Einleitung: Die im Genom der Schweine integrierten porzinen endogenen Retroviren (PERV) gehören zu den potentiellen humanpathogenen Erregern, die eines der Risiken bei der Xenotransplantation darstellen. Für die Abschätzung des Infektionsrisikos von PERV sind drei Verfahrensweisen von Bedeutung: Erstens die Evaluierung der PERV-Freisetzung aus porzinen Zellen und Geweben; Zweitens die Etablierung eines In vivo-Infektionsmodells und Drittens ein retrospektives Screenen von Patienten. Methoden: Die PERV-Expression in Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse wurde in vitro und in vivo evaluiert. Anschließend wurde PERV auf nicht-humanen Primatenzellen passagiert. In einem zweiten Modellversuch wurde murinen Zellen in vitro und SCID-Mäusen in vivo zellfreies PERV appliziert. Schließlich wurden Seren von Patienten analysiert. Ergebnisse: Die untersuchten Inselzellen setzten keine Viruspartikel frei und konnten somit weder humane Zellen noch BALB/c-Mäuse infizieren. Die verwendeten Affenzellen produzierten infektiöses PERV mit geringer Replikation. Weder in den murinen Modellversuchen noch in den untersuchten Patienten wurde eine Übertragung von PERV beobachtet. Schlussfolgerung: Schweine der Deutschen Landrasse könnten als Ausgangsbasis für die Zucht sicherer Schweine für die Xenotransplantation dienen. Da keine Infektion verschiedener muriner Zellen mit PERV beobachtet wurde, muss angenommen werden, dass Publikationen anderer Arbeitsgruppen, die eine PERV-Infektion in SCID-Mäusen diagnostizierten, ein falsch-positives Ergebnis aufgrund von Mikrochimärismus oder aufgrund von Pseudotypisierungen mit murinen endogenen Retroviren wiedergeben. Unsere Befunde werden dadurch erhärtet, dass der Rezeptor für PERV-A auf murinen Zellen nicht exprimiert wird und diese auch in vitro nicht infiziert werden konnten. In Übereinstimmung mit den weltweit etwa 200 behandelten Patienten konnte auch in den beiden neuen Studien keine Übertragung von PERV festgestellt werden. / Objective: Porcine endogenous retroviruses (PERVs) are integrated in the porcine genome and are able to infect human cells in vitro. Therefore, PERVs are one of the possible pathogens which poses a risk for xenotransplantations. In this study three significant methods were used to evaluate the infectious risk of PERV: The release of PERV particles from porcine cells and tissues, the formation of an in vivo infection model and a retrospective screening of patients. Methods: Islet cells from german landrace pigs were co-cultivated with human cells in vitro and were transplanted in BALB/c mice in vivo. Serial passaging experiments were performed with nonhuman primate cells. Murine cells were incubated in vitro and SCID mice in vivo with PERV. Sera of patients who were treated ex vivo with porcine liver cells and who had received islet cells were investigated for antibodies against PERV. Results: No virus release were observed in german landrace islet cells, thus they were neither able to infect human cells nor BALB/c mice. The used nonhuman primate cells released low replicating PERVs. None of the murine cells could be infected by PERV and no provirus integration was observed in different SCID mice organs. PERV-specific antibodies were found in none of the investigated patients. Conclusion: German landrace pigs could be used as a source for breeding safe genetically modified pigs suitable for xenotransplantation. Since there were no detectable PERV infection of different murine cells and SCID mice, it have to be supposed, that previously reported PERV transmissions to SCID mice might be due to microchimerism or to pseudotyping of murine endogenous retroviruses. Our results were confirmed by the fact, that the receptor for PERV-A is not expressed on murine cells and that these cells could not be infected in vitro. The absence of a PERV transmission in the investigated patients, correspond to the results obtained from approximately twohundred treated patients worldwide.

