Abstract Changes of cellular polarity in osteoclasts during resorption cycle was studied. Targeting of vesicular stomatitis virus (VSV) G-protein has earlier been studied in epithelial cells and in neurons, in which it serves as a basolateral or dendritic marker protein, respectively. In osteoclasts it occupied only the peripheral parts of the circulation facing basal membrane, but not ruffled border membrane or sealing zone area. Apical or axonal markers including Influenza A haemagglutinin were neither targeted to ruffled border area. Instead, they were transported to a limited area in the middle of the osteoclast basal surface. This membrane domain also showed staining for organic bone matrix components. Further works were done to find out the route of degraded bone matrix components to this membrane domain. It is shown in the confocal laser scanning and transmission electron microscopic level that osteoclasts take both organic and inorganic bone matrix dissolution products into intracellular vesicles which then are transcytosed to basal surface and finally exocytosed. One biological function to the new membrane domain seems to be to serve as an endpoint for intracellular handling of degraded bone matrix components, and as a final secretion point to release these components to circulation. This specialized membrane area is named as functional secretory domain (FSD) in this study. Membrane associated fine structures on the FSD area showed some novel membrane associsted structures. Their appearance and amount correlated to the resorption activity of osteoclasts suggesting that these new structures, termed clastosomes and debris, could be directly involved in the handling of bone degradation products during resorption. It is also shown that the bone matrix itself has effect on the resorption activity of cultured osteoclasts.

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L'utilisation récente des nanoparticules (NPs) comme vecteurs pour l'imagerie et l'adressage d'agents thérapeutiques en nano-médecine nécessite la compréhension de leurs mécanismes d'internalisation et de transport au niveau des barrières biologiques. Dans ce contexte, l'objectif de cette étude est de caractériser l'interaction et la transcytose de NPs de silice fluorescentes en fonction de leur taille (15, 50 et 100 nm) dans un modèle in-vitro de barrière endothéliale pulmonaire humaine. L'internalisation et le transport trans-endothélial des NPs a été analysé quantitativement à l'échelle nanométrique par microscopie électronique à transmission (MET) combinée à de la stéréologie. Un transport trans-endothélial a été observé pour toutes les tailles de NPs. Néanmoins, l'analyse de la distribution intracellulaire révèle une tendance à l'accumulation dans les voies de dégradation cellulaires pour les NPs de 50 et 100 nm. Cette accumulation est moindre pour les NPs de 15 nm. L'internalisation des NPs a également été analysée par cytométrie en flux et MET en présence de différents inhibiteurs de l'endocytose dans le but d'identifier leurs voies d'internalisation. En fonction de la taille des NPs, les mécanismes d'endocytose varient, suggérant une dépendance du transport trans-cellulaire à certains mécanismes d'endocytose. L'internalisation des NPs de 15 nm par la voie d'endocytose cavéole dépendante pourrait ainsi expliquer l'efficacité de leur transport du côté basal. Les méthodologies développées pour l'étude du transport trans-cellulaire des NPs de silice peuvent être appliquées à l'étude de NPs synthétiques plus complexes ou de NPs biologiques, telles que les lipoprotéines de basse-densité, et ce dans un contexte pathologique. / The recent use of nanoparticles (NPs) as carriers for imaging and delivery of therapeutics agents in nanomedecine involves understanding their endocytosis and transcytosis mechanisms at biological barriers. In this context, the aim of this study was to characterize the interaction and transcytosis of fluorescent silica NPs in function of their size (15, 50, and 100 nm) in an in-vitro model of human pulmonary endothelial barrier. NPs internalization and trans-endothelial transport has been quantitatively analyzed at nanometer resolution using transmission electron microscopy (TEM) combined with stereology. Trans-endothelial transport has been observed for each size of NPs. However cellular distribution analysis shows an accumulation in the cellular degradation pathways for 50 nm and 100 nm NPs. Whereas 15 nm NPs are less accumulated. NPs uptake was also analyzed by flow cytometry and TEM in the presence of different inhibitors to decipher NPs internalization pathways. Depending on NPs size, the involved endocytosis pathways were different, suggesting a dependency of trans-cellular transport toward endocytic mechanisms. The specific internalization of 15 nm NPs by the caveolin dependant pathway could explain the efficacy of their release at the basal side. Techniques developed for the study of the trans-cellular transport of silica NPs can also be applied to more complex synthetic NPs or biological NPs, such as low-density lipoproteins, in a pathological context.

