweben 58 4.2.2 Zielstrukturen eingesetzter Antikörper in immunhistochemischen Färbungen von DCs 60 4.2.3 SlanDCs als DC-Subpopulation in Kolonkarzinom-Geweben 61 4.3 Phänotyp infiltrierender slanDCs im Kolonkarzinom 64 4.3.1 Expression von CD83 durch slanDCs 64 4.3.2 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs 67 4.3.3 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs 69 4.4 SlanDCs als Komponente von tertiären lymphoiden Strukturen im Kolonkarzinom 71 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 Anlage 1 91 Anlage 2 92 Danksagung 93 / Colorectal cancer as an immunogenic tumor is characterized by a marked infiltration of different immune cell populations. Especially CD8+ T-lymphocytes and CD4+ T helper cells type 1 seem to influence tumor growth and therefore play an increasing role as prognostic markers. Thus, it has been shown that high densities of these T cell subsets are associated with improved survival of colorectal cancer patients. These new insights could become part of the classification of colorectal cancer and influence therapeutic decisions. Despite these studies, little is known about the frequency and properties of native human dendritic cells (DCs) in colon cancer tissues and their potential role in antitumor immunity. DCs as professional antigen-presenting cells are critical for the induction and maintenance of antitumor immunity and can essentially influence tumor progression. Thus, the frequency, distribution, maturation, and cytokine expression of 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in colon cancer tissues as well as in corresponding tumor-free colon specimens were investigated. SlanDCs represent a subset of human blood DCs that secrete large amounts of proinflammatory cytokines upon activation. Furthermore slanDCs are able to efficiently activate CD4+ T cells, tumor-reactive CD8 + T cells, and natural killer cells. Due to these functional properties, slanDCs may contribute to antitumor immunity and may influence tumor growth. Within this doctoral thesis the presence of slanDCs in primary colon cancer samples was immunohistochemically verified. In this context, a higher frequency of slanDCs in colon cancer tissues (mean: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) in comparison to the corresponding tumor-free specimens (mean: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) could be detected. Moreover, higher frequencies of infiltrating slanDCs in colon cancer tissues (mean: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) were detectable compared to plasmacytoid DCs (mean: 4,86 pDCs/mm2, n=20), representing another human blood DC-subset. Based on these results, various immunofluorescence stainings were performed to investigate maturation and cytokine expression of the infiltrating slanDCs. SlanDCs expressing the maturation marker CD83 were detected in all 10 analyzed colon cancer tissues (mean: 46,7% CD83+ slanDCs). In addition, IL-23-expressing slanDCs were present at varying percentages in 10 of 11 evaluated colon cancer samples (mean: 33,8% IL-23+ slanDCs). Interestingly, in several tissues slanDCs represented a marked proportion of all IL-23-expressing cells. However, slanDCs expressing tumor necrosis factor could only be detected in low frequencies in the analyzed colon cancer specimens. Further studies revealed that slanDCs are a novel component of the T-cell zone of colon cancer-associated tertiary lymphoid structures (TLS). A proportion of these TLS-associated slanDCs displays a mature phenotype or express IL-23. These novel findings indicate that slanDCs may modulate adaptive immune responses in the T-cell zone of colon cancer-associated TLS and may contribute to the regulation of tumor progression. Furthermore the IL-23-expressing slanDCs in the tumor-surrounding stroma and the TLS may promote the generation of IL-17-producing cells and may participate in inflammation-related cancer progression mediated by the IL-23/IL-17 axis. These novel observations can help to decipher the role of human native DCs in colon cancer and may have implications for the design of therapeutic strategies against this tumor entity.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das humane Immunsystem 1 1.2 Dendritische Zellen 2 1.2.1 Phänotyp und Funktion dendritischer Zellen 3 1.2.2 Aktivierung von T-Lymphozyten durch dendritische Zellen 4 1.2.3 Subpopulationen humaner dendritischer Zellen 6 1.3 Interaktion von Immunsystem und Tumor 8 1.4 Infiltration von Tumoren durch Immunzellen 10 1.5 Kolonkarzinome 11 1.5.1 Entwicklung, Charakteristika und Klassifikation kolorektaler Karzinome 12 1.5.2 Therapieansätze des Kolonkarzinoms 14 1.6 Zielstellung 17 2 Material und Methoden 19 2.1 Material 19 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 19 2.1.2 Lösungen und Puffer 19 2.1.3 Testkitsysteme 19 2.1.4 Antikörper zur Detektion von Oberflächenmolekülen 20 2.1.5 Seren 20 2.1.6 Geräte 21 2.1.7 Sonstige Materialien 21 2.1.8 Gewebeproben 21 2.2 Methoden 23 2.2.1 Vorbereitung der Gewebeproben zur Immunmarkierung 23 2.2.2 Immunhistochemischer Nachweis von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben 24 2.2.3 Untersuchung der Zytokinexpression von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben und tumorfreien Kolon-Geweben mit Fluoreszenzfärbungen 25 2.2.4 Nachweis der Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben mit einer Fluoreszenzfärbung 26 2.2.5 Analyse einer Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.6 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 26 2.2.7 Nachweis der Expression von CD83 und Interleukin-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 28 2.2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen von slanDCs und pDCs in