Apesar de o protozoário Toxoplasma gondii ser considerado a única espécie válida para o gênero, são reconhecidas três linhagens clonais, denominadas Tipo I, Tipo II e Tipo III, predominantes em países da Europa ocidental e Estados Unidos. Com a pesquisa de amostras deste parasito provenientes de outras regiões do mundo, como no caso do Brasil, várias outras configurações genotípicas diferentes das dos arquétipos mencionados acima vêm sendo encontradas. Neste trabalho, quarenta galinhas/galos (Gallus domesticus) de criação livre de oito propriedades rurais de áreas limítrofes ao Pantanal da Nhecolândia no estado do Mato Grosso do Sul foram eutanasiadas e amostras de sangue, cérebro e coração foram coletadas. O sorodiagnóstico foi realizado através do Teste de Aglutinação Modificado (MAT) e, com um pool de órgãos dos animais positivos, foi realizado bioensaio em camundongos. Foram obtidos, após o bioensaio, 11 isolados de T. gondii. O DNA foi extraído dos tecidos dos camundongos infectados e a tipificação dos isolados foi realizada utilizando 12 marcadores PCR-RFLP, genericamente denominados SAG1, 5´3´SAG2, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico e CS3. Vinte e sete galinhas (67,5%) foram sorologicamente positivas para T. gondii e 13 (32,5%) foram negativas. Das amostras soropositivas, 7 (25,9%) foram positivas na diluição 1:5, 3 (11,1%) em 1:10, 2 (7,4%) em 1:20, 3 (11,1%) em 1:320, 1 (3,7%) em 1:640, 3 (11,1%) em 1:1280, 2 (7,4%) em 1:2560, 4 (14,8%) em 1:5120 e 2 (7,4%) em 1:10240. Quanto à genotipagem, cinco genótipos foram revelados nos 11 isolados de galinhas de cinco propriedades do município de Aquidauana e uma propriedade do município de Rio Verde do Mato Grosso, incluindo um genótipo misto encontrado em um isolado (TgCkBr198) que demonstrou um complexo cujos padrões são uma combinação de 2 alelos observados em oito loci. Dois genótipos foram descritos pela primeira vez, considerando os 140 isolados de galinhas de diferentes regiões brasileiras avaliadas em estudos anteriores. Os resultados corroboram com estudos anteriores sobre os isolados de T. gondii no Brasil, confirmando sua diversidade e atipicidade. / Despite the protozoan Toxoplasma gondii is considered the only valid species for the genus, three clonal lineages are recognized, known as the Type I, Type II and Type III, which predominate in Western European countries and the USA. The search for samples of this parasite from other regions of the world, as in the case of Brazil, has revealed different genotypes other than the archetypes above mentioned. In this study, forty free range chickens (Gallus domesticus) of eight farms from areas belonging to the Pantanal Nhecolândia in the state of Mato Grosso do Sul were euthanized and samples of blood, brain and heart were collected. The serodiagnosis was performed using the technique of modified agglutination test (MAT) and a pool of organs of seropositive animals was used to perform the bioassay in mice. It was obtained 11 isolates of T. gondii. DNA was extracted from tissues of infected mice and characterization of isolates was performed using 12 PCR-RFLP markers, known generically SAG1, 5\'3\'SAG2, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, C29-2, L358, PK1, Apico and CS3. Twenty-seven chickens (67.5%) were serologically positive for T. gondii and 13 (32.5%) were negative. Among the seropositive samples, 7 (25.9%) were positive at 1:5 dilution, 3 (11.1%) in 1:10, 2 (7.4%) in 1:20, 3 (11.1%) at 1:320, 1 (3.7%) at 1:640, 3 (11.1%) in 1:1280, 2 (7.4%) in 1:2560, 4 (14.8%) on 1:5120 and 2 (7.4%) at 1:10240. With regard to genotyping, five genotypes were found within 11 isolates from chickens from five properties in the municipality of Aquidauana and one property of the municipality of Rio Verde of Mato Grosso, including a mixed genotype found in one isolate (TgCkBr198) that showed a complex pattern which is a combination of 2 alleles observed at eight loci. Two genotypes have been described for the first time, considering the 140 isolates from chickens in different Brazilian regions evaluated in previous studies. The results corroborate with previous studies on the isolates of T. gondii in Brazil, confirming their diversity and atypicality.

