Cellular function and physiology are largely established through regulated gene expression. The first step in gene expression, transcription of the genomic DNA into RNA, is a process that is highly aligned at the levels of initiation, elongation and termination. In eukaryotes, protein-coding genes are exclusively transcribed by RNA polymerase II (Pol II). Upon transcription of the first 15-20 nucleotides (nt), the emerging nascent RNA 5’ end is modified with a 7-methylguanosyl cap. This is one of several RNA modifications and processing steps that take place during transcription, i.e. co-transcriptionally. For example, protein-coding sequences (exons) are often disrupted by non-coding sequences (introns) that are removed by RNA splicing. The two transesterification reactions required for RNA splicing are catalyzed through the action of a large macromolecular machine, the spliceosome. Several non-coding small nuclear RNAs (snRNAs) and proteins form functional spliceosomal subcomplexes, termed snRNPs. Sequentially with intron synthesis different snRNPs recognize sequence elements within introns, first the 5’ splice site (5‘ SS) at the intron start, then the branchpoint and at the end the 3’ splice site (3‘ SS). Multiple conformational changes and concerted assembly steps lead to formation of the active spliceosome, cleavage of the exon-intron junction, intron lariat formation and finally exon-exon ligation with cleavage of the 3’ intron-exon junction. Estimates on pre-mRNA splicing duration range from 15 sec to several minutes or, in terms of distance relative to the 3‘ SS, the earliest detected splicing events were 500 nt downstream of the 3‘ SS. However, the use of indirect assays, model genes and transcription induction/blocking leave the question of when pre-mRNA splicing of endogenous transcripts occurs unanswered. In recent years, global studies concluded that the majority of introns are removed during the course of transcription. In principal, co-transcriptional splicing reduces the need for post-transcriptional processing of the pre-mRNA. This could allow for quicker transcriptional responses to stimuli and optimal coordination between the different steps. In order to gain insight into how pre-mRNA splicing might be functionally linked to transcription, I wanted to determine when co-transcriptional splicing occurs, how transcripts with multiple introns are spliced and if and how the transcription termination process is influenced by pre-mRNA splicing. I chose two yeast species, S. cerevisiae and S. pombe, to study co-transcriptional splicing. Small genomes, short genes and introns, but very different number of intron-containing genes and multi-intron genes in S. pombe, made the combination of both model organisms a promising system to study by next-generation sequencing and to learn about co-transcriptional splicing in a broad context with applicability to other species. I used nascent RNA-Seq to characterize co-transcriptional splicing in S. pombe and developed two strategies to obtain single-molecule information on co-transcriptional splicing of endogenous genes: (1) with paired-end short read sequencing, I obtained the 3’ nascent transcript ends, which reflect the position of Pol II molecules during transcription, and the splicing status of the nascent RNAs. This is detected by sequencing the exon-intron or exon-exon junctions of the transcripts. Thus, this strategy links Pol II position with intron splicing of nascent RNA. The increase in the fraction of spliced transcripts with further distance from the intron end provides valuable information on when co-transcriptional splicing occurs. (2) with Pacific Biosciences sequencing (PacBio) of full-length nascent RNA, it is possible to determine the splicing pattern of transcripts with multiple introns, e.g. sequentially with transcription or also non-sequentially. Part of transcription termination is cleavage of the nascent transcript at the polyA site. The splicing status of cleaved and non-cleaved transcripts can provide insights into links between splicing and transcription termination and can be obtained from PacBio data. I found that co-transcriptional splicing in S. pombe is similarly prevalent to other species and that most introns are removed co-transcriptionally. Co-transcriptional splicing levels are dependent on intron position, adjacent exon length, and GC-content, but not splice site sequence. A high level of co-transcriptional splicing is correlated with high gene expression. In addition, I identified low abundance circular RNAs in intron-containing, as well as intronless genes, which could be side-products of RNA transcription and splicing. The analysis of co-transcriptional splicing patterns of 88 endogenous S. cerevisiae genes showed that the majority of intron splicing occurs within 100 nt downstream of the 3‘ SS. Saturation levels vary, and confirm results of a previous study. The onset of splicing is very close to the transcribing polymerase (within 27 nt) and implies that spliceosome assembly and conformational rearrangements must be completed immediately upon synthesis of the 3‘ SS. For S. pombe genes with multiple introns, most detected transcripts were completely spliced or completely unspliced. A smaller fraction showed partial splicing with the first intron being most often not spliced. Close to the polyA site, most transcripts were spliced, however uncleaved transcripts were often completely unspliced. This suggests a beneficial influence of pre-mRNA splicing for efficient transcript termination. Overall, sequencing of nascent RNA with the two strategies developed in this work offers significant potential for the analysis of co-transcriptional splicing, transcription termination and also RNA polymerase pausing by profiling nascent 3’ ends. I could define the position of pre-mRNA splicing during the process of transcription and provide evidence for fast and efficient co-transcriptional splicing in S. cerevisiae and S. pombe, which is associated with highly expressed genes in both organisms. Differences in S. pombe co-transcriptional splicing could be linked to gene architecture features, like intron position, GC-content and exon length.

Position weight matrices (PWMs) have become a tool of choice for the identification of transcription factor binding sites in DNA sequences. PWMs are compiled from experimentally verified and aligned binding sequences. PWMs are then used to computationally discover novel putative binding sites for a given protein. DNA-binding proteins often show degeneracy in their binding requirement, the overall binding specificity of many proteins is unknown and remains an active area of research. Although PWMs are more reliable predictors than consensus string matching, they generally result in a high number of false positive hits. A previous study introduced a novel method to PWM training based on the known motifs to sample additional putative binding sites from a proximal promoter area. The core idea was further developed, implemented and tested in this thesis with a large scale application. Improved mono- and dinucleotide PWMs were computed for Drosophila melanogaster. The Matthews correlation coefficient was used as an optimization criterion in the PWM refinement algorithm. New PWMs keep an account of non-uniform background nucleotide distributions on the promoters and consider a larger number of new binding sites during the refinement steps. The optimization included the PWM motif length, the position on the promoter, the threshold value and the binding site location. The obtained predictions were compared for mono- and dinucleotide PWM versions with initial matrices and with conventional tools. The optimized PWMs predicted new binding sites with better accuracy than conventional PWMs.