Kolonkarzinom-Geweben und in tumorfreien Kolon-Geweben 29 2.2.9 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 31 3.2 Assoziation der ermittelten Frequenz infiltrierender slanDCs mit der TNM-Klassifikation des Kolonkarzinoms 37 3.3 Nachweis von pDCs in Kolonkarzinom-Geweben 39 3.4 Expression von CD83 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 42 3.5 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 44 3.6 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben 47 3.7 Kolokalisation von slanDCs und CD3+ T-Lymphozyten in Kolonkarzinom-Geweben 50 3.8 Detektion von slanDCs in tertiären lymphoiden Strukturen von Kolonkarzinom-Geweben 51 3.9 Expression von CD83 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 54 3.10 Expression von IL-23 durch slanDCs in TLS von Kolonkarzinom-Geweben 56 4 Diskussion 57 4.1 DCs als zentrale Mediatoren einer Tumor-gerichteten Immunantwort 57 4.2 DCs als Komponente des Immunzellinfiltrats im Kolonkarzinom 58 4.2.1 Immunhistochemischer Nachweis von DCs in Kolonkarzinom-Geweben 58 4.2.2 Zielstrukturen eingesetzter Antikörper in immunhistochemischen Färbungen von DCs 60 4.2.3 SlanDCs als DC-Subpopulation in Kolonkarzinom-Geweben 61 4.3 Phänotyp infiltrierender slanDCs im Kolonkarzinom 64 4.3.1 Expression von CD83 durch slanDCs 64 4.3.2 Expression von Interleukin-23 durch slanDCs 67 4.3.3 Expression von Tumornekrosefaktor durch slanDCs 69 4.4 SlanDCs als Komponente von tertiären lymphoiden Strukturen im Kolonkarzinom 71 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 Anlage 1 91 Anlage 2 92 Danksagung 93

Despite measures on the European level to increase the compatibility between the HE sectors of the member states, the recent literature exposes variations in their efficiencies. To gain insights into these differences we split the efficiency term according to the two management levels each university is confronted with. Utilizing a recent advancement in the method to measure efficiency, we separate short-term (transient) and long-term (persistent) efficiency, while controlling for unobserved institution specific heterogeneity. While the first term reflects the efficiency of the individual universities working within the country, the second term echoes the influence of the country specific overall HE structure. The cross-country comparison displays if the overall efficiency difference between countries is related to individual performance of their universities or their HE structure. This allows more purposeful policy recommendation and expands the literature regarding the efficiency of universities in a fundamental way. Choosing Italy and Germany as two important illustrative examples we can take advantage of a novel dataset including characteristics of institutions in both countries for an exceptional long period of time from 2001 to 2011. We show that the Italian universities exhibit a higher overall efficiency value than their German counterparts. With the individual universities working at the upper bound of efficiency in both countries, the overall inefficiency as well as the gap between the countries is caused by persistent, structural inefficiency. To expedite a true European Area of Higher Education future measures should hence aim at the country specific structure, not solely at affecting the activities of single universities.

The switch to unleaded fuels in the 1970s and the high air pollution in areas of high population density due to traffic particularly since the 1990s required the use of alternative fuel additives to achieve an improvement of the combustion. The utilization of oxygenated hydrocarbons as antiknock additives and so-called oxygenates provided a more complete and efficient combustion with simultaneously less harmful and polluting emissions. These include the synthetic ethers methyl tert-butyl ether (MTBE), ethyl tert-butyl ether (ETBE), tert-amyl methyl ether (TAME) and tert-amyl ethyl ether (TAEE). MTBE has a particular position as within some years it became the dominant oxygenate worldwide. Since then, over 100.000 leakages, most often in close proximity to gas stations, resulted in just as many oxygenate-contaminated sites of soil and groundwater within few years. The high water solubility of these ethers leads to an especially fast and extensive spread of the contamination plumes. Ether-contaminated groundwater has a turpentine-like taste that is noticed already in really low concentrations. Thus, such water can no longer serve as drinking water and requires a counter-measure. The chemical parameters of oxygenates decrease the efficiency of otherwise successfully applied techniques such as adsorption or aeration. In addition the ethers proved recalcitrant against microbial attack. The search for microorganisms that could degrade these synthetic oxygenates indeed resulted in the enrichment of many isolates. The majority of these isolates oxidize the ethers in a cometabolic manner either partially or completely to CO2. However, only few cultures are capable of independent growth on these oxygenates. These include the beta-proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 and Aquincola tertiaricarbonis L108, of which the latter is of particular interest for the present work. Strain L108 is characterized by good growth on MTBE and is presently the only known isolate which is able to mineralize ETBE, TAME and TAEE at similar rates. This work examined the seemingly particularly well adapted oxygenate ether metabolism of strain L108, that was formerly isolated from an aquifer highly contaminated with MTBE. Via diverse deletion studies key enzymes of the degradative metabolism and their genetic background were clearly identified. Hence, the results of this work contribute to verify so