As formas sintomáticas de toxoplasmose são um grave problema de saúde pública e ocorrem em cerca de 10 a 20% das pessoas infectadas. Com o objetivo de melhorar o diagnóstico molecular de toxoplasmose sintomática em pacientes brasileiros, este estudo avaliou o desempenho da PCR em tempo real (qPCR) na detecção do DNA de T. gondii testando dois conjuntos de iniciadores moleculares (B1 e REP-529) para diagnóstico molecular. A metodologia foi testada em 807 amostras clínicas com diagnóstico clínico conhecido, ELISA e PCR convencional (cPCR) em um período de 9 anos. Todas as amostras foram de pacientes com suspeita clínica de diferentes formas da toxoplasmose. De acordo com a curva mínima de limite de detecção (no CT), o REP-529 apresentou maior sensibilidade para detectar DNA de T. gondii do que B1. Ambos os conjuntos de iniciadores moleculares foram avaliados retrospectivamente usando o DNA de 515 amostras clínicas diferentes. Os 122 pacientes com resultado negativo na PCR em tempo real, provavelmente por terem infecção crônica, demonstraram alta especificidade (REP-529, 99,2% e B1, 100%). Das 393 amostras com ELISA positivo (IgG), 146 apresentaram diagnóstico clínico de toxoplasmose e cPCR positivo. As sensibilidades de REP-529 e B1 foram de 95,9% e 83,6%, respectivamente. A comparação dos desempenhos do REP-529 e B1 foi analisada prospectivamente em 292 amostras. Assim, a partir de um total de 807 amostras de DNA analisadas, 217 (26,89%) apresentaram PCR positivo, pelo menos em um conjunto de iniciadores e com toxoplasmose sintomática confirmada pelo diagnóstico clínico. O REP-529 foi positivo em 97,23%, enquanto o B1 amplificou apenas 78,80%. Depois de comparar várias amostras em um laboratório brasileiro de referência, este estudo concluiu que o conjunto de iniciadores REP-529 apresentou melhor desempenho do que B1. Essas observações foram baseadas após o uso de casos com diagnóstico clínico definido, ELISA e cPCR. / Symptomatic forms of toxoplasmosis are a serious public health problem and occur in around 10-20% of the infected people. Aiming to improve the molecular diagnosis of symptomatic toxoplasmosis in Brazilian patients, this study evaluated the performance of real time PCR (qPCR) in detecting T. gondii DNA testing two primer sets (B1 and REP-529) for molecular diagnosis. The methodology was assayed in 807 clinical samples with known clinical diagnosis, ELISA, and conventional PCR (cPCR) results in a 9-year period. All samples were from patients with clinical suspicion of several features of toxoplasmosis. According to the minimum detection limit curve (in CT), REP-529 had greater sensitivity to detect T. gondii DNA than B1. Both primer sets were retrospectively evaluated using 515 DNA from different clinical samples. The 122 patients without toxoplasmosis (with negative real-time PCR) provided high specificity (REP-529, 99.2% and B1, 100%). From the 393 samples with positive ELISA (IgG), 146 had clinical diagnosis for toxoplasmosis and positive cPCR. REP-529 and B1 sensitivities were 95.9% and 83.6%, respectively. Comparison of REP-529 and B1 performances was further analyzed prospectively in 292 samples. Thus, from a total of 807 DNA analyzed, 217 (26.89%) had positive PCR with, at least one primer set and with symptomatic toxoplasmosis confirmed by clinical diagnosis. REP-529 was positive in 97.23%, whereas B1 amplified only 78.80%. After comparing several samples in a Brazilian referral laboratory, this study concluded that REP-529 primer set had better perform than B1 one. These observations were based after using cases with defined clinical diagnosis, ELISA, and cPCR.