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris VI, France / Le contrôle de la transcription constitue le principal niveau de la régulation de l’expression des gènes dans les cellules eucaryotes. Dans le génome de ces derniers, les éléments régulateurs peuvent être localisés à de très grandes distances du gène qu’ils régulent. Le laboratoire a identifié 6 familles indépendantes avec un diabète insipide néphrogénique (DIN) lié à l’X portant de grandes délétions en amont du gène de l’AVPR2. Dans chacune de ces familles, les gènes AVPR2 et AQP2 ont été retrouvés intacts et les hommes sont atteints de DIN lié à l’X dans sa forme rénale « classique ». Le séquençage et l’analyse de 30 et 31 kilobases en amont et en aval de l’AVPR2 ont permis l’identification de 6 zones délétées chez 6 familles indépendantes, dont 5 zones de taille supérieure à 7 kilo bases, et une zone, de 102 paires de bases, commune à l’ensemble des délétions. Chez le patient porteur de cette délétion, l’osmolalité urinaire ne répond pas au dDAVP. Contrairement à ce qui est observé chez les patients atteints de DIN avec mutations de l’AVPR2, celui-ci présente des réponses hémodynamiques et de coagulation, normales. Ceci indique que les récepteurs V2 ne sont pas exprimés dans le tubule collecteur mais le sont au niveau des cellules endothéliales. Le but de notre travail est donc de tenter de comprendre les mécanismes régulateurs du locus de l’AVPR2, et plus précisément d’étudier l’expression « tissu spécifique » de ce gène. Les études réalisées in vivo, dans le système Hprt, confirment le rôle activateur de la séquence de 102 pb : coloration intense des tubules collecteurs avec la construction comportant la zone délétée et absence avec la construction ne la contenant pas. Cependant, les expériences menées in vitro semblent indiquer que cet effet dépende du contexte extracellulaire, isotonique ou hypertonique, de la nature des cellules, du tubule proximal ou collecteur, ainsi que du promoteur de l’AVPR2. L’identification des protéines liant potentiellement l’une des extrémités de la délétion a révélé la présence, soit de protéines régulatrices, soit de séquences inconnues, toutes exprimées dans le rein. À terme, ces études, ainsi que celles en découlant, permettront de positioner l’AVPR2 comme une cible de choix dans le traitement des diabètes insipides, centraux et néphrogéniques, par thérapie génique. / Transcriptional control is the primary means of regulating genes expression in eukaryotes cells. In the genome of the latter, regulatory elements can be localised with very long distance from the gene which they control. The laboratory identified six independent families with X-linked nephrogenic diabete insipidus (NDI) bearing large deletions upstream of the AVPR2 gene leaving intact AVPR2 and AQP2 coding sequences. Males bearing these deletions have classical renal X-linked NDI. The sequencing and analysis of 30 and 31 kilo bases upstream and downstream, respectively, encompassing the AVPR2 gene had led to identify 6 deletions in 6 ancestrally independent families including, 5 larger than 7 kilo bases and one of 102 base paires shared by the other deletions. In male patient bearing the 102 bp upstream deletion, urinary osmolality was unresponsive to dDAVP but, unlike patients with mutations in the coding sequence, their coagulation and hemodynamic responses to dDAVP were normal. This suggests that V2 receptors are not expressed in renal collecting duct cells but normally expressed in endothelial cells. Our goal is thus to understand the regulatory mechanism controlling the AVPR2 locus and more precisely the tissu specific expression of this gene.. The studies carried out in vivo, in the Hprt system, confirm the enhancer role of the sequence of 102 bp: intense coloration of the collecting tubules with construction comprising the deleted zone and abscence with construction not containing it. However, in vitro undertaken experiments seem to indicate that this effect depends on the extracellular context, isotonic or hypertonic, of the nature of the cells, of the tubule proximal or collecting duct, as well as promoter of the AVPR2. The identification of proteins potentially binding one of the ends of the deletion revealed the presence, either of regulating proteins, or of unknown sequences, all expressed in the kidney. In the long term, these studies, like those while rising, will make it possible to position the AVPR2 gene like a target of choice in the treatment of the diabetes insipidus, central and nephrogenic, by genic therapy.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) altère les fonctions du système immunitaire pour promouvoir sa persistance. Les composantes de l’immunité ciblées par le VIH-1 incluent les lymphocytes Th17 et les cellules dendritiques dérivées des monocytes (CDDMs). Deux sous-populations de lymphocytes Th17, nommées Th17 et Th1Th17, ont précédemment été décrites avec des propriétés transcriptionnelles et des spécificités antigéniques distinctes. Les cellules Th17 et Th1Th17 sont hautement permissives à l’infection par le VIH et leur fréquence est diminuée chez les sujets chroniquement infectés sous trithérapie antirétrovirale. Toutefois, seulement une fraction des lymphocytes Th17 est infectée par le VIH, indiquant l’existence de Th17 résistants à la réplication virale. Également, il est connu que l’infection à VIH induit une altération de la fréquence des monocytes reflétée par l’expansion de la population monocytaire exprimant le récepteur Fcγ de type III/CD16. Les monocytes sont des précurseurs de cellules dendritiques et une altération de ratio entre les monocytes