far just hypothesized metabolic steps by detailed enzymatic and genetic studies. Based on detected metabolites, first studies on MTBE biodegradation already postulated an oxidative pathway via TBA, 2-methyl-1,2-propane-diol (MPD) and 2-HIBA. In case of a monoxygenatic hydroxylation of the methoxy group of MTBE a hemiacetale results as reaction product, from which the tertiary alcohol TBA can be formed easily in subsequent reactions. By comparing wild type strain L108 with the spontaneous mutant strain L10, we were now able to clearly show that the cytochrome P-450 monoxygenase system EthABCD accounts solely for this MTBE-oxidizing activity. It is also the only enzyme catalyzing the corresponding hydroxylation of ETBE, TAME and TAEE. In strain L108 this enzyme complex is expressed constitutively. TBA, which is also generated from hydroxylation of ETBE, is, as postulated and verified by this study, degraded by a different monoxygenase resulting in MPD. Via Tn5-mediated mutations this enzyme was confirmed as Rieske non-heme mononuclear iron monooxygenase MdpJ. MPD is further altered to the corresponding branched acid 2-HIBA, presumably by two dehydrogenation reactions. For the degradation of 2-HIBA, diverse hypotheses exist on the basis of known enzymatic reactions. Another Tn5 mutation now gave evidence, that in the mentioned beta-proteobacteria the novel mutase HcmAB linearizes 2-HIBA to 3-hydroxybutyric acid (3-HB) dependent on cobalamin and coenzyme A (CoA). Sequence comparison revealed, that strain L108 acquired all three key enzyme complexes, EthABCD, MdpJ and HcmAB via horizontal gene transfer (HGT). For TAME and TAEE a completely new degradation pathway was found. In strain L108, the resulting degradation product tert-amyl alcohol (TAA) of these ethers is, like TBA, also specifically oxidized by MdpJ. In Tn5-deletion studies and metabolite analyzes, however, no hydroxylation could be detected. Instead, TAA is rather desaturated. Therefore within the metabolism no diols or acids analogue to MPD or 2-HIBA were formed. Instead, via MdpJ TAA is initially degraded to the unsaturated tertiary alcohol and hemiterpene 2-methyl-3-butene-2-ol. Prenol (3-methyl-2-buten-2-ol), prenal (3-methyl-2-buten-2-al) and 3-methyl crotonic acid were detected as additional metabolites. Hence, an isomerization of the branched acid by HcmAB is apparently irrelevant in TAA biodegradation. Accordingly it could be shown, that deletion mutants for HcmAB indeed could not grow on TBA, but are still able to grow on TAA, just as fast as the wild type, in fact. The tertiary alcohol 2-methyl-3-butene-2-ol is presumably transformed via another isomerase resulting in the primary alcohol prenol. Prenol is further oxidized by postulated dehydrogenases to 3-methyl crotonic acid. This would also be in correlation to the already observed degradation pathway of the monoterpene linalool in other bacteria. However, the responsible enzymes in strain L108 are not yet identified. Besides this principal gain of knowledge in the degradation of xenobiotic ether structures and the evolution of degradative microorganism, the now confirmed key enzymes EthB, MdpJ and HcmAB, respectively their coding genes, can be used as specific markers to monitor natural degradation processes in in situ studies. On this basis, the presence of active microorganisms and additionally - derived from the confirmed single key enzymes - a potentially complete degradation can be concluded. In the long run, it might be possible to stimulate the natural microbiological activity, e.g. via bioaugmentation with degradation specialists. Furthermore, regarding the potential progress of remediation procedures, potentially limiting steps can be distinguished via respective markers and narrowed down as possible cause of deficient degradation activity. However, such function-based monitoring requires specific verification. Therefore, subsequent studies have to analyze, if there is a sequence diversity among these three key enzymes. Previous sequence comparisons hypothesize that up to 60% accordance in the protein sequence in homologues of MdpJ and HcmA they can still be assumed to possess the same enzymatic function. This diversity has to be considered in the development of specific probes. / Die Einführung bleifreien Benzins in den 1970er-Jahren und die hohe Emissionsbelastung von Ballungszentren durch den Straßenverkehr insbesondere seit den 1990er-Jahren erforderte den Einsatz alternativer Benzinadditive, um eine Verbesserung der Verbrennung zu erreichen. Die Nutzung sauerstoffhaltiger Kohlenwasserstoffe als Antiklopfmittel und als sogenannte Oxygenate bot sich an, da diese eine effizientere Verbrennung mit gleichzeitig niedrigeren gesundheits- und umweltschädigenden Emissionen fördern. Zu den Oxygenaten gehören die synthetischen Ether Methyl-tert-butylether (MTBE), Ethyl-tert-butylether (ETBE), tert-Amylmethylether (TAME) und tert-Amylethylether (TAEE). Eine herausragende Stellung nimmt MTBE ein. Innerhalb weniger Jahre wurde es zum hauptsächlich verwendeten Oxygenat weltweit. Seitdem führten jedoch über 100.000 Leckagen, zumeist in Tankstellennähe, innerhalb weniger Jahre zu ebenso zahlreichen Kontaminationen des Grundwassers mit Oxygenaten. Aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit kommt es dabei zu einer besonders schnellen und großflächigen Ausbreitung der Ether. Derart belastetes Grundwasser weist schon bei geringsten Etherkonzentrationen einen als terpentinartig wahrgenommenen Geruch und Geschmack auf und kann daher nicht mehr als Trinkwasserzufuhr genutzt werden. Es bedarf einer Lösung dieses Problems. Die chemischen Parameter der Ether senken allerdings die Effizienz anderweitig erfolgreich genutzter technischer Sanierungsverfahren