Em nosso estudo pretendemos estudar a via oral para o desenvolvimento de vacina para toxoplasmose utilizando parasitas irradiados por Cobalto-60, como uma alternativa para a prevenção desta importane parasitose. Para tanto, avaliamos o desenvolvimento da imunidade sistêmica e intestinal e a resistência à infecção, em camundongos imunizados por esta via com taquizoítos irradiados a 255Gy, e desafiados com cistos da cepa ME-49. Camundongos isogênicos C57Bl/6j foram imunizados com 107 taquizoitos de T. gondii irradiados a 255Gy em diferentes esquemas e utilizando adjuvantes leite (anti-péptico) e hidróxido de alumínio (anti-ácido). As preparações de taquizoítos irradiados por via oral induziram produção de imunoglobulinas IgG e IgA no soro de camundongos, sendo predominante a subclasse de IgG2a, similar a infecção crônica, determinadas por ELISA. Seu uso com adjuvantes anti-pépticos ou anti-ácidos induziu produção de IgA fecal e menos significativamente de IgG fecal. Existem indícios de indução de tolerância em nível intestinal, com queda da produção de anticorpos e da proliferação celular antígeno dirigida, especialmente quando o leite foi utilizado como adjuvante, em ensaios de produção in vitro de anticorpos ou proliferação estimulada por antígenos de T.gondii, por esplenócitos e linfócitos intestinais. As preparações orais induziram proteção quantitativa ao desafio dos animais imunizados por cepa cistogênica, que foi semelhante a imunização parenteral, quando o hidróxido de alumínio foi usado como adjuvante. Todos estes dados mostram a possibilidade de desenvolvimento de uma vacina oral para toxoplasmose utilizando taquizoítos irradiados, com aplicação prática num futuro próximo para uso em campo, utilizando iscas atrativas para imunizar felinos domésticos e selvagens. / We study the oral route for the development of a vaccine for toxoplasmosis, using parasites irradiated with 60 Cobalt, as an alternative for vaccine development to this worldwide parasitic infection. We evaluated the development of immunity at serum or mucosal levels, and their efficiency in protect the mice against challenge with oral cysts of the ME-49 strain. C57Bl/6j isogenic mice were immunized by oral route with 107 255 Gy irradiated tachyzoites from RH strain, at several protocols using milk as anti-peptic adjuvant and alum hydroxide as antacid. The preparations of irradiated tachyzoites induced production of serum IgG and IgA in immunized mice, as determined by ELISA, with IgG2a as the dominant subclass, similar to chronic infection. Their use with adjuvant allowed the excretion of significant amounts of IgA in stools also IgG, despite a lesser extent. There are suggestion of tolerance induction at mucosal level, with lower antigen induced proliferation and lower in vitro antibody production by spleen and gut lymphocytes, with the latter doses, specially when milk was used as adjuvant. All oral preparations induced some quantitative protection against challenge, which was similar to the parenteral route only isolated alum hydroxide was used as adjuvant. All these data support the possibility of the development of an oral vaccine against toxoplasmosis, using irradiated tachyzoites, which would be possible tool in near future for use in field baits, for immunizing either domestic or wild felids.

O Toxoplasma gondii apresenta uma estrutura populacional clonal. A análise genotípica do locus SAG2 foi realizada para determinar a ocorrência de diferentes linhagens de T. gondii (tipos I, II e III) em gatos domésticos. Amostras de soro de 237 gatos de 15 municípios no estado de São Paulo foram testadas para pesquisa de anticorpos anti-T. gondii através do teste de aglutinação modificado (MAT). Anticorpos (MAT ≥ 25) foram encontrados em 84 (35,4%) dos 237 gatos. Com os tecidos (cérebro, coração, língua e musculatura esquelética) de 71 gatos positivos foram realizados bioensaios em camundongos (cinco camundongos por grupo) sendo obtidos 47 isolados. A análise de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP) sobre produtos do locus SAG2 amplificados pela PCR revelou que 34 isolados (72,4%) eram do tipo I, 12 (25,5%) eram do tipo III e um (2,1%) apresentava infecção mista (tipo I e tipo III). Não houve isolado do tipo II. A maioria dos isolados do tipo I (23/34) causou o óbito de todos os camundongos infectados e a maioria dos isolados do tipo III (7/12) não levou ao óbito nenhum camundongo infectado. Foram encontrados cistos no cérebro dos camundongos infectados em todos os 47 isolados. A determinação genotípica também foi feita diretamente das amostras primárias dos gatos (homogeneizados de tecidos) usando a nested-PCR-RFLP. A caracterização do locus SAG2 foi bem sucedida em 80,4% (37/46) das amostras testadas. Os genótipos obtidos das amostras primárias foram idênticos aos dos isolados correspondentes. O genótipo misto foi confirmado pelo seqüenciamento direto de DNA dos produtos da PCR obtidos do isolado e da amostra primária do gato. Amostras dos cinco camundongos infectados com este isolado foram seqüenciadas. Três camundongos se infectaram com o genótipo tipo III, um com o genótipo tipo I e o outro com o genótipo misto, demonstrando que infecções mistas podem originar diferentes padrões de infecção em um hospedeiro. / Toxoplasma gondii has a clonal population structure. Genotypic analysis of the SAG2 locus was performed to determine the occurrence of the different lineages of T. gondii (types I, II and III) in domestic cats. Antibodies to T. gondii were determined in serum samples of 237 cats from 15 counties in São Paulo state, Brazil, by the modified agglutination test (MAT). Antibodies (MAT ≥ 25) were found in 84 (35.4%) of 237 cats. Tissues (brain, heart, tongue and skeletal muscle) of 71 of the positive cats were bioassayed in mice (five mice per group). Forty-seven isolates were obtained. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) in PCR-amplified SAG2 products revealed that 34 isolates (72.4%) were type I, 12 (25.5%) were type III and one (2.1%) was mixed with type I and type III. There was no type II isolate. Most of the type I isolates (23/34) killed all infected mice and most of the type III isolates (7/12) killed no infected mice. Tissue cysts were found in mice infected with all 47 isolates. The genotype determination was also made directly from primary samples from cats (tissue homogenates) using nested-PCR-RFLP analysis. Characterization of the SAG2 locus was successful in 80.4% (37/46) of the samples tested. Genotypes obtained from primary samples were the same as those from the corresponding isolates. The mixed genotype was confirmed by direct DNA sequencing of PCR products from the isolate and from the cat primary sample and samples from the five mice infected with this isolate were sequenced. Three had type III genotype, one had type I, and one had type I + type III, demonstrating that mixed infections can originate different patterns of infection in a host.