CD16+ et CD16- pourrait avoir des conséquences délétères sur la qualité des réponses immunitaires. Le rôle fonctionnel des CDDM exprimant ou non CD16 dans le contexte de la pathogénèse à VIH-1 demeure inconnu. Ce projet de thèse est divisé en 2 parties: 1) l’étude de l’hétérogénéité des cellules Th17 et 2) la caractérisation approfondie des CDDM CD16+ et CD16- dans le contexte d’homéostasie et de la pathogénèse de l’infection à VIH. Dans la première partie, nous avons fonctionnellement caractérisé deux nouvelles sous-populations de lymphocytes Th17 avec une expression différentielle des récepteurs de chimiokines CXCR3 et CCR4 : nommés CCR6+DN et CCR6+DP, exprimant toutes les deux CCR6, marqueur de lymphocytes Th17. Nous avons démontré que les cellules CCR6+DN et CCR6+DP partagent des caractéristiques biologiques communes avec les cellules Th17 et Th1Th17 incluant la permissivité au VIH. Nos résultats indiquent que les cellules CCR6+DN représentent un stade précoce de différentiation des lymphocytes Th17 et expriment des marqueurs de cellules T folliculaires. De plus, comparativement aux sous-populations Th17, Th1Th17 et CCR6+DP, la fréquence et le compte des CCR6+DN sont préservés au sein des sujets chroniquement infectés sous thérapie antirétrovirale. Nous proposons un modèle dans lequel les cellules CCR6+DN représentent des lymphocytes Th17 résistantes à l’effet cytopatique du virus qui contribuent à la persistance virale par leur capacité de porter un virus compétent en matière de réplication. Dans la deuxième partie, nos résultats révèlent que les CDDMs CD16+ et CD16- représentent deux populations uniques avec des propriétés transcriptionelles et fonctionnelles distinctes. Les CDDMs CD16- détiennent un potentiel immunogène supérieur tandis que les CDDMs CD16+ ont une meilleure capacité de transmettre le virus aux cellules T CD4+ au repos. Également, nous confirmons l’effet néfaste du VIH sur les fonctions immunologiques des cellules DC à stimuler la prolifération et la polarisation des cellules Th17 spécifiques à C. albicans et à S. aureus. En conclusion, les résultats inclus dans cette thèse fournissent une compréhension détaillée sur l’hétérogénéité présente au sein des lymphocytes Th17 et des CDDMs et révèlent de nouveaux déterminants moléculaires de l’immunité exploités par le VIH au profit de sa persistance. / The ultimate aim of immunity is to restrict the emergence of exogenous pathogens while providing immune tolerance to self-antigens. The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) disrupts the functions of the immune system to promote its own dissemination and persistence. The components of the host immunity targeted by HIV-1 include the Th17 lineage and the monocytes. The Th17 lineage was previously reported to include two different populations referred to as the Th17 and Th1Th17 cells exhibiting different transcriptional profiles and antigenic specificities. Both Th17 and Th1Th17 cells are permissive to HIV and their frequency is reduced in the blood and gut mucosa of chronically HIV-infected subjects. Nevertheless, HIV-1 infects only a fraction of the Th17 pool, suggesting the existence of Th17 cells resistant to HIV. In addition, it well documented that HIV-1 infection alters the pool of peripheral blood monocytes and induces the expansion of a monocytic population expressing the Fcγ receptor III/CD16. Monocytes are precursors for dendritic cells (DCs) and an altered CD16+/CD16- monocyte ratio may have deleterious consequences on the quality of immune responses. The functional features of CD16+ versus CD16- monocyte-derived DCs (MDDCs) in the context of HIV infection remain to be elucidated. This thesis is divided in two parts: 1) the study of Th17 cell heterogeneity and 2) the in depth characterization of CD16+ and CD16- monocytes-derived DCs (MDDCs) at homeostasis and during HIV-1 infection. In the first part, we have identified and functionally characterized two new previously uncharacterized subsets of CCR6+ T-cells with differential expression of CXCR3 and CCR4, double negative CCR4-CXCR3- (CCR6+DN) and double positive CCR4+CXCR3+ (CCR6+DP) subsets. We demonstrated CCR6+DN and CCR6+DP share cytokine production, antigenic specificity, lineage plasticity and HIV permissiveness with the previously characterized Th17 (CCR6+CCR4+CXCR3-) and Th1Th17 (CCR6+CCR4-CXCR3+) subsets. Among these four Th17 subsets, CCR6+DN cells were found to represent an early stage of Th17 differentiation and expressed features of T follicular helper T-cells. Moreover, in contrast to Th17, Th1Th17 and CCR6+DP subsets, the frequency and counts of CCR6+DN cells was preserved in chronically HIV-infected subjects under antiretroviral treatments compared to uninfected controls. Our results suggest that CCR6+DN represent long-lived Th17 cells contributing to HIV persistence by carrying replication-competent virus. In the second part, our results reveal that CD16+ and CD16- MDDCs represent two distinct populations with unique transcriptional programs and immunological functions. CD16- MDDCs displayed a superior immunogenic potential, whereas CD16+ MDDCs exhibited a higher capacity to induce HIV replication in resting CD4+ T-cells. Also, we confirmed the negative effect of HIV on DCs immunogenic function involving the stimulation of T-cell proliferation and Th17 polarization in response to pathogens such as C. albicans and S. aureus. Overall, in this thesis we provide a better understanding on Th17 and MDDC heterogeneity and reveal new molecular determinants of pathogenicity in immune cells that are exploited by HIV-1 to insure its persistence in the infected host.