HIV est principalement transmis par voie sexuelle. Bien que les stratégies de prévention basées sur les antirétroviraux (TasP et PrEP) soient efficaces, d'autres approches (en particulier vaccinales) restent d' actualité.Dans la première partie de ce travail, nous avons caractérisé le réservoir séminal de HIV chez des patients chroniquement infectés et sous trithérapie antirétrovirale (TARV). Dans le sperme, HIV est présent sous forme libre et/ou associée aux NSMC. Ces deux formes peuvent être transmises. Le TARV réduit la quantité de virus libre dans le sperme, sans éliminer le virus associé aux NSMC. A heure du TasP, comme meilleur outil de prévention de la transmission sexuelle, mieux caractériser l'état de ce virus résiduel (latent, réplicatif, défectif ?) est nécessaire. Dans notre travail, le virus associé aux NSMC n'a pas été réactivé, laissant supposer que le virus résiduel dans les NSMC de patients sous TARV au long cours, peut être défectif. Ces données restent à confirmer dans de plus grandes cohortes.Dans la deuxième partie du travail, nous avons caractérisé sur le plan isotypique et fonctionnel, les anticorps dirigés contre HIV du sperme. L'objectif est de mettre en évidence des anticorps « large spectre » neutralisant HIV, et/ou inhibant la transcytose, et/ou capables d'ADCC et ciblant les souches virales potentiellement transmissibles par voie sexuelle. Nous avons identifié dans le plasma séminal de certains patients des anticorps neutralisant des souches X4 tropiques, alors que les souches majoritairement transmises par voie sexuelle sont R5 tropiques. Nous avons observé la capacité d' anticorps dirigés contre HIV du plasma séminal à traverser un épithélium monocouche. Le rôle protecteur ou facilitateur est à préciser. Des anticorps protecteurs pourraient être utilisés dans des formulations de type microbicides ou en immunothérapie et contribuer également à un développement de vaccin après identification des épitopes cibles. / HIV new infections are mostly related to sexual transmission. Semen contains HIV free particles and cell-associated HIV. Both forms are sexually transmitted. Although PrEP and TasP are efficient to prevent HIV sexual transmission, other strategies like a Vaccine remain needed.In a first part, we studies HIV reservoir in HIV-infected patients receiving combined antiretroviral treatment (cART) in semen. cART reduced HIV viral load in semen, but had a no activity against cell-associated HIV. We tried to reactivate HIV cell reservoir in semen to better characterize its role. We did not observe any reactivation; HIV reservoir in semen might be mostly latent, or defective. This observation should be confirmed in larger cohort of patients.In a second part, we aimed to study the prevalence of anti-HIV antibodies in semen and their role in sexual transmission. Semen of HIV-infected men contains anti-HIV immunoglobulins (Igs), mostly IgG. We observed that unspecific Igs (IgG, IgAl, IgA2) and anti-HIV IgG and IgA were able to transmigrate across an epithelium monolayer mimicking endocervix. This transmigration property may facilitate HIV transcytosis. We also observed a neutralizing activity by Igs purified from semen of 2 chronically infected patients against a X4-tropic viral strain. Seminal anti-HIV may exhibit a dual role (facilitating or limiting) HIV sexual transmission. Protective antibodies purified from semen might be used in preventive strategies like microbicides or serotherapy, and may help to develop vaccine after identification of their epitopes.