Foram colhidas, de março a junho de 2004, amostras de sangue de 108 carneiros e 920 matrizes de 32 propriedades comerciais de ovinos do Distrito Federal, totalizando 1028 amostras. Os soros foram submetidos à reação de imunofluorescência indireta (RIFI), utilizando-se as diluições 1:64 e 1:50 como ponto de corte para, respectivamente, T. gondii e N. caninum. A prevalência observada para T. gondii foi de 38,22% (26,81% < IC 0,95 < 49,62%). Os títulos variaram de 64 a 65536, e o título com maior freqüência foi 2048 (21,15%). Para N. caninum, a prevalência foi de 8,81% (7,08% < IC 0,95 < 10,53%), com títulos variando de 50 a 51200, sendo o título mais freqüente 50 (21,11%). Ovinos reagentes a ambos os parasitas corresponderam a 4,67%. A análise dos possíveis fatores de risco não foi possível, pois todas as propriedades possuíam ao menos um animal positivo para T. gondii e a maioria (87,50%) das propriedades foram positivas para N. caninum. A prevalência para T. gondii foi significativamente maior entre os machos que entre as fêmeas. Utilizando-se reação em cadeia pela polimerase e enzimas de restrição para o locus SAG2, em uma amostra de cérebro dentre 11 colhidas em um abatedouro da região foi identificado T. gondii tipo I. Os resultados demonstram que as infecções pelos dois parasitas estão presentes e disseminadas no rebanho ovino do Distrito Federal. / From March to June 2004, serum samples from 108 rams and 920 ewes were collected from 32 herds within Distrito Federal, Brazil. The samples were tested by Immunofluorescent Antibody Test, using sera diluted 1:64 and 1: 50 as cut-off values for the detection of antibodies against Toxoplasma gondii and Neospora caninum, respectively. The observed prevalence for T. gondii infection was 38.22% (26.81%<IC 0,95<49.62%). The titers encountered ranged from 64 to 65536, with the most prevalent titer being 2048 (21.15%). The observed prevalence for N. caninum infection was 8.81% (7.08%<IC 0,95<10,53%). The titers ranged from 50 to 51200, being 50 the most frequent titer value (21.11%). The reactant sera to both pathogens corresponded to 4.67% of the samples. The risk factors for T. gondii and N. caninum infections were not determined because of the absence of negative herds for T. gondii infection and the high proportion of herds positive for N. caninum infection (87.50%). The prevalence for T. gondii infection was significantly higher among males than in females. By using the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism of locus SAG2 on 11 brain samples collected in a regional slaughterhouse, only one sample was positive and proved to be archetype I. The results show that infection by both parasites is widespread in the ovine population from Distrito Federal.

Com o objetivo de identificar Toxoplasma gondii e Neospora caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) 217 roedores (quatro camundongos -Mus musculus, 20 ratazanas - Rattus norvegicus e 193 ratos de telhado - Rattus rattus) foram capturados entre abril de 2005 e fevereiro de 2008, para realização do diagnóstico biológico e molecular. Das 20 ratazanas (Rattus norvegicus) capturadas apenas uma foi positiva para T. gondii pelo bioensaio, correspondendo a 5% de positividade entre as ratazanas e 0,46% entre todos os roedores capturados. O isolado obtido dessa ratazana foi caracterizado como genótipo recombinante I, III e u-1 por PCR-RFLP, similar ao isolado previamente descrito e obtido de duas ovelhas e um gato, todos do Estado de São Paulo. Quatro amostras de roedores negativos ao bioensaio resultaram como positivas ao T. gondii pela nested PCR B1. Entretanto, quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) não houve confirmação desse resultado em três delas. Em relação ao N. caninum, amostras de tecido cerebral e cardíaco de 121 roedores foram examinadas por nested PCR Nc5, tendo sido encontradas 12 amostras positivas, provenientes de 10 roedores. Quando submetidas à nested PCR ITS1 e à restrição enzimática (RFLP) N. caninum não foi confirmado em nenhuma das amostras. Este estudo conclui que a ocorrência de T. gondii e N. caninum em roedores urbanos da Grande São Paulo (SP) é baixa, sugerindo que estes animais não possuem papel importante na cadeia epidemiológica como reservatórios desses agentes para predadores como os cães e gatos urbanos. / In order to identify Toxoplasma gondii and Neospora caninum in urban rodents from the Great São Paulo (SP) 217 rodents (four Mus musculus, 20 Rattus norvegicus and 193 Rattus rattus) were captured between April 2005 and February 2008 to biological and molecular diagnosis. One out of the 20 Rattus norvegicus was considered positive by bioassay in mice, corresponding to a 5% positivity among Rattus norvegicus and a 0.46% positivity considering all captured rodents. The isolate from this rat was characterized as a recombinant I, III and u-1 genotype by RFLP-PCR. This characterization had been previously described from isolates obtained from two sheep and one cat also from São Paulo state. Four samples from rodents with negative results by bioassay were positive to T. gondii by nested PCR B1. However, when tested with nested PCR ITS1 and RFLP these results were not confirmed in three of these samples. Regarding N. caninum, brain and heart samples of 121 rodents were examined by nested PCR Nc5 and 12 samples from 10 rodents were positive. When tested with nested PCR ITS1 and RFLP all of these samples turned out to be negative. This study concludes that T. gondii and N. caninum have low occurrence in urban rodents in the Great São Paulo area, and they are not important as T. gondii and/or N. caninum reservoirs to predators like urban cats and dogs.