Plusieurs souches cliniques de Candida albicans résistantes aux médicaments antifongiques azolés surexpriment des gènes encodant des effecteurs de la résistance appartenant à deux classes fonctionnelles : i) des transporteurs expulsant les azoles, CDR1, CDR2 et MDR1 et ii) la cible des azoles 14-lanostérol déméthylase encodée par ERG11. La surexpression de ces gènes est due à la sélection de mutations activatrices dans des facteurs de transcription à doigts de zinc de la famille zinc cluster (Zn2Cys6) qui contrôlent leur expression : Tac1p (Transcriptional activator of CDR genes 1) contrôlant l’expression de CDR1 et CDR2, Mrr1p (Multidrug resistance regulator 1), régulant celle de MDR1 et Upc2p (Uptake control 2), contrôlant celle d’ERG11. Un autre effecteur de la résistance clinique aux azoles est PDR16, encodant une transférase de phospholipides, dont la surexpression accompagne souvent celle de CDR1 et CDR2, suggérant que les trois gènes appartiennent au même régulon, potentiellement celui de Tac1p. De plus, la régulation transcriptionnelle du gène MDR1 ne dépend pas seulement de Mrr1p, mais aussi du facteur de transcription de la famille basic-leucine zipper Cap1p (Candida activator protein 1), un régulateur majeur de la réponse au stress oxydatif chez C. albicans qui, lorsque muté, induit une surexpression constitutive de MDR1 conférant la résistance aux azoles. Ces observations suggèrent qu’un réseau de régulation transcriptionnelle complexe contrôle le processus de résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans. L’objectif de mon projet au doctorat était d’identifier les cibles transcriptionnelles directes des facteurs de transcription Tac1p, Upc2p et Cap1p, en me servant d’approches génétiques et de génomique fonctionnelle, afin de i) caractériser leur réseau transcriptionnel et les modules transcriptionnels qui sont sous leur contrôle direct, et ii) d’inférer leurs fonctions biologiques et ainsi mieux comprendre leur rôle dans la résistance aux azoles. Dans un premier volet, j’ai démontré, par des expériences de génétique, que Tac1p contrôle non seulement la surexpression de CDR1 et CDR2 mais aussi celle de PDR16. Mes résultats ont identifié une nouvelle mutation activatrice de Tac1p (N972D) et ont révélé la participation d’un autre régulateur dans le contrôle transcriptionnel de CDR1 et PDR16 dont l’identité est encore inconnue. Une combinaison d’expériences de transcriptomique et d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à l’hybridation sur des biopuces à ADN (ChIP-chip) m’a permis d’identifier plusieurs gènes dont l’expression est contrôlée in vivo et directement par Tac1p (PDR16, CDR1, CDR2, ERG2, autres), Upc2p (ERG11, ERG2, MDR1, CDR1, autres) et Cap1p (MDR1, GCY1, GLR1, autres). Ces expériences ont révélé qu’Upc2p ne contrôle pas seulement l’expression d’ERG11, mais aussi celle de MDR1 et CDR1. Plusieurs nouvelles propriétés fonctionnelles de ces régulateurs ont été caractérisées, notamment la liaison in vivo de Tac1p aux promoteurs de ses cibles de façon constitutive et indépendamment de son état d’activation, et la liaison de Cap1p non seulement à la région du promoteur de ses cibles, mais aussi celle couvrant le cadre de lecture ouvert et le terminateur transcriptionnel putatif, suggérant une interaction physique avec la machinerie de la transcription. La caractérisation du réseau transcriptionnel a révélé une interaction fonctionnnelle entre ces différents facteurs, notamment Cap1p et Mrr1p, et a permis d’inférer des fonctions biologiques potentielles pour Tac1p (trafic et la mobilisation des lipides, réponse au stress oxydatif et osmotique) et confirmer ou proposer d’autres fonctions pour Upc2p (métabolisme des stérols) et Cap1p (réponse au stress oxydatif, métabolisme des sources d’azote, transport des phospholipides). Mes études suggèrent que la résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans est intimement liée au métabolisme des lipides membranaires et à la réponse au stress oxydatif. / Many azole resistant Candida albicans clinical isolates overexpress genes encoding azole resistance effectors that belong to two functional categories: i) CDR1, CDR2 and MDR1, encoding azole-efflux transporters and ii) ERG11, encoding the target of azoles 14-lanosterol demethylase. The constitutive overexpression of these genes is due to activating mutations in transcription factors of the zinc cluster family (Zn2Cys6) which control their expression. Tac1p (Transcriptional activator of CDR genes 1), controlling the expression of CDR1 and CDR2, Mrr1p (Multidrug resistance regulator 1), regulating MDR1 expression and Upc2p (Uptake control 2), controlling the expression of ERG11. Another determinant of clinical azole resistance is PDR16, encoding a phospholipid transferase, whose overexpression often accompanies that of CDR1 and CDR2 in clinical isolates, suggesting that the three genes belong to the same regulon, potentially that of Tac1p. Further, MDR1 expression is not only regulated by Mrr1p, but also by the basic-leucine zipper transcription factor Cap1p (Candida activator protein 1), which controls the oxidative stress response in C. albicans and whose mutation confers azole resistance via MDR1 overexpression. These observations suggest that a complex transcriptional regulatory network controls azole resistance in C. albicans. My Ph.D. studies are aimed at identifying the direct transcriptional targets of Tac1p, Upc2p and Cap1p using genetics and functional genomics approches in order to i) characterize their regulatory network and the transcriptional modules under their direct control and ii) infer their biological functions and better understand their roles in azole resistance. In the first part of my studies, I showed that Tac1p does not only control the expression of CDR1 and CDR2, but also that of PDR16. My results also identified a new activating mutation in Tac1p (N972D) and revealed that the expression of CDR1 and PDR16 is under the control of another yet unknown regulator. The combination of transcriptomics and genome-wide location (ChIP-chip) approaches allowed me to identify the in vivo direct targets of Tac1p (PDR16, CDR1, CDR2, ERG2, others), Upc2p (ERG11, ERG2, MDR1, CDR1, others) and Cap1p (MDR1, GCY1, GLR1, others). These results also revealed that Upc2p does not only control the expression of ERG11 but also that of MDR1 and CDR1. Many new functional features of these transcription factors were found, including the constitutive binding of Tac1p to its targets under both activating and non-activating conditions, and the binding of Cap1p which extends beyond the promoter region of its target genes, to cover the open reading frame and the putative transcription termination regions, suggesting a physical interaction with the transcriptional machinery. The characterization of the transcriptional regulatory network revealed a functional interaction between these factors, notably between Cap1p and Mrr1p, and inferred potential biological functions for Tac1p (lipid mobilization and traffic, response to oxidative and osmotic stress) and confirmed or suggested other functions for Upc2p (sterol metabolism) and Cap1p (oxidative stress response, regulation of nitrogen utilization and phospholipids transport). Taken together, my results suggest that azole resistance in C. albicans is tightly linked to membrane lipid metabolism and oxidative stress response.