In this study, we demonstrated that the CSKSSDYQC-peptide ligand which was identified from a random phage-peptide library through an in vivo phage display technique with rats could prominently improve the transport efficiency of macromolecules, such as large filamentous phage particles (M13 bacteriophage), across the intestinal mucosal barrier. Synthetic CSKSSDYQC-peptide ligands significantly inhibited the binding of phage P1 encoding CSKSSDYQC-peptide ligands to the intestinal mucosal tissue and immunohistochemical analysis showed that the CSKSSDYQC-peptide ligands could be transported across the intestinal mucosal barrier via goblet cells as their specific gateway. Thus, we inferred that CSKSSDYQC-peptide ligand might have a specific receptor on the goblet cells and transported from intestinal lumen to systemic circulation by transcytosis mechanism. These results suggest that CSKSSDYQC-ligand could be a promising tool for development of an efficient oral delivery system for macromolecular therapeutics in the carrier-drug conjugate strategy.

La Protéine Prion (PrP) est une glycoprotéine ubiquitaire attachée au feuillet externe de la membrane plasmique par une ancre glycosylphosphatidylinositole (GPI). Cette dernière est l’agent infectieux responsable de la maladie Creutzfeld-Jacob ou « maladie de la vache folle ». Cette protéine existe sous sa forme cellulaire mais également sous sa forme infectieuse, nommée PrPSc (Scrapie). Alors que la fonction de PrPSc est établie au cours de la pathogenèse, la fonction de la protéine cellulaire est beaucoup plus énigmatique notamment chez les mammifères. Il est clairement admis que la forme infectieuse découle d’un changement de conformation de la forme cellulaire. Ainsi afin de mieux appréhender le rôle de la protéine prion dans les cellules saines mais également lors de la pathogenèse il apparaît essentiel d’étudier le trafic de cette protéine. La protéine prion est exprimée dans les cellules neuronales qui sont comme les cellules épithéliales des cellules polarisées. J’ai au cours de ma thèse étudié le trafic de la protéine prion dans les cellules polarisées MDCK. MDCK est la lignée épithéliale sur laquelle nous avons la plus grande connaissance. Dans mon travail j’ai utilisé des cellules MDCK polarisées classiquement en culture bidimensionnelle (2D) mais également en culture tridimensionnelle (3D) où les cellules forment des kystes, structures hautement polarisées, physiologiquement proches de l’épithélium in vivo. Il apparaît que dans les cellules MDCK polarisées sur filtre (en 2D) la localisation de la PrP est controversée. Nous avons trouvé que, contrairement à la majorité des protéines à ancre GPI, la PrP suit la voie de transcytose. La PrP qui se retrouve à la membrane basolatérale est transcytosée vers la membrane apicale. De plus la PrP envoyée à la surface apicale est clivée (clivage alpha) générant deux fragments distincts : le fragment C1, pourvu de l’ancre GPI qui reste associé à la surface apicale et le fragment soluble N1 qui est sécrété dans le milieu de culture des cellules MDCK cultivées en 2D ou dans le lumen des cellules MDCK cultivées en 3D. Mon travail permet de mieux comprendre les études réalisées auparavant mais surtout révèle l’existence d’un mécanisme de transcytose de la protéine prion dans les cellules épithéliales. Cette information est essentielle et nous permet de supposer que ce mécanisme pourrait être également utilisé par les cellules neuronales. / The Prion Protein (PrP) is a ubiquitously expressed glycosylated membrane protein attached to the external leaflet of the plasma membrane via a glycosylphosphatidylinositol anchor (GPI). While the misfolded PrPSc scrapie isoform is the infectious agent of “prion diseases” the cellular isoform (PrPC) is an enigmatic protein with unclear function. Prion protein has received considerable attention due to its central role in the development of Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) known as “prion diseases”, in animals and humans. Understanding the trafficking, the processing and degradation of PrP is of fundamental importance in order to unravel the mechanism of PrPSc mediated pathogenesis, its spreading and cytotoxicity. The available data regarding PrP trafficking are contradictory. To investigate PrP trafficking and sorting we used polarized MDCK cells (two-dimensional and tree-dimensional cultures) where the intracellular traffic of GPI-anchored proteins (GPI-APs) is well characterized. GPI-APs that are sorted in the Trans Golgi Network follow a direct route from the Golgi apparatus to the apical plasma membrane. The exception to direct apical sorting of native GPI-APs in MDCK cells is represented by the Prion Protein. Of interest, PrP localization in polarized MDCK cells is highly controversial and its mechanism of trafficking is not clear. We found that full-length PrP and its cleavage fragments are segregated in different domains of the plasma membrane in polarized cells in both 2D and 3D cultures and that the C1/PrP full-length ratio increases upon MDCK polarization. We revealed that differently from other GPI-APs, PrP undergoes basolateral-to-apical transcytosis in fully polarized MDCK cells and is α-cleaved during its transport to the apical surface. This study not only reconciles and explains the different findings in the previous literature but also provides a better picture of PrP trafficking and processing, which has been shown to have major implications for its role in prion disease.