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Zugl.: Stuttgart, Univ., Diss., 2008

Die Signalübertragung durch Wnt/beta-Catenin stellt einen der wichtigsten Signalwege während der Embryogenese sowie im adulten Organismus dar. Die homologen Gerüstproteine Conductin und Axin stehen im Mittelpunkt eines zentralen Multiproteinkomplexes, der im Zytoplasma für die Regulation des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine kombinierte genetische Analyse von Conductin und Axin in der Maus durchgeführt. Dazu habe ich mit Hilfe der Technik der homologen Rekombination das Conductin-Gen deletiert und ein Reportergen unter die Kontrolle des endogenen Conductin-Promotors gebracht. Im Weiteren habe ich festgestellt, dass der gemeinsame Verlust von Conductin und einem Axin-Allel (Con-/-;Ax+/-) zu Holoprosenzephalie (HPE) führt, die durch schwere kraniofazialen und Vorderhirndefekten in der Maus charakterisiert ist. Dabei zeigte die detaillierte Analyse eine genetische Interaktion des Wnt-Signalwegs mit dem Shh-Signalweg. Störungen im Shh-Signalweg sind auch beim Menschen für die Ausbildung von HPE verantwortlich gemacht worden. Daneben führt die gleichzeitige Abwesenheit von Conductin und Axin (Con-/-;Ax-/-) zum Verlust der anterior-posterioren Achse in einem frühen Entwicklungsstadium und zum Absterben der Embryonen nach dem Tag 6,5 der Entwicklung. Die vorliegende Arbeit zeigt, wie Unterschiede in der biologischen Bedeutung zweier funktionell redundanter Faktoren mit genetischen Methoden in der Maus aufgeklärt werden können. / The Wnt/beta-Catenin pathway represents one of the most important signaling cascades during development as well as in the adult organism. The homologous scaffolding proteins Conductin and Axin are the backbone of a central multi protein complex that is responsible for the tight regulation of the Wnt/beta-Catenin pathway in the cytoplasm. In the present study I have performed a combined genetic analysis of Conductin and Axin in the mouse. To this end I have deleted the Conductin gene by homologous recombination in embryonic stem cells and inserted a reporter gene under the control of the endogenous Conductin promoter. I could show that the simultaneous loss of Conductin and one Axin allele (Con-/-;Ax+/-) causes Holoprosencephaly (HPE), which is characterized by severe craniofacial and forebrain defects in the mouse. The detailed analysis of the mutant mice reveals a genetic interaction of Wnt and Shh signaling and defective Shh signaling has previously been implicated in the formation of HPE in human patients. Moreover, complete absence of both Conductin and Axin (Con-/-;Ax-/-) leads to loss of the anterior-posterior axis early in development and death of the embryos after E6.5. The present study exemplifies how differences in the biological function of two mechanistically redundant factors can be studied by genetic means in the mouse.

Einleitung: Das ARDS (acute respiratory distress syndrome) stellt mit einer schweren Hypoxämie aufgrund eines hohen pulmonalen Recht-Linksshunts, mit einer pulmonalen Hypertonie und einer diffusen inflammatorischen Reaktion der gesamten Lunge trotz einiger etablierter Therapieansätze ein häufig letal endendes Krankheitsbild dar. Neben zahlreichen neuen klinisch-experimentellen Therapieansätzen erlangt die i.v.-Aplikation von Almitrindimesilat größere Beachtung. Zuerst verabreicht bei chronisch obstruktiven Atemwegserkrankungen erkannte man bald, daß neben der ventilationssteigernden Wirkung auch Effekte an der pulmonalen Gefäßstrombahn im Sinne einer Optimierung des Ventilations-Perfusions-Verhältnisses für die zu beobachtende Verbesserung der pulmonalen Oxygenation verantwortlich sind. Eine Potentierung der Hypoxischen Pulmonalen Vasokonstriktion (HPV) wird dafür verantwortlich gemacht. Kontrovers diskutierte Dosierungen in Tierversuchen und vereinzelten Anwendungen am Menschen legten nahe, daß systemische Dosis-Wirkungsanalysen erfolgen mußten. Desweiteren sollte