HYAL-1 (hyaluronidase-1) appartient à la famille des hyaluronidases connues pour leur rôle dans la dégradation de l’acide hyaluronique. L’expression de HYAL-1 est élevée dans de nombreux type de cancers, notamment dans le cancer de la prostate, de la vessie, des reins et du sein où il est impliqué dans la croissance tumorale et les métastases. Récemment notre laboratoire a aussi démontré une expression élevée de HYAL-1 dans le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) de type mucineux et à cellules claires, expression qui est inversement corrélée à celle du récepteur de l’oestrogène alpha (REα). Cependant, malgré le fait que le rôle de HYAL-1 dans le cancer soit bien établit, le mécanisme de sa régulation reste encore inconnu. Le REα est un facteur de transcription qui suite à sa liaison avec son ligand va réguler l’expression de plusieurs gènes. Le REα ainsi stimulé par l’hormone va activer la transcription de ces gènes cibles mais il est connu maintenant qu’une grande partie des gènes régulés par le REα sont en réalité réprimés par ce récepteur. Dans ce travail nous proposons d’étudier le mécanisme de la régulation du gène HYAL-1 par le REα dans le CEO à cellules claires et dans le cancer du sein. L’expression ectopique du REα dans la lignée TOV21G (RE-) de même que le traitement de la lignée MCF-7 (RE+) avec de l’oestrogène a induit une diminution du niveau d’expression de l’ARN m de HYAL-1. Ces résultats nous ont permis de confirmer que HYAL-1 est un gène cible du REα. Il est aussi connu que le REα peut exercer son action par différents mécanismes d’action, entre autres en interagissant avec une séquence d’ADN appelée élément de réponse à l’oestrogène (ERE), retrouvé sur le promoteur des gènes cibles ou bien indirectement par des interactions protéine-protéine en se liant à d’autres facteur de transcription tels que Sp1. Après avoir identifiés de telles séquences sur le promoteur proximal de HYAL-1, (1 ERE proximal à -900 pb, 3 distaux à -32350 pb, 48430, -50130 pb du site d’initiation de la transcription) en plus des 2 Sp1 connus (-60 et – 1020pb), nous avons démontrés par immunoprécipitation de la chromatine que le REα est recruté sur le promoteur de HYAL-1 au niveau de l’ERE proximal -900 pb et du distal -32350 pb de même que sur le site Sp1 -1020 pb. De plus, l’activité biologique de l’ERE -900 pb et du ii Sp1-1020pb à été confirmée par des essais de gènes rapporteurs à la luciférase. Avec son rôle connu dans la tumorigenèse, l’identification de HYAL-1 comme gène cible du REα pourrait être une avenue intéressante pour le traitement des cancers hormono-indépendants. / HYAL-1 (hyaluronidase-1) belongs to the hyaluronidase family of enzymes that degrade hyaluronic acid. HYAL-1 expression is elevated in many types of cancers including prostate, bladder, liver and breast cancer where it is involved in tumor growth and metastasis. In accordance to these observations, our group has also demonstrated high expression of HYAL-1 in clear cell and mucinous epithelial ovarian cancer (EOC) subtypes which was inversely correlated to that of estrogen receptor alpha (ERα). However, despite the fact that the role of HYAL-1 in cancer is well established, the mechanism of its regulation is still unknown. ERα is a transcriptional factor that regulates target-gene expression following ligand binding. Upon hormone stimulation, activated ERα will upregulate transcription of many target genes. However, it has been recently well documented that a large number of ERα responsive genes are in fact repressed. In this work we propose to study the mechanism by which ERα regulates HYAL-1 expression in clear cell EOC subtype as well as in breast cancer. The ectopic expression of ERα in TOV21G cell line (ERα -) and estrogen treatment of MCF-7 cells (ERα +) decreased HYAL-1 mRNA expression and allowed us to confirm that HYAL-1 is an ERα target gene. It is also known that ERα may exert its action through different mechanisms of action including interacting with a DNA sequence called estrogen response element (ERE) found in the promoter of target genes or indirectly by protein-protein interactions by binding to other transcription factor such as Sp1. Having identified such sequences in the proximal promoter of HYAL-1, (one proximal ERE -900 bp, 3 distals at -32350, -48430, -50130 bp from the start site of transcription) in addition to the two known Sp1 (-60 and -1020pb), we have demonstrated by chromatin immunoprecipitation that ERα is recruited at the HYAL-1 promoter at the ERE sites -900 pb and -32350 pb as well as at the Sp1 site -1020. Furthermore, the biological activity of the proximal ERE -900 and Sp1 -1020 sites were further confirmed by luciferase reporter gene assay. Given its known role in tumorigenesis, identification of HYAL-1 as an ERα target may provide an interesting approach for the treatment of hormono-independent cancer.