auf Basis von z. B. Adsorption oder Aerisierung. Auch gegenüber mikrobiellen Abbau erweisen sie sich als rekalzitrant. Die Suche nach oxygenatabbauenden Mikroorganismen führte zwar zur Anreicherung vieler Isolate, welche die Oxygenate cometabolisch partiell oder sogar komplett oxidieren, nur sehr wenige Kulturen sind aber zu autarkem Wachstum auf diesen Ethern fähig. Dazu gehören die Beta-Proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 und der dieser Arbeit zugrunde liegende Aquincola tertiaricarbonis L108. Der Stamm L108 zeichnet sich durch ein vergleichsweise gutes Wachstum auf MTBE aus und ist als bisher einzig bekanntes Isolat in der Lage, auch ETBE, TAME und TAEE ähnlich schnell zu mineralisieren. Die vorliegende Arbeit handelt von dem scheinbar besonders gut an den Oxygenatabbau adaptierten Stoffwechsel des ursprünglich aus MTBE-kontaminiertem Grundwasser angereicherten Stammes L108. Durch verschiedene Deletionsstudien wurden Schlüsselenzyme des Abbaus und deren genetischer Hintergrund eindeutig identifiziert. Die Ergebnisse der genetischen, enzymatischen und physiologischen Studien des Wildtyps im Vergleich zu den erzeugten Deletionsstämmen tragen dazu bei, bisher nur postulierte Reaktionsschritte zu verifizieren. Schon seit den ersten Studien zum MTBE-Abbau wird anhand markanter Metabolite ein oxidativer Abbau via TBA, 2-Methyl-1,2-propandiol (MPD) und 2-Hydroxyisobuttersäure (2-HIBA) vermutet. Im Fall einer Hydroxylierung der Methoxygruppe von MTBE wird ein Hemiacetal als Reaktionsprodukt erzeugt, aus dem nachfolgend leicht der tertiäre Alkohol TBA entstehen kann. Durch den Vergleich des Wildtyps mit der Spontanmutante Stamm L10 konnte jetzt gezeigt werden, dass hierfür allein das Cytochrom-P450-Monooxygenasesystem EthABCD verantwortlich ist. Dieses katalysiert auch exklusiv die entsprechende Hydroxylierung von ETBE, TAME und TAEE. In Stamm L108 wird das Enzym konstitutiv exprimiert. TBA, das auch aus der Hydroxylierung von ETBE resultiert, wird, wie postuliert und in dieser Arbeit verifiziert, durch eine weitere Monooxygenase zu MPD abgebaut. Durch eine Tn5-Transposon-vermittelte Mutation konnte verifiziert werden, dass es sich bei diesem Enzym um die Rieske-nicht-Häm-Monooxygenase MdpJ handelt. MPD wird im weiteren Verlauf voraussichtlich durch zwei Dehydrogenierungen zur korrespondierenden, verzweigten Säure 2-HIBA gewandelt. Zum 2-HIBA-Abbau gibt es, basierend auf bekannten Enzymreaktionen, diverse Hypothesen. Anhand einer weiteren Tn5-Mutation konnte jetzt bestätigt werden, dass in den genannten beta-Proteobacteria die neuartige Mutase HcmAB wirksam ist, welche 2-HIBA abhängig von Cobalamin und Coenzym A (CoA) zu 3-Hydroxybuttersäure (3-HB) linearisiert. Sequenzvergleiche ergaben, dass Stamm L108 die Schlüsselenzyme des Etherabbaus, EthABCD, MdpJ und HcmAB, durch horizontalen Gentransfer erworben hat. Für TAME und TAEE wurde ein völlig neuer Abbauweg gefunden. In Stamm L108 wird der beim Abbau dieser Ether entstehende tert-Amylalkohol (TAA) wie TBA ebenfalls exklusiv durch MdpJ oxidiert. Durch die Tn5-Deletionsstudien und durch Analyse der Metabolite konnte allerdings keine Hydroxylierung nachgewiesen werden. TAA wird durch MdpJ vielmehr desaturiert. Somit entstehen im Abbauweg keine zu MPD und 2-HIBA analogen Diole und Säuren, sondern TAA wird zunächst durch MdpJ zu einem ungesättigten tertiären Alkohol, dem Hemiterpen 2-Methyl-3-buten-2-ol, abgebaut. Prenol (3-Methyl-2-buten-2-ol), Prenal (3-Methyl-2-buten-2-al) und 3-Methylcrotonsäure wurden als weitere Metabolite des TAA-Stoffwechsels detektiert. Somit spielt eine Isomerisierung einer tertiär verzweigten Säure durch HcmAB im TAA-Abbauweg offensichtlich keine Rolle. Entsprechend konnte gezeigt werden, dass Deletionsmutanten für hcmAB zwar nicht mehr auf TBA, aber immer noch auf TAA wachsen können, und das genauso schnell, wie der Wildtyp. Der tertiäre Alkohol 2-Methyl-3-buten-2-ol wird wahrscheinlich durch eine andere Isomerase zum primären Alkohol Prenol umgewandelt und dieser dann durch Dehydrogenasen zur Methylcrotonsäure oxidiert. Dies würde dem bereits in anderen Bakterien beobachteten Abbauweg des Monoterpens Linalool entsprechen. Die in Stamm L108 dafür verantwortlichen Enzyme wurden aber noch nicht identifiziert. Neben diesem grundsätzlichen Erkenntnisgewinn zum Abbau der xenobiotischen Etherverbindungen und der Evolution degradativer Mikroorganismen, können die hier bestätigten Schlüssel-enzyme EthABCD, MdpJ und HcmAB bzw. deren codierende Gene als spezifische Marker zum Monitoring natürlicher Abbauprozesse für in-situ-Untersuchungen genutzt werden. Auf dieser Basis kann auf die Anwesenheit aktiver Mikroorganismen und zudem noch - abgeleitet aus der Präsenz der einzelnen Schlüsselenzyme - auf einen potenziell kompletten Abbau geschlossen werden. Darauf aufbauend kann die natürliche mikrobiologische Aktivität durch nachfolgende biotechnologische Maßnahmen stimuliert werden, zum Beispiel durch eine Bioaugmentation mit Abbauspezialisten. Des weiteren können mögliche limitierende Schritte hinsichtlich des potenziellen Verlaufs der Sanierungsmaßnahme über Präsenztiter der betreffenden Marker gezielter verfolgt und als etwaige Ursachen defizitärer Abbauleistungen eingegrenzt werden. Voraussetzung für dieses funktionsbasierte Monitoring ist allerdings der spezifische Nachweis. Somit sollte in nachfolgenden Studien analysiert werden, ob es bei den drei Schlüsselenzymen eine Sequenzdiversität gibt. Die bisherigen Sequenzvergleiche lassen zumindest vermuten, dass bis etwa 60% Übereinstimmung der Proteinsequenzen bei Homologen von MdpJ und HcmA noch mit der gleichen Enzymfunktion zu rechnen ist. Diese Diversität sollte bei der Entwicklung von spezifischen Sonden berücksichtigt werden.