untersucht werden ob die im Rahmen des ARDS zu beobachtende Pulmonalarterielle Hypertonie durch das Medikament zunimmt. Methoden: Mit Hilfe eines durch repetitive saline bronchoalveoläre Lavage induzierten ARDS-Modells am Schwein wurden an 14 Schweinen in Narkose prospektiv randomisiert entweder sechs ansteigende Dosen (0,5, 1, 2, 4, 8, und 16 (g/kgKG/min) Almitrindimesilat oder dessen Solvens Apfelsäure appliziert. Während des Versuches wurde volumenkontrolliert beatmet (FiO2 1,0 , PEEP 5 cm H2O). Nach je 30 minütiger Infusion der entsprechenden Dosierungen wurde Parameter des Gasaustausches und der pulmonalen sowie der systemischen Hämodynamik erhoben. Innerhalb der Gruppen wurde mittels des einfachen ANOVA-Test mit Bonferonikorrekturfaktor, zwischen den Gruppen mit dem Mann-Whitney-Test auf signifikante Unterschiede hin untersucht. Signifikanz der Unterschiede wurde bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit p ( 0,05 angenommen. Ergebnisse: Niedrige Dosierungen, 0,5 - 2 (g/kgKG/min, reduzieren die venöse Beimischung und führen zu einem statistisch signifikanten Anstieg des Sauerstoffpartialdruckes mit einem Optimum für diesen günstigen Einfluß bei einer Infusionsrate von 1 µg/kgKG/ min. Hohe Dosierungen hingegen erhöhen die venöse Beimischung und senken den Sauerstoffpartialdruck und führen damit zu einer erheblichen Verschlechterung des Krankheitsbildes im Vergleich zu niedrigen Dosen und der Ausgangssituation bzw. dem nichttherapierten Tieren. Der Pulmonalarterielle Mitteldruck nahm nach Almitrindimesilatgabe geringfügig zu. Mit zunehmender Dosierung erreichte der MPAP höhere Werte als zum Zeitpunkt des stabilen Lungenschadens, jedoch waren keine dieser Steigerungen statistisch signifikant. Diskussion: Almitrindimesilat zeigte einen dosisabhängigen Einfluß auf den pulmonalen Gasaustausch. Dieser wirkt sich in niedrigen Dosierungen positiv auf die Hypoxämie aus. Der Pulmonalarterielle Druck bleibt konstant. Als Mechanismus der positiven Auswirkung liegt eine Potenzierung der HPV für niedrige Dosierungen nahe. / Objectives: The ARDS (acute respiratory distress syndrome) is characterized by a diffuse inflammatory response, a pulmonary hypertension and a severe hypoxemia mainly because of ventilation-perfusion-mismatching. Despite of some new therapeutical strageties the mortality remains high. Almitrine bismesylate was first described to improve arterial oxygenation in COPD- patients primary by increasing alveolar ventilation due to a stimulating effect on peripheral chemoreceptors. Furthermore several experimental studies have confirmed that almitrine improves PaO2 possibly because of reducing the ventilation- perfusion-mismatching by enhancing the hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV). Controversal results have been reported concernig the doses of intravenous Almitrine to be beneficial. Furthermore it remains unclear to what extend the pulmonary hypertension is augmented by a drug which is inhancing or restroring the HPV. Therefore we determined a dose-response-curve of almitrine in a animal model of ARDS. Methods: After induction of anaesthesia the ARDS-Modell was induced by repeated saline wash-0,5-2 ?g/kgKG/minout of surfactant. 14 swine received almitrine or the solvent in a prospective randomized manner. During the experiment the volume controlled mode of mechanical ventilation remained unchanged (FiO2 1,0 , PEEP 5 cm H2O). After the increasing doses of 0,5, 1, 2, 4, 8 and 16 ?g/kgKG/min each for 30 min we investigated the effects of i.v. almitrine on the pulmonary gasexchange and the pulomanry and systemic hemodynamics. Statistics were carried out by Two way Analysis of Variance p