Em nosso estudo pretendemos estudar a via oral para o desenvolvimento de vacina para toxoplasmose utilizando parasitas irradiados por Cobalto-60, como uma alternativa para a prevenção desta importane parasitose. Para tanto, avaliamos o desenvolvimento da imunidade sistêmica e intestinal e a resistência à infecção, em camundongos imunizados por esta via com taquizoítos irradiados a 255Gy, e desafiados com cistos da cepa ME-49. Camundongos isogênicos C57Bl/6j foram imunizados com 107 taquizoitos de T. gondii irradiados a 255Gy em diferentes esquemas e utilizando adjuvantes leite (anti-péptico) e hidróxido de alumínio (anti-ácido). As preparações de taquizoítos irradiados por via oral induziram produção de imunoglobulinas IgG e IgA no soro de camundongos, sendo predominante a subclasse de IgG2a, similar a infecção crônica, determinadas por ELISA. Seu uso com adjuvantes anti-pépticos ou anti-ácidos induziu produção de IgA fecal e menos significativamente de IgG fecal. Existem indícios de indução de tolerância em nível intestinal, com queda da produção de anticorpos e da proliferação celular antígeno dirigida, especialmente quando o leite foi utilizado como adjuvante, em ensaios de produção in vitro de anticorpos ou proliferação estimulada por antígenos de T.gondii, por esplenócitos e linfócitos intestinais. As preparações orais induziram proteção quantitativa ao desafio dos animais imunizados por cepa cistogênica, que foi semelhante a imunização parenteral, quando o hidróxido de alumínio foi usado como adjuvante. Todos estes dados mostram a possibilidade de desenvolvimento de uma vacina oral para toxoplasmose utilizando taquizoítos irradiados, com aplicação prática num futuro próximo para uso em campo, utilizando iscas atrativas para imunizar felinos domésticos e selvagens. / We study the oral route for the development of a vaccine for toxoplasmosis, using parasites irradiated with 60 Cobalt, as an alternative for vaccine development to this worldwide parasitic infection. We evaluated the development of immunity at serum or mucosal levels, and their efficiency in protect the mice against challenge with oral cysts of the ME-49 strain. C57Bl/6j isogenic mice were immunized by oral route with 107 255 Gy irradiated tachyzoites from RH strain, at several protocols using milk as anti-peptic adjuvant and alum hydroxide as antacid. The preparations of irradiated tachyzoites induced production of serum IgG and IgA in immunized mice, as determined by ELISA, with IgG2a as the dominant subclass, similar to chronic infection. Their use with adjuvant allowed the excretion of significant amounts of IgA in stools also IgG, despite a lesser extent. There are suggestion of tolerance induction at mucosal level, with lower antigen induced proliferation and lower in vitro antibody production by spleen and gut lymphocytes, with the latter doses, specially when milk was used as adjuvant. All oral preparations induced some quantitative protection against challenge, which was similar to the parenteral route only isolated alum hydroxide was used as adjuvant. All these data support the possibility of the development of an oral vaccine against toxoplasmosis, using irradiated tachyzoites, which would be possible tool in near future for use in field baits, for immunizing either domestic or wild felids.