Le développement et l'homéostasie des os requièrent l'orchestration spatio-temporelle d'un grand nombre de signaux moléculaires. Ces signaux entraînent l'activation ou l'inhibition de différents facteurs de transcription, lesquels sont en mesure de contrôler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et des chondrocytes. L'intégrité de ces différents mécanismes se doit d'être maintenu tout au long de la vie. Ainsi, une anomalie dans l'un de ces mécanismes conduit à l'apparition de pathologies osseuses et métaboliques telles qu’une hypophosphatémie, l'ostéoporose ou l'ostéoarthrite (OA). Afin d'en apprendre davantage sur la biologie osseuse, le projet décrit dans cette thèse a pour objectif de caractériser de nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle pour deux gènes importants dans le développement des os et le maintien de leur intégrité. Il s’agit du Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1 (PITX1) et du Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome (PHEX). Le premier mécanisme présenté dans cette thèse concerne la régulation transcriptionnelle du gène PITX1, un facteur de transcription à homéodomaine nécessaire, notamment, au développement des os des membres inférieurs et au maintien de l'intégrité du cartilage articulaire chez l'adulte. Ainsi, dans les chondrocytes articulaires, on note que l'expression de PITX1 est assurée par le recrutement du facteur de transcription E2F1 à deux éléments de réponse présents dans la région proximale du promoteur de PITX1. Aussi, dans les chondrocytes articulaires de patients souffrant d'OA, dans lesquels l'expression de PITX1 est fortement diminuée, un mécanisme de répression transcriptionnelle, lequel implique la protéine multifonctionnelle Prohibitin (PHB1), semble être activé. En effet, dans ces chondroytes, on note une forte accumulation nucléaire de PHB1 comparativement aux chondrocytes articulaires de sujets sains. Le second mécanisme présenté dans cette thèse concerne la répression transcriptionnelle de PHEX, la peptidase mutée dans le syndrome d'hypophosphatémie lié au chromosome X (X-Linked Hypophosphatemia, XLH), lequel se caractérise par une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Le traitement d'ostéoblastes à la Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) permet d’observer la répression de PHEX. Afin de caractériser le mécanisme responsable de cette répression, des expériences de gènes rapporteurs ont révélé la présence de deux éléments de réponse pour le répresseur transcriptionnel E4BP4 dans le promoteur de PHEX. La suppression de l'expression d'E4BP4 par l'utilisation d'ARN d'interférence a permis de valider que ce facteur de transcription est responsable de la répression de PHEX suite au traitement d'ostéoblastes à la PTHrP. En somme ces nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle permettent de mieux comprendre la régulation de l'expression de PITX1 et de PHEX. Aussi, cette nouvelle implication de PHB1 dans la pathogenèse de l'OA offre de nouvelles possibilités de traitement et pourrait servir pour le diagnostic précoce de cette pathologie. Enfin, la caractérisation d'E4BP4 en tant que médiateur pour la répression de PHEX par la PTHrP suggère que ce répresseur transcriptionnel pourrait être impliqué dans le contrôle de la minéralisation des os et des niveaux de phosphate sanguin. / Bone development and homeostasis need a large amount of molecular signals to be finely regulated in time and space. These signals lead to the activation or to the inhibition of different transcription factors, which are implicated in the control of osteoblast and chondrocyte proliferation and differentiation. The integrity of these mechanisms is required in order to have a healthy life. Indeed, if one of these mechanisms is dysfunctional, different diseases could develop such as hypophosphatemia, osteoporosis and osteoarthritis (OA). In order to contribute to the comprehension of bone biology, the present thesis describes new mechanisms for the transcriptional regulation of two genes implicated in bone development and regulation: PITX1 (Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1) and PHEX (Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome). The first mechanism described in this thesis relates to the transcriptional regulation of PITX1, a gene that encodes for a member of the homeobox family of transcription factors. PITX1 is required in bone development of inferior members and in the maintenance of the articular cartilage integrity in adults. Thereby, we showed that in articular chondrocytes, the expression of PITX1 is activated after the transcription factor E2F1 was recruited at two response elements in the proximal region of its promoter. Moreover, in articular chondrocytes from OA patients, we observed that the expression of PITX1 is strongly decreased. We proposed that the mechanism responsible for this repression requires the multitask protein Prohibitin (PHB1), which is strongly accumulated in OA chondrocyte nuclei, but not in chondrocyte nuclei from healthy individuals. The second mechanism described in this thesis reports a transcriptional mechanism by which PHEX, the gene that encodes for the peptidase mutated in the syndrome X-Linked Hypophosphatemia (XLH)and characterized by hypophosphatemia and osteomalecia, is repressed. We showed that the treatment of osteoblasts with the Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) induced a decrease in PHEX expression. In order to characterize the mechanism responsible for this repression, we performed gene reporter experiments and identified two response elements for the transcription factor E4BP4 in the PHEX promoter. The downregulation of E4BP4 by siRNA led to the validation that this repressor decreased the expression of PHEX in osteoblasts after their treatment with PTHrP. In conclusion, the new transcriptional mechanisms presented in this thesis allow a better understanding of PITX1 and PHEX expression. Moreover, the potential role of PHB1 in the establishment of OA presents many interesting possibilities regarding the treatment and diagnosis of this disease. Finally, the characterization of E4BP4 as a mediator of PHEX repression by the PTHrP suggests that E4BP4 could be implicated in the control of bone mineralization and phosphate levels in the blood.