Das Renin-Angiotensin-System ist nachweislich in die Entwicklung der schwangerschaftsspezifischen Erkrankung Präeklampsie involviert. Ziel der Arbeit ist die Charakterisierung der Effekte des zirkulierenden sowie uteroplazentaren Renin-Angiotensin-Systems im Rattenmodell. Wurden weibliche Ratten, transgen für humanes Angiotensinogen, mit männlichen Ratten, transgen für humanes Renin verpaart, so entwickelten sie während der Schwangerschaft Bluthochdruck und Proteinurie, während die umgekehrte Kreuzung diese Hauptsymptome der Präeklampsie nicht zeigte. Weiterhin wurde mit einer Kontrollgruppe sowie einer Angiotensin II behandelten Gruppe gearbeitet. Chronisch, systemische Angiotensin II Infusion (1000 ng/kg/min) erhöhte zirkulierendes Angiotensin II während in der umgekehrten, Präeklampsie-negativen Kreuzung uteroplazentares Angiotensin II erhöht war. In der Präeklampsie-positiven Gruppe war Angiotensin II zirkulär und uteroplazentar erhöht. Bluthochdruck und Albuminurie waren alleinig in den Tiermodellen mit erhöhtem zirkulierendem Angiotensin II nachweisbar. In der Kontrollgruppe kam es während der Schwangerschaft zu einer physiologischen Herzhypertrophie, während in der Präeklampsie-positiven Gruppe Anzeichen einer pathologischen Herzhypertrophie nachweisbar waren. Weiterhin unterstützte uteroplazentares Angiotensin II die tiefe Invasion von Trophoblasten in plazentafernen Spiralarterien, während zirkulierendes Angiotensin II die Trophoblasteninvasion im gesamten mesometrialen Dreieck diffus förderte. In Zellkulturexperimenten konnte gezeigt werden, dass Angiotensin II die Mobilität und die Invasion einer Trophoblastenzelllinie förderte. Ebenso erhöhte Angiotensin II die Migration von Trophoblasten in Plazentakulturen. Diese Ergebnisse verdeutlichen den unterschiedlichen Einfluss des zirkulierenden und uteroplazentaren Renin-Angiotensin-Systems auf die Schwangerschaft und tragen damit zum Verständnis pathologischer Prozesse bei, die zu Präeklampsie führen. / Dysregulation of the renin-angiotensin-system is important in preeclampsia, a pregnancy specific disorder, characterized by high blood pressure and albuminuria. Aim of this study is to characterize the effects of circulation and uteroplacental renin-angiotensin-system during pregnancy in a rat model. Female rats transgenic for the human angiotensinogen gene crossed with males transgenic for the human renin gene develop preeclampsia, whereas those of the opposite cross do not. We used this model to study the role of angiotensin II in trophoblast invasion, which is shallow in human preeclampsia but deeper in this model. We investigated the following groups: preeclampsia rats, opposite-cross rats, angiotensin II–infused rats and control rats. Angiotensin II infusion increased only circulating angiotensin II levels, opposite cross influenced only uteroplacental angiotensin II and preeclampsia rats showed increased circulating and uteroplacental angiotensin II. Blood pressure and albuminuria occurred in the models with high circulating angiotensin II but not in other models. Control rats showed physiological heart hypertrophy during pregnancy whereas pathological heart hypertrophy occurred in preeclampsia rats. High uteroplacental angiotensin II influenced deep trophoblast invasion in distant spiral arteries whilst the effect of circulating angiotensin II was more diffuse. We then studied human trophoblast cell line and villous explants derived from first-trimester pregnancy. Local angiotensin II dose-dependently increased migration, invasion and motility. The data suggest that angiotensin II stimulates trophoblast invasion in vivo in the rat and in vitro in human cells, a hitherto fore unrecognized function.