Das Ziel der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit bestand in der Erarbeitung von Datenmaterial zur Bestimmung der Prävalenz von Toxoplasma-gondii-Antikörpern bei Schlachtschweinen und in handelsüblichen Hackfleischproben vom Schwein. Um den Einfluss unterschiedlicher Haltungsbedingungen zu ermitteln, wurde jeder Betrieb anhand einer Checkliste im Rahmen einer Feldstudie überprüft. Die Einteilung der Bestände erfolgte in 5 Kategorien (Kategorie 1: >1000 Tiere, Kategorie 2: >500-1000 Tiere, Kategorie 3: 100-500 Tiere, Kategorie 4: Tiere aus Ökobetrieben, Kategorie 5: Tiere aus einzelbäuerlicher Haltung). Im Zeitraum von Februar 2001 bis August 2002 wurden 1028 Schlachtschweine aus 104 Beständen (958 Mastschweine, 66 Sauen, 4 Spanferkel) schwerpunktmäßig aus dem Landkreis Wittenberg mit Ausnahme der Tiere aus Ökobetrieben in den Schlachtbetrieben beprobt. Als Probematerial dienten Blutserum und aus der Zwerchfellpfeilermuskulatur gewonnener Fleischsaft der Schlachtschweine. Des Weiteren wurden 240 Hackfleischprodukte aus dem Handel beprobt, von denen ebenfalls der Fleischsaft untersucht wurde. Eine weitere Aufgabenstellung der Arbeit bestand darin zu prüfen, ob der als serologischer Test verwendete ELISA neben der Eignung für Blutseren auch zur Untersuchung des Fleischsaftes verwendet werden kann. Es wurde ein ELISA nach SEINEKE (1996) auf der Grundlage eines Tachyzoitenlysates als Antigen verwendet. Die Detektion der gebundenen Antikörper erfolgte durch POD (Meerettichperoxidase)-markierte Anti-Schwein-Antikörper von der Ziege. Zur Bewertung der Messergebnisse wurde ein Indexverfahren herangezogen. Blutserum wurde 1:400, Fleischsaft 1:40 verdünnt. Die Ergebnisse der Studien lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1. Die Untersuchungen mit dem verwendeten ELISA bieten eine akzeptable Sicherheit (Korrelationskoeffizient von rs = 0,841) bei hoher Signifikanz, wie aus den Doppelbestimmungen bei 711 Blutproben ermittelt werden konnte. 2. Fleischsaft ist grundsätzlich für die Anwendung des ELISA bei Ermittlung des Toxoplasmagondii- Antikörperstatus geeignet (Korrelationskoeffizient rs = 0,472; p < 0,01). 3. Die Gesamtprävalenz der Serumproben beträgt 20,6% mit dem Cut-off-Wert bei einem Index > 20. Diese Ergebnisse weisen aus, dass ein beachtliches Toxoplasmoserisiko besteht, wenn Schweinefleisch roh verzehrt wird. 4. Bei Betrachtung der einzelnen Bestandskategorien wurden folgende Seroprävalenzen bei Mastschweinen ermittelt: Kategorie 1: 15,4%, Kategorie 2: 7,3%, Kategorie 3: 16,4%, Kategorie 4: 15,1%. Höchste Prävalenzen ergaben sich bei unter individuellen, einzelbäuerlichen Bedingungen gehaltenen Schweinen der Kategorie 5: 52,0%. 5. Bei Sauen muss auf Grund des Alters generell von höheren Prävalenzen ausgegangen werden. Es wurde ein Wert von 27,2% für alle überprüften Sauen ermittelt. 6. Ein reelles Bild über das Vorkommen von Toxoplasma-gondii-Antikörpern kann nur durch die Betrachtung der Einzelbestände ermittelt werden. So findet man in der Gruppe der Ökotiere (Kategorie 4) Prävalenzschwankungen von 1,4% bis 34,6%, sowie zwischen den Mastschweinebeständen der Kategorien 1 bis 3 von 1,6% bis 20,5%. Insofern kann allein aus der Kenntnis der Haltungsform nicht sicher auf ein geringes oder hohes Vorkommen des Parasiten geschlossen werden. 7. Die Feldstudien in den einzelnen Beständen belegen eindeutig den Einfluss der Haltungsbedingungen der Schweine auf die ermittelten Prävalenzen für Toxoplasma gondii. Grundsätzlich konnte festgestellt werden, dass unabhängig von Bestandsgröße und Haltungskategorie der direkte oder indirekte Einfluss von Katzen (z.B. über Ausläufe, Futter, Einstreu) als wesentliche Ursache für die Präsenz des Parasiten angesehen werden muss. 8. Beim Hackfleisch wurde eine Gesamtprävalenz für Toxoplasma-gondii-Antikörper von 5,3% nachgewiesen. Dies belegt das Risiko für Infektionen mit Toxoplasma gondii insbesondere beim Verzehr von rohen bzw. unzureichend erhitzten Schweinefleischerzeugnissen. Die vorliegenden Untersuchungen liefern für ein begrenztes Territorium Datenmaterial zu Prävalenzen von Toxoplasma gondii sowohl für Proben von Schlachtschweinen als auch für Hackfleischproben aus dem Handel. Zur Bewertung des deutschlandweit zu erwartenden Risikos sind jedoch weitere flächendeckende Untersuchungen erforderlich.