La distribution de principes actifs dans le système nerveux central (SNC) est entravée par la présence d'une barrière physiologique, la barrière hémato-encéphalique (BHE). L'endothélium cérébral est pourvu d'un large éventail de systèmes de transport, parmi lesquels la trancytose récepteur-dépendante, qui peut être mise à profit pour vectoriser toute une gamme d'agents thérapeutiques vers le SNC de manière non invasive. Dans le cadre de cette approche, le LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), exprimé à la surface de la BHE, est une cible particulièrement intéressante. L'objectif de ce travail est le développement de nouveaux ligands du LDLR en tant que vecteurs potentiels de la BHE. Le criblage d'une librairie de peptides aléatoires dirigée contre le LDLR a permis l'identification d'un peptide 15-mer cyclique ayant une haute affinité in vitro. Une étude des relations structure/activité a ensuite été menée afin d'améliorer l'affinité pour le LDLR et d'augmenter la stabilité plasmatique de ce peptide. Cette étude a abouti à l'identification d'un nouveau peptide « lead » qui a été conjugué à des molécules actives afin d'évaluer la capacité du peptide à vectoriser un principe actif à travers la BHE après administration in vivo chez la souris. / Drug delivery to the central nervous system (CNS) is hindered by the presence of a physiological barrier, the blood-brain barrier (BBB). The brain endothelium is endowed with a series of transport systems, including receptor-mediated transcytosis. This system can also be used to transport therapeutics into the brain as a non-invasive manner. Among receptors expressed on the BBB, the low density lipoprotein receptor (LDLR) is relevant as a drug delivery system. This project is dedicated to the development of new peptide-based ligands of LDLR as potential BBB-vectors. The screening of a random peptide library directed to the LDLR led to the identification of hits such as a cyclic 15-mer peptide with high in vitro affinity. A structure/activity relationship study was then carried out in order to improve its affinity towards the LDLR and to increase its plasmatic stability. This study led to the identification of a new lead peptide which was conjugated to bioactive compounds in order to assess the ability of our peptide to shuttle a drug across the BBB following in vivo administration in mice.