Die Mucositis enoralis ist eine häufige und dosislimitierende Nebenwirkung der Strahlentherapie von Kopf-Hals-Tumoren. Die zugrunde liegenden Pathomechanismen sind komplex und beinhalten die Reaktionen und Interaktionen von Epithelzellen, Fibroblasten, Makrophagen und Gef¨aßendothelzellen. Dies schließt die vermehrte Bildung von Stickstoff-Monoxid (NO) in Folge einer Stimulation der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) ein. Ziele der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Wirkung von L-NAME (nitro-L-Arginin-Methyl-Ester), einem unselektiven Inhibitor der NOS, auf die Strahlenreaktion der oralen Mukosa im etablierten Tiermodell der Schleimhaut der Zungenunterseite der Maus zu untersuchen. Materialien und Methoden: Die Untersuchungen erfolgen mit Mäusen des InzuchtWildtypstammes C3H/Neu. Als Bestrahlungstechniken kommen die perkutane Schnauzenbestrahlung (200 kV Röntgenstrahlung) und/oder die lokale Bestrahlung (25 kV Röntgenstrahlung) eines 3·3 mm2 großen Testfeldes der Zungenunterseite der Maus zum Einsatz. In Fraktionierungsprotokollen werden 5x3 Gy/Woche über 1 (Tage 04) sowie 2 Wochen (Tage 0-4, 7-11) auf die gesamte Schnauze der Tiere appliziert. Anschließend erfolgt eine lokale Aufsättigungsbestrahlung mit gestaffelten Dosen (5 Dosisgruppen, je 10 Tiere) zur Generierung kompletter Dosis-Effekt-Kurven (Tag 7 bzw. 14). Einzeitbestrahlungen des lokalen Testfeldes finden ebenfalls mit gestaffelten Dosen statt. L-NAME (täglich 0,2 mg/kg i.p.) wird an den Bestrahlungstagen 30 Minuten vor der Bestrahlung appliziert. Bei Einzeitbestrahlung werden 2 verschiedene Behandlungszeiträume getestet: 3 Tage vor der Bestrahlung bis zur Erstdiagnose (-3/D) oder Ausheilung der Ulzerationen (-3/H). In Kombination mit fraktionierter Bestrahlung über 1 Woche werden 3 Zeiträume untersucht (-3/7, -3/D oder -3/H). Bei 2 Wochen fraktionierter Bestrahlung erfolgt die L-NAME-Gabe in folgenden Intervallen: -3/7, -3/D, -3/H, -3/14 oder 7/14. Als quantaler Endpunkt für Dosis-EffektAnalysen dient die Ulzeration der Schleimhaut im Testfeld. Mittels Logit-Analyse werden Dosis-Effekt-Beziehungen ermittelt. Der ED50-Wert und dessen Standardabweichung σ dienen der Charakterisierung der Dosis-Effekt-Kurven. In histologischen Untersuchungen werden maximal 10 Fraktionen zu 3 Gy über 2 Wochen appliziert, mit/ohne Gabe von L-NAME von Tag -3 bis zur Tötung. Die Zungenentnahme erfolgt bei je 5 Tieren in zweitägigen Abständen (Tag 1 bis 25). Ergebnisse: Für die alleinige Einzeitbestrahlung ergibt sich eine signifikante Dosisabhängigkeit der Ulkusinzidenz mit einer ED50 von 13,6±1,0 Gy. Die mittlere Latenzzeit beträgt 10,6±1,1 Tage, die durchschnittliche Ulkusdauer 3,5±1,0 Tage. Nach alleiniger einwöchig fraktionierter Bestrahlung beträgt die ED50 der Testbestrahlung 12,3±0,8 Gy. L-NAME von Tag -3 bis Tag 6 bzw. -3/D hat keinen signifikanten Einfluss (ED50 13,3±1,2 Gy bzw. 12,8±1,0 Gy). Lediglich für den Applikationszeitraum Tag -3/H kann eine signifikante Erhöhung der ED50 auf 14,7±1,7 Gy (p=0,0298) nachgewiesen werden. Die Testbestrahlung nach 2-wöchiger Fraktionierung ohne L-NAME ergibt eine ED50 von 13,0±0,1 Gy. L-NAME hat wiederum keinen signifikanten Einfluss auf die Strahlenempfindlichkeit der Mundschleimhaut (ED50-Werte: -3/6 - 12,9±0,1 Gy, -3/14 - 13,0±0,1 Gy, -3/H - 13,8±1,4 Gy und 7/14 - 13,1±0,8 Gy). Während alleiniger fraktionierter Bestrahlung nimmt die Zellzahl zunächst ab (Tag 11: 70 %). Im Anschluss steigt sie über das Ausgangsniveau (Tag 19: 126 %). F¨ur die L-NAME-behandelte Schleimhaut findet sich ein qualitativ vergleichbarer Verlauf; es zeigt sich lediglich eine geringfügige Erhöhung der Zellzahl in der funktionellen Schicht (150 % statt 140 %). Die Epitheldicke nimmt unter L-NAME-Behandlung in den ersten Tagen der Nachbeobachtungszeit deutlich zu. Schlußfolgerungen: Zusammenfassend erweist sich in der vorliegenden Arbeit nur die L-NAME-Applikation -3/H bei einwöchig fraktionierter Bestrahlung als wirksam, wobei der Grund f¨ur diese selektive Wirkung unklar bleibt. Offensichtlich sind NOvermittelte Prozesse ohne substanzielle Relevanz f¨ur die epitheliale Strahlenreaktion der Mundschleimhaut. Auf der Basis dieser Ergebnisse ist die Hemmung von iNOS durch L-NAME keine aussichtsreiche Strategie zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis, und sollte deshalb auch nicht in klinischen Studien verfolgt werden. Die Frage, ob andere (i)NOS-Hemmstoffe ein mukoprotektives Potential besitzen, sollte in weiteren, translationalen strahlenbiologischen Studien geklärt werden.