Einleitung: Toxoplasma (T.) gondii zählt zu den häufigsten intrazellulären Parasiten weltweit. Alleinige Endwirte im fakultativ heteroxenen Lebenszyklus sind die Feliden. Als Zwischenwirte können jedoch zahlreiche Säugetier- und Vogelarten dienen, in denen sich parasitäre Gewebezysten entwickeln. Einer der Hauptübertragungswege auf den Menschen stellt der Verzehr von T. gondii-haltigem Fleisch infizierter Nutztiere dar. Inwieweit Putenfleisch ein potentielles Infektionsrisiko birgt und welche Bedeutung Puten in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose besitzen ist nicht ausreichend geklärt. Ziel der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein reproduzierbares Infektionsmodell bei Puten für T. gondii zu entwickeln, um die Verteilung und Persistenz des Parasiten im Gewebe zu ermitteln. Es wurden verschiedene Parameter, wie Infektionsstadium, Infektionsdosis, Applikationsmodus und Untersuchungszeitpunkt hinsichtlich ihres Einflusses auf die Entwicklung parasitärer Gewebestadien verglichen. Material und Methoden: Insgesamt wurden 74 Puten nach einer Aufzuchtperiode von 4 bis 8 Wochen experimentell mit T. gondii-Tachyzoiten oder Oozysten infiziert. Je nach Versuchsgruppe wurden Tachyzoiten vom Stamm ME49 intravenös und/oder intramuskulär appliziert oder Oozysten vom Stamm ME49, DX oder Hannover 1 oral verabreicht. Die Verifikation der Infektion erfolgte über den Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper mit Hilfe eines kinetischen ELISA. Drei bis acht Puten jeder Versuchsgruppe wurden 6 bis 8 oder 10 bis 12 Wochen nach der Infektion getötet. Von jedem Tier wurden folgende Gewebeproben entnommen: Brust-, Oberschenkel- und Unterschenkelmuskulatur, Herz, Leber, Muskel- und Drüsenmagen, Gehirn, Lunge, Milz, Nieren, Darm, Pankreas und Hoden (sofern vorhanden). Die Organe wurden getrennt vollständig homogenisiert. Bei den Muskeln wurden Proben von verschiedenen Lokalisationen entnommen und ebenfalls einzeln homogenisiert. Der Nachweis von T. gondii-DNA in den Gewebeproben erfolgte mittels konventioneller PCR, basierend auf der Amplifizierung eines 469 bp Fragments des B1-Gens, und anschließender nested PCR (Länge Zielfragment: 375 bp). Zusätzlich wurden zu Beginn der Studie lichtmikroskopische Untersuchungen einzelner Organe in Form nativer Quetschpräparate (400fache Vergrößerung) auf T. gondii-Zysten durchgeführt. Ergebnisse: Ungeachtet der Infektionsdosis und des inokulierten Parasitenstadiums konnten bei keinem der Versuchstiere klinische Symptome einer Toxoplasmose beobachtet werden. Die unterschiedlich hohen Infektionsdosen hatten im Allgemeinen keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl positiv getesteter Puten oder Organproben. Lediglich die Anzahl positiver Gehirnproben nahm mit ansteigender Oozystendosis signifikant zu. Bei der Betrachtung aller Versuchsgruppen fiel auf, dass die Befallshäufigkeit der Organe sowohl zwischen den Tieren verschiedener Infektionsgruppen als auch innerhalb einer Infektionsgruppe stark schwankte. So variierte die Anzahl positiv getesteter Organe bei den Tachyzoiten-infizierten Puten zwischen 0 und 7, bei den Oozysten-infizierten Puten zwischen 0 und 9 Organen pro Tier. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass sich T. gondii heterogen in der Pute verteilt und mindestens 12 Wochen persistieren kann. Bezogen auf alle Versuchstiere gab es kein Organ, dass durchgängig negativ blieb. Nach der Tachyzoiteninfektion waren am häufigsten Leber (43,3%), gefolgt von Brustmuskel (26,7%) und Herz (20,0%) infiziert, während bei den Oozysten-infizierten Tieren der Erreger am häufigsten im Gehirn (47,2%), gefolgt von Oberschenkelmuskulatur (25,0%) und Herz und Unterschenkelmuskulatur (je 22,2%) nachgewiesen werden konnte. Schlussfolgerungen: Tachyzoiten und Oozysten erwiesen sich als gleichermaßen geeignete Infektionsmedien und führten hinsichtlich der systemischen Verteilung des Parasiten in der Pute zu vergleichbaren Ergebnissen. Ein spezifischer Organtropismus des Erregers konnte nicht festgestellt werden. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene und des Verbraucherschutzes bedeuten die Ergebnisse, dass im Fall einer T. gondii-Infektion ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann.