Les cellules souches somatiques présentent habituellement un comportement très différent des cellules souches pluripotentes. Les bases moléculaires de l’auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires ont été récemment déchiffrées grâce à la facilité avec laquelle nous pouvons maintenant les purifier et les maintenir en culture durant de longues périodes de temps. Par contre, il en va tout autrement pour les cellules souches hématopoïétiques. Dans le but d’en apprendre davantage sur le fonctionnement moléculaire de l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, j’ai d’abord conçu une nouvelle méthode de criblage gain-de-fonction qui répond aux caprices particuliers de ces cellules. Partant d’une liste de plus de 700 facteurs nucléaires et facteurs de division asymétrique candidats, j’ai identifié 24 nouveaux facteurs qui augmentent l’activité des cellules souches hématopoïétiques lorsqu’ils sont surexprimés. J’ai par la suite démontré que neuf de ces facteurs agissent de manière extrinsèque aux cellules souches hématopoïétiques, c’est-à-dire que l’effet provient des cellules nourricières modifiées en co-culture. J’ai également mis à jour un nouveau réseau de régulation de transcription qui implique cinq des facteurs identifiés, c’est-à-dire PRDM16, SPI1, KLF10, FOS et TFEC. Ce réseau ressemble étrangement à celui soutenant l’ostéoclastogénèse. Ces résultats soulèvent l’hypothèse selon laquelle les ostéoclastes pourraient aussi faire partie de la niche fonctionnelle des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. De plus, j’ai identifié un second réseau de régulation impliquant SOX4, SMARCC1 et plusieurs facteurs identifiés précédemment dans le laboratoire, c’est-à-dire BMI1, MSI2 et KDM5B. D’autre part, plusieurs indices accumulés tendent à démontrer qu’il existe des différences fondamentales entre le fonctionnement des cellules souches hématopoïétiques murines et humaines. / Somatic stem cells usually exhibit a very different behavior compared to pluripotent stem cells. The molecular basis of embryonic stem cell self-renewal was recently decrypted by the relative straightforwardness with which we can now purify and maintain these cells in culture for long periods of time. However, this is not the case with hematopoietic stem cells. In order to elucidate the molecular mechanisms of hematopoietic stem cell self-renewal, I developed a novel gain-of-function screening strategy, which bypasses some constraints found with these cells. Starting from a list of more than 700 candidate nuclear factors and asymmetric division factors, I have identified 24 new factors that increase hematopoietic stem cell activity when overexpressed. I have also found that nine of these factors act extrinsically to hematopoietic stem cells, i.e., the effect comes from the engineered feeder cells in co-culture. Moreover, I have revealed a new transcriptional regulatory network including five of the factors identified, i.e., PRDM16, SPI1, KLF10, FOS and TFEC. This network is particularly similar to that involved in osteoclastogenesis. These results raise the hypothesis that osteoclasts might also be part of the functional hematopoietic stem cell niche in the bone marrow. Furthermore, I have identified a second regulatory network involving SOX4, SMARCC1 and several factors previously identified in the laboratory, i.e., BMI1, MSI2 and KDM5B. Besides, several lines of evidence tend to show that there are fundamental differences between mouse and human hematopoietic stem cells.

La régulation de l’expression des gènes est ce qui permet à nos cellules de s’adapter à leur environnement, de combattre les infections ou, plus généralement, de produire la quantité exacte de protéine nécessaire pour répondre à un besoin spécifique. Parmi les joueurs les plus importants dans cette régulation de l’expression des gènes on retrouve les microARN (miARN). Ces petits ARN de 22 nucléotides sont présents chez la majorité des espèces multicellulaires et sont responsables du contrôle direct de plus de 30% des gènes exprimant des protéines chez les vertébrés. La famille de miARN lethal-7 (let-7) est composée de miARN parmi les plus connus et ayant des fonctions cruciales pour la cellule. La régulation du niveau des miARN let-7 est essentielle au bon développement cellulaire. La biogenèse de ces miARN, du transcrit primaire jusqu’à leur forme mature, est régulée principalement par Lin28, une protéine pluripotente très conservée. Cette protéine est composée d’un domaine cold shock (CSD) et de deux domaines de liaison au zinc. C’est grâce à ces domaines de liaison à l’ARN que Lin28 peut lier et inhiber la maturation des miARN let-7. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’interaction entre Lin28 et le microARN précurseur let-7g afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’inhibition de la biogenèse du miARN. À l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons d’abord défini les principaux déterminants de l’interaction entre Lin28 et la boucle terminale du miARN précurseur let-7g (TL-let-7g). Nous avons conclu que le domaine C-terminal de Lin28, composé d’un motif riche en lysines et arginines ainsi que de deux motifs de liaison au zinc, permet à la protéine de lier spécifiquement et avec haute affinité un renflement riche en guanine conservé chez les précurseurs de la famille let-7. Aussi, parce que la séquence et la spécificité de liaison à l’ARN de ce domaine C-terminal sont semblables à celles de la protéine NCp7 du VIH, nous avons défini ce dernier comme le domaine NCp7-like de Lin28. Par la suite, nous avons caractérisé la multimérisation de trois protéines Lin28 sur la boucle terminale de pre-let-7g. Ceci a permis de réconcilier d’apparentes contradictions retrouvées dans la littérature actuelle concernant les sites de liaison de Lin28 lors de sa liaison aux miARN précurseurs. Nous avons identifié trois sites de liaison à haute affinité sur TL-let-7g qui sont liés dans un ordre précis par trois protéines Lin28. Lors de la formation du complexe multimérique, le CSD permet une déstabilisation de l’ARN, ce qui rend accessible plusieurs sites de liaison. Le domaine NCp7-like permet plutôt un assemblage ordonné de la protéine et facilite la liaison initiale de cette dernière. Ces nouveaux résultats rendent possible la mise au point d’un nouveau modèle de l’interaction entre Lin28 et le miARN précurseur let-7g. En conclusion, les études réalisées dans cette thèse apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’une importante famille de miARN et permettront de guider les futures études dans le domaine de recherche en pleine effervescence qu’est celui de la biogenèse des miARN. / The regulation of gene expression is