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In dieser Arbeit wurden Vektorimpfstoffe auf der Basis rekombinanter Vacciniaviren hinsichtlich ihrer Eignung zur Immunisierung gegen Infektionen mit Respiratorischen Synzytialviren (RSV) untersucht. Hierfür standen genetisches Material und Viruspräparationen des Respiratorischen Synzytialvirus des Rindes (BRSV, Stamm Odijk) sowie des Respiratorischen Synzytialvirus des Menschen (HRSV, Subtyp A2) sowie rekombinante Vacciniaviren MVA-HRSV-F bzw. MVA-HRSV-G zur Verfügung. Rekombinante MVA-Viren, welche die Gene der BRSV-Oberflächenproteine G und F (MVA-BRSV-F, MVA-BRSV-G, MVA-BRSV-Gneu), sowie Viren in welchen die Fremdgensequenzen durch Deletion wieder entfernt sind (Revertante Viren MVA-∆BRSV-F und MVA-∆BRSV-G), wurden gentechnologisch hergestellt. Alle rekombinanten MVA-Viren wurden molekular-virologisch charakterisiert und dienten zur Gewinnung und Prüfung von Testimpfstoffen im Tiermodell. Die Untersuchungen zeigen: 1. Alle neu konstruierten rekombinanten MVA-BRSV-Viren produzierten nach Infektion von Zellkulturen die erwünschten Zielantigene, die BRSV-Glykoproteine F und G. Für das durch MVA-Expression hergestellte BRSV-F-Glykoprotein konnte außerdem die biologische Funktionalität in einem Fusionstest in infizierten HeLa-Zellen nachgewiesen werden. 2. Die Charakterisierung der Genome aller MVA-BRSV- sowie MVA-HRSV-Vektorviren bestätigte die exakte Insertion der Fremdgensequenzen im anvisierten Genombereich und zeigte die genetische Stabilität der Virusisolate nach Passagierung. 3. Bei der Untersuchung des Wachstumsverhaltens von MVA-BRSV-F und MVA-BRSV-G zeigte sich die eingeschränkte Vermehrungsfähigkeit des Virus MVA-BRSV-G. Die Konstruktion und Untersuchung der revertanten Viren MVA-∆BRSV-F und MVA-∆BRSV-G belegte die Koproduktion des G-Proteins als Ursache des verminderten Replikationsvermögens. Dieser für ein mögliches Impfvirus erhebliche Nachteil konnte durch die Verwendung eines moderateren Vacciniavirus-Promotors zur Fremdgenexpression (rekombinantes Virus MVA-BRSV-Gneu) behoben werden. 4. Die Prüfung von Testimpfstoffen auf der Grundlage der rekombinanten MVA-HRSV-Viren in einem Maus-HRSV-Infektionsmodell zeigte, dass MVA-HRSV-Impfstoffe, im Gegensatz zu Impfstoffen aus mit Formalin-inaktiviertem HRSV, Immunantworten mit einem ausgewogenen TH1/TH2-assoziierten Zytokinprofil induzierten. Eine infolge von Immunisierung verstärkte Einwanderung eosinophiler Zellen (Marker für Immunpathogenese) in die Lungen HRSV-infizierter Tiere, konnte nach MVA-Impfung nicht beziehungsweise in nur sehr geringem Ausmaß festgestellt werden (OLSZEWSKA et al. 2004). 5. Wichtige erste Daten hinsichtlich der Verträglichkeit, Immunogenität und Schutzwirkung rekombinanter Impfstoffe auf der Basis von MVA-BRSV-F und MVA-BRSV-G konnten in einem Kälber BRSV-Infektionsmodell erhoben werden. Die zweimalige Immunisierung mit MVA-Impfstoff verlief bei allen Tieren ohne feststellbare Nebenwirkungen und die Anregung Vaccinia- bzw. BRSV-F-spezifischer Antikörper bestätigte die Immunogenität der Vektorvakzinen. Schließlich belegten klinische Daten, insbesondere die fehlende Fieberreaktion bei Impflingen nach BRSV-Belastungsinfektion, die Schutzwirkung der MVA-BRSV-Impfstoffe. Insgesamt