Les Apicomplexa sont des parasites intracellulaires obligatoires. Ils peuvent être responsables d’importantes maladies infectieuses. Toxoplasma gondii par exemple, se développe au sein de la cellule hôte, dans une niche protectrice « la vacuole parasitophore » jusqu’à épuisement des ressources de la cellule hôte ou il provoque sa sortie pour ré envahir à nouveau, c’est la phase aigüe de la toxoplasmose. Afin de répondre à leur besoins nutritifs nécessaires à cette expansion rapide, le parasite combine de manière intéressante et très complexe les voies de synthèse de novo et d’import des nutriments depuis la cellule hôte. Dans le cas des lipides, le parasite en a besoin en une importante quantité pour assurer la ségrégation des organites, la formation des nouvelles membranes filles et l’expansion de la membrane de la vacuole parasitophore pendant la division. La synthèse de novo des lipides a été reportée essentielles pour le parasite tout comme la synthèse de novo des acides gras via la voie procaryote de synthèse des acides gras FASII dans l’apicoplaste.Dans cette étude nous apportant des éléments intéressants qui relient la voie de synthèse FASII et la synthèse des lipides. Nous avons pu démontrer que l’apicoplaste possède une voie de synthèse des précurseurs important voire essentielles à la synthèse de tous les lipides membranaires, qui est principalement le LPA dans le cas de T. gondii. Les enzymes acyltransférase impliquées dans la synthèse de ces précurseurs sont TgATS1 et TgATS2 pour former le LPA et le PA respectivement. Elles sont ortologues aux enzymes précédemment caractérisées chez les bactéries et le chloroplaste des plantes et algues. Les modifications de ces enzymes et les analyses de lipidique et de spectrométrie de masse, ont révélé le rôle l’implication de ces enzymes dans la synthèse des phospholipides membranaires à partir des acides gras néo synthétisés de novo (le C14:0). Cette étude présente aussi des résultats préliminaires sur une voie de synthèse du PA dans le réticulum endoplasmique. La être de TgATS2 n’est pas létale et elle est compensée par augmentation de l’abondance des acides gras C16 :0 et C18 :0 dans la fraction des phospholipides extraits. Ces informations suggèrent une importante collaboration entre l’apicoplaste et le réticulum endoplasmique pour la synthèse des lipides nécessaires pour le développement intracellulaire du parasite. / Apicomplexa phylum includes a large number of obligate intracellular parasites responsible for important human and animal diseases, especially malaria and toxoplasmosis. There is current no efficient vaccine against these parasites. Severe toxoplasmosis caused by Toxoplasma gondii, occurs in immunocompromised individuals and during congenital infection. T. gondii is dependent on large amounts of lipids for its intracellular development within the host cell. These lipids are acquired by a combination of host lipid scavenging and de novo biosynthetic pathways. T. gondii is able to de novo synthesis of fatty acid via a prokaryotic FASII pathway in the apicoplast, a relict non-photosynthetic plastid. Genome mining suggests that the apicoplast can generate phosphatidic acid, central phospholipid precursor. Our recent work confirmed that the apicoplast harbors the first step of PA synthesis via a glycerol-3-phosphate acyltransferase enzyme called ATS1 by homology to chloroplast enzyme, which generates lysophosphatidic acid (LPA). This essential LPA can be exported from the apicoplast for the de novo bulk synthesis of phospholipids sustaining parasite membrane biogenesis (Amiar et al. Plos Path. 2016). T. gondii genome encodes for two other acyltransferases named sn-acylglycerol 3-Phosphate acyltransferases (AGPAT). AGPATs ensure the second step of PA synthesis using LPA. In this work we showed that these enzymes are localized in the Endoplasmic Reticulum and the apicoplast (named AGPAT and ATS2, respectively). A genetic disruption of ATS2 using CRISPR-Cas9 strategy affects parasite growth and normal cytokinesis. Lipidomic analysis using mass spectrometry combined to stable isotope labelling of ATS2-KO reveals an important reduction of lipids containing apicoplast-generated fatty acid C14:0. However, an increase of lipids containing C16 and C18 fatty acids was observed, suggesting a compensation of ATS2 loss by AGPAT activity in ER. These data indicated an important collaboration between apicoplast and ER for lipid synthesis that involves massive lipid trafficking between the two organelles.