Als ein Grund für die vertikale Transmission von HIV von der Mutter auf das Kind während der Schwangerschaft bzw. der Geburt wird der Transport von HIV durch die Eihaut diskutiert. Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um einen rezeptorvermittelten Transport, der auf einer Interaktion zwischen einer Lektin-bindenden Domäne auf dem viralen Oberflächenglykoprotein gp120 und einem Rezeptor auf der epithelialen Oberfläche beruht. In der vorliegenden Arbeit konnte die in den Transport von zellfreien HIV-1 durch epitheliale Zellen beteiligte Domäne auf gp120 erstmals näher charakterisiert werden. Überlappende Oligopeptide –basierend auf der Aminosäurensequenz von gp120– wurden zur Hemmung der Transzytose von HIV-1 durch humane Amnionzellen verwendet. Vier dieser Oligopeptide inhibierten die Transzytose von HIV-1 signifikant. Ein synthetisches Peptid (Env362-420) mit einer Länge von 59 Aminosäuren, welches die Sequenz der inhibierenden Oligopeptide darstellt, reduzierte die Menge an transportierten Viren ebenfalls, unabhängig vom HIV-1 Subtyp. Im Weiteren konnte der Transport von HIV-1 durch polyklonale Antikörper in Seren HIV-Infizierter, die mit Env362-420 reagierten, und durch Seren, die durch eine Immunisierung von Kaninchen mit Env362-420 gewonnen wurden, inhibiert werden. Antikörper gegen die in den Transport involvierte Domäne konnte in Seren HIV-Infizierter zu jedem Stadium der Infektion nachgewiesen werden. Bei einer Expression der Antikörper in der frühen Infektionsphase wäre ein positiver Einfluss auf die Prognose der Krankheit vorstellbar. Ob ein Zusammenhang zwischen einer Antikörperexpression gegen Env362-420 in HIV-infizierten Schwangeren und der Wahrscheinlichkeit einer HIV-Transmission auf das Kind besteht, muss noch geklärt werden. Env362-420 kann zur Identifizierung des Rezeptors auf der epithelialen Oberfläche, welcher in die Transzytose von HIV involviert ist, und zur Entwicklung von Inhibitoren der Mutter–Kind-Übertragung von HIV herangezogen werden. / The transport of HIV through the fetal membranes is discussed as one possible reason for the vertical transmission of HIV from mother to child during pregnancy or labor. HIV can penetrate epithelial barriers by a receptor-mediated transport mechanism involving interaction of a lectin-like domain on the viral glycoprotein gp120 and a receptor on the epithelial surface. In this study the domain on gp120 involved in transcytosis of cell-free HIV-1 through epithelial cells was characterized in more detail. Overlapping oligopeptides of gp120 were used to inhibit transcytosis of HIV 1 through an amnion cell monolayer. Four oligopeptides significantly inhibited transcytosis of HIV 1. A synthetic oligopeptide (Env362-420) with a length of 59 amino acids representing the sequence of the four inhibiting oligopeptides significantly reduced the transport of HIV, independent of the HIV 1 subtype. Furthermore, human HIV-positive sera with antibodies reacting with the domain Env362-420 and rabbit sera raised against the oligopeptide Env362-420 also inhibited the transport of HIV-1. Antibodies directed against the transcytosis domain could be detected in sera from every stage of infection. The development of these antibodies in the early stage of infection might play a role in the outcome of the HIV disease.It has to be investigated whether HIV 1-infected women who developed these antibodies show a lower rate of HIV transmission to their offspring than those without such antibodies. Env362–420 can also be used as a tool to identify the receptor involved in transcytosis on the epithelial cell surface and to develop inhibitors that could help prevent mother-to-child transmission of HIV during pregnancy or labor.

Les neurotoxines botuliques (BoNTs), produites par C. botulinum, sont responsables du botulisme humain et animal. Dans sa forme naturelle, le botulisme résulte le plus souvent d’une absorption des toxines botuliques à partir du tube digestif après ingestion d’aliments contaminés par la toxine et C. botulinum. L’intoxination peut être divisée en 4 grandes étapes : production de toxine par la bactérie, ingestion d’aliments contenant la toxine préformée, passage de la neurotoxine à travers la barrière intestinale et action protéolytique aux terminaisons nerveuses. La régulation de la production des toxines et le passage des neurotoxines botuliques à travers la barrière intestinale sont mal compris. BoNT s’associe à des protéines non toxiques (NAPs) pour former des complexes de différentes tailles. Les gènes codant les BoNTs et NAPs sont regroupés sur le locus botulique et leur expression est contrôlée positivement par le facteur sigma alternatif BoTR/A. La toxinogénèse chez C. botulinum est contrôlée par un réseau complexe de régulateurs incluant au moins 3 systèmes à deux composants (TCS), identifiés pas la méthode d’ARN antisens, qui régulent positivement la