what allows our cells to adapt to their environment, to fight infections or, more generally, to express the appropriate level of proteins to meet a specific need. The microRNAs (miRNAs) are among the most important players in the regulation of gene expression. These small RNAs of 22 nucleotides are present in most multicellular species and are responsible for the direct control of more than 30% of protein-expressing genes in vertebrates. The miRNA lethal-7 (let-7) family consist of some of the most studied miRNAs and plays crucial roles in the cell. The appropriate regulation of the let-7 miRNAs level is essential for proper cellular development. The biogenesis of these miRNAs, from the primary transcript to their mature form is mainly regulated by Lin28, a highly-conserved pluripotent protein. This protein is composed of a cold shock domain (CSD) and two zinc-binding domains. These RNA-binding domains allow Lin28 to bind and inhibit the maturation of the let-7 miRNA. The objective of this thesis is to characterize the interaction between the Lin28 protein and the let-7g miRNA precursor to better understand the role of this protein in the inhibition of miARN biogenesis. Using biochemical and biophysical techniques, we first identified the main determinants of the interaction between Lin28 and the terminal loop of the precursor miRNA let-7g (TL-let-7g). We concluded that the C-terminal domain of Lin28, composed of a lysine-rich and arginine-rich motif in addition to two zinc-binding motifs, is sufficient to bind with high affinity a conserved guanine-rich bulge located on the TL-let-7g. In addition, because the sequence and RNA-binding specificity of this C-terminal domain are similar to those of the HIV protein NCp7, we defined this region as the NCp7-like domain of Lin28. Subsequently, we characterized the multimerization of three Lin28 proteins on the terminal loop of pre-let-7g. This study helped to reconcile apparent contradictions found in the current literature regarding the Lin28-binding sites on miRNA precursors. We identified three high-affinity binding sites on TL-let-7g that are bound in a stepwise manner by the three Lin28 proteins. As part of the formation of the multimeric complex, both RNA-binding domains of Lin28 play an important role. The CSD destabilizes the RNA and this exposes several binding sites, whereas the NCp7-like domain allows an orderly protein assembly and facilitates the initial binding of the protein. These results lead us to propose a new model for the interaction between Lin28 and pre-let-7g. In conclusion, these studies provide a better understanding of the molecular mechanisms involved in the post-transcriptional regulation of an important family of miRNAs and will help guide future projects in the expanding research area of miRNA biogenesis.

L’adaptation de l’organisme à son environnement est essentielle à sa survie. L’homéostasie énergétique permet l’équilibre entre les apports, les dépenses et le stockage d’énergie. Un surplus calorique important dérègle ce processus et mène au développement du syndrome métabolique caractérisé, entre autres, par une obésité, un diabète de type II, des maladies cardiovasculaires et des dyslipidémies. La ghréline participe au maintien de l’équilibre énergétique durant le jeûne en stimulant la production de glucose par le foie et le stockage lipidique dans le tissu adipeux. Le coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha, surexprimé en situation de jeûne, est impliqué dans l’induction de la production de glucose par le foie et l’oxydation des acides gras. Notre hypothèse est que ces deux acteurs clés du métabolisme énergétique constituent un axe de régulation commun. Dans cette étude, nous montrons que la ghréline participe à la régulation de PGC-1alpha. Son récepteur GHS-R1a, possédant une forte activité constitutive, est également impliqué de façon indépendante au ligand. GHS-R1a réduit l’activité transcriptionnelle de PGC-1alpha tandis que l’ajout du ligand inverse modérément cette action. L’effet de GHS-R1a corrèle avec l’acétylation de PGC-1alpha qui est fortement augmentée de façon dose-dépendante. La stabilité de PGC-1alpha est également augmentée par le GHS-R1a indépendamment de l’ubiquitine. La ghréline diminue la capacité de PGC-1alpha à lier PPARbeta, un récepteur nucléaire partenaire de PGC-1alpha. De plus, la ghréline réduit, de façon ligand-dépendante, la capacité de coactivation de PGC-1alpha sur PPARbeta dans les hépatocytes. L’ensemble de ces résultats identifie PGC-1alpha comme cible du signal de la ghréline et suggère un axe de régulation ghréline/PGC-1alpha/PPARbeta.Une meilleure compréhension de cet axe de régulation va permettre la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour faire face aux pathologies associées au syndrome métabolique. / The adaptation of an organism to its environment is essential to its survival. Energy homeostasis is defined as the balance between intakes, expenses and storage of energy. An excess of calories disrupts this process and leads to the development of the metabolic syndrome that is characterized by obesity, type II diabetes, cardiovascular diseases and dyslipidemia. During fasting, ghrelin participates in the maintenance of energy balance by stimulating hepatic production of glucose and lipid storage in adipose tissue. The transcriptional coactivator PGC-1alpha is overexpressed in the liver during fasting and is involves in the induction of the hepatic glucose production and fatty acid oxidation. Our hypothesis is that these two key performers in the energy metabolism constitute a common axis control. In this study, we show that ghrelin plays a role in the regulation of PGC-1alpha. The ghrelin receptor GHS-R1a is also involved because of its strong constitutive activity in absence of ligand. We found that GHS-R1a inhibited PGC-1alpha transcriptional activity whereas adding ghrelin to cells moderated this effect. PGC-1alpha activation by GHS-R1a correlated with a dose-dependent increase of PGC-1alpha acetylation. The stability of PGC-1alpha was also increased by ghrelin receptor in a manner involving the ubiquitin-independent proteasome pathway. Ghrelin decreased the ability of PGC-1alpha to bind to PPARbeta, one of its nuclear receptor partners. Furthermore, ghrelin decreased the ability of PGC-1alpha to coactivate PPARbeta in a ligand-dependent manner in hepatocytes. Together, these results identify PGC-1alpha as a metabolic target of GHSR-1a signaling and defines a new regulatory axis involving ghrelin/PGC-1alpha/PPARbeta in hepatocytes. A better understanding of this regulation axis will provide novel aspects in therapeutic targeting of diseases associated with the metabolic syndrome.