Three advanced methodologies for the preparation of extremely sterically hindered tertiary alkyl amines have been developed. The syntheses of 28 novel tertiary alkylamines that accommodate unusual steric hindrance are detailed. The electrophilic amination of alkyl Grignard reagents with N-chlorodialkylamines, in the presence of N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine (TMEDA) as a key additive, gives a variety of unprecedentedly sterically hindered tertiary alkylamines in good yields. Alternative strategy to 1-adamantyl-substituted (1-Ad) sterically hindered tertiary amines, which involved instead an SN1 reaction between 1-Ad cation with various secondary amines, is described. A complementary strategy to 1-Ad-based sterically hindered tertiary amines, which involves an iminium salt intermediate, is also reported. Salient features of the three protocols that are detailed here include unusual tolerance of steric hindrance, mild reaction conditions employed, ease of product isolation-purification, and absence of catalysts/transition metals. The molecular structures of two faithful examples of extremely sterically hindered tertiary alkylamines were determined by single crystal X-ray diffraction, and the height “h” of nitrogen pyramid of these compounds were measured. The NMR spectra show a restriction in rotation at room temperature among many hindered tertiary amines, and some of them exhibit two complete sets of peaks for two non-equivalent rotamers at room temperature. 15N NMR has been applied to study the structural changes in highly sterically hindered tertiary amines. Most of these compounds have been shown to undergo Hofmann type elimination reaction upon thermolysis at 100 degree in inert solvents, like toluene. / In der vorliegenden Arbeit wurden drei Methoden zur Synthese von tertitären Aminen mit extremer sterischer Hinderung entwickelt und zur Synthese von 28 neuen tertiären Alkylaminen mit entsprechender sterischer Hinderung angewendet. Die elektrophile Aminierung von Grignard-Reagenzien mit N-Chlordialkylaminen, unter Zusatz von N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TMEDA) als Schlüsselkomponente, ermöglicht einen einfachen Zugang zu einer Vielzahl von tertiären Aminen mit extremer sterischer Hinderung mit guten Ausbeuten. Eine alternative Synthesestrategie unter SN1-Bedingungen führt zu sterisch-gehinderten 1-Adamantyl-substituierten (1-Ad) tertiären Aminen durch die Reaktion eines 1-Ad-Kations mit unterschiedlichen sterisch-gehinderten sekundären Aminen. Angelehnt an die zuvor beschriebene Reaktion können auch sterisch gehinderte Imine über eine Iminium-Salz-Zwischenstufe zu sterisch-gehinderten 1-Ad-substituierten tertiären Aminen umgesetzt werden. Auch in diesen Fall zeichnet sich die Reaktion durch eine bemerkenswerte Toleranz gegenüber sterischer Hinderung, milden Reaktionsbedingungen, leichte Produktisolierbarkeit und die Abwesenheit von Übergangsmetallkatalysatoren aus. Die molekulare Struktur zweier repräsentativer tertiärer Alkylamine mit extremer sterischer Hinderung wurde mittels Röntgeneinkristallstrukturanalyse untersucht und die Höhe “h” ihrer Stickstoff-Pyramide bestimmt. Die NMR-Spektren zeigen bei RT eine Einschränkung der freien Rotation um die N-C-Bindungsachse, teilweise führt dies zu vollständig getrennten Signalsätzen für die einzelnen Rotamere. 15N-NMR-Spektroskopie wurde ebenfalls zur Untersuchung von Strukturveränderungen genutzt. In inerten Lösungsmitteln, wie Toluol, zeigen die Verbindungen bei 100 °C in den meisten Fällen eine Hofmann-Eliminierung.

The switch to unleaded fuels in the 1970s and the high air pollution in areas of high population density due to traffic particularly since the 1990s required the use of alternative fuel additives to achieve an improvement of the combustion. The utilization of oxygenated hydrocarbons as antiknock additives and so-called oxygenates provided a more complete and efficient combustion with simultaneously less harmful and polluting emissions. These include the synthetic ethers methyl tert-butyl ether (MTBE), ethyl tert-butyl ether (ETBE), tert-amyl methyl ether (TAME) and tert-amyl ethyl ether (TAEE). MTBE has a particular position as within some years it became the dominant oxygenate worldwide. Since then, over 100.000 leakages, most often in close proximity to gas stations, resulted in just as many oxygenate-contaminated sites of soil and groundwater within few years. The high water solubility of these ethers leads to an especially fast and extensive spread of the contamination plumes. Ether-contaminated groundwater has a turpentine-like taste that is noticed already in really low concentrations. Thus, such water can no longer serve as drinking water and requires a counter-measure. The chemical parameters of oxygenates decrease the efficiency of otherwise successfully applied techniques such as adsorption or aeration. In addition the ethers proved recalcitrant against microbial attack. The search for microorganisms that could degrade these synthetic oxygenates indeed resulted in the enrichment of many isolates. The majority of these isolates oxidize the ethers in a cometabolic manner either partially or completely to CO2. However, only few cultures are capable of independent growth on these oxygenates. These include the beta-proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 and Aquincola tertiaricarbonis L108, of which the latter is of particular interest for the present work. Strain L108 is characterized by good growth on MTBE and is presently the only known isolate which is able to mineralize ETBE, TAME and TAEE at similar rates. This work examined the seemingly particularly well adapted oxygenate ether metabolism of strain L108, that was formerly isolated from an aquifer highly contaminated with MTBE. Via diverse deletion studies key enzymes of the degradative metabolism and their genetic background were clearly identified. Hence, the results of this work contribute to verify so far just hypothesized metabolic steps by detailed enzymatic and genetic studies. Based on detected metabolites, first studies on MTBE biodegradation already postulated an oxidative pathway via TBA, 2-methyl-1,2-propane-diol (MPD) and 2-HIBA. In case of a monoxygenatic hydroxylation of the methoxy group of MTBE a hemiacetale results as reaction product, from which the tertiary alcohol TBA can be formed easily in subsequent reactions. By comparing wild type strain L108 with the spontaneous mutant strain L10, we were now able to clearly show that the cytochrome P-450 monoxygenase system EthABCD accounts solely for this MTBE-oxidizing activity. It is also the only enzyme catalyzing the corresponding hydroxylation of ETBE, TAME and TAEE. In strain L108 this enzyme complex is expressed constitutively. TBA, which is also generated from hydroxylation of ETBE, is, as postulated and verified by this study, degraded by a different monoxygenase resulting in MPD. Via Tn5-mediated mutations this enzyme was confirmed as Rieske non-heme mononuclear iron monooxygenase MdpJ. MPD is further altered to the corresponding branched acid 2-HIBA, presumably by two dehydrogenation reactions. For the degradation of 2-HIBA, diverse hypotheses exist on the basis of known enzymatic reactions. Another Tn5 mutation now gave evidence, that in the mentioned beta-proteobacteria the novel mutase HcmAB linearizes 2-HIBA to 3-hydroxybutyric acid (3-HB) dependent on cobalamin and coenzyme A (CoA). Sequence comparison revealed, that strain L108 acquired all three key enzyme complexes, EthABCD, MdpJ and HcmAB via horizontal gene transfer (HGT). For TAME and TAEE a completely new degradation pathway was found. In strain L108, the resulting degradation product tert-amyl alcohol (TAA) of these ethers is, like TBA, also specifically oxidized by MdpJ. In Tn5-deletion studies and metabolite analyzes, however, no hydroxylation could be detected. Instead, TAA is rather desaturated. Therefore within the metabolism no diols or acids analogue to MPD or 2-HIBA were formed. Instead, via MdpJ TAA is initially degraded to the unsaturated tertiary alcohol and hemiterpene 2-methyl-3-butene-2-ol. Prenol (3-methyl-2-buten-2-ol), prenal (3-methyl-2-buten-2-al) and 3-methyl crotonic acid were detected as additional metabolites. Hence, an isomerization of the branched acid by HcmAB is apparently irrelevant in TAA biodegradation. Accordingly it could be shown, that deletion mutants for HcmAB indeed could not grow on TBA, but are still able to grow on TAA, just as fast as the wild type, in fact. The tertiary alcohol 2-methyl-3-butene-2-ol is presumably transformed via another isomerase resulting in the primary alcohol prenol. Prenol is further oxidized by postulated dehydrogenases to 3-methyl crotonic acid. This would also be in correlation to the already observed degradation pathway of the monoterpene linalool in other bacteria. However, the responsible enzymes in strain L108 are not yet identified. Besides this principal gain of knowledge in the degradation of xenobiotic ether structures and the evolution of degradative microorganism, the now confirmed key enzymes EthB, MdpJ and HcmAB, respectively their coding genes, can be used as specific markers to monitor natural degradation processes in in situ studies. On this basis, the presence of active microorganisms and additionally - derived from the confirmed single key enzymes - a potentially complete degradation can be concluded. In the long run, it might be possible to stimulate the natural microbiological activity, e.g. via bioaugmentation with degradation specialists. Furthermore, regarding the potential progress of remediation procedures, potentially limiting steps can be distinguished via respective markers and narrowed down as possible cause of deficient degradation activity. However, such function-based monitoring requires specific verification. Therefore, subsequent studies have to analyze, if there is a sequence diversity among these three key enzymes. Previous sequence comparisons hypothesize that up to 60% accordance in the protein sequence in homologues of MdpJ and HcmA they can still be assumed to possess the same enzymatic function. This diversity has to be considered in the development of specific probes.:Bibliographische Darstellung Eidesstattliche Erklärung Danksagung Abstract Kurzfassung Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Tertiäre Ether als Benzin-Oxygenate - Hintergrund und Umweltproblematik 1.2. Mikrobiologischer Abbau tertiärer Ether 1.3. Postulierter Abbauweg 1.4. Monitoring-Tools für biologischen Abbau 1.5. Ziel dieser Arbeit 1.6. Referenzen der Einleitung 2. Die initiale Etherspaltung des Stammes L108 2.1. Die Ethermonooxygenase EthB 2.2. Supplemental Material 3. Die spezifische Alkoholmonooxygenase MdpJ 3.1. Die Alkoholmonooxygenase MdpJ als Hydroxylase und Reduktase 3.2. Supplemental Material 4. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB des Stammes L108 4.1. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB 4.2. Supplemental Material 5. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.1. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.2. Supplemental Material 6. Diskussion 6.1. Nachweis der Schlüsselenzyme in Stamm L108 durch Mutation 6.2. Nutzen für den Nachweis natürlichen Abbaus 6.3. Der TAA-Metabolismus als neuartiger Abbauweg 6.4. Mikrobiologische Anpassung an Xenobiotika am Beispiel MTBE 6.5. Ausblick 6.6. Referenzen der Diskussion Anhang Curriculum Vitae Publikationsverzeichnis Tagungsbeiträge Nachweis über Anteile der Co-Autoren / Die Einführung bleifreien Benzins in den 1970er-Jahren und die hohe Emissionsbelastung von Ballungszentren durch den Straßenverkehr insbesondere seit den 1990er-Jahren erforderte den Einsatz alternativer Benzinadditive, um eine Verbesserung der Verbrennung zu erreichen. Die Nutzung sauerstoffhaltiger Kohlenwasserstoffe als Antiklopfmittel und als sogenannte Oxygenate bot sich an, da diese eine effizientere Verbrennung mit gleichzeitig niedrigeren gesundheits- und umweltschädigenden Emissionen fördern. Zu den Oxygenaten gehören die synthetischen Ether Methyl-tert-butylether (MTBE), Ethyl-tert-butylether (ETBE), tert-Amylmethylether (TAME) und tert-Amylethylether (TAEE). Eine herausragende Stellung nimmt MTBE ein. Innerhalb weniger Jahre wurde es zum hauptsächlich verwendeten Oxygenat weltweit. Seitdem führten jedoch über 100.000 Leckagen, zumeist in Tankstellennähe, innerhalb weniger Jahre zu ebenso zahlreichen Kontaminationen des Grundwassers mit Oxygenaten. Aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit kommt es dabei zu einer besonders schnellen und großflächigen Ausbreitung der Ether. Derart belastetes Grundwasser weist schon bei geringsten Etherkonzentrationen einen als terpentinartig wahrgenommenen Geruch und Geschmack auf und kann daher nicht mehr als Trinkwasserzufuhr genutzt werden. Es bedarf einer Lösung dieses Problems. Die chemischen Parameter der Ether senken allerdings die Effizienz anderweitig erfolgreich genutzter technischer Sanierungsverfahren auf Basis von z. B. Adsorption oder Aerisierung. Auch gegenüber mikrobiellen Abbau erweisen sie sich als rekalzitrant. Die Suche nach oxygenatabbauenden Mikroorganismen führte zwar zur Anreicherung vieler Isolate, welche die Oxygenate cometabolisch partiell oder sogar komplett oxidieren, nur sehr wenige Kulturen sind aber zu autarkem Wachstum auf diesen Ethern fähig. Dazu gehören die Beta-Proteobacteria Methylibium petroleiphilum PM1 und der dieser Arbeit zugrunde liegende Aquincola tertiaricarbonis L108. Der Stamm L108 zeichnet sich durch ein vergleichsweise gutes Wachstum auf MTBE aus und ist als bisher einzig bekanntes Isolat in der Lage, auch ETBE, TAME und TAEE ähnlich schnell zu mineralisieren. Die vorliegende Arbeit handelt von dem scheinbar besonders gut an den Oxygenatabbau adaptierten Stoffwechsel des ursprünglich aus MTBE-kontaminiertem Grundwasser angereicherten Stammes L108. Durch verschiedene Deletionsstudien wurden Schlüsselenzyme des Abbaus und deren genetischer Hintergrund eindeutig identifiziert. Die Ergebnisse der genetischen, enzymatischen und physiologischen Studien des Wildtyps im Vergleich zu den erzeugten Deletionsstämmen tragen dazu bei, bisher nur postulierte Reaktionsschritte zu verifizieren. Schon seit den ersten Studien zum MTBE-Abbau wird anhand markanter Metabolite ein oxidativer Abbau via TBA, 2-Methyl-1,2-propandiol (MPD) und 2-Hydroxyisobuttersäure (2-HIBA) vermutet. Im Fall einer Hydroxylierung der Methoxygruppe von MTBE wird ein Hemiacetal als Reaktionsprodukt erzeugt, aus dem nachfolgend leicht der tertiäre Alkohol TBA entstehen kann. Durch den Vergleich des Wildtyps mit der Spontanmutante Stamm L10 konnte jetzt gezeigt werden, dass hierfür allein das Cytochrom-P450-Monooxygenasesystem EthABCD verantwortlich ist. Dieses katalysiert auch exklusiv die entsprechende Hydroxylierung von ETBE, TAME und TAEE. In Stamm L108 wird das Enzym konstitutiv exprimiert. TBA, das auch aus der Hydroxylierung von ETBE resultiert, wird, wie postuliert und in dieser Arbeit verifiziert, durch eine weitere Monooxygenase zu MPD abgebaut. Durch eine Tn5-Transposon-vermittelte Mutation konnte verifiziert werden, dass es sich bei diesem Enzym um die Rieske-nicht-Häm-Monooxygenase MdpJ handelt. MPD wird im weiteren Verlauf voraussichtlich durch zwei Dehydrogenierungen zur korrespondierenden, verzweigten Säure 2-HIBA gewandelt. Zum 2-HIBA-Abbau gibt es, basierend auf bekannten Enzymreaktionen, diverse Hypothesen. Anhand einer weiteren Tn5-Mutation konnte jetzt bestätigt werden, dass in den genannten beta-Proteobacteria die neuartige Mutase HcmAB wirksam ist, welche 2-HIBA abhängig von Cobalamin und Coenzym A (CoA) zu 3-Hydroxybuttersäure (3-HB) linearisiert. Sequenzvergleiche ergaben, dass Stamm L108 die Schlüsselenzyme des Etherabbaus, EthABCD, MdpJ und HcmAB, durch horizontalen Gentransfer erworben hat. Für TAME und TAEE wurde ein völlig neuer Abbauweg gefunden. In Stamm L108 wird der beim Abbau dieser Ether entstehende tert-Amylalkohol (TAA) wie TBA ebenfalls exklusiv durch MdpJ oxidiert. Durch die Tn5-Deletionsstudien und durch Analyse der Metabolite konnte allerdings keine Hydroxylierung nachgewiesen werden. TAA wird durch MdpJ vielmehr desaturiert. Somit entstehen im Abbauweg keine zu MPD und 2-HIBA analogen Diole und Säuren, sondern TAA wird zunächst durch MdpJ zu einem ungesättigten tertiären Alkohol, dem Hemiterpen 2-Methyl-3-buten-2-ol, abgebaut. Prenol (3-Methyl-2-buten-2-ol), Prenal (3-Methyl-2-buten-2-al) und 3-Methylcrotonsäure wurden als weitere Metabolite des TAA-Stoffwechsels detektiert. Somit spielt eine Isomerisierung einer tertiär verzweigten Säure durch HcmAB im TAA-Abbauweg offensichtlich keine Rolle. Entsprechend konnte gezeigt werden, dass Deletionsmutanten für hcmAB zwar nicht mehr auf TBA, aber immer noch auf TAA wachsen können, und das genauso schnell, wie der Wildtyp. Der tertiäre Alkohol 2-Methyl-3-buten-2-ol wird wahrscheinlich durch eine andere Isomerase zum primären Alkohol Prenol umgewandelt und dieser dann durch Dehydrogenasen zur Methylcrotonsäure oxidiert. Dies würde dem bereits in anderen Bakterien beobachteten Abbauweg des Monoterpens Linalool entsprechen. Die in Stamm L108 dafür verantwortlichen Enzyme wurden aber noch nicht identifiziert. Neben diesem grundsätzlichen Erkenntnisgewinn zum Abbau der xenobiotischen Etherverbindungen und der Evolution degradativer Mikroorganismen, können die hier bestätigten Schlüssel-enzyme EthABCD, MdpJ und HcmAB bzw. deren codierende Gene als spezifische Marker zum Monitoring natürlicher Abbauprozesse für in-situ-Untersuchungen genutzt werden. Auf dieser Basis kann auf die Anwesenheit aktiver Mikroorganismen und zudem noch - abgeleitet aus der Präsenz der einzelnen Schlüsselenzyme - auf einen potenziell kompletten Abbau geschlossen werden. Darauf aufbauend kann die natürliche mikrobiologische Aktivität durch nachfolgende biotechnologische Maßnahmen stimuliert werden, zum Beispiel durch eine Bioaugmentation mit Abbauspezialisten. Des weiteren können mögliche limitierende Schritte hinsichtlich des potenziellen Verlaufs der Sanierungsmaßnahme über Präsenztiter der betreffenden Marker gezielter verfolgt und als etwaige Ursachen defizitärer Abbauleistungen eingegrenzt werden. Voraussetzung für dieses funktionsbasierte Monitoring ist allerdings der spezifische Nachweis. Somit sollte in nachfolgenden Studien analysiert werden, ob es bei den drei Schlüsselenzymen eine Sequenzdiversität gibt. Die bisherigen Sequenzvergleiche lassen zumindest vermuten, dass bis etwa 60% Übereinstimmung der Proteinsequenzen bei Homologen von MdpJ und HcmA noch mit der gleichen Enzymfunktion zu rechnen ist. Diese Diversität sollte bei der Entwicklung von spezifischen Sonden berücksichtigt werden.:Bibliographische Darstellung Eidesstattliche Erklärung Danksagung Abstract Kurzfassung Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Tertiäre Ether als Benzin-Oxygenate - Hintergrund und Umweltproblematik 1.2. Mikrobiologischer Abbau tertiärer Ether 1.3. Postulierter Abbauweg 1.4. Monitoring-Tools für biologischen Abbau 1.5. Ziel dieser Arbeit 1.6. Referenzen der Einleitung 2. Die initiale Etherspaltung des Stammes L108 2.1. Die Ethermonooxygenase EthB 2.2. Supplemental Material 3. Die spezifische Alkoholmonooxygenase MdpJ 3.1. Die Alkoholmonooxygenase MdpJ als Hydroxylase und Reduktase 3.2. Supplemental Material 4. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB des Stammes L108 4.1. Die 2-HIBA-Mutase HcmAB 4.2. Supplemental Material 5. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.1. Der TAA-Abbau des Stammes L108 5.2. Supplemental Material 6. Diskussion 6.1. Nachweis der Schlüsselenzyme in Stamm L108 durch Mutation 6.2. Nutzen für den Nachweis natürlichen Abbaus 6.3. Der TAA-Metabolismus als neuartiger Abbauweg 6.4. Mikrobiologische Anpassung an Xenobiotika am Beispiel MTBE 6.5. Ausblick 6.6. Referenzen der Diskussion Anhang Curriculum Vitae Publikationsverzeichnis Tagungsbeiträge Nachweis über Anteile der Co-Autoren