unterstützen die erzielten Ergebnisse dieser Arbeiten die weitere präklinische und klinische Untersuchung von MVA-Vektorimpfstoffen zur wirksameren und sichereren Bekämpfung von Infektionen mit Respiratorischen Synzytialviren. / This study investigated vector vaccines based on recombinant vaccinia virus MVA for their suitability to immunize against infections with respiratory syncytial viruses. Genetic material and virus stocks of bovine respiratory syncytial virus (BRSV, Strain Odijk) and human respiratory syncytial virus (HRSV, Strain A2) and recombinant vaccinia viruses MVA-HRSV-F and MVA-HRSV-G were provided and used in this study. The project work included the genetical engineering of recombinant MVA expressing gene sequences encoding the BRSV surface proteins G and F (MVA-BRSV-F, MVA-BRSV-G, MVA-BRSV-Gneu) and the secondary generation of mutant viruses in which recombinant gene sequences have been removed (revertant viruses MVA-∆BRSV-F, MVA-∆BRSV-G). All recombinant MVA were carefully characterized in in vitro experiments and served for generation of vaccine preparations being tested in animal model systems. The investigations demonstrate: 1. All recombinant MVA-BRSV viruses produced the target antigens (BRSV-F and -G proteins) upon tissue culture infections. Functional activity of BRSV-F protein was demonstrated in a cell fusion assay using virus-infected HeLa cells. 2. The characterization of the genomes of all MVA recombinant viruses confirmed the correct insertion of foreign gene sequences into the target site of the MVA genome and demonstrated the genetic stability of the vector viruses upon tissue culture passage. 3. In vitro studies on virus growth revealed a reduced replicative capacity of the recombinant virus MVA-BRSV-G. Construction and growth analysis of revertant viruses MVA-∆BRSV-F and MVA-∆BRSV-G demonstrated that over expression of BRSV-G protein caused this replication deficiency which could be avoided by using a more moderate vaccinia virus promoter for transcriptional control of recombinant gene expression (recombinant virus MVA-BRSV-Gneu). 4. Upon characterization in a mouse-HRSV challenge model candidate vaccines based on recombinant MVA-HRSV viruses, in contrast to formalin inactivated HRSV, and induced a well balanced TH1 and TH2 cytokine profile. In addition, none of the MVA-HRSV-F vaccinated animals and only two of the MVA-HRSV-G immunized mice showed low-level eosinophilia in the lungs after HRSV challenge infection (OLSZEWSKA et al. 2004). 5. Vaccination experiments in the calf-BRSV challenge model generated first relevant data on safety, immunogenicity and protective capacity of MVA-BRSV recombinant vaccines. The repeated application of MVA vaccine was well tolerated by all vaccinated animals and the induction of vaccinia- and BRSV-F-specific antibody responses confirmed the immunogenicity of the MVA vector vaccines. Moreover, clinical data (lack of fever response in vaccines) suggested the protective capacity of MVA-BRSV immunization upon BRSV challenge. The obtained results from these studies clearly support further preclinical and clinical evaluation of recombinant MVA candidate vaccines to immunize against disease caused by RSV infections in cattle and humans.