production de complexe botulique indépendamment de BoTR/A. D’autre part, l’entrée de BoNT/B dans la barrière intestinale a été suivie à l’aide du fragment HcB marqué en fluorescence dans une anse intestinale ligaturée de souris. Des analyses en microscopie à fluorescence, immunohistochimie et microscopie électronique ont permis de mettre en évidence que HcB transcytose à travers les entérocytes par une voie d’endocytose dépendante de la dynamine. HcB cible les terminaisons nerveuses acétylcholinergiques de la lamina propia des villosités et gagne les neurones acétylcholinergiques et sérotoninergiques de la sous-muqueuse et de la musculeuse en seulement 10 minutes. Une étude in vitro réalisée sur cellules intestinales (m-ICcl2) montre que l’entrée de HcB est dépendante de récepteurs gangliosidiques GD1b/GT1b présents à la surface des cellules mais pas de la synaptotagmine II qui est requise pour l’entrée de BoNT/B dans les cellules neuronales. / Botulinum neurotoxins (BoNTs), produced by C. botulinum, are responsible for animal and human botulism. In its natural form, botulism is mostly acquired after absorption of BoNTs in the digestive tract after ingestion of food contaminated with C. botulinum and its toxins. The intoxination can be divided in 4 major steps: toxin production, ingestion of food contaminated with BoNTs, passage of BoNTs through the intestinal barrier, and proteolytic activity on nerve endings. Regulation of toxin production and passage of BoNTs through the intestinal barrier are poorly understood. BoNT associates with non toxic protein (NAPs) to form complexes of various sizes. The BoNTs and NAPs genes are clustered in the botulinum locus and are positively regulated by an alternative sigma factor BotR/A. Toxinogenesis in C. botulinum is regulated by a complex regulatory network containing at least 3 two components systems (TCS), identified by antisens RNA strategy, which regulate the production of botulinum complex independently of BotR/A. On the other hand, BoNT/B entry was monitored with fluorescent HcB fragment in ligatureted mouse intestinal loop. Fluorescent imaging analysis, immunohistochemistry and electron microscopy, have evidence that HcB is transcytosed through enterocytes cells by an endocytosis dynamin dependant. HcB targets acetylcholinergic nerves localized in lamina propria of villi then reaches serotoninergic and acetylcholinergic nerve endings in the submucosa and musculosa within 10 minutes. In vitro experiments performed on intestinal cell line (m-ICcl2) shows that the endocytosis of HcB is dependent on the GD1b/GT1b gangliosidic receptors on the cell surface but not on the synaptotagmine II protein which is recquiered HcB entry in neuronal cells

<p>Over the past decade, the development of macromolecular drugs based on peptides, proteins and nucleic acids has increased the interest in microparticulate drug delivery, i.e., the delivery of drug systems in the nanometer and micrometer ranges. However, little is known so far about the effect that microparticulate systems have on various tissues after administration. Additionally, the knowledge of mechanisms responsible for the uptake and transport of microparticles across the human intestine is incomplete and requires further investigation to improve both the safety profiles and the efficiency of these drug delivery systems.</p><p>This thesis is comprised of two parts. The first one investigates gene expression responses obtained from DNA arrays in local and distal tissues after microparticulate drug delivery. The second part focuses on the mechanisms responsible for the transport of microparticles across epithelial cells lining the intestine.</p><p>The results presented in the first part demonstrated that gene expression analysis offers a detailed picture of the tissue responses after intramuscular or pulmonary administration of microparticulate drug delivery systems compared to the traditional techniques used for such evaluations. In addition, DNA arrays provided a useful and sensitive tool for the initial characterization and evaluation of both local and distal tissue responses, making it possible to distinguish between gene expression patterns related to each studied delivery system.</p><p>The results presented in the second part demonstrated that the surface properties of the microparticle were important for the extent of transport across an <i>in vitro</i> model of the follicle-associated epithelium (FAE), comprised of intestinal epithelial cells specialized in particle transport (M cells). Another important finding was that the enteropathogen bacterium, <i>Yersinia pseudotuberculosis</i>, induced microparticle transport across the normal intestinal epithelium, represented by Caco-2 cells and excised human ileal tissue. This transport was most probably mediated by an increased capacity for macropinocytosis in the epithelial cells.</p>