Zusammenfassung Thure Adler Der Streptozotozin-induzierte Diabetes in der transgenen CD4/DR17-Maus Aus dem Institut für Immunologie der Veterinärmedizinischen Fakultät und dem Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig, 80 Seiten, 24 Abbildungen, 20 Tabellen, 217 Literaturangaben Die Verwendung transgener Tiere, die humane Moleküle exprimieren, gewinnt zunehmend an Bedeutung bei der Erforschung der Funktionen solcher Moleküle in Krankheitsprozessen und bei der experimentellen Erprobung neuartiger Therapieverfahren, in denen solche Moleküle die Zielstrukturen darstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde die CD4/DR17-Maus, welche das humane CD4- und das DR17-Molekül exprimiert, im MLD-STZ-induzierten Diabetes, einem Tiermodell für den Typ 1 Diabetes, eingesetzt. Die funktionelle Beteiligung der Transgene wurde durch einen Vergleich mit Segreganten untersucht, denen die Transgene teilweise fehlen. Als klinische Parameter sind Blutglukose und Glukosetoleranz erfaßt worden, histopathologisch wurden Insulitis und Insulingehalt der Inselzellen bestimmt. Ferner wurde getestet, ob sich durch Verabreichung von monoklonalen Antikörpern, die gegen das transgene hCD4- oder gegen das CD8-Molekül gerichtet sind, dieser STZ-induzierte Diabetes beeinflussen läßt. Mit Hilfe der durchflußzytometrischen Immunfluoreszenzanalyse von Blutzellen wurde zusätzlich überprüft, ob Veränderungen auf T-Zellen hinsichtlich der Expression der Aktivierungsmarker CD25, CD69 und CD71 während des STZ-induzierten Diabetes auftreten. Es wurde gezeigt, dass die CD4/DR17-transgene Maus nach der Behandlung mit mehrfachen subdiabetogenen Dosen von Streptozotozin eine transiente Hyperglykämie entwickelt, die mit einer verringerten Glukosetoleranz sowie Insulitiden und einem Rückgang des Insulingehaltes in den Langerhans’schen Inseln einhergeht. Vergleiche mit Segreganten zeigen, dass die Expression beider transgener Merkmale zur maximalen Ausprägung einer schwergradigen Insulitis beiträgt. Die Anwendung von monoklonalen Antikörpern gegen das transgene hCD4-Molekül nach Beginn der STZ-Behandlung hat den Diabetes nicht wirkungsvoll verzögert. Dagegen milderte eine Behandlung mit Antikörpern, die gegen das CD8-Molekül gerichtet sind, den Diabetesverlauf. Während des STZ-Diabetes veränderte sich die Expression von Aktivierungsmarkern auf Lymphozyten des peripheren Blutes nicht signifikant. Die Arbeit belegt, dass die CD4/DR17-Maus suszeptibel gegenüber der Induktion eines experimentellen Diabetes mit mehrfachen subdiabetogenen Dosen von Streptozotozin ist. Die transgenen Moleküle hCD4 und DR17 sind dabei am Krankheitsprozeß beteiligt. / Summary Thure Adler The streptozotocin-induced diabetes in the transgenic CD4/DR17 mouse From the Institute of Immunology, Faculty of Veterinary Medicine and the Institute of Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Faculty of Medicine, University of Leipzig 80 pages, 24 figures, 20 tables, 217 references Today, transgenic animals that express human molecules are getting important tools in functional studies and experimental, therapeutical attempts, that target these molecules. In this study, the CD4/DR17 mouse expressing the human CD4 and the human DR17 molecules and with a defective murine CD4 gene, was used in the multiple low-dose streptozotocin-induced (MLD-STZ) diabetes model, a model for type 1 diabetes. The functional involvement of the transgenic molecules in the development of the MLD-STZ-diabetes was analysed by comparing CD4/DR17 mice and segregants that lack one or more of the transgenes. The described parameters included the measurement of blood glucose levels and oral glucose tolerance tests, histopathologically grading of insulitis and determination of the content of insulin in pancreatic islets by immunohistological methods. In addition, the model was used to test the potential therapeutic effect of the administration of monoclonal antibodies against hCD4 or CD8. Furthermore, alterations of the expression of the activation markers CD25, CD69 and CD71 during the experimentally induced diabetes has been measured by FACS analysis. The study shows, that CD4/DR17 mice develop a transient hyperglycemia after MLD-STZ treatment, accompanied by a reduced tolerance to oral glucose, insulitis and the reduction of the content of insulin in the pancreatic islets. The full incidence of insulitis requires the expression of both transgenes. The treatment performed with monoclonal antibodies against the transgenic hCD4 after STZ-treatment could not meliorate the diabetic course, while the treatment with anti CD8 antibodies moderated the diabetic process. After STZ-treatment the expression of activation marker of peripheral T-cells did not alter significantly. Thus, the CD4/DR17 mouse is shown to be susceptible to the induction of experimental diabetes with MLD-STZ. The transgenic molecules CD4 and DR17 are involved in the